Summary
Este protocolo describe los procedimientos experimentales para evaluar la diferenciación de las células dendríticas plasmacitoides en las placas de Peyer a partir de progenitores comunes de células dendríticas, usando técnicas que implican el aislamiento mediada por FACS de células, la transferencia génica hidrodinámica, y análisis de flujo de subconjuntos inmunes en las placas de Peyer.
Abstract
Este protocolo detalla un método para analizar la capacidad de progenitores hematopoyéticos purificados para generar células dendríticas plasmacitoides (PDC) en el parche de Peyer del intestino (PP). Progenitores de células dendríticas comunes (LDC, lin - c-kit Lo CD115 + de Flt3 +) se purificaron a partir de la médula ósea de ratones C57BL6 por FACS y se transfirieron a ratones receptores que carecen de una población significativa PDC en PP, en este caso, IFNAR - / - los ratones se usaron como los destinatarios de transferencia. En algunos ratones, la sobreexpresión del ligando de Flt3 factor de crecimiento de células dendríticas (Flt3L) se aplica antes de la transferencia adoptiva de los CDP, usando la transferencia de genes hidrodinámico (HGT) de plásmido Flt3L-codificación. Flt3L sobreexpresión expande poblaciones de DC procedentes de transferidos (o endógenos) progenitores hematopoyéticos. A los 7-10 días después de la transferencia progenitor, PDC que surgen de los progenitores de forma adoptiva transferidos se distinguen de las células receptoras de labase de la expresión del marcador CD45, con PDC de los CDP transferidos siendo CD45.1 + y ser receptores CD45.2 +. La capacidad de los CDP transferidos a contribuir a la población PDC en PP y para responder a Flt3L se evaluó por citometría de flujo de PP suspensiones de células individuales de los ratones receptores. Este método puede ser usado para probar si otras poblaciones progenitoras son capaces de generar PP PDC. Además, este enfoque podría utilizarse para examinar el papel de los factores que se predice que afectan el desarrollo PDC en PP, mediante la transferencia de subconjuntos progenitoras con una caída apropiada, nocaut o sobreexpresión del factor de desarrollo putativo y / o mediante la manipulación de citocinas circulantes a través de HGT . Este método también puede permitir el análisis de cómo PDC PP afectan a la frecuencia o la función de otros subconjuntos inmunes en PP. Una característica única de este método es el uso de IFNAR - / - ratones, que muestran severamente reducida PP PDC en relación con los animales de tipo salvaje, por lo tanto allowing reconstitución de PP PDC en la ausencia de efectos de confusión de la irradiación letal.
Introduction
Este sentido, demuestran un protocolo para evaluar si progenitores de células dendríticas comunes (LDC) son capaces de dar lugar a la célula dendrítica plasmocitoide población (PDC) en las placas de Peyer (PP). El objetivo general de la utilización de este método fue el de evaluar la regulación del desarrollo del PDC en las placas de Peyer (PP PDC). La razón de que esto es importante es que PDC PP difieren de PDC se encuentran en otros tejidos, incluyendo la médula ósea, la sangre y el bazo, y por lo tanto no está claro si PDC PP y otras poblaciones PDC son de desarrollo y / o funcionalmente relacionadas. Específicamente, PDC son ampliamente conocidos por ser el principal tipo I de interferón (IFN) productores en el sistema hematopoyético, en respuesta a Toll-like receptor 7 y 9 (TLR7 / 9) la estimulación de la secreción de IFN rápido 1-3. Sin embargo, PDC PP son deficientes en la producción de IFN de tipo I en respuesta a la estimulación de TLR agonista 4,5. Por otra parte, PP PDC también difieren de PDC que se encuentran en la médula ósea y el bazo enque requiere señales del interferón de tipo I (IFN) receptor (IFNAR1) o la señalización de IFN STAT1 molécula para su desarrollo y / o acumulación 5. Estos datos han sugerido la posibilidad de que distintos mecanismos de regulación controlan PDC PP frente a PDC en otros órganos (por ejemplo, médula ósea, bazo) 5.
La razón que llevó al desarrollo de este método se basa en los últimos avances en la comprensión de células dendríticas (DC) la biología. La mayoría, si no todos, los subconjuntos de DC se derivan de progenitores hematopoyéticos que expresan el receptor de tirosina quinasa 3 similar al FMS (de Flt3) 6-10; sin embargo, el desarrollo de CC no está restringido a la mieloide clásico y vías linfoides. Por ejemplo, Flt3 + progenitores mieloides comunes (CMPS, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcγR más altas / -) dan lugar a los CDP (lin - c-kit lo CD115 + FIt3 +), which diferenciar aún más en los países en desarrollo y PDC convencionales (CDC) de 9,10. Por el contrario, de Flt3 + progenitores linfoides comunes (CLPS, lin - IL-7R + Sca-1 lo c-kit lo) se desarrollan principalmente en PDC 11. Por lo tanto, los estudios anteriores indican PDC surgen de, al menos, 2 poblaciones progenitoras hematopoyéticas distintas en el marco de la regulación de Flt3L, aunque el análisis típico se ha limitado a la médula ósea, el bazo y / o subconjuntos PDC sangre. Por lo tanto, la población (s) progenitor que genera PP PDC requiere investigación. La comprensión de los orígenes del PP PDC arrojará luz sobre si comparten vías de desarrollo comunes con otras poblaciones PDC, o utilizar mecanismos distintos durante su generación en el PP.
Una ventaja única del enfoque descrito en el presente documento es el uso de ratones que muestran una deficiencia grave en PP PDC como receptores para la transferencia adoptiva de células progenitoras hematopoyéticas. Los ratones con el gensupresión de tic en el gen que codifica IFNAR1 (IFNAR - / - ratones) o STAT1 (Stat1 - / -) reveló un agotamiento sorprendente en PP PDC 5. Por lo tanto, estas cepas proporcionan un entorno en el cual se reducen PDC PP, lo que permite estudios de transferencia adoptiva que se realizaron en ausencia de los regímenes de ablación celular potentes tales como la irradiación letal. Una fuerza adicional del método presentado aquí es el uso de la transferencia génica hidrodinámica (HGT) para estimular cantidades circulantes elevados de Flt3L. Esto proporciona un enfoque rentable para inducir Flt3L in vivo, en comparación con la inyección de la proteína recombinante. Numerosos estudios, incluyendo aquellos en nuestro laboratorio, han empleado HGT para inducir cantidades de citoquinas en una variedad de condiciones experimentales 5,12,13.
La división del trabajo y las funciones inmunológicas precisas para los países en desarrollo es de gran interés en la inmunología. En particular, el PDC son importantes mediadores de la tolerancia oral y anti-viral sistémicarespuestas, sin embargo, también parecen contribuir al desarrollo y persistencia de la autoinmunidad y el cáncer de 14-17. El protocolo se describe en este documento permitirá a los mecanismos de desarrollo que regulan PP PDC para ser más plenamente exploradas. Además, este enfoque puede permitir que los estudios para evaluar la función PP pDC, y puede ser extendida a la comprensión de la regulación y la función de otras poblaciones inmunes dentro de los PP.
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Protocol
Aprobación institucional se debe obtener por adelantado para todas las manipulaciones experimentales descritas en el presente documento con ratones. Estos incluyen el uso de ratones C57BL6 para el aislamiento de células progenitoras de médula ósea, IFNAR - / - ratones como receptores para la transferencia adoptiva de células progenitoras hematopoyéticas y el uso de HGT para la sobreexpresión de citoquinas in vivo. Alojamiento adecuado y cuidado de los animales también deben ser proporcionados por el investigador o institución. Además, la aprobación institucional puede ser necesaria para los plásmidos utilizados en la transferencia de genes hidrodinámico (es decir, la aprobación de ADN recombinante). Los estudios aquí descritos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso del Centro de Cáncer MD Anderson de la UT.
1. Transferencia génica hidrodinámica (HGT)
Este paso debe ser realizado 2 días antes de la transferencia adoptiva de los CDP para inducir circulantes Flt3L para la expansión de DC in vivo 5. Prepare al menos 5 destinatario ratones / grupo.
- Para lograr eficiente HGT, los vasos sanguíneos del receptor IFNAR - / - ratones (CD45.2 +) deben ser dilatados mediante la exposición de los ratones a una lámpara de calentamiento durante 5-10 min.
- Coloque el ratón en un dispositivo de inmovilización y desinfectar su cola con etanol al 70%.
- Inyectar 5 g de plásmido que codifica Flt3L en 2 ml de PBS estéril en la vena de la cola usando una aguja de calibre 27. Para la cohorte de control, inyección de 5 mg de vector vacío (pORF) a través de la vena de la cola como se indica.
- Monitorear los ratones durante 15-30 minutos para asegurar que no hay efectos nocivos de la inyección en la vena de la cola. Ratones Volver a instalación de vivienda durante 2 días.
2. Aislamiento de Progenitores Hematopoyéticas de médula ósea de ratón
Este paso se debe realizar 2 días después de HGT. Utilice CD45.1 + ratones congenic como la fuente de progenitores de la médula ósea para la transferencia adoptiva en receptor IFNAR - /- animales (CD45.2 +). En este protocolo, se requieren cepas congenic para distinguir donante y el receptor DCs derivadas, así como para evitar el agotamiento inmune mediada por MHC de falta de coincidencia. Se requieren aproximadamente 10 a 20 ratones para proporcionar un número suficiente de células progenitoras hematopoyéticas (10 5 células / ratón receptor) para los experimentos de transferencia.
- La eutanasia a 10 congenic CD45.1 + ratones mediante asfixia con CO2 y dislocación cervical.
- Coloque cada canal en una bandeja de disección y esterilizar el abdomen y las piernas con etanol al 70%.
- Hacer una incisión en la mitad del abdomen y cortar a través de la piel del abdomen para cada pierna, corte de la piel a lo largo de la pierna.
- Retire con cuidado la piel de cada pierna, y cortar y quitar las patas de la canal por la articulación de la cadera con unas tijeras afiladas.
- Retire con cuidado los músculos del fémur y la tibia de cada pata usando una cuchilla afilada.
- Eliminarambos extremos del fémur y la tibia con un escalpelo afilado y lugar los huesos en una placa de cultivo que contiene RPMI completo (RPMI con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino, 1% penicilina / estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM y 50 mM β-mercaptoetanol) .
- Preparar una jeringa que contiene 1 ml de RPMI completo, conectados a una aguja 27.
- Insertar la aguja de 27 G en un extremo del fémur o de la tibia. Enjuague la médula ósea del fémur o de la tibia mediante la inyección suavemente el RPMI completo en el hueso. Asegúrese de que las células de médula ósea están siendo removidos del hueso, lo que puede lograrse mediante la detección visual de medios expulsados que parece nublada.
- Repita el lavado cada fémur y la tibia 3x para eliminar completamente las células de la médula ósea.
- Preparar una suspensión de células pipeteando suavemente las células hacia arriba y abajo de 3 a 5 veces en la placa de cultivo.
- Retire los residuos haciendo pasar las células de la médula ósea a través de un colador de 40 células M, la colocación de las células de exudados en una nueva culturalmentee plato. Interrumpir cualquier grupos de células que aparecen en el colador por una suave presión con el extremo de un émbolo de jeringa estéril.
- Lisar las células rojas de la sangre (RBC) presentes en la suspensión de células de médula ósea total de con tampón de lisis RBC comercial según las instrucciones del fabricante. Utilice 2 ml RBC lisis buffer/4-6 x 10 7 células (generalmente células de un ratón) y un tiempo de incubación de 5 min a temperatura ambiente.
- Lavar las células de la médula ósea por la granulación células por centrifugación durante 4 min a 500 xg, aspirando suavemente el medio de cultivo, resuspender en 10 ml de tampón FACS (PBS 1x + 2 mM de EDTA + 1% de FBS), células de revestimiento por centrifugación y suavemente aspirando de lavado tampón.
- Repetir el lavado, como se describe en el paso 2,13, para un total de 2 lavados.
3. Fluorescencia de células activadas (FACS) para aislar los CDP
Este paso requiere el acceso a un separador de células MidiMACS y columnas MACS LD para un procedimiento de selección negativa inicial,así como una máquina de FACS con al menos 3 láseres para purificar el subconjunto progenitoras multicolor después de la tinción con anticuerpos conjugados con fluorescencia.
- Después del segundo lavado en el paso 2.14, contar las células de la médula ósea. Sedimentar las células por centrifugación como se describe en el paso 2.13 y resuspender en tampón FACS para lograr una concentración final de 4 x 10 7 células por 30 l de tampón FACS.
- Para preparar las células para FACS, las células de linaje negativo primero se enriquecen con una técnica de selección negativa que elimina las células de linaje positivo de la mezcla de médula ósea usando cromatografía en columna de esferas magnéticas. Para el procedimiento de selección negativa, se añade 1 g de cada uno de los siguientes anticuerpos anti-ratón de rata comercial (ABS) que reconocen marcadores de linaje hematopoyético: CD3, CD19, CD11c, CD11b y Ter-119 Abs. Los Abs debe añadirse en un volumen de 2 l / Ab a la suspensión de células 30 l en tampón de FACS.
- Se incuba la suspensión celular a 4 º C durante 30min. Después de la incubación, se lavan las células dos veces con 10 ml de tampón FACS como se describe en el paso 2,13.
- Resuspender las células para alcanzar una concentración final de 4 x 10 7 cells/40 l de tampón FACS. Añadir 20 l de cabra anti-rata microperlas magnéticas IgG por cada 40 l de suspensión celular. Mezclar suavemente y se incuba a 4 ° C durante 30 min. Lavar las células con 10 ml de tampón FACS como se describe en el paso 2,13.
- Resuspender hasta 10 células de la médula ósea 8 en 500 l de tampón FACS.
- Cargar una columna MACS LD en un separador de células MidiMACS según las instrucciones del fabricante y pre-enjuague de la columna con tampón de 2 ml de FACS.
- Aplicar la suspensión de células de médula ósea de la columna, la carga de hasta 5 x 10 8 células en 2,5 ml de tampón FACS. Asegurar un tubo de recogida (tubo cónico de 15 ml) se coloca debajo de la columna. Lavar la columna 3 veces con 2 ml de tampón FACS / lavado, y recoger las células que pasan a través de la columna, que se enriquece paracélulas de linaje negativo. Contar las células en el material eluido (WASH-a través) de la columna.
- Para llevar a cabo la selección positiva de subconjuntos progenitoras hematopoyéticas por FACS, las células de tinción con la siguiente Abs conjugado con fluorescencia: IL-7R (Pacific Blue), de Flt3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, además de una mezcla de Abs marcadores de linaje dirigidos contra CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 y Ter119 (todo marcado con PerCP Cy5.5). Utilice 0,5-1 l de cada Ab en un volumen total de 100 l. Incubar suspensión de células a 4 º C durante 20-30 min.
- Lavar las células como se indica en el paso 2.13 y resuspender en tampón de FACS en una concentración de 2-3 x 10 7 células / ml. Filtrar células a través de un tubo 35 M tapa filtro de células para eliminar los agregados celulares. Este último paso es crucial para evitar la obstrucción de la máquina FACS.
- Coloque la suspensión de células en un tubo de FACS en el escenario FACS y ordenar los CDP (lin - c-kit lo CD115 + FIt3 +) en elbase del perfil de marcador indicado. Recoger las células purificadas en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de RPMI completo.
- Registre el número absoluto de células clasificadas al final de la carrera FACS. Sedimentar las células por centrifugación como se indica en el paso 2.13 y resuspender en PBS estéril para experimentos de transferencia adoptiva.
4. La transferencia adoptiva de los CDP
Este paso se realiza por lo general en las instalaciones de animales, donde se alojan los ratones receptores. Dependiendo de la ubicación de la máquina de FACS, que puede implicar el transporte de las poblaciones de células progenitoras purificadas en las instalaciones de animales antes de la transferencia adoptiva. Suspensiones de células progenitoras deben mantenerse estéril y transportados en hielo.
- Preparar suspensiones de células para la inyección mediante la dilución de 10 5 CDP purificados en un volumen total de 100 l de PBS estéril. Coloque suspensión de células en una jeringa conectada a una aguja de calibre 27.
- Exponer el receptor IFNAR - / - +) a una lámpara de calentamiento durante 5-10 minutos para conseguir la inyección eficiente a través de la vena de la cola.
- Coloque el ratón en un dispositivo de inmovilización y desinfectar su cola con etanol al 70%.
- Inyectar 10 CDP 5 FACS-purificado en 100 l de PBS en la cola vena con una aguja de 27.
- Monitorear los ratones durante 15-30 minutos para asegurar que no hay efectos nocivos de la inyección en la vena de la cola. Ratones Regreso a las instalaciones de la vivienda.
5. El aislamiento del PP y Medición de pDC Cantidades
- A los 7-10 días después de la transferencia adoptiva, la eutanasia a los ratones receptores. Abra suavemente el ratón por la disección y exponer el intestino.
- Quite todo el intestino y colocarlo en toallas de papel empapadas-PBS. Recoge todos los PPs visibles a lo largo de la pared del intestino delgado mediante finas pinzas y tijeras. C57BL6 y IFNAR - / - ratones tienen típicamente 5-10 PP / ratón, que son diferentes de los folículos linfoides aislados encontradosa lo largo del intestino delgado 18. Tenga en cuenta que los PPs suelen ser estructuralmente distintos, incluso dentro de un solo ratón, asegúrese tan cuidadosamente todos los PPs se identifican y disecados.
- Coloque PP en una placa de Petri que contenía PBS, y el uso de fórceps para eliminar las heces. Repita este procedimiento dos veces para limpiar los PP.
- Resumen PP con 1 mg / ml de colagenasa IV en 10 ml de solución salina equilibrada de Hank 1x (HBSS) en un matraz de 50 ml con agitación vigorosa durante 1 hora a 37 ° C.
- Coloque el PP digerido en el compartimiento superior de un 40 micras células colador celular y de la fuerza a través del filtro con un émbolo de jeringa estéril. Recoger la suspensión de células PP en un tubo cónico de 15 ml.
- Pellet células PP tensas por centrifugación a 500 xg durante 5 min y se vuelve a suspender en 6 ml de solución de Percoll 37% (37% de Percoll en medio RPMI). Colocar suavemente 6 ml de solución de Percoll 70% (70% de Percoll en medio RPMI) por debajo de la suspensión de células, para formar un paso de gradiente de Percoll.
- Centrifugar las células durante 20 min unaT 800 xg con la centrífuga rompa. Las células mononucleares se migrar a la interfaz 37/70%. Después de la centrifugación, la población de células mononucleares se debe recoger por cuidado de pipeteado en la región de interfaz. Pellet recogió células por centrifugación y se lavan dos veces en 50 ml de RPMI completo / lavado. Un gran volumen se utiliza para asegurar la eliminación completa de Percoll.
- Teñir las células PP recolectados con los siguientes anticuerpos para detectar PDC murinos que se derivan de los progenitores de forma adoptiva transferidos (CD45.1 +) o ratones receptores (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) y PDCA-1 (FITC) Abs. Realizar análisis de citometría de flujo de células PP como se indica en los pasos 3.9 y 3.10. Identificar PDC por su CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + fenotipo. Números absolutos PDC se pueden determinar por la siguiente ecuación:% PDC x parael número de células tal PP = PP PDC.
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Representative Results
Nuestros resultados muestran la estrategia de activación periódica para el aislamiento de los CDP a partir de células de médula ósea de ratón (Figura 1), como se detalla en los Protocolos 2 y 3. CDP comprenden aproximadamente el 0,1% del total de células de la médula ósea, y aproximadamente 4-6 x 10 4 CDP pueden ser aislados de un ratón. Tras la transferencia adoptiva, CDP se diferencian en PDC y CDC 10.
Figura 1. Estrategia Gating para la purificación de FACS de los CDP. Células de médula ósea se obtuvieron de ratones C57BL6. Células de linaje positivo se agotaron con Abs contra marcadores de linaje (CD3, CD19, CD11b, CD11c, Ter119) utilizando MACS selección microbead mediada. La población de la médula ósea de linaje negativo enriquecido estaba manchada de marcado con fluorescencia Abs para CDP y linaje marcadores y purificados por FACS como se muestra. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para identificar PDC en PP, utilizamos un inicial hacia adelante y estrategia de activación periódica dispersión lateral, seguido por gating para CD11c + células Siglec-H + (Figuras 2A y 2B) IFNAR -. / - Ratones tienen una reducción significativa en PDC en PP con respecto a los ratones de tipo salvaje (Figura 2B) 5. Por el contrario, CD11c + Siglec-H - CDC se encuentran en cantidades similares en ambos genotipos (Figura 2B). Por lo tanto, IFNAR - / - ratones son una oportunidad para examinar PP pDC reconstitución sin efectos de la irradiación letal 5. Por ejemplo, la transferencia adoptiva de los CDP tipo salvaje en IFNAR - / - ratones, tal como se describe en el paso 4, estimula un aumento de la PP PDC (Figura 2B). Por otra parte, el tratamiento previo con Flt3L HGT (paso 1) mejora aún más la expansión PDC en PP (Figura 2B), lo que implica CDP transferidos y la posibilidad endógenos Flt3 + progenitores responder a Flt3L mediante la inducción de PDC PP. Ambas condiciones también estimularon CD11c + Siglec-H - CDC asciende, en consonancia con el origen del desarrollo de los CDC 6. PDC en PP expresan marcadores tradicionales PDC incluyendo PDCA-1, Siglec-H y B220, y carecen de CD11b (Figuras 2B-D) 4,5. Además, el análisis de PP de IFNAR - / - ratones que recibieron tanto Flt3L HGT y transferidos CDP mostraron que la mayoría (~ 70%) de PDC se obtuvieron a partir de donantes (CD45.1 +) ratones (Figura 2E). Colectivamente, estos datos demuestran que la transferencia adoptiva de los CDP induce la población PP PDC en respuesta a las señales mediadas por Flt3L in vivo.
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. Figura 2 Análisis de PP PDC en IFNAR - / - ratones sobre Flt3L HGT y la transferencia adoptiva de los CDP IFNAR -. / - Ratones fueron inyectados por vía intravenosa con 5 g de plásmido de Flt3L codificación o un vector vacío (pORF) por HGT. Dos días más tarde, 10 5 CDP FACS-purificado se transfirieron de forma adoptiva a través de inyección en la vena de la cola. Siete días después de la transferencia de CDP, PP fueron recogidas y analizadas por montos PDC (A, B). CD11c + Siglec-H + PDC en ratones que recibieron los CDP + con Flt3L HGT se analizaron adicionalmente para PHVA-1, B220 (C), CD11b (D), CD45.1 y CD45.2 (E) la expresión. El patrón de expresión de PHVA-1, B220 y CD11b fue similar en PDC en todos los 3 grupos (datosno se muestra). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La técnica de transferencia adoptiva descrito en el presente documento evaluó la contribución de los CDP para la población PP PDC en ratones receptores que son deficientes en PP PDC (por ejemplo IFNAR - / - ratones). En experimentos futuros, será importante evaluar el potencial de otros subconjuntos progenitoras en la generación de PDC PP, en particular, si PDC PP derivan de Flt3 + CLPs. Esta pregunta es importante ya que no queda claro por qué PDC PP son especialmente sensibles a las señales de IFNAR-STAT1 para PP devengo 5, y si PDC PP siguen las señales de desarrollo similares como PDC en otros órganos.
En teoría, este método también puede llevarse a cabo en ratones que carecen de poblaciones PDC en todos los órganos. Por ejemplo, los ratones con deficiencia en el factor de transcripción E2-2, el "regulador maestro" PDC (es decir TCF4 - / - ratones), espectáculo sorprendente PDC agotamiento 19. Sin embargo, TCF4 - / - micrófonoe son embriones letal, y por lo tanto TCF4 - / - necesitaría médula ósea de ratones quiméricos a ser usadas como receptores para los experimentos de transferencia adoptivos. Sin embargo, aún se desconoce si PDC PP son sensibles a la irradiación y se agotarían con eficacia en TCF4 - / - quimeras. Por otra parte, la irradiación letal tiene efectos amplios sobre el sistema hematopoyético y apoyar a las poblaciones del estroma que puedan afectar PP pDC reconstitución. Por lo tanto, el uso de IFNAR - / - ratones, podrían ser preferibles receptores para evaluar la capacidad de adoptivamente subconjuntos progenitoras transferidos a generar PDC PP a TCF4 - / -. quimeras Stat1 - / - ratones también muestran una reducción notable en PDC PP y podrían ser empleados como recipientes para estudios de transferencia adoptiva a orígenes evolutivos estudio PP PDC 5. Una advertencia a la utilización de IFNAR - / - o Stat1 - / - ratones es su estado inmunodeficiente, WHIch podría impactar PP pDC la reconstitución o la función de maneras desconocidas. Por lo tanto, los enfoques independientes para evaluar orígenes evolutivos PP PDC mejorarían la confianza en la interpretación de datos.
Técnicamente, hay que señalar que la población del CDP se encuentra a muy baja frecuencia en la médula ósea total de, por tanto, el agotamiento de las células positivas al marcador de linaje por cromatografía en columna de perlas magnéticas mediada antes de la FACS es importante para la purificación eficiente de las células progenitoras por FACS. Este paso agotamiento enriquece las células de linaje negativo, lo que resulta en menor tiempo FACS (y costo) para la purificación del progenitor. El procedimiento de ozono descrito en este documento utiliza una mezcla de anticuerpos específicos de linaje que se combinan para cada experimento. Comercial cócteles de anticuerpos linaje están también disponibles y se pueden utilizar para la eliminación de células del linaje-positivo, en lugar de la mezcla que se describe. La ventaja del enfoque descrito es su flexibilidad en ser adaptable para DIFfines de agotamiento rentes, mediante el ajuste de los anticuerpos que están presentes en la mezcla.
En la preparación de suspensiones de células individuales de PP, es importante para eliminar la mayor cantidad de tejido intestinal que rodea al PP como sea posible. Esto puede lograrse mediante una cuidadosa disección de la PP. Digestión suficiente de los PP con colagenasa es un paso clave para liberar los leucocitos del tejido intestinal. La técnica de centrifugación en gradiente de densidad de Percoll descrito es un método preferido para enriquecer los leucocitos a partir de muestras de PP digeridos. Además, es importante señalar que la proteína marcadora PDC PHVA-1 puede ser regulado por IFN de tipo I y otros estímulos 20. Por lo tanto, Siglec-H se prefiere como un marcador de PDC para los estudios que implican la manipulación de citoquinas.
El uso de HGT tiene una clara ventaja en términos de ser altamente rentable. Mientras Flt3L HGT se utilizó en este estudio, la capacidad de otras citoquinas o factores solubles en el regPDC ulate PP podrían ser probados utilizando HGT, en la ausencia o presencia de la transferencia adoptiva de células de progenitores hematopoyéticos. Sin embargo, HGT resulta en la producción sostenida de citoquinas a partir del plásmido transferidos frente a los aumentos más transitorios observados durante la inyección de citoquina recombinante, que dependen de citoquina-vida media 5,13. La elevación prolongada de citoquinas circulantes puede no reflejar cantidades fisiológicas alcanzados durante las respuestas hematopoyéticas de emergencia o de infección. Esta advertencia debe tenerse en cuenta durante las fases experimentales de planificación y evaluación de los datos.
En trabajos futuros, la manipulación selectiva de la población PP pDC, como se describe en este documento, puede ayudar en el tratamiento de la función PP PDC. PDC PP están condicionadas por los mediadores presentes en el medio ambiente de la mucosa y son deficientes en la producción de IFN de tipo I a TLR 4,5 activación. Análisis de PDC PP reconstituido dentro Stat1 - / - ratones demostró estos CElls tienen una baja capacidad comparable para inducir IFN tipo I en TLR9 activación con respecto al PDC PP que surgen de forma natural (no se muestra), lo que indica PDC PP derivados de los CDP transferidos retener al menos esta propiedad de los recursos naturales PP PDC. El tipo reducido I IFN producción de PP PDC contrasta con el tipo I IFN robusta secreción de otras poblaciones de PDC y plantea una pregunta sobre el papel funcional de los PP PDC. Por otra parte, PDC PDC PP se asemejan que se desarrollan en la presencia de IFN de tipo I, una población PDC que demuestra la estimulación eficaz de IL-17 de producción de linfocitos T CD4 + (células Th17) 5. Mientras que las células Th17 son ampliamente considerados como una población inflamatoria que induce, tienen ambas funciones de protección y de patógenos en el intestino 21. Por otra parte, se ha informado de PDC para mediar la tolerancia sistémica de antígeno administrado por vía oral 15. El papel de PDC PP en la inmunidad local y sistémica es de gran interés, como la comprensión de este punto puede revelar new enfoques para manipular las respuestas inmunes e inflamatorias intestinales en la terapia de la enfermedad.
En conclusión, el método que aquí se presenta permite la evaluación del potencial de desarrollo de subconjuntos progenitoras hematopoyéticas para generar PP PDC. Este procedimiento proporciona ratones con PDC PP reconstituidas. Por lo tanto, este enfoque puede ser utilizado no sólo para la evaluación de PP PDC orígenes hematopoyéticas sino también para la comprensión de la contribución de PDC PP a las funciones inmunes en el ambiente intestinal.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a los Dres. Alex Gelbard y Willem Overwijk para el asesoramiento sobre la transferencia génica hidrodinámica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (AI098099, SSO), el Centro MD Anderson para el Cáncer de la epigenética, el Centro MD Anderson para la Inflamación y Cáncer (SSW), y el Fondo RE Bob Smith Educación (HSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml Conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat anti-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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