Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Разделение эпидермиса и дермы крыс термолизином для обнаружения сайт-специфической воспалительной мРНК и белка

Published: September 29, 2021 doi: 10.3791/59708
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, Oklahoma State University Center for Health Sciences, 2Institute for Shock Physics, Washington State University
* These authors contributed equally

Summary

Здесь представлен протокол отделения эпидермиса от дермы для оценки выработки медиатора воспалительного средства. После воспаления эпидермис задней лапы крыс отделяется от дермы термолизином при 4 °C. Затем эпидермис используется для анализа мРНК методом ОТ-ПЦР и оценки белка с помощью вестерн-блотт и иммуногистохимии.

Abstract

Простые в использовании и недорогие методы необходимы для определения специфического для участка производства воспалительных медиаторов и нейротрофиных препаратов во время повреждения кожи, воспаления и / или сенсибилизации. Целью этого исследования является описание протокола разделения эпидермиса и дермы с использованием термолизина, протеиназы, которая активна при 4 ° C. Чтобы проиллюстрировать эту процедуру, крыс Sprague Dawley анестезируют, а правым задним лапам вводят каррагинан. Через шесть и двенадцать часов после инъекции крыс с воспалением и наивных крыс усыпляют, а кусок задней лапы, гламурной кожи помещают в холодную модифицированную орлиную среду Дульбекко. Затем эпидермис отделяется на базальной мембране от дермы термолизином в PBS с хлоридом кальция. Далее дерму закрепляется микродиссекционными щипцами, а эпидермис аккуратно дразнят. Толуидиновым синим окрашиванием участков тканей показывают, что эпидермис отделяется чисто от дермы у базальной мембраны. Все клеточные слои кератиноцитов остаются нетронутыми, а эпидермальные гребни рете вместе с вмятинами от кожных сосочков отчетливо наблюдаются. Качественная и в режиме реального времени ОТ-ПЦР используется для определения фактора роста нервов и уровней экспрессии интерлейкина-6. Вестерн-блоттинг и иммуногистохимия, наконец, выполняются для обнаружения количества фактора роста нервов. Этот отчет иллюстрирует, что переваривание холодного термолизина является эффективным методом отделения эпидермиса от дермы для оценки изменений мРНК и белка во время воспаления.

Introduction

Оценка медиаторов воспаления и нейротрофических факторов со стороны кожи может быть ограничена из-за неоднородности типов клеток, обнаруженных в воспаленной дерме и эпидермисе1,2,3. Недавно было рассмотрено несколько ферментов, химических, термических или механических методов, включающих разделение двух слоев или для выполнения диссоциации клеток для оценки4. Кислота, щелочь, нейтральная соль и тепло могут быстро отделить эпидермис от дермы, но клеточный и внеклеточный отек часто возникает5,6. Трипсин, панкреатин, эластаза, кератиназа, коллагеназа, проназа, диспаза и термолизин являются ферментами, которые использовались для эпидермально-дермального разделения4,7. Трипсин и другие широкомасштабные протеолитические ферменты активны при 37-40 °C, но должны тщательно контролироваться, чтобы предотвратить диссоциацию эпидермальных слоев. Рассеивание расщепляет эпидермис на пластинке денса, но требует 24 ч для отделения в холодных4,8 или более коротких временных точках при 37 °C4,9. Ограничивающей особенностью всех этих методик является потенциальное нарушение морфологии тканей и потеря целостности мРНК и белка.

Для поддержания целостности мРНК и белка метод отделения кожи следует проводить на холоде в течение короткого периода времени. При оценке методов разделения кожи для исследований воспаления термолизин является эффективным ферментом для отделения эпидермиса от дермы при низких температурах4. Термолизин активен при 4 °C, расщепляет эпидермальные гемидемосомы от lamina lucida и отделяет эпидермис от дермы в течение 1–3 ч4,8,10. Целью данного отчета является оптимизация использования термолизина для отделения воспаленного эпидермиса крыс от дермы для выявления уровней мРНК и белка для медиаторов воспаления и нейротрофических факторов. Было представлено несколько предварительных докладов11,12,13,14,15. Целью данной рукописи является описание оптимальной методики разделения кожи с использованием термолизина и демонстрация обнаружения 1) маркеров воспаления, 2) мРНК интерлейкина-6 (IL-6) и 3) мРНК и белка фактора роста нервов (NGF) в эпидермисе крыс с каррагинаном-индуцированным воспалением (C-II)16,17. Предварительный отчет с использованием полной адъювантной модели Фройнда показывает, что уровни мРНК и белка NGF увеличиваются на ранней стадии во время воспаления15. У мышей сенсибилизация кожи при местном применении оксазолона вызывает ранний подъем мРНК IL-6 с использованием гибридизации in situ36. Как IL-6, так и NGF были замешаны в C-II18,19,но не было сообщений, описывающих уровни мРНК или белка для IL-6 или NGF конкретно из эпидермиса во время острых стадий C-II.

Техника термолизина недорогая и простая в исполнении. Кроме того, отделение термолизинов эпидермиса от дермы позволяет проводить мРНК, вестерн-блот и иммуногистохимический анализ медиаторов воспаления и нейротрофических факторов в процессе воспаления15. Исследователи должны быть в состоянии легко использовать эту технику как в доклинических, так и в клинических исследованиях воспаления кожи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными Центра медицинских наук Университета штата Оклахома IACUC (#2016-03).

1. Каррагинан-индуцированное воспаление (C-II)

  1. Обезболить самцов и/или самок крыс Sprague Dawley (200–250 г; 8–9 недель) изофлураном (или инъекционным анестетиком).
  2. Проверьте глубину анестезии, коснувшись роговицы и слегка зажав левую заднюю лапу. Когда животное соответствующим образом обезболивается, реакции роговицы или лапы не наблюдается.
  3. Подкожно вводят в правую глянку заднюю лапу со 100 мкл 1% (мас./об.) λ-каррагинана, разведенного в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS)20.
    1. Убедитесь, что используются соответствующие средства контроля, такие как наивные крысы без изофлурана в этом отчете. Предварительные исследования показывают, что наивные крысы с изофлураном или без него имеют одинаковую базальную экспрессию эпидермального IL-6 и NGF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наивные крысы являются предпочтительными элементами контроля для исследований воспаления, поскольку подкожно-физиологический раствор или PBS вызывают местное воспаление23,37.
  4. Оцените отек У крыс С-II, чтобы гарантировать эффективность каррагинана(Рисунок 1)20. Определите величину отека, измерив толщину плюсневой кисти задней лапы суппортами.
  5. Через 6–12 ч усыпляет крыс с ПОМОЩЬЮCO2 (или инъекционной передозировки анестетика) и срезает острым скальпелем куски глазчатой кожи задних лап размером 1 мм x 2 мм. Если используется волосатая кожа, то сбривайте ее перед срезанием кусочков кожи 1 мм х 2 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что соответствующие временные точки выбраны в соответствии с конкретными исследованиями.
  6. Используя микродиссекционные щипцы, переведите кожу в 1 мл холодной модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) в микроцентрифужной трубке на льду и держите в холодном виде в течение 15–60 минут.

2. Термолизиновая сепарация эпидермиса и дермы

  1. Приготовьте и активируйте термолизин.
    1. Готовят раствор термолизина, добавляя 5 мг Geobacillus stearothermophilus к 10 мл PBS, при рН = 8 (концентрация 500 мкг/мл).
    2. Готовят 1 М раствор кальция хлорида (CaCl2 безводный), добавляя 1,11 г в 10 мл дистиллированногоH2O.
    3. Для предотвращения аутолиза термолизина добавляют 10 мкл хлорида кальция к 10 мл раствора термолизина. Конечная концентрация хлористого кальция составит 1 мМ.
    4. Aliquot 1 мл активированного термолизина в 10 скважин 24-скважинной клеточной культуральной пластины на льду.
  2. Используйте фермент термолизин для отделения эпидермиса от дермы.
    1. Используя микродиссекционные щипцы, перенесите по одному образцу кожи в каждую скважину активированного термолизина. Следите за тем, чтобы не погружать кожу в раствор термолизина.
    2. Осторожно постучите по коже на боковой стороне колодца, чтобы помочь освободить образец кожи из щипцов, чтобы плавать на растворе термолизина.
    3. Всплывайте кожу в раствор термолизина роговым слоем (наружным эпидермисом) стороной вверх и дермой вниз. Очень важно, чтобы дерма была обращена вниз, иначе эффективное разделение не произойдет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество времени для инкубации термолизина должно быть определено эмпирически конечным пользователем. Глабрус, кожа задних лап у крыс Sprague Dawley (200–250 г; 8–9 недель) часто требует 2,0–2,5 ч для разделения. Ожидается, что время инкубации будет варьироваться в зависимости от вида и возраста.
    4. После соответствующего времени инкубации в термолизине используют микродиссекционные щипцы для переноса одного образца кожи в колодец из 6-й ямочной клеточной культуры с 7-8 мл холодного (4 °C) DMEM. Это дает больше места для отделения эпидермиса от дермы.
    5. Погрузите кожу в DMEM.
    6. Аккуратно расчесывайте эпидермис щипцами по периметру кожи до тех пор, пока на границах не будет наблюдаться почти полупрозрачный эпидермис. Если этого достичь не удается, верните образец кожи в раствор термолизина еще на 15–30 мин.
    7. Как только эпидермис заметно отделится от дермы, то аккуратно проведите и эпидермис, и дерму микродиссекционными щипцами и очень медленно вытяните эпидермис из дермы.
    8. Оцените полупрозрачные условия изолированного эпидермиса и убедитесь, что он оптически согласован. См. рисунок 2 для примера образца эпидермиса крыс размером 1 мм x 2 мм. Если есть вариация полупрозрачности, то правильного разделения не произошло.
  3. Инактивировать термолизин с помощью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в отделенных кусочках эпидермиса и дермы.
    ВНИМАНИЕ: Термолизин, который остается в эпидермисе и дерме, все еще активен и может повредить слои, если не инактивирован.
    1. Приготовьте стоковый раствор 0,5 млн ЭДТА. Для этого медленно добавьте 0,93 г ЭДТА в 5 мл двойной дистиллированной воды. Добавьте гидроксид натрия в раствор до тех пор, пока он не очистится. Убедитесь, что pH раствора составляет ~8,0.
    2. Сделайте раствор ЭДТА 5 мМ в DMEM. Добавьте 0,25 мл 0,5 мл раствора ЭДТА к 25 мл ДМЭМ.
    3. Поместите отделенный эпидермис и дерму в раствор ЭДТА/ДМЭМ 5 мМ при 4 °C в течение 30 мин, чтобы дезактивировать активность термолизина.
  4. Оценивают эпидермис с помощью тинкториальной гистологии8,9,10.
    1. Зафиксируйте часть эпидермиса в 10% нейтральном формалине, 4% параформальдегиде или 0,25% параформальдегиде с 0,8% раствором пикриновой кислоты в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) с перемешиванием.
    2. Поместите фиксированный эпидермис в 10% сахарозу в PBS на 1 ч при РТ с перемешиванием.
    3. Заморозьте эпидермис в тканевом встраиваемом матриксе для сечения. Вырежьте поперечные сечения 14 мкм с помощью криостата и оттепельных секций на стеклянных микроскопических стеклах с желатиновым покрытием.
    4. Сухие срезы на слайде грелкой и окрашивают рабочим раствором толуидина синего (ТБ; 10% ТБ в 1% хлориде натрия) в течение 90 с. Обложить крышки водной монтажной средой.
    5. Наблюдают эпидермис с помощью микроскопии яркого поля в 50–250x.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если произошло правильное разделение, эпидермис будет отделен чисто от дермы, и будут обнаружены пять слоев: слой базальный, слой спинозума, гранулезный слой, луцидумный слой и роговой слой. Пример отделенного эпидермиса из кожи крыс можно увидеть на рисунке 3.

3. Экстракция белка и анализ вестерн-блот

  1. Выполняют вестерн-блоттинг на разделенных образцах тканей с использованием ранее опубликованного протокола21.
  2. Гомогенизировать эпидермис в 50 мкл лизисного буфера (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5% глицерина и 1% тритона X-100), содержащего коктейль ингибиторов фосфатазы и протеазы.
  3. Центрифуги пробуют на максимальной скорости в течение 15 мин при 4 °C и оценивают супернатант на концентрацию белка с помощью набора для анализа белка.
  4. Загрузите равные концентрации белка (30 мкг) на гели SDS, выполните электрофорез, а затем перенесите белки на нитроцеллюлозные или PVDF-мембраны.
  5. Блокируют мембраны с 5% молоком в течение 2 ч и инкубируют на ночь в первичных антителах (мышиный анти-NGF, E12, 1:1000).
  6. Промыть 3x PBS с 0,3% анимацией в течение 10 мин каждый и инкубировать с меченым вторичным антителом (например, щелочной фосфатазой, меченой кроликом против мыши IgG).
  7. Используйте систему сканирования для оценки сигнала вестерн-блот (например, подложку ECF и платформу визуализации).

4. Иммуногистохимия

  1. Поместите образцы тканей в фиксатор для оптимальной иммунореактивности: 0,96% (мас./об.) пикриновой кислоты и 0,2% (мас./об.) формальдегида в 0,1 М фосфатно-натриевого буфера, рН =7,3 21,22,23 в течение 4 ч при РТ. Переведите в 10% сахарозу в PBS на ночь при 4 °C.
  2. Выполняют стандартную иммуногистохимию на участкахтканей 21,22,23.
  3. Встраивают эпидермис животных в один замороженный блок в встраиваемую матрицу и вырезают 10–30 мкм участков на криостате. Установите секции на стеклянные стекла микроскопа с желатиновым покрытием и высушите при 37 °C в течение 2 ч.
  4. Промывайте секции в течение трех, 10 мин полосканий в PBS и инкубируют в течение 24-96 ч в первичных антисыворотках, [например, мышиный анти-NGF (E12, 1:2000)] и антибелковый генный продукт кролика 9,9 (PGP 9,5, 1:2000), разведенный в PBS, содержащий 0,3% (мас./об.) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T с 0,5% бычим сывороточным альбумином (BSA) и 0,5% поливинилпирролидоном (PVP).
  5. После первичной инкубации антисыворотки промыть секции три раза в течение 10 мин в PBS и инкубировать 1 ч при RT в Alexa Fluor 488 ослик против кролика IgG (1:1000) и Alexa Fluor 555 ослик против мыши IgG (1:1000), разведенных в PBS-T.
  6. Промыть участки три раза в PBS в течение 10 мин и прикрепить крышки с невядающей монтажной средой, чтобы замедлять затухание иммунофлуоресценции.

5. Выделение РНК и синтез кДНК

  1. Выполняют стандартную полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) на образцах кожи21. Выделяют общую РНК с помощью фенола, раствора изотиоцианата гуанидина.
  2. Осуществляют комплементарный синтез ДНК с помощью реверскриптазы вируса лейкоза муренимолемии Молони.
  3. Используйте следующие последовательности праймеров для усиления NGF и IL-6:
    NGF (Смысл) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
    NGF (Антисмысловый) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
    Ил-6 (Смысл) - ГКААТТКТГАТГАТГАТГААКАКГАТГАГГК;
    Ил-6 (Антисмысловый) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG
  4. Сравните уровни NGF и IL-6 мРНК с геном β-актина:
    β-АКТИН (смысл) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
    β-ACTIN (Антисмысловый) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
  5. Оценка с помощью качественной ОТ-ПЦР с использованием теплового циклира и количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) с использованием системы qRT-PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Инъекция каррагинана в заднюю лапу крысы вызывала классические симптомы воспаления, такие как покраснение и отек16,17. Набухание задней лапы измеряли механическими суппортами20. Исходное значение толщины лапы было получено для каждой крысы перед обработкой каррагинаном и измерено снова через 6 ч и 12 ч. Толщина лап была значительно увеличена по сравнению с исходными значениями(рисунок 1).

Термолизиновая инкубация кожи задней лапы крысы производила лист эпидермиса. Микроскопия Брайтфилда использовалась для оценки эффективности разделения термолизинов эпидермиса и дермы(рисунок 2). Слои эпидермиса могут быть определены при фокусировки через лист при более высоком увеличении. Толуидиновым синим окрашиванием эпидермальных сечений показало, что эпидермис отделялся от дермы у базальной мембраны(рисунок 3). Эпидермальные гребни rete (эпидермальные колышки) вместе с вмятинами от кожных сосочков были неповреждены. Наблюдались все клеточные слои кератиноцитов.

Вестерн-блоттинг термолизин-разделенного эпидермиса дал последовательные результаты, указывающие на стабильные уровни белка во время техники при 4 °C. Очень мало белка NGF было обнаружено в наивном эпидермисе крыс, но уровни белка NGF были подняты (250%) через 6 ч C-II по сравнению с наивными животными(рисунок 4). После 12 ч C-II уровни NGF были снижены по сравнению с 6 ч, но оставались повышенными (55%) по сравнению с контрольной частью. Иммуногистохимия для NGF в отделенном эпидермисе обеспечила надежное иммуноокрашивание и подтвердила результаты от вестерн-блотов(рисунок 5). NGF-иммунореактивность (IR) не была обнаружена в наивном контрольном эпидермисе, но через 6 ч C-II наблюдался NGF-ir в большинстве кератиноцитов гранулезного слоя и луцидного слоя. Несколько клеток для спинозного слоя были NGF-иммунореактивными (IR) при 6 ч C-II. Через 12 ч C-II NGF-ir возникал в кератиноцитах гранулезного слоя и луцидумного слоя с некоторыми клетками в гранулезном слое интенсивно NGF-IR. Ни в один момент времени NGF-ir не был обнаружен в базальном слое или роговом слое. PGP9.5-IR внутриэпидермальные, варикозные нервные волокна присутствовали в отделенном эпидермисе от наивных и C-II крыс(рисунок 5).

Качественная ОТ-ПЦР продемонстрировала хорошее качество мРНК из термолизин-разделенного эпидермиса(Рисунок 6А, Рисунок 7А). Используя актин в качестве родового гена для количественной ПЦР в реальном времени, экспрессия мРНК NGF в эпидермисе во время C-II была значительно повышена (>3 раза) через 6 ч по сравнению с наивными крысами(рисунок 6B). Через 12 ч мРНК NGF вернулась к исходным уровням(рисунок 6B). Используя актин в качестве гена домашнего хозяйства для количественной ПЦР в реальном времени, мРНК IL-6 в эпидермисе во время C-II была значительно повышена (>6 раз) через 6 ч по сравнению с наивными крысами(рисунок 7B). Через 12 ч уровни мРНК IL-6 значительно снизились с 6-часовых количеств, но оставались повышенными (в 2 раза) по сравнению с наивными крысами(рисунок 7B).

Figure 1
Рисунок 1: Инъекция каррагинана вызывает отек лапы.
Исходное значение было получено для каждой крысы до обработки каррагинаном. После 6 ч и 12 ч лечения толщина лапы значительно увеличилась по сравнению с исходными значениями. Результаты выражаются как SEM с шестью крысами за обработку (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; t-тест студента, непарный, двуххвостый, был выполнен в каждый момент времени). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Термолизин производит лист эпидермиса.
Микроскопия Брайрфилда выявила полупрозрачный эпидермальный лист размером примерно 1 мм х 2 мм. Слои эпидермиса могут быть определены при фокусировки через лист при более высоком увеличении. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Толуидин синее окрашивание эпидермиса.
Микроскопия Брайтфилда определила, что термолизин вызывает эффективное отделение эпидермиса от дермы. Эпидермальные гребни rete (эпидермальные колышки; наконечники стрел) наблюдались вместе с вмятинами от кожных сосочков (стрел). Все клеточные слои кератиноцитов были неповреждены. SB: пласт базальный, SS: пласт спинозума, SG: гранулезный слой, SL: слой люцидум, SC: роговой слой. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Экспрессия белка NGF в эпидермисе во время воспаления, вызванного каррагинаном.
Уровни NGF были повышены (250%) после 6 ч воспаления по сравнению с наивными животными. Через 12 ч уровни были снижены по сравнению с 6 ч, но были повышены (55%) в отличие от наивных животных. Результаты выражаются как SEM с тремя крысами в группе (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; t-тест студента, непарный, двуххвостый был выполнен в каждой точке времени) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Иммунореактивность (ir) NGF и PGP9.5 при C-II.
Столбцы A, B, C показывают ядерное окрашивание NGF-ir, PGP9.5-ir и DAPI, тогда как столбцы A1-C 1 показываюттолько NGF-ir. На всех изображениях роговой слой находится слева, а базальный слой — справа. NGF-ir не был обнаружен в наивном контрольном эпидермисе (A, A1). Через 6 ч C-II(B,B1)NGF-ir присутствовал в большинстве кератиноцитов гранулезного слоя (короткие стрелки) и луцидумного слоя (длинные стрелы). Несколько клеток для спинозного слоя были NGF-ir на 6 ч C-II (большие наконечники стрел). Через 12 ч C-II(C,C1)NGF-ir возникал в кератиноцитах гранулезного слоя и луцидумного слоя (длинные стрелки) с некоторыми клетками в гранулозном слое интенсивно NGF-ir (короткие стрелки). Ни в один момент времени NGF-ir не был обнаружен в базальном слое или роговом слое. PGP9.5-ir интраэпидермальные нервные волокна присутствовали в отделенном эпидермисе от наивных и C-II крыс (маленькие наконечники стрел, A-C). SB: пласт базальный, SS: слой спинозума, SG: гранулезный слой, SL: слой люцидума. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: МРНК NGF при воспалении, вызванном каррагинаном.
Экспрессия мРНК NGF в термолизин-разделенном эпидермисе во время С-II оценивалась с помощью качественной ПЦР(А)и количественной ПЦР в реальном времени(В). Качественные мРНК-блоты (А) для NGF и актина продемонстрировали, что существует мРНК хорошего качества, которую можно оценить во время воспаления. Экспрессия мРНК NGF в эпидермисе во время C-II оценивалась количественной ПЦР в реальном времени с использованием актина в качестве гена ведения хозяйства (B). МРНК NGF была значительно повышена (>3 раза) после 6 ч C-II по сравнению с наивными необработанными крысами, но уровни вернулись к исходному уровню через 12 ч (B). Результаты выражаются как SEM с тремя крысами в группе (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; t-тест студента, непарный, двуххвостый был выполнен в каждой точке времени). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: МРНК IL-6 при каррагинане-индуцированном воспалении.
Экспрессия IL-6 мРНК в термолизин-разделенном эпидермисе во время С-II оценивалась с помощью качественной ПЦР(А)и количественной ПЦР в реальном времени(В). Качественные мРНК-блоты (А) для IL-6 и актина показали наличие мРНК хорошего качества для оценки во время воспаления. Экспрессия IL-6 мРНК в эпидермисе во время C-II оценивалась с помощью количественной ПЦР в реальном времени с использованием актина в качестве гена ведения хозяйства (B). МРНК IL-6 был значительно повышен (>6 раз) через 6 ч C-II по сравнению с наивными необработанными крысами (B). Через 12 ч уровни мРНК IL-6 были значительно снижены с 6-часовых уровней, но оставались повышенными (в 2 раза) по сравнению с наивными крысами (B). Результаты выражаются как среднее значение S.E.M. с двумя крысами в группе (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, в каждой точке времени был выполнен t-тест студента, непарный, двуххвостый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Исследование определило, что эпидермис глазчатой кожи задней лапы крысы легко отделялся от дермы с помощью термолизина (0,5 мГ/мл) в PBS с 1 мМ хлорида кальция при 4 °C в течение 2,5 ч. Гистологическая оценка показала, что эпидермис был отделен от дермы на базальной мембране и что эпидермальные гребни рете были неповрежденными. Термолизин представляет собой внеклеточную металлоэндопептидазу, полученную грамположительной(Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. Его активность стабильна при 4 °C, но функционирует в широком диапазоне температур10,24,25. Этот фермент широко использовался для химии белка24,25,но несколько групп показали его применение для разделения кожи на эпидермальные и/или кожные листы4,8,10,26,27. Walzer et al. были первыми, кто сообщил о эпидермально-дермальном разделении кожи человека с использованием термолизина при 4 °C (250-500 мкг / мл в течение 1 ч)10. С помощью световой и электронной микроскопии было определено, что разделение происходит на эпидермальной базальной мембране между ламинином и буллезным пемфигоидным антигеном10.

Кроме того, гемидесмосомы, прикрепления базальных кератиноцитов к базальной мембране, были нарушены избирательно10,29. Rakhorst et al. сравнили термолизин (4 °C, 500 мкг/мл, ночь) с диспазой для эпидермально-дермального разделения слизистой оболочки щечки кролика8. Термолизин был неполным в отделении эпидермиса слизистой оболочки от дермы, что означает, что могут возникать различия для видов, времени инкубации, состава раствора (нет CaCl2 для предотвращения автолиза термолизина24),источника термолизина и / или специфических для сайта различий, указанных в других исследованиях10,26,27. Конечные пользователи текущего протокола должны обязательно использовать свежий термолизин и всегда включать хлорид кальция, но также должны знать об этих потенциальных ограничениях.

Хотя некоторые исследователи использовали термолизин при 37 ° C26,29,пользователи этого протокола должны помнить о том, чтобы поддерживать ткань кожи при 4 ° C, чтобы сохранить стабильность белка и мРНК. Мы использовали DMEM при 4 °C в качестве раствора для кожи до и после разделения термолизина из-за его полезности для поддержания клеток в культуре28,и ранее он использовался для разделения кожи с термолизином8,26,27,30,31. Тем не менее, Walzer et al. использовали стерильный PBS, дополненный 200 мкГ / мл стрептомицина, 200 ЕД / мл пенициллина и 2,5 мкг / мл гриба10,тогда как другие использовали различные среды (например, кератиноцитарные питательные среды, свободные от эпидермального фактора роста) с последующим полосканием PBS29.

В протоколе разделение термолизина выполняли в 500 мкг/мл термолизина и 5 мМ хлорида кальция в PBS (pH = 8), аналогично оригинальному методу10. DMEM был использован в качестве раствора для разделения термолизина при 4 °C (ночь)8,а буфер HEPES был эффективно использован с 500 мкГ / мл раствора термолизина при 37 °C в течение 2 ч29. Однако мы не исследовали, как культуральная среда или другие буферы влияют на активность термолизина для эпидермально-дермального разделения. Хлорид кальция является важным дополнением для уменьшения аутолиза термолизина24,32 и удаление этой ступени может привести к неполному расщеплению эпидермиса из дермы8.

Размер образца кожи, по-видимому, влияет на время, необходимое для инкубации термолизина, и эффективность ферментативного расщепления эпидермиса из дермы. Исследователи должны оценить соответствующий размер выборки и время инкубации для своих собственных тканей. Плавание образцов на растворе термолизина с эпидермисом, обращенным вверх, важно для оптимальной эффективности ферментов10. Как отмечалось ранее, место действия термолизина находится в кератиноцитарных гемидемосомах и базальной мембране4,10,29; поэтому термолизин работает внутрь от краев кожи. По нашему опыту, края кожи отделяются раньше, чем середина образца, и важно дать достаточно времени для полного ферментативного расщепления. Когда расщепление завершено, эпидермис должен легко оттягиваться от дермы. Если все еще прикреплены, потягивание слоев может привести к тому, что части дермы уйдут с эпидермисом.

Ограничением метода термолизина является требуемое время. Повышение концентрации термолизина выше 500 мкГ/мл не уменьшает время разделения и плохое сохранение эпидермиса при более высоких концентрациях10. Методы эпидермально-дермального разделения были рассмотрены недавно4,и многие методы занимают 30-60 мин при 20-40 °C. Тепловое (50-60 °C) отделение кожи происходит быстро (от 30 с до 10 мин)4,но белки и мРНК, как известно, быстро разлагаются при таких высоких температурах. Альтернативно, тиоцианат натрия (2 N) на RT может быть приемлемым методом быстрого разделения (5 мин)4,6,но целостность белка и мРНК не изучалась с помощью этого метода6. Метод холодного термолизина был выбран для сохранения белка и мРНК, но не было проведено прямых сравнений между целостностью белка и мРНК с использованием других методов.

В настоящем исследовании показано, что переваривание холодного термолизина является эффективным методом отделения эпидермиса от дермы для оценки изменений мРНК и белка во время воспаления. Во время воспаления, вызванного каррагинаном, уровни мРНК и белка NGF и уровни мРНК IL-6 были повышены через 6 ч, возвращаясь близко к исходному уровню на 12 ч. При иммуногистохимии иммунореактивность NGF была повышена в кератиноцитах через 6 ч и 12 ч. Преимуществом термолизинового метода является возможность выполнения сайт-селективного анализа. Например, повышенная продукция NGF и IL-6 в текущем исследовании происходит от кератиноцитов, поскольку кожные клетки исключены из анализов. Этот метод позволяет получить представление о местоположении и типах медиаторов для сенсибилизации первичных афферентных терминалов33. Кроме того, этот метод позволяет лучше понять временной ход выработки нейротрофина наряду с поглощением и транспортом в первичных афферентах при воспалении34,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не раскрывают информацию.

Acknowledgments

Финансирование этого исследования было предоставлено Национальными институтами здравоохранения NIH-AR047410 (KEM)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
λ-carrageenan Millipore Sigma 22049 Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation
7500 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107 For RT-PCR analysis
Calcium chloride (CaCl2), anhydrous Millipore Sigma 499609 Prevents autolysis of thermolysin
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium Millipore Sigma C0612 Aqueous mounting medium after toluidine blue staining
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A-31570 Secondary antibody for immunohistochemistry
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21206 Secondary antibody for immunohistochemistry
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11966-025 To maintain tissue integrity
Ethylenediaminetetraacetic acid Millipore Sigma E6758 Stops thermolysin reaction
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase Promega M1701 For complementary DNA synthesis
Mouse anti-NGF Antibody (E-12) Santa Cruz Biotechnology sc-365944 For neurotrophin immunohistochemistry
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 To retard immunofluorescence quenching
Rabbit anti-PGP 9.5 Cedarlane Labs CL7756AP For intraepidermal nerve staining
SAS Sprague Dawley Rat Charles River Strain Code 400 Animal used for inflammation studies
Shandon M-1 Embedding Matrix Thermo Fisher Scientific 1310TS Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific A24811 For RT-PCR analysis
SYBR Select Master Mix Thermo Fisher Scientific 4472908 For RT-PCR analysis
Thermolysin Millipore Sigma T7902 From Geobacillus stearothermophilus
Toluidine Blue Millipore Sigma 89640 For tinctorial staining for brightfield microscopy
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 For total RNA extraction for RTPCR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
  2. Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
  3. Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
  4. Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
  5. Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
  6. Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
  7. Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
  8. Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
  9. Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
  10. Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
  11. Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
  12. Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
  13. Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , # 17 (2011).
  14. Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
  15. Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
  16. Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
  17. Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
  18. Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
  19. Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
  20. Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
  21. Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
  22. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
  23. Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
  24. van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , Volume 1, Chapter 111 540-553 (2013).
  25. Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
  26. Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
  27. Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
  28. Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1: Unit 1.2 (2001).
  29. Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
  30. Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  31. Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
  32. Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
  33. Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
  34. Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
  35. Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
  36. Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
  37. Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 175 эпидермис термолизин фактор роста нервов интерлейкин-6 воспаление qPCR вестерн-блоттинг иммуногистохимия
Разделение эпидермиса и дермы крыс термолизином для обнаружения сайт-специфической воспалительной мРНК и белка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gujar, V., Anderson, M. B., Miller,… More

Gujar, V., Anderson, M. B., Miller, K. E., Pande, R. D., Nawani, P., Das, S. Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein. J. Vis. Exp. (175), e59708, doi:10.3791/59708 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter