Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos
Summary
Este protocolo descreve os procedimentos experimentais para avaliar a diferenciação de células dendríticas plasmacytoid em placas de Peyer de progenitores de células dendriticas comuns, utilizando técnicas que envolvem o isolamento de FACS mediada por células, a transferência de genes hidrodinâmico, e análise de fluxo de subconjuntos imunes em placas de Peyer.
Abstract
Este protocolo detalha um método para analisar a capacidade dos progenitores hematopoiéticos purificadas para gerar células dendríticas plasmocitóides (PDC) em placa de Peyer intestinal (PP). Progenitores de células dendríticas comuns (CDPs, lin – de c-kit eis CD115 + + FLT3) foram purificadas a partir da medula óssea de ratinhos C57BL6 por FACS e transferido para murganhos receptores que não possuem uma população significativa pDC em PP, neste caso, o IFNAR – / – ratinhos foram utilizados como os receptores de transferência. Em alguns camundongos, a superexpressão do fator de crescimento de células dendríticas Flt3 ligante (Flt3L) foi aplicada antes adotivos transferência de CDPs, utilizando transferência de genes hidrodinâmico (HGT) de Flt3L-plasmídeo. Flt3L a superexpressão expande as populações DC provenientes transferidos (ou endógenos) células progenitoras hematopoéticas. No 7-10 dias após a transferência progenitor, pDCs que surgem a partir dos progenitores adotivamente transferidos foram distinguidas das células receptoras nobase de CD45 expressão do marcador, com pDCs de CDPs transferidos sendo CD45.1 + e destinatários sendo CD45.2 +. A capacidade de LDC transferidos para contribuir para a população pDC em PP e para responder a Flt3L foi avaliada por citometria de fluxo de PP suspensões de células individuais a partir de ratinhos receptores. Este método pode ser utilizado para testar se a outras populações progenitoras são capazes de gerar PP pDCs. Além disso, esta abordagem pode ser usada para examinar o papel de factores que estão previstos para afectar o desenvolvimento do pDC em PP, transferindo subconjuntos progenitoras com um knockdown apropriado, eliminar ou sobre-expressão do factor de putativa de desenvolvimento e / ou através da manipulação de citocinas circulantes através HGT . Este método também pode permitir a análise de como pDCs PP afetar a freqüência ou função de outros subconjuntos imunes em PPs. Uma característica única deste método é o uso de IFNAR – / – ratos, que mostram dizimadas PP pDCs em relação ao tipo selvagem animais, assim allowing reconstituição do PP pDCs na ausência de efeitos de confusão de irradiação letal.
Introduction
Aqui, nós demonstramos um protocolo para avaliar se progenitores de células dendríticas comuns (CDPs) são capazes de dar origem a células dendríticas plasmocitóide população (PDC) em placa de Peyer (PP). O objetivo geral deste método foi avaliar a regulação do desenvolvimento de pDCs na placa de Peyer (PP pDCs). A razão pela qual isto é importante é que pDCs PP diferem de pDCs encontrado em outros tecidos, incluindo a medula óssea, do sangue e do baço, e, por conseguinte, não está claro se pDCs PP e outras populações pDC são termos de desenvolvimento e / ou funcionalmente relacionados. Especificamente, pDCs são amplamente conhecido por ser o principal tipo I interferon (IFN) produtores dentro do sistema hematopoiético, respondendo ao receptor Toll-like 7 e 9 (TLR7 / 9) estimulação por IFN rápida secreção 1-3. No entanto, pDCs PP são deficientes na produção de IFN tipo I em resposta a estimulação agonista TLR 4,5. Além disso, PP pDCs também diferem de pDCs encontradas na medula óssea e no baço, emrequerendo sinais provenientes do receptor do interferão do tipo I (IFN) (IFNAR1) ou sinalização de IFN STAT1 molécula para o seu desenvolvimento e / ou a acumulação 5. Estes dados sugerem a possibilidade de que os mecanismos reguladores distintos controlar pDCs PP contra pDCs noutros órgãos (por exemplo, medula óssea, baço) 5.
A lógica que levou ao desenvolvimento deste método foi baseada em avanços recentes na compreensão da biologia das células dendríticas (DC). A maioria, se não todos, os subconjuntos de DC derivar de progenitores hematopoiéticos que expressam a tirosina-quinase 3 de receptor tipo fms (FLT3), 6-10, no entanto, o desenvolvimento DC não se restringe ao mielóide clássico e vias linfóides. Por exemplo, FLT3 + progenitores mielóides comuns (CMPs, lin – IL-7R – Sca-1 – c-kit + CD34 + FcγR lo / -) dão origem a CDPs (lin – c-kit lo CD115 + Flt3 +), which diferenciar ainda mais em pDCs e DCs convencionais (CDCs) 9,10. Por outro lado, Flt3 + progenitores linfóides comuns (CLPs, Lin – IL-7R + Sca-1 lo c-kit lo) se desenvolvem principalmente em pDCs 11. Portanto, estudos anteriores indicam pDCs surgem pelo menos duas populações progenitoras hematopoiéticas distintas ao abrigo do regulamento de Flt3L, embora a análise típica tem sido restrita para a medula óssea, baço e / ou subconjuntos pDC sangue. Assim, a população de (s) progenitor que gera PP pDCs necessária investigação. Compreender as origens do PP pDCs vai lançar luz sobre se eles compartilham as vias de desenvolvimento comuns a outras populações PDC ou utilizar mecanismos distintos durante a sua geração no PP.
A única vantagem da abordagem aqui descrita é a utilização de ratos que apresentam uma deficiência grave em PP pDCs como receptores para a transferência adoptiva de células progenitoras hematopoiéticas. Ratos com genesupressão tique no gene que codifica a IFNAR1 (IFNAR – / – murganhos) ou STAT1 (Stat1 – / -) revelou uma depleção marcante em PP pDCs 5. Portanto, estas linhagens proporcionar um ambiente no qual os pDCs PP são reduzidos, permitindo estudos de transferência adoptivos ser realizada na ausência de potentes regimes de ablação celular, tais como a irradiação letal. Teor adicional método apresentado é utilização de transferência gene hidrodinâmico (HGT) estimular montantes elevadas circulantes Flt3L. Isso fornece uma abordagem de custo eficaz para induzir Flt3L in vivo, contra injeção de proteína recombinante. Inúmeros estudos, incluindo aqueles em nosso laboratório, empregaram HGT para induzir quantidades de citocinas em uma variedade de condições experimentais 5,12,13.
A divisão do trabalho e funções imunológicas precisas para DCs é de grande interesse na área de imunologia. Em particular, pDCs são mediadores importantes de tolerância oral e sistémica anti-viralrespostas, ainda que também parecem contribuir para o desenvolvimento e persistência de auto-imunidade e cancro 14-17. O protocolo aqui descrito vai permitir que os mecanismos que regulam o desenvolvimento PP pDCs ser mais plenamente exploradas. Além disso, esta abordagem pode permitir estudos para avaliar a função PP PDC e pode ser prorrogado para o entendimento da regulação e função de outras populações imunológicas dentro PPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica de transferência adoptiva descrita aqui avaliada a contribuição de LDC a população PP pDC em ratinhos receptores que são deficientes em PP pDCs (por exemplo, elemento de IFNAR – / – ratinhos). Em experimentos futuros, será importante para avaliar o potencial de outros subconjuntos progenitoras na geração pDCs PP, em especial, se pDCs PP derivam FLT3 + CLPs. Esta questão é importante, uma vez que ainda não está claro por que pDCs PP são excepcionalmente sensíveis a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos drs. Alex Gelbard e Willem Overwijk para aconselhamento sobre a transferência de genes hidrodinâmico. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH (AI098099, SSW), o Centro MD Anderson para o cancro da Epigenética, o Centro MD Anderson de Inflamação e do Câncer (SSW), eo Fundo de Educação Bob Smith RE (HSL).
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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