Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Проточной цитометрии на основе анализа на мониторинге NK клеточных функций

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54615
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

Простой и надежный метод описан здесь, чтобы проанализировать множество функций NK-клеток, таких как дегрануляции, цитокина и производство хемокинов в различных подмножеств NK-клеток.

Introduction

В рамках врожденной иммунной системы естественных киллеров (NK) клетки способствуют первой линии защиты от инфицированных вирусом или злокачественно трансформированных клеток. Система ингибирующих и активирующих рецепторов позволяет им различать между здоровыми и трансформированные клетки без предварительного антигена затравки в отличие от Т-клеток. При столкновении клетки - мишени NK - клетки высвобождают содержание своих цитотоксических гранул (например, Перфорин, гранзимы) в иммунной синапса , чтобы убить свою цель. Кроме того, NK - клетки вырабатывают и выделяют различные виды цитокинов (например, интерфероном гамма: IFN-γ, фактор некроза опухоли-α: TNF-α) и хемокинов (например, макрофагальный воспалительный белок-1β: MIP-1) по клетке - мишени взаимодействие или цитокин стимуляция 1.

Достаточные функции NK-клеток, такие как цитотоксичность, хемокинов и продукции цитокинов оказывают значительное влияние на судьбы различных дисоблегчает. Больных лейкемией показывают увеличение частоты рецидивов , если они демонстрируют дефектный профиль NK клеток на момент постановки диагноза , состоящий из сокращения производства IFN-gamma и снижением экспрессии активации клеточных рецепторов NK 2. Раннее восстановление числа клеток NK и функции , включая выработку цитокинов при взаимодействии клетки - мишени связано с уменьшением рецидивов и улучшение выживаемости у пациентов , получающих аллогенной трансплантации стволовых клеток 3. Кроме того, после начала терапии интерфероном у больных , инфицированных вирусом гепатита С дегрануляция способность периферических клеток NK в начале ответчиков сильнее , чем в неответчиков 4. Числа NK клеток (> 80 / мкл) на 15 -й день после аутологичной трансплантации стволовых клеток (autoSCT) у пациентов , страдающих от лимфомы или множественной миеломы являются прогностическими улучшенной прогрессии и общей выживаемости 5. У пациентов с меланомой экспрессия Т-клетки immunoglobulin- и муцин-домен-containinг молекула-3 (ТИМ-3), иммунное-регулирующий белок на клетках NK, коррелирует со стадией заболевания и прогнозом 6.

Ученые контролировали функции NK-клеток на протяжении последних десятилетий. Первоначальный анализ клеточной цитотоксичности NK против опухолевых клеток без предварительного грунтования была адресована с помощью анализа 7 51 Cr-релиз. Совсем недавно ученые разработали нерадиоактивного метод оценки цитотоксичности NK расширенных клеток 8. Цитокина и хемокина производство было часто оценивали с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) методы 9,10. В последние десятилетия эти методы были дополнены с помощью проточной цитометрии анализов на основе. Применение ингибиторов белка переноса (например, брефелдин А и монензин) и методы проницаемости клеточной мембраны в сочетании с протоколами обычного поверхностного окрашивания позволили ученым изучать хемокинов и производство цитокинов в различной удельной лимфыocyte подмножества (например, T, B или NK - клетки) 11. Кроме того, различные проточная цитометрия на основе анализы были разработаны для контроля Т и NK-клеток, цитотоксичность. В 2004 году Альтер и др. Описали поверхностную экспрессию лизосом-ассоциированный белок CD107a (ЛАМПА1) на NK - клетках , на клетки - мишени столкновения в качестве маркера дегрануляции цитотоксических гранул 12. Так как широкий спектр различных люминофоры и цитометров многоканальными доступны в наши дни, это стало возможным одновременно контролировать различные функции клеток NK (цитотоксичность, цитокинами и производства хемокин) в различных подмножеств NK-клеток. Это становится особенно важным в ситуациях , когда размер выборки ограничен, например, в биопсий или образцах крови пациентов , страдающих от лейкопении.

Чтобы проверить глобальные функции NK клеток, различные анализы потока цитометрии на основе могут быть эффективно объединены. Theorell и др. , Стимулированные NK - клетки от АЭМдоноры lthy с опухолевой клеточной линии К562 и анализировали NK - клеток дегрануляцию, изнутри наружу сигнала и хемокинов производства с помощью проточной цитометрии 13. Недавно подгруппы NK клеток, фенотип и функции у больных опухолей во время autoSCT были проанализированы с помощью проточной цитометрии анализов на основе. Было показано , что NK - клетки были способны degranulate и продуцируют цитокины / хемокины при обнаружении опухолевых клеток в очень ранние моменты времени после того, как autoSCT 11.

Здесь протокол описан для оценки функции клеток NK при взаимодействии с опухолевыми клетками, включая емкость дегрануляции, хемокинов и продукции цитокинов с помощью проточной цитометрии на основе анализа, что дает возможность контролировать функции NK-клеток в различных подмножеств одновременно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Данное исследование было проведено в соответствии с рекомендациями местных комитета по этике Университета Франкфурта.

1. Культивирование клеток К562

  1. Культуры клеток К562 в R10 средах (RPMI 1640 с глютамином среды, 1% пенициллина / стрептомицина, 10% фетальной сыворотки теленка) при плотности 0,5-1 х 10 6 клеток на мл в клеточной культуральной колбе при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  2. Урожай К562 24 ч до начала нового эксперимента.
    1. Удалить клеточную культуральную колбу, содержащую клетки К562 из инкубатора. Повторное приостановить К562 клеток в культуральной среде, осторожно пипеткой вверх и вниз.
    2. Передача культуральной среды, содержащей клетки К562 в 15 или 50 мл трубки и осаждения клеток при 400 х г в течение 8 мин. Удалите супернатант и вновь приостановить клетки в 5 мл R10 СМИ и хорошо перемешать.
    3. Передача 20 мкл раствора клеток в лунку 96-U-луночный планшет. Добавьте 20 мкл трипанового синего ихорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 5 раз. Внесите 10 мкл раствора в камеру подсчета клеток и подсчета клеток.
    4. Гранул клетки при 400 х г в течение 8 мин. Повторное приостановить клетки в R10 СМИ и регулировать концентрацию K562 клеток до 0,5-1 × 10 6 клеток на мл.
    5. Инкубируйте клеток K562 в клеточной культуральной колбе при температуре 37 ° С и 5% CO 2 до использования.

2. Выделение NK-клеток

  1. В соответствии с утверждением и руководящими принципами местным комитетом по этике, получить письменное согласие здорового донора или пациента перед сбором 6-10 мл либо EDTA или гепарином периферической крови.
  2. Хранить реагенты для выделения клеток NK при 4 ° С до начала эксперимента и затем использовать их при комнатной температуре (RT) в стерильных условиях. Изолировать ЕКК из периферической крови с использованием магнитных микрогранул и специфический магнит для выделения клеток в соответствии с тон инструкции изготовителя.
    1. Развести один флакон лиофилизированного NK клеток коктейль антител отрицательной изоляции пипеткой 7,5 мл предоставленного буфера А (входит в комплект изоляции клеток NK) во флакон. Осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз 3-4 раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что суспензия однородна перед каждым использованием.
    2. Приготовьте коктейль окончательное решение путем смешивания соответствующих объемов восстановленного гранул из стадии 2.2.1 и буфера В (входит в комплект изоляции NK клеток). Для определения этих объемов, определяют объем образца цельной крови в мл в объеме = 1,0. Используйте 0,25 объемов разведенном осадке (с этапа 2.2.1) и 0,25 объемами буфера В обрабатывать 1 объем цельной крови.
    3. Перенести смесь в соответствующую пробирку, содержащую образца цельной крови. Не пипеткой вверх и вниз, чтобы избежать потери крови внутри пипетки. Вместо этого закройте трубку и перемещайте его осторожно вверх и вниз, пока suspenSion является однородным. Не вихрь.
    4. Далее гомогенизировать образец с использованием трубки ротатор в течение 5 мин при комнатной температуре.
    5. В стерильных условиях, снимите крышку и поместите трубку в магнитный сепаратор в течение 15 мин в соответствии с рекомендациями производителя. Убедитесь, что метки трубка обращена к задней стороне магнита, чтобы обеспечить бесперебойную видимость разделительной линии. Не перемещайте магнит в процессе разделения, так как эта процедура будет нарушена.
    6. Тщательно передачи супернатант в новую 15 мл трубки и заполняют с полной медиа (СМ, кроветворной СМИ клеток, 1% пенициллина / стрептомицина, 5% сыворотке крови человека). Гранул клетки при 400 х г в течение 8 мин.
      1. Дополнительно: Если осадок красного цвета, повторно приостанавливать клеток в 1 мл эритроцитарной буфера для лизиса (например, 1 мл аммоний-хлорида-калия (ACK) лизирующего буфер: 155 мМ NH 4 Cl, 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ КНСО 3 в 1 л дистиллированной воды (DW)) и инкубируют в течение 8 минут при комнатной температуре. В качестве альтернативы, используйте эрythrocyte истощение комплект.
        Примечание: Имейте в виду, что использование буфера ACK может отрицательно воздействовать на функции 14 NK клеток.
      2. Быстро разбавить буфер ACK путем добавления, по меньшей мере, 1 мл CM, чтобы остановить лизиса и центрифуге при 400 мкг в течение 8 мин для осаждения клеток.
    7. Повторное приостановить осадок клеток в 1 мл CM и продолжить разметку. Перенесите 20 мкл раствора NK клеток на 96-U-луночный планшет. Добавьте 20 мкл метиленового синего в каждую лунку и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 5 раз. Внесите 10 мкл раствора в камеру подсчета клеток и графа клеток. В качестве альтернативы, используют 30 мкл неразбавленного клеточной суспензии для подсчета с помощью коммерчески доступного счетчика клеток.
    8. Отрегулировать клетки в концентрации , по меньшей мере , 2 х 10 4 NK клеток на 100 мкл CM.
    9. Произвести поверхностное антитело окрашивание изолированной популяции NK клеток для проверки чистоты с использованием проточного цитометра.
      1. Prepare решение специальной смеси путем смешивания объемов указанных антител в соответствии с таблицей 1.
      2. Повторное приостановить клеток в 88,5 мкл буфера для промывки (WB, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 0,1% NaN 3 в PBS) и добавляют 11,5 мкл раствора основной смеси. Инкубируйте клетки в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
        Внимание: NaN 3 является токсичным и мутагенным. Обращайтесь с ним, соответственно, к соответствующему Паспорте безопасности (MSDS).
      3. Добавьте 1 мл WB и осаждения клеток при 400 мкг в течение 4 мин.
      4. Повторное приостановить клеток в 300 мкл буфера для окрашивания плюс DAPI. Приобретать клеток с использованием проточного цитометра.
        Примечание: Продолжать дальше с экспериментом, только если степень чистоты NK-клеток составляет по меньшей мере 80% всех живых лимфоцитов.

3. Сбор клеток K562 для стимуляции клеток NK

  1. Удалите культуры клеток колбу, содержащую клетки К562 (со стадии 1.2) из-й е инкубатор. Повторное приостановить К562 клеток в культуральной среде, осторожно пипеткой вверх и вниз.
  2. Передача всей культуральной среды в 15 или 50 мл трубки и осаждения клеток при 400 мкг в течение 8 мин. Жидкость над осадком сливают и вновь приостановить клетки в 5 мл фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) и хорошо перемешать.
  3. Передача 20 мкл раствора клеток в лунку 96-U-луночный планшет. Добавьте 20 мкл трипанового синего и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 5 раз. Внесите 10 мкл раствора в камеру подсчета клеток и подсчета клеток. В качестве альтернативы используют 30 мкл неразбавленного клеточной суспензии для подсчета с помощью коммерчески доступного счетчика клеток.
  4. Гранул клетки при 400 х г в течение 8 мин. Повторное приостановить клеток в КМ при концентрации по крайней мере , 2 х 10 4 клеток К562 на 100 мкл среды.
    Примечание: Используйте тот же К562 и концентрации NK клеток для того, чтобы инкубировать как на эффектор: мишень (Е: Т) соотношение 1: 1, в дальнейшем.
"> 4. Стимулирование NK-клеток с опухолевыми клетками K562 Line и цитокины

  1. Аккуратно смешайте клетки с помощью пипетки их вверх и вниз, по крайней мере в 5 раз. Распределить 100 мкл / лунку раствора NK клеток в необходимые лунки 96-V-луночного планшета.
    1. Используйте по крайней мере две скважины для каждого донора, один с и один без стимула (например, К562 опухолевых клеток и цитокинов). Всякий раз , когда это возможно, выполнить эксперимент по крайней мере , в двух экземплярах и добавить положительного контроля (например, форбол 12-миристат 13-ацетата (РМА) и Ionomycin; конечная концентрация: 50 нМ РМА, 1 мкМ иономицина на лунку). Подготовить обновленный проточной цитометрии компенсации за день эксперимента.
      Примечание: Титруйте антитела Перед использованием (обсуждение см).
  2. Выключить свет и добавить анти-CD107a антитела (2 мкл, конечная концентрация: 1: 100) в каждую лунку с клетками NK на 96-V-луночного планшета.
  3. Аккуратно перемешайте клетки К562 с помощью пипетки их вверх и вниз вне менее 5 раз.
    1. Из лунок, содержащих анти-CD107a раствор антител NK клеток /, определить те из них, запланированные для стимуляции клеток К562. Добавьте 100 мкл / лунку раствора К562 клеток в лунки. Тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 5 раз.
    2. Добавить интерлейкин-2 (ИЛ-2, конечная концентрация 100 Ед / мл) и интерлейкин-15 (ИЛ-15, конечная концентрация 10 нг / мл) в лунки, содержащие клетки К562 и раствор антител NK-клеток / анти-CD107a.
      1. Необязательно: Проверьте влияние либо клеток К562 или цитокинами один на распределенных NK-клеток, чтобы расшифровать индуцированный опухолью по сравнению с цитокин-индуцированной функции NK-клеток.
    3. Определение скважин на 96-V-луночного планшета запланирован как отрицательный контроль без стимула. Добавить 100 мкл / лунку CM эти лунки, содержащие только раствор антител NK клеток / анти-CD107a. Тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 5 раз.
      1. Дополнительно: Для получения положительного контроля, добавьте 100 мкм; Л СМ, содержащий РМА и Ionomycin (конечная концентрация: 50 нМ PMA, 1 мкМ иономицин на лунку) в лунку с раствором антитела NK клеток / анти-CD107a.
  4. Инкубируйте клетки в течение 3 часов в темноте при 37 ° С и 5% CO 2.
  5. Готовят раствор белка ингибитора транспортировки (например, брефелдин А и / или монензин) в СМ. После 1 часа инкубации, добавьте раствора в каждую лунку 96-V-луночный планшет со светом выключен (конечная концентрация: 0.5-1μM брефелдин А и 2-3 мкМ моненсин). Тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 5 раз. Продолжить инкубации в течение оставшегося 2 ч.

5. Поверхностные и внутриклеточное Окрашивание

  1. После инкубационного периода 3 ч, смешать клетки в лунки 96-V-луночный планшет, осторожно пипеткой вверх и вниз, по крайней мере в 5 раз, и передавать их в проточной цитометрии трубок. Добавить 1 мл / трубки WB. Гранул клетки при 400 мкг в течение 4 мин,
    1. Дополнительно: Перед тем как центрифугирование промыть лунки с 100 мкл / лунку PBS, с целью оптимизации восстановления клеток, с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 5 раз, прежде чем перенос клеток в соответствующие FACS трубки.
  2. Удалите супернатант и продолжить с поверхностью окрашиванию.
  3. Включите амин-реактивным флуоресцентный краситель, который не является проникающего живых клеток с максимумом излучения 423 нм в качестве фиксируемой мертвого маркера клеток (DCM). Выполните окрашивание ранее (см ниже) или параллельно с поверхностью антитела окрашивания в зависимости от типа DCM используется.
    1. Повторное приостановить клеток в 99 мкл / трубки PBS и добавляют 1 мкл / пробирку из фиксируемой DCM (конечная концентрация: 1: 100). Смешайте клетки хорошо, используя вихревой и инкубировать их в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    2. Приготовьте раствор специальной смеси путем смешивания «поверхности» антител , перечисленных в таблице 2 (см окрашивания шаг столбец выделен синим цветом). Используйте в системупоказаны, Volumes / трубки и умножать их с количеством проточной цитометрии трубок окрашиваться.
    3. После инкубации возьмите проточной цитометрии пробирки с клетками и добавить 1 мл / трубки WB. Гранул клетки при 400 мкг в течение 4 мин.
    4. Жидкость над осадком сливают, вновь приостановить клеток в 84 мкл / пробирку WB и добавить 16 мкл / пробирку раствора основной смеси. Смешайте клетки хорошо с помощью вихря. Инкубируйте клетки в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
    5. Через 20 мин добавляют 1 мл / пробирку WB и гранул клетки при 400 мкг в течение 4 мин.
  4. Жидкость над осадком сливают и вновь приостановить клетки в 100 мкл / пробирку раствора холодного фиксации (например, 2% (конечная) параформальдегид или формальдегид). Смешайте клетки хорошо с помощью вихря. Инкубируйте клетки в течение 10 мин при 4 ° С в темноте.
    1. Пятно клетки для внутриклеточных цитокинов / хемокинов после этого шага или хранить их в течение ночи при температуре 4 ° С в WB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации в течение ночи, низшая восстановления клеток может произойти.
  5. Вымойте клеток в 1 мл трубки WB / при 400 мкг в течение 4 мин и приступить к стадии пермеабилизации.
  6. Подготовьте пермеабилизирующего буфера (PB) (например, 0,2% сапонина, 1% -ный раствор BSA в PBS).
  7. Вымойте клетки дважды в 1 мл / трубки ПБ при 400 мкг в течение 4 мин. Продолжить с внутриклеточного окрашивания.
    Внимание: сапонины потенциально раздражает. Обращайтесь с ним, соответственно, к соответствующему Паспорте безопасности (MSDS).
  8. Приготовьте раствор специальной смеси с использованием указанных "внутриклеточные" объемы антител в таблице 2 (выделен зеленым цветом). Перемножить эти объемы с количеством труб, чтобы окрасить.
    1. Повторное приостановить клеток в 90 мкл трубки PB / и применить 10 мкл / пробирку раствора антител основной смеси. Хорошо перемешать с помощью вихря и инкубировать клетки в течение 30 мин при 4 ° С в темноте.
  9. Вымойте клетки дважды в 1 мл / трубки ПБ при 400 мкг в течение 4 мин.
  10. Жидкость над осадком сливают и вновь приостановить клетки в 400 мкл / трубки PB. Смешайте клетки хорошо с помощью вихря. Поместите клетки на льду в темноте до измерения.

6. Проточная цитометрия Компенсация и приобретение

  1. Выберите каналы для различных флюорохромами (таблица 2) в проточной цитометрии программного обеспечения сбора в папке установки параметров. Кроме того, выбрать каналы для FSC-A и -Н, а также для SSC-A и -Н.
  2. Загрузите матрицу, созданную для компенсации выбранных параметров в файл приобретения.
    1. Создать матрицу коррекции с использованием выделенных клеток NK с этапа 2.2.8, выполняя один цветной краситель для каждой используемой флуорохромом (смотри таблицу 2). Используйте протокол поверхностного окрашивания, описанные в шагах 5.1-5.4. Включите неокрашенной управление (без каких-либо антител), а также средства управления изотипные и / или флуоресценции минус один контроль (FMO).
      Примечание: В качестве альтернативы компенсации на основе клеток, используют IgG-связывающие бусин в качестве контролей компенсации.
    2. Поместите каждую пробирку для единичных образцов штамме и образец без антител в нагнетательную образец порт (SIP). Нажмите на кнопку "запись" в программном обеспечении сбора цитометрии потока и приобрести номер ячейки , по меньшей мере , 5 × 10 3 NK клеток на образце.
    3. Используйте приложение расчета компенсации в цитометрии приобретения программного обеспечения для создания матрицы компенсации.
  3. Создать точечные участки для идентификации популяции клеток NK.
    1. Определение отдельных клеток с использованием FSC-A / FSC-H и SSC-A / SSC-H точечные участки. Нажмите на кнопку "многоугольник ворота". Нарисуйте ворота вокруг клеток, которые имеют линейную картину распределения в обоих графиках точки. Дважды щелкните на воротах, чтобы открыть новый точечный участок.
    2. Выберите FSC-A / SSC-точечным участок для идентификации лимфоцит/ NK клеточной популяции (см рисунок 1). Нарисуйте многоугольник ворота вокруг него и дважды щелкните на воротах.
  4. Поместите каждую пробирку из анализа стимуляции клеток NK в SIP. Нажмите на кнопку "запись" и приобрести номер ячейки , по меньшей мере , 5 × 10 3 NK клеток на образце.

7. Анализ и статистика

  1. Откройте проточной цитометрии программы программного обеспечения для анализа. Нажмите на кнопку загрузки образца, чтобы открыть нестимулируемых контрольного образца.
  2. Создание литниковой системы для различных NK клеточных популяций (рисунок 1).
    1. Нажмите на кнопку точечный участок для создания / SSC-Участок FSC-A. Нажмите на кнопку затвора прямоугольника и нарисуйте прямоугольник ворота над всеми событиями с A-ЛПС значение> 5 × 10 4 , чтобы исключить мусор. Откройте ворота с помощью двойного щелчка на воротах.
    2. Выберите снова параметры FSC-A / SSC-А, в пределах нового точечного участка и нажать на кнопку затвора многоугольник. Dсырые многоугольник ворота вокруг популяции лимфоцитов (см рисунок 1). Откройте ворота.
    3. Выберите SSC-Параметр / SSC-H для нового точечного участка и нарисовать многоугольник ворота вокруг всех единичных клеток. Отдельные клетки демонстрируют линейное распределение по параметрам FSC-A / FSC-H и ССК-А / SSC-H (см рисунок 1). Откройте ворота, дважды щелкнув на нем.
    4. Повторите шаг 7.2.3 с использованием параметров FSC-A / FSC-H на этот раз.
    5. Используйте CD45 параметров и дампа канала (CD3, CD14; CD19; DCM), чтобы исключить мертвые клетки. Нарисуйте прямоугольник ворота вокруг всех CD45 положительным и Dump канала отрицательных клеток. Откройте ворота с помощью двойного щелчка на воротах.
    6. Определить все население NK клеток при помощи CD56 и дамп параметров канала. Создайте прямоугольник ворота вокруг да около CD56 положительным и Dump канала отрицательных клеток. Откройте ворота, дважды щелкнув на нем.
    7. Нарисуйте прямоугольник вокруг ворота все три подмножества NK клеток в пределах CD56 / CD16 точка сюжета. язьntify различные подмножества как CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + и CD56 + подмножеств CD16 ++ NK - клеток.
  3. Анализ NK клеточных функций для каждой ячейки Subset Индивидуальный НК.
    1. Нажмите на одну из трех NK-клеток подмножества ворот, чтобы открыть его. Создание трех различных участков ДОТ для CD56 / CD107a, CD56 / IFN-gamma и CD56 / MIP-1.
    2. Нарисуйте прямоугольник ворота для CD56 положительных клеток, которые являются положительными , а также для CD107a, IFN-gamma или MIP-1 соответственно (см рисунок 1).
    3. Повторите шаг 7.3.1-7.3.2 для каждого оставшегося NK клеток подмножества.
  4. Повторите шаг 7.2 и 7.3 для всех стимулированных образцов. Сохранить все статистические значения каждого отдельного образца нажав на кнопку статистики, экспортирующих в рамках программного обеспечения для анализа.
  5. Откройте файлы, содержащие статистические значения отдельных образцов для анализа функции NK-клеток. Выберите значения для отдельной клетки NKподмножества (например, CD56 ++ CD16 - NK - клетки), скопировав их в другой файл.
    1. Вычесть процент CD107a положительный NK клеток, которые не были обработаны с раздражителем, от процентного содержания CD107a положительных клеток NK, которые были обработаны с раздражителем.
      Примечание: Использование результата, чтобы продемонстрировать способность дегрануляции этой конкретной субпопуляции NK в ответ на раздражитель.
    2. Повторите шаг 7.5.1 для IFN-gamma и MIP-1ß-положительных NK-клеток, чтобы продемонстрировать цитокинов и хемокинов производства в ответ на стимул.
    3. Повторите шаг 7.5.1-7.5.2 для каждого оставшегося NK клеток подмножества, чтобы оценить их способность дегрануляцию и производство цитокинов / хемокинов при стимуляции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Стратегия стробирования для анализа дегрануляцию, цитокина и хемокина производство всей популяции клеток NK и трех различных подмножеств NK клеток показаны на рисунке 1.

Типичные результаты одного здорового донора, показаны на рисунке 2. NK - клетки без какого - либо стимула производства ни IFN-gamma , ни MIP-1 и не выражали CD107a на их поверхности (рис 2А). В противоположность этому, NK-клетки, стимулированные с опухолевыми клетками и цитокинов, продуцируемых значительное количество внутриклеточного IFN-gamma и MIP-1. Кроме того, более 20% из них дегранулированных при взаимодействии опухолевых клеток , обозначенном выражающий CD107a на их поверхности (фиг.2с). РМА и Ionomycin стимуляции использовали в качестве контроля (Фигура 2В).

е 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54615 / 54615fig1.jpg "/>
Рисунок 1:. Стробирования стратегии Последующие ворота построены. Во-первых, мусор исключены в / SSC-A участка FSC-A. Затем лимфоциты идентифицированы и дублеты, исключаются с использованием двух участков с SSC-A / SSC-H и FSC-A / FSC-H. После этого ворота , включая все CD45 + клеток и за исключением всех мертвых, CD3 +, CD14 + и CD19 + клеток устанавливается путем построения графика CD45 / Dump канал. Затем клетки NK обозначаются стробирования на CD56 + клеток. Участок с CD56 / CD16 может быть использован для идентификации основных подмножеств NK клеток. И, наконец, в пределах всей популяции NK-клеток, функциональные маркеры идентифицированы путем нанесения CD56 по сравнению с CD107a, IFN-gamma и MIP-1, соответственно. Это может быть сделано , а также для всех различных видов подмножеств NK - клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 2:. Типичные результаты от одного здорового донора NK клеток с использованием стратегии стробирования , описанную на рисунке 1, NK - клеточные функциональные маркеры , такие как CD107a (для дегрануляции), ИФН-γ и MIP-1β могут быть идентифицированы. В левой колонке (А) показаны результаты , с использованием клеток NK в отсутствии стимула. В средней колонке (В) показывает результаты в присутствии положительного контроля РМА / иономицином. В правой колонке (С) представляет результаты для клеток NK , стимулированных опухолевых клеток линии К562 и в присутствии цитокинов IL - 2 (100 ед / мл) и IL-15 (10 нг / мл). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть увеличенная версия этой фигуры.

Таблица 1: Антитела для проверки чистоты.

Таблица 2
Таблица 2: Антитела для вне- и внутриклеточного окрашивания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный метод является простым, быстрым и надежным подход к изучению функций NK-клеток из образцов цельной крови здоровых доноров или пациентов. Этот метод дает большое преимущество , чтобы непосредственно очищению ЕКК из цельной крови, избегая больших затрат времени центрифугирования в градиенте плотности, который является обязательным для многих других методов очистки 15. Кроме того, она требует меньшего объема выборки по сравнению с "классическим" изоляции NK клеток / обогащения методами, что делает его подходящей альтернативой для образцов педиатрических и / или иммуно-дефицитных пациентов. Этот протокол может быть использован для получения базальных значений NK клеточных функций экс-естественных условиях, но она также позволяет дальнейшую культуру НК и расширение, будучи, таким образом , дополняют друг друга с другими методами , ранее описанным 8. Тем не менее некоторые важные шаги должны быть приняты во внимание. Поскольку анализ основан на вне- и внутриклеточного окрашивания антител, крайне важно, чтобы определить оптимальное гореочий концентрацию для каждого антитела в первую очередь. Специально для внутриклеточного окрашивания, тщательная оценка используемых антител настоятельно рекомендуется. Хороший подход заключается в проверке серии разведений используемого антитела (например, 1: 100 до 1: 12,5) в суспензии клеток , стимулированной или без РМА / иономицином. В дальнейшем соотношение положительных событий между вынужденными и ООН-стимулированной образцов рассчитаны и построены. Разбавление антитела с самым высоким положительным передаточным отношением переключения складка (лучшее отношение сигнала к фону) следует использовать для дальнейших экспериментов 16. Кроме того, использование элементов управления, как isotype- и FMO управления может оказаться правильно иметь фундаментальное значение, особенно для внутриклеточного окрашивания, чтобы ворота на популяции положительных клеток.

Тем не менее, есть некоторые важные недостатки описанного способа. Выражение CD107a является маркером дегрануляции и, следовательно, лишь косвенно указывает на клеточную цитотоксичность NK. NK цитотоксичностий емкости дегрануляция могут быть разными. Повышающей регуляции в аутофагии в опухолевых клетках приводит к деградации секретируемого гранзимом и уменьшает гибель клеток при взаимодействии клеток NK 17. Поэтому дополнительный ДХМ (например, расщепляется каспазы 3) могут быть добавлены к панели окрашивания, чтобы контролировать события клеточной гибели в пределах клетки - мишени 18. Кроме того, клетка цитотоксичность НК находится под влиянием количества цитотоксических белков в составе их гранул (например, перфорина, гранзимом), которая может быть определена количественно с помощью внутриклеточного окрашивания 19,20.

Кроме того, существуют различные возможности для изменения протокола. Вместо изолированных клеток NK, могут быть использованы мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС). Хотя надо иметь в виду, что абсолютное количество клеток NK в популяции PBMC отличается между различными донорами и даже между образцами, полученными из того же донора в разные моменты времени. клетка degranul NKключает сильно зависит от Е: отношение Т. Для того чтобы сравнить функции NK-клеток между разными донорами или в различные моменты времени, абсолютное число NK клеток в популяции PBMC следует использовать для установления постоянного E: отношение Т во всех экспериментах. Если функции NK - клеточные контролируются в различные моменты времени в пределах того же донора, МНПК могут быть заморожены , и анализ может быть сделано сразу для всех разные моменты времени с тем , чтобы уменьшить между экспериментальными вариации 11.

Поскольку окрашивания панелей до 18 цветов возможны, анализ функций NK клеток может быть расширена до гораздо более подробно. Использование дополнительных поверхностных маркеров CD57, в том числе NKG2A и клеток-киллеров иммуноглобулин подобных рецепторов (Кирс), далее клеточные подмножества NK могут быть идентифицированы. Образованные клетки NK, экспрессирующие по крайней мере один чувство собственного KIR degranulate сильнее при взаимодействии с клетками K562, чем необразованные NK клеток. В отличие от этого , более дифференцированы CD57 + CD56 + - CD56 + NK - клеток 21. Кроме того, другие маркеры функции NK-клеток, могут быть решены. LFA-1, является важной молекулой адгезии для NK клеток и выражается в его открытой конформации при активации NK-клеток. Это так называемый "изнутри-наружу сигнал" является ранним NK клеток маркер активации 22.

Наконец, стимулы для тестирования функций NK-клеток могут быть изменены, а также. В нашем опыте свежевыделенные клетки NK только degranulate плохо при взаимодействии К562 клеток, если не добавлять цитокины. Использование свежеизолированных МНПК без дополнительного добавления цитокина обойти эту проблему, из-за влияния байстэндер клеток. Кроме того, продукция цитокинов, особенно IFN-γ и TNF-α, может быть инициировано на IL-12 и IL-18 стимуляции 23. производство IFN-γ в пределах подмножеств NK клеток может отличаться в зависимг на используемом раздражитель (cytokine- по сравнению с мишенью-индуцированной стимуляции) 24. Кроме того, вместо того чтобы использовать К562 качестве клеток - мишеней, первичные опухолевые клетки , полученные от пациентов с опухолевыми могут быть использованы для того , чтобы проверить функции клеток NK против аутологичных опухолевых клеток , до или во время иммуномодулирующего терапии (например, препарат моноклональных антител или иммунно-модулирующим препаратов (IMiDs)).

В течение последних нескольких лет, поле иммунотерапии стремительно развивается с клинической апробации иммунных ингибиторов контрольных точек (например, ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab) 25 и успешные испытания с использованием генетически модифицированного рецептора химерного антигена (CAR) -expressing Т - клеток , а также в качестве клеток - CAR-NK (обзор в ссылке 26), для лечения гематологических больных 27 опухолей. Поэтому NK клеток на основе иммунотерапии становится все больше и больше в центре внимания. Анти-CD20 антитела были большим успехом в обработкнт злокачественных лимфом в течение последних двух десятилетий 28. Подавляющее большинство клеток NK выражают сродство Fc рецептора CD16 низкий, позволяющий клеткам распознавать и убивать клетки-мишени антител меченных (антитело-зависимой клеточной цитотоксичности - ADCC). Способность антитела вызывать функции NK - клеток могут быть испытаны в пробирке с использованием описанного протокола 29. Terszowski и др. ADCC проанализированных клеток NK 'против линии B лимфобластоидная клеток с использованием различных клинически утвержденных анти-CD20 антитела. В то время как ADCC индуцируется при терапии ритуксимабом (первая клинически одобрено анти-CD20 антитело , 30) отрицательно влияют взаимодействия / HLA KIR, этот эффект не наблюдался при использовании obinutuzumab (новый glycoengineered тип II CD20 моноклональное антитело) 31, 32. Кроме того, функции NK - клеток под влиянием различных новых противоопухолевых препаратов , таких как ИМИД леналидомид 33 и различных тирозин-KINASингибиторы е (ИТК) 34. В настоящее время специфические ингибиторы контрольных точек NK клеток тестируются в клинических испытаниях. Примерами являются использование анти-КИР 35,36 или анти-NKG2A антител (NCT02331875), а также активирующих агонистов , таких как анти-CD137 антитела (NCT01775631; NCT02110082).

Важно отметить, что адоптивный перенос НК клеток была выполнена в множестве различных злокачественных заболеваний , с многообещающими клинические эффекты 37. С целью выбора лучшего донора, функции NK клеток против опухоли пациента могут быть испытаны в пробирке , используя образцы крови у потенциальных доноров NK - клеток.

Таким образом, описанный протокол предназначен для анализа различных функций натуральных киллеров у здоровых доноров или пациентов. Эти функции могут быть проверены в различных подмножеств клеток NK на различные раздражители в выбранные моменты времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0.4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

Tags

Иммунология выпуск 116 NK-клетки CD107a цитотоксичность функция IFN-gamma MIP-1 клетки К562
Проточной цитометрии на основе анализа на мониторинге NK клеточных функций
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, … More

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter