Summary
هنا هو بروتوكول لفصل البشرة من الأدمة لتقييم إنتاج الوسيط الالتهابي. بعد الالتهاب ، يتم فصل البشرة مخلب الجرذ الخلفي من الأدمة عن طريق الدلس الحراري عند 4 درجة مئوية. ثم يتم استخدام البشرة لتحليل الحمض النووي الريبي عن طريق RT-PCR وتقييم البروتين عن طريق وصمة عار الغربية والكيمياء المناعية.
Abstract
هناك حاجة إلى تقنيات سهلة الاستخدام وغير مكلفة لتحديد إنتاج محدد الموقع من الوسطاء الالتهابية والأعصاب أثناء إصابة الجلد والالتهاب و / أو التوعية. الهدف من هذه الدراسة هو وصف بروتوكول فصل البشرة الجلدية باستخدام الهريسين الحراري ، وهو بروتين ينشط عند 4 درجات مئوية. لتوضيح هذا الإجراء ، يتم تخدير فئران سبراغ دولي ، ويتم حقن الكفوف الخلفية اليمنى بالكاراجينان. بعد ست واثنتي عشرة ساعة من الحقن ، يتم قتل الفئران ذات الالتهاب والجرذان الساذجة ، ويتم وضع قطعة من مخلب هندى ، جلد جلابروس في متوسط النسر المعدل في Dulbecco البارد. ثم يتم فصل البشرة في غشاء الطابق السفلي من الأدمة عن طريق الليسين الحراري في برنامج تلفزيوني مع كلوريد الكالسيوم. بعد ذلك ، يتم تأمين الأدمة عن طريق ملقط التشظي الدقيق ، ويتم مضايق البشرة بلطف. تلطيخ الأزرق Toluidine من أقسام الأنسجة تبين أن البشرة يتم فصلها بشكل نظيف من الأدمة في غشاء الطابق السفلي. جميع طبقات خلايا الكيراتينية لا تزال سليمة، ويلاحظ بوضوح التلال rete البشرة جنبا إلى جنب مع المسافات البادئة من الحليمات الجلدية. يستخدم نوعي وفي الوقت الحقيقي RT-PCR لتحديد عامل نمو الأعصاب ومستويات التعبير interleukin-6. يتم إجراء النشاف الغربي والكيمياء المناعية أخيرا للكشف عن كميات من عامل نمو الأعصاب. يوضح هذا التقرير أن هضم الهضم الحراري البارد هو طريقة فعالة لفصل البشرة عن الأدمة لتقييم الحمض النووي الريبي وتعديلات البروتين أثناء الالتهاب.
Introduction
تقييم الوسطاء الالتهابية والعوامل العصبية من الجلد يمكن أن تكون محدودة بسبب عدم التجانس من أنواع الخلايا الموجودة في الأدمة الملتهبة والبشرة1،2،3. وقد استعرضت مؤخرا العديد من الإنزيمات والكيميائية والحرارية ، أو التقنيات الميكانيكية التي تنطوي على فصل طبقتين أو لأداء تفكك الخلايا للتقييم4. حمض, القلويات, الملح محايد, والحرارة يمكن تقسيم البشرة من الأدمة بسرعة, ولكن تورم الخلوية وخارج الخلية غالبا ما يحدث5,6. تريبسين, البنكرياس, الاستاز, keratinase, كولاجيناز, بروناز, ديسباس, وثيرمليسين هي الانزيمات التي استخدمت لفصل البشرة الجلدية4,7. التريبسين والإنزيمات البروتيوليكية واسعة النطاق الأخرى نشطة في 37-40 درجة مئوية ولكن يجب مراقبتها بعناية لمنع تفكك طبقات البشرة. Dispase يشق البشرة في densa lamina، ولكن يتطلب 24 ساعة لفصل في الباردة4،8 أو أقصر timepoints في 37 °C4،9. ومن السمات التي تحد من كل هذه التقنيات هو الاضطراب المحتمل لمورفولوجيا الأنسجة وفقدان سلامة الحمض النووي الريبي والبروتين.
للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي والبروتين، ينبغي أن يتم إجراء طريقة فصل الجلد في البرد لفترة قصيرة من الزمن. في تقييم تقنيات فصل الجلد لدراسات الالتهاب ، يعد الهسين الحراري إنزيما فعالا لفصل البشرة عن الأدمة في درجات الحرارة الباردة4. Thermolysin نشطة في 4 درجة مئوية، يشق البشرة hemidesmosomes من لامينا لوسيدا، ويفصل البشرة من الأدمة في غضون 1-3 ح4،8،10. الهدف من هذا التقرير هو تحسين استخدام الثيرمولين لفصل البشرة الفئران الملتهبة من الأدمة للكشف عن الحمض النووي الريبي ومستويات البروتين للوسطاء الالتهابية والعوامل العصبية. تم تقديم العديد من التقارير الأولية11،12،13،14،15. الهدف من هذه المخطوطة هو وصف تقنية فصل الجلد الأمثل باستخدام اللدائن الحرارية وإظهار الكشف عن 1) علامات الالتهاب، 2) إنترلوكين-6 (IL-6) مرنا، و 3) عامل نمو الأعصاب (NGF) مرنا والبروتين في البشرة من الفئران مع التهاب الناجم عن الكاراجينان (C-II)16،17. تقرير أولي باستخدام نموذج المساعد فروند الكامل يشير إلى أن NGF مرنا ومستويات البروتين زيادة في وقت مبكر خلال التهاب15. في الفئران، والحساسية الجلد مع التطبيق الموضعي لأوكسيازولون يسبب ارتفاع مبكر في IL-6 مرنا باستخدام التهجين في الموقع36. وقد تورط كل من IL-6 وNGF في C-II18,19, ولكن لم تكن هناك تقارير تصف الحمض النووي الريبي أو مستويات البروتين لIL-6 أو NGF على وجه التحديد من البشرة خلال المراحل الحادة من C-II.
تقنية الهسين الحراري غير مكلفة ومباشرة لأداء. وعلاوة على ذلك، فصل الحرارة من البشرة من الأدمة يسمح لرنا، لطخة الغربية، والتحليل المناعي الكيميائي للوسطاء الالتهابات والعوامل العصبية خلال عملية الالتهاب15. يجب أن يكون المحققون قادرين على استخدام هذه التقنية بسهولة في كل من الدراسات قبل السريرية والسريرية لالتهاب الجلد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع هذا البروتوكول إرشادات رعاية الحيوان لمركز جامعة ولاية أوكلاهوما للعلوم الصحية IACUC (#2016-03).
1. التهاب الناجم عن كاراجينان (C-II)
- تخدير الفئران الذكور و / أو الإناث سبراغ دولي (200-250 غرام؛ 8-9 أسابيع من العمر) مع isoflurane (أو مخدر عن طريق الحقن).
- تحقق من عمق التخدير عن طريق لمس القرنية وقرص مخلب الخلفي الأيسر بخفة. عندما يتم تخدير الحيوان بشكل مناسب ، لن يلاحظ أي استجابة للقرنية أو مخلب.
- حقن تحت الجلد في glabrous الحق، مخلب الخلفي مع 100 ميكرولتر من 1٪ (ث / v) λ-كاراجينان المخفف في المالحة الفوسفات العازلة (PBS)20.
- تأكد من استخدام الضوابط المناسبة، مثل الفئران السذاجة دون isoflurane في هذا التقرير. وتشير الدراسات الأولية إلى أن الفئران السذاجة مع أو بدون ايزوفلوران لديها نفس التعبير القاعدي من البشرة IL-6 و NGF.
ملاحظة: الفئران السذاجة هي المفضلة ضوابط لدراسات التهاب منذ تحت الجلد المالحة أو PBS يسبب التهاب المحلية23،37.
- تأكد من استخدام الضوابط المناسبة، مثل الفئران السذاجة دون isoflurane في هذا التقرير. وتشير الدراسات الأولية إلى أن الفئران السذاجة مع أو بدون ايزوفلوران لديها نفس التعبير القاعدي من البشرة IL-6 و NGF.
- تقييم وذمة الفئران C-II لضمان فعالية كاراجينان (الشكل 1)20. تحديد كمية وذمة عن طريق قياس سمك مشط القدم مخلب الخلفي مع الفرجار.
- في 6-12 ساعة، والقتل الرحيم الفئران معثاني أكسيد الكربون (أو جرعة زائدة مخدر عن طريق الحقن) وقطع 1 مم × 2 ملم قطعة من الجلد مخلب هند glabrous مع مشرط حاد. إذا تم استخدام الجلد المشعر، ثم حلق قبل قطع 1 مم × 2 ملم من الجلد.
ملاحظة: تأكد من اختيار النقاط الزمنية المناسبة وفقا للدراسات المحددة. - باستخدام ملقط التحلل الدقيق، نقل الجلد إلى 1 مل من متوسط النسر المعدلة دولبيكو الباردة (DMEM) في أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد والحفاظ على البرد لمدة 15-60 دقيقة.
2. فصل الثيرمو يسين من البشرة والأدمة
- إعداد وتنشيط الثيرمولين.
- إعداد حل من thermolysin، بإضافة 5 ملغ من geobacillus stearothermophilus إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني، في درجة الحموضة = 8 (تركيز 500 ميكروغرام / مل).
- إعداد محلول 1 M من كلوريد الكالسيوم (CaCl2 اللامائية) عن طريق إضافة 1.11 غرام إلى 10 مل من المقطر H2O.
- لمنع التحلل الذاتي للتحلل الحراري، أضف 10 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم إلى 10 مل من محلول التحلل الحراري. وسيكون التركيز النهائي كلوريد الكالسيوم 1 mM.
- Aliquot 1 مل من الديناميل الحراري المنشط في 10 آبار من 24 لوحة ثقافة خلية جيدة على الجليد.
- استخدام الهضم انزيم الهضم بالحرارة لفصل البشرة من الأدمة.
- باستخدام ملقط التشتيت الدقيق، نقل عينة جلد واحدة في كل بئر من الديناميل الحراري المنشط. تأكد من عدم غمر الجلد في محلول اللحلول الحرارية.
- اضغط برفق على الجلد على جانب البئر للمساعدة في إطلاق عينة الجلد من ملقط لتعويم على محلول الزحلة الحرارية.
- تعويم الجلد في محلول الهراسين الحراري مع الطبقة كورنيوم (البشرة الخارجية) الجانب صعودا والأدمة التي تواجه أسفل. ومن الأهمية بمكان أن يواجه الأدمة إلى أسفل، أو الفصل الفعلي لن يحدث.
ملاحظة: يجب تحديد مقدار الوقت لاحتضان thermolysin تجريبيا من قبل المستخدم النهائي. جلابروس، جلد مخلب الخلفي من الفئران داولي سبراغ (200-250 غرام؛ 8-9 أسابيع من العمر) غالبا ما يتطلب 2.0-2.5 ساعة للانفصال. ومن المتوقع أن يختلف وقت الحضانة باختلاف الأنواع والعمر. - بعد وقت الحضانة المناسب في الليسين الحراري ، استخدم ملقط التشتت الدقيق لنقل عينة جلد واحدة إلى بئر من لوحة زراعة خلايا جيدة 6 مع 7-8 مل من DMEM البارد (4 درجة مئوية). وهذا يتيح مساحة أكبر لفصل البشرة عن الأدمة.
- تزج الجلد في DMEM.
- فرشاة بلطف البشرة مع ملقط حول محيط الجلد حتى لوحظ البشرة شبه شفافة على الحدود. إذا لم يتحقق ذلك، أعد عينة الجلد إلى محلول الهلازين الحراري لمدة 15-30 دقيقة أخرى.
- مرة واحدة البشرة ينفصل بشكل ملحوظ من الأدمة، ثم عقد بعناية كل من البشرة والأدمة مع ملقط microdissection وسحب ببطء شديد البشرة من الأدمة.
- تقييم مدى راحة البشرة المعزولة والتأكد من أنها متسقة بصريا. انظر الشكل 2 للحصول على مثال لعينة من 1 مم × 2 مم من البشرة الفئران. إذا كان هناك اختلاف في الشفافية ، ثم الفصل السليم لم يحدث.
- تعطيل الهريسين الحراري باستخدام حمض الإيثيلينديامينتتراستيك (EDTA) في القطع المنفصلة من البشرة والأدمة.
تنبيه: لا يزال الهزليسين الحراري الذي يبقى في البشرة والأدمة نشطا ويمكن أن يضر الطبقات إن لم يكن معطلا.- إعداد 0.5 M EDTA الأسهم الحل. للقيام بذلك، أضف ببطء 0.93 غرام EDTA إلى 5 مل من الماء المقطر المزدوج. أضف هيدروكسيد الصوديوم إلى المحلول حتى ينجلي. تأكد من أن رقم الحموضة للحل هو ~ 8.0.
- قم بإجراء حل EDTA 5 mM في DMEM. إضافة 0.25 مل من 0.5 M EDTA حل الأسهم إلى 25 مل من DMEM.
- ضع البشرة والأدمة المنفصلة في محلول EDTA/DMEM الذي 5 mM عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لتعطيل نشاط Thermolysin.
- تقييم البشرة مع الأنسجة التكفيرية8،9،10.
- إصلاح جزء من البشرة في 10٪ الفورمالين محايدة, 4٪ paraformaldehyde, أو 0.25٪ paraformaldehyde مع 0.8٪ محلول حمض بيكريك ل 1 ح في درجة حرارة الغرفة (RT) مع التحريض.
- وضع البشرة الثابتة في السكروز 10٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في RT مع التحريض.
- تجميد البشرة في مصفوفة تضمين الأنسجة للتقطير. قطع 14 ميكرومتر المقاطع العرضية باستخدام أقسام cryostat وذوبان جبل على شرائح المجهر الزجاجي المغلفة الجيلاتين.
- أقسام جافة على الشريحة أكثر دفئا وصمة عار مع حل العمل من الأزرق التولويدين (السل؛ 10٪ السل في 1٪ كلوريد الصوديوم) لمدة 90 ثانية. يغطي Appose مع وسط تصاعد مائي.
- مراقبة البشرة مع المجهر برايتفيلد في 50x-250x.
ملاحظة: إذا حدث فصل مناسب، سيتم تقسيم البشرة بشكل نظيف من الأدمة وسيتم الكشف عن الطبقات الخمس: طبقة basale، طبقة سبينوسوم، طبقة غرانوبولوسوم، ستراتوم لوسيدوم، وطبقة كورنيوم. ويمكن رؤية مثال على البشرة الفئران فصل الجلد في الشكل 3.
3. استخراج البروتين وتحليل لطخة الغربية
- تنفيذ النشاف الغربية على عينات الأنسجة المنفصلة باستخدام بروتوكول نشرت سابقا21.
- تجانس البشرة في 50 ميكرولتر من العازلة تحلل (25mM تريس HCl، درجة الحموضة = 7.4، 150 mM NaCl، 1 M M EDTA، 5٪ الجلسرين، و 1٪ تريتون X-100) تحتوي على كوكتيل فوسفاتاز وبروتياز.
- عينات الطرد المركزي بسرعة قصوى لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية وتقييم supernatant لتركيز البروتين باستخدام مجموعة اختبار البروتين.
- تحميل تركيزات متساوية من البروتين (30 ميكروغرام) على المواد الهلامية SDS، وإجراء الكهربائي، ومن ثم نقل البروتينات إلى النيتروسليلوز أو أغشية PVDF.
- كتلة الأغشية مع 5٪ الحليب لمدة 2 ساعة واحتضان بين عشية وضحاها في الأجسام المضادة الأولية (الماوس المضادة NGF، E12، 1:1000).
- غسل 3x مع برنامج تلفزيوني مع 0.3٪ توين لمدة 10 دقيقة لكل واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المسمى (على سبيل المثال، الفوسفاتاز القلوية المسمى أرنب المضادة للفأرة IgG).
- استخدم نظام المسح الضوئي لتقييم إشارة البقعة الغربية (على سبيل المثال، ركيزة ECF ومنصة تصوير).
4. الكيمياء المناعية
- ضع عينات الأنسجة في مثبت لالخمول المناعي الأمثل: 0.96٪ (ث / v) حمض بيريك و 0.2٪ (ث / v) الفورمالديهايد في 0.1 M صوديوم الفوسفات العازلة، درجة الحموضة = 7.321،22،23 لمدة 4 ساعات في RT. نقل إلى 10٪ السكروز في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- إجراء الكيمياء المناعية القياسية على أقسام الأنسجة21،22،23.
- تضمين البشرة من الحيوانات في كتلة واحدة المجمدة في تضمين مصفوفة وقطع 10-30 ميكرومتر أقسام على cryostat. قم بتركيب المقاطع على شرائح المجهر الزجاجي المغلفة بالجيلاتين وجافة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- غسل أقسام لمدة ثلاثة، 10 دقيقة شطف في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 24-96 ساعة في antisera الأولية، [على سبيل المثال، الماوس المضادة لNGF (E12، 1:2000)] والأرنب المضادة للبروتين المنتج الجيني 9.9 (PGP 9.5، 1:2000) المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3 ٪ (ث / الخامس) تريتون X - 100 (PBS - T) PBS - T مع 0.5 ٪ ألبوم مصل البقر (جيش الصحابة) و 0.5 ٪ polyvinylpyrrolidone (PVP).
- بعد الحضانة الأولية المضادة للروم، شطف أقسام ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني واحتضان 1 ساعة في RT في اليكسا فلور 488 حمار المضادة للأرنب IgG (1:1000) واليكسا فلور 555 حمار المضادة للفأرة IgG (1:1000) المخفف في PBS-T.
- شطف أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة وأغطية اللصق مع المتوسطة تصاعد غير يتلاشى لتثبيط يتلاشى من immunofluorescence.
5. عزل الحمض النووي الريبي وتوليف CDNA
- أداء معيار عكس تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) على عينات الجلد21. عزل مجموع الحمض النووي الريبي باستخدام الفينول، محلول ايزوثيوسياناتي guanidine.
- تنفيذ تخليق الحمض النووي التكميلية من قبل مولوني مورين فيروس سرطان الدم عكس transcriptase.
- استخدم التسلسلات التمهيدية التالية لتضخيم NGF و IL-6:
NGF (إحساس) - GTGGACCCCAAACTGTAGAAACGG
NGF (Antisense) – GTGAGTCCTGGغاغاغاغاتغاتكاتكاتكاتغ
IL-6 (إحساس) - GCAATTCTTGTATGAACAGCغاغاتغاتغ؛
IL-6 (مضاد للسينس) - GTAGAAACGGAACTCCAGAGAGAG - قارن مستويات NGF و IL-6 مرنا إلى β-actin التدبير المنزلي الجينات:
β-أكتين (إحساس) - TGCGTGACATTAAGAGCTGTGCTATG
β-أكتين (Antisense) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA - تقييم مع نوعي RT-PCR باستخدام دورة الحرارية والكمية في الوقت الحقيقي PCR (qRT-PCR) باستخدام نظام QRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تسبب حقن كاراجينان في مخلب الفئران الخلفي الأعراض الكلاسيكية للالتهاب مثل احمرار وذمة16،17. تم قياس تورم مخلب الخلفي مع الفرجار الميكانيكية20. تم الحصول على قيمة خط الأساس لسمك مخلب لكل فأر قبل العلاج كاراجينان وقياسها مرة أخرى في 6 ساعة و 12 ساعة. زيادة سمك مخلب بشكل ملحوظ مقارنة مع قيم خط الأساس (الشكل 1).
أنتجت حضانة الهلوسين الحراري لجلد مخلب الجرذ الجليدي الخلفي ورقة من البشرة. تم استخدام المجهر برايتفيلد لتقييم فعالية فصل الزحم الحراري للبشرة والأدمة(الشكل 2). يمكن تحديد طبقات البشرة مع التركيز من خلال الورقة في التكبير الأعلى. Toluidine الأزرق تلطيخ البشرة المقاطع العرضية أظهرت أن البشرة فصلت عن الأدمة في غشاء الطابق السفلي (الشكل 3). كانت التلال rete البشرة (أوتاد البشرة) جنبا إلى جنب مع المسافات البادئة من الحليمات الجلدية سليمة. لوحظت جميع طبقات خلايا الكيراتينية.
النشاف الغربي من البشرة المنفصلة بالحرارة أسفر عن نتائج متسقة تشير إلى مستويات بروتين مستقرة خلال هذه التقنية عند 4 درجات مئوية. تم الكشف عن القليل جدا من البروتين NGF في البشرة الفئران السذاجة، ولكن تم رفع مستويات البروتين NGF (250٪) بعد 6 ساعة من C-II بالمقارنة مع الحيوانات السذاجة(الشكل 4). بعد 12 ساعة من C-II، تم تخفيض مستويات NGF مقارنة مع 6 ساعة لكنها ظلت مرتفعة (55٪) بالنسبة للضوابط. قدمت الكيمياء المناعية لNGF في البشرة المنفصلة مناعة موثوقة وأكدت النتائج من البقع الغربية(الشكل 5). لم يتم الكشف عن النشاط المناعي NGF (ir) في البشرة مراقبة ساذجة، ولكن في 6 ساعة C-II، كان هناك NGF-ir في معظم الخلايا القرنية من غرانوبولوسوم الطبقة والطبقة لوسيدوم. وكانت عدد قليل من الخلايا لطبقة سبينوسوم NGF-المناعي (IR) في 6 ساعة C-II. في 12 ح C-II, NGF-ir وقعت في keratinocytes من طبقة غرانوبولوسوم والطبقات لوسيدوم مع بعض الخلايا في طبقة غرانوبولوسوم بشكل مكثف NGF-IR. في أي وقت من الأوقات تم الكشف عن NGF-ir في طبقة basale أو الطبقة كورنيوم. PGP9.5-IR داخلالديديرمال، كانت الألياف العصبية الدوالي موجودة في البشرة المنفصلة عن الفئران السذاجة وC-II (الشكل 5).
أظهرت النوعية RT-PCR أن هناك نوعية جيدة مرنا من البشرة مفصولة بالحرارة(الشكل 6A، الشكل 7A). باستخدام أكتين كجين التدبير المنزلي لPCR الكمية في الوقت الحقيقي، NGF مرنا التعبير في البشرة خلال C-II كان مرتفعا بشكل ملحوظ (>3 أضعاف) في 6 ساعة مقارنة مع الفئران السذاجة (الشكل 6B). وعند 12 ساعة، عاد الحمض النووي الريبي NGF إلى مستويات خط الأساس(الشكل 6B). باستخدام أكتين كجين التدبير المنزلي لPCR الكمية في الوقت الحقيقي، IL-6 مرنا في البشرة خلال C-II كان مرتفعا بشكل ملحوظ (>6 أضعاف) في 6 ساعة مقارنة مع الفئران السذاجة(الشكل 7B). عند 12 ساعة، انخفضت مستويات IL-6 مرنا بشكل ملحوظ من 6 h كميات لكنها ظلت مرتفعة (2-أضعاف) مقارنة مع الفئران السذاجة (الشكل 7B).
الشكل 1: حقن كاراجينان تنتج وذمة مخلب.
تم الحصول على قيمة خط الأساس لكل فأر قبل علاج كاراجينان. بعد 6 ساعة و 12 ساعة من العلاج، زاد سمك مخلب بشكل ملحوظ بالمقارنة مع قيم خط الأساس. يتم التعبير عن النتائج على أنها SEM مع ستة فئران لكل علاج (* p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، *** p < 0.001 ؛ تم إجراء اختبار t للطالب ، غير المدفوع ، ذو الذيلين ، في كل نقطة زمنية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تنتج Thermolysin ورقة من البشرة.
كشف المجهر برايتفيلد ورقة البشرة شفافة ما يقرب من 1 ملم × 2 ملم في الحجم. يمكن تحديد طبقات البشرة مع التركيز من خلال الورقة في التكبير الأعلى. مقياس الشريط = 500 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تلطيخ الأزرق Toluidine من البشرة.
قرر المجهر برايتفيلد أن الهراسين تسبب في فصل فعال للبشرة من الأدمة. ولوحظت التلال rete البشرة (أوتاد البشرة؛ رؤوس الأسهم) جنبا إلى جنب مع المسافات البادئة من الحليمات الجلدية (السهام). كانت جميع طبقات خلايا الكيراتينوسيت سليمة. SB: طبقة basale، SS: الطبقة سبينوسوم، SG: طبقة غرانوبولوسوم، SL: الطبقة لوسيدوم، SC: الطبقة كورنيوم. مقياس الشريط = 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التعبير البروتين NGF في البشرة خلال التهاب الناجمة عن كاراجينان.
تم زيادة مستويات NGF (250٪) بعد 6 ساعة من الالتهاب مقارنة بالحيوانات الساذجة. بعد 12 ساعة، تم تخفيض المستويات مقارنة مع 6 ساعة ولكن تم رفعها (55٪) على النقيض من الحيوانات السذاجة. يتم التعبير عن النتائج على أنها SEM مع ثلاثة فئران لكل مجموعة (* p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، *** p < 0.001 ؛ تم إجراء اختبار الطالب t ، unpaired ، ذو الذيلين في كل نقطة زمنية) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: NGF و PGP9.5 النشاط المناعي (ir) أثناء C-II.
الأعمدة A, B, C تظهر NGF-ir, PGP9.5-ir, و DAPI تلطيخ النووية, بينما الأعمدة A1-C1 تظهر فقط NGF-ir. في جميع الصور، الطبقة القرنية نحو اليسار والطبقة basale نحو اليمين. لم يتم الكشف عن NGF-ir في البشرة التحكم السذاجة (A, A1). في 6 ح C-II (B, B1),NGF-ir كان موجودا في معظم keratinocytes من granulosum الطبقة (السهام القصيرة) وstratum lucidum (السهام الطويلة). وكانت عدد قليل من الخلايا لطبقة سبينوسوم NGF-ir في 6 ساعة C-II (رؤوس الأسهم الكبيرة). في 12 ح C-II (C, C1),NGF-ir وقعت في keratinocytes من الطبقة الجرانوبولوسوم والطبقة لوسيدوم (السهام الطويلة) مع بعض الخلايا في طبقة غرانوبولوسوم بشكل مكثف NGF-ir (السهام القصيرة). في أي وقت من الأوقات تم الكشف عن NGF-ir في طبقة basale أو الطبقة كورنيوم. كانت الألياف العصبية داخل البشرة PGP9.5-ir موجودة في البشرة المنفصلة عن الفئران الساذجة وC-II (رؤوس الأسهم الصغيرة ، A-C). SB: طبقة basale، SS: الطبقة سبينوسوم، SG: ستراتوم غرانوبولوسوم، SL: ستراتوم لوسيدوم. مقياس الشريط = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: NGF مرنا خلال التهاب الناجمة عن كاراجينان.
NGF تم تقييم التعبير مرنا في البشرة يفصل بين بالحرارة خلال C-II من قبل PCR النوعية(A)والكمية في الوقت الحقيقي PCR (B). أظهرت البقع النوعية مرنا (A) لNGF وactin أن هناك نوعية جيدة مرنا التي يمكن تقييمها أثناء الالتهاب. تم تقييم التعبير NGF مرنا في البشرة خلال C-II من قبل PCR الوقت الحقيقي الكمي باستخدام أكتين كجين التدبير المنزلي (B). تم رفع NGF مرنا بشكل ملحوظ (>3 أضعاف) بعد 6 ساعة من C-II مقارنة مع الفئران غير المعالجة السذاجة، ولكن المستويات عادت إلى خط الأساس عند 12 ساعة (B). يتم التعبير عن النتائج على أنها SEM مع ثلاثة فئران لكل مجموعة (* ص < 0.05 ، ** ص < 0.01 ، *** p < 0.001 ؛ تم إجراء اختبار الطالب t ، غير المدفوع ، ذيلين في كل نقطة زمنية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: IL-6 مرنا أثناء الالتهاب الناجم عن الكاراجينان.
IL-6 تم تقييم التعبير مرنا في البشرة التي تفصل بين الحرارة خلال C-II من قبل PCR النوعية(A)والكمية في الوقت الحقيقي PCR (B). وأظهرت البقع النوعية مرنا (A) لIL-6 وactin كان هناك مرنا ذات نوعية جيدة للتقييم أثناء الالتهاب. تم تقييم تعبير IL-6 mRNA في البشرة خلال C-II عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام actin كجين التدبير المنزلي (B). IL-6 مرنا كانت مرتفعة بشكل ملحوظ (>6 أضعاف) بعد 6 ساعة من C-II مقارنة مع الفئران السذاجة غير المعالجة (B). عند 12 ساعة، انخفضت مستويات IL-6 mRNA بشكل كبير من مستويات 6 ساعة ولكنها ظلت مرتفعة (2 أضعاف) مقارنة بالجرذان الساذجة (B). يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط S.E.M. مع اثنين من الفئران لكل مجموعة (* ص < 0.05، ** ص < 0.01، *** ص < 0.001، تم إجراء اختبار الطالب t، غير مدفوع الأجر، ذيلين في كل نقطة زمنية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقررت الدراسة أن البشرة من جلد مخلب الجرذ الخلفي glabrous تم فصلها بسهولة من الأدمة باستخدام الليسين الحراري (0.5 mG/mL) في PBS مع كلوريد الكالسيوم 1 mM في 4 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. وأشار التقييم النسيجي إلى أن البشرة انفصلت عن الأدمة في غشاء الطابق السفلي وأن التلال الشبكية البشرة سليمة. Thermolysin هو metalloendopeptidase خارج الخلية التي تنتجها غرام إيجابية (جيو)عصيات thermoproteolyticus24. نشاطها مستقر عند 4 درجة مئوية ولكنه يعمل على مدى مجموعة واسعة من درجات الحرارة10،24،25. وقد استخدم هذا الانزيم على نطاق واسع لكيمياء البروتين24,25, ولكن أظهرت عدة مجموعات تطبيقه لفصل الجلد في البشرة و / أو الجلد ورقة4,8,10,26,27. وكان والزر وآخرون أول من أبلغ عن انفصال الجلد الجلد باستخدام الهريسين الحراري عند 4 درجات مئوية (250-500 ميكروغرام/مل لمدة ساعة واحدة)10. مع المجهر الخفيف والإلكترون ، تم تحديد الفصل في غشاء الطابق السفلي البشرة بين اللامينين وموقع مستضد pemphigoid الثور10.
وعلاوة على ذلك، تم تعطيل hemidesmosomes، ومرفقات الخلايا القرنية القاعدية إلى غشاء الطابق السفلي، بشكل انتقائي10،29. قارن راكهورست وآخرون الليسين الحراري (4 درجات مئوية، 500 ميكروغرام/مل، بين عشية وضحاها) بفك الجلد لفصل البشرة الجلدية بين الغشاء المخاطي البوكال للأرنب8. Thermolysin كانت غير مكتملة في فصل البشرة المخاطية من الأدمة مما يدل على أن الاختلافات قد تحدث للأنواع، وقت الحضانة، وتكوين الحل (لا CaCl2 لمنع التحلل الذاتي بالحرارة24)،مصدر التحلل الحراري، و / أو الاختلافات الخاصة بالموقع المشار إليها من الدراسات الأخرى10،26،27. يجب على المستخدمين النهائيين للبروتوكول الحالي التأكد من استخدام الثيرموليسين الطازج وتشمل دائما كلوريد الكالسيوم ولكن أيضا يجب أن تكون على بينة من هذه القيود المحتملة.
على الرغم من أن بعض المحققين قد استخدمت thermolysin في 37 °C26,29, مستخدمي هذا البروتوكول يجب أن تضع في اعتبارها للحفاظ على أنسجة الجلد في 4 °C للحفاظ على استقرار البروتين ورنا. استخدمنا DMEM في 4 درجة مئوية كحل للبشرة قبل وبعد فصل الدلسين الحراري بسبب فائدته في الحفاظ على الخلايا في الثقافة28، وقد تم استخدامه سابقا لفصل الجلد مع8،26 ،27،30،31. ومع ذلك، استخدم والزر وآخرون برنامج تلفزيوني معقم مع تكملة مع 200 ميكروغرام / مل streptomycin، 200 U/mL البنسلين، و 2.5 ميكروغرام / مل fungizone10،في حين أن البعض الآخر قد استخدمت وسائل الإعلام المختلفة (على سبيل المثال، وسائل الإعلام ثقافة الكيراتينية خالية من عامل نمو البشرة) تليها PBS الشطف29.
في البروتوكول، تم إجراء فصل الليسين الحراري في 500 ميكروغرام /مل بالحرارة و 5 MM كلوريد الكالسيوم في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة = 8)، على غرار الطريقة الأصلية10. وقد استخدمت DMEM كحل لفصل الحرارة في 4 درجة مئوية (بين عشية وضحاها)8،وقد استخدمت العازلة HEPES بشكل فعال مع محلول 500 ميكروغرام / مل بالحرارة في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة29. ومع ذلك ، لم نستكشف كيف تؤثر المخازن المؤقتة المتوسطة والثقافية أو غيرها على نشاط Thermolysin لفصل البشرة والجلد. كلوريد الكالسيوم هو إضافة هامة لتقليل التحلل الذاتي للتحلل الحراري24،32 وحذف هذه الخطوة قد يؤدي إلى انشقاق غير مكتملة من البشرة من الأدمة8.
يبدو أن حجم عينة الجلد يؤثر على الوقت اللازم لاحتضان اللدائن الحرارية وفعالية الانقسام الأنزيمي للبشرة من الأدمة. يحتاج المحققون إلى تقييم حجم العينة المناسب ووقت الحضانة لأنسجتهم الخاصة. تعويم العينات على محلول الهرموسين مع البشرة التي تواجه التصاعدي مهم لفعالية الانزيم الأمثل10. كما لوحظ سابقا، فإن موقع العمل لthermolysin هو في الخلايا الكيراتينية hemidesmosomes والغشاء الطابق السفلي4،10،29؛ لذلك، يعمل الثيرمولين إلى الداخل من حواف الجلد. من تجربتنا، حواف الجلد منفصلة في وقت سابق من منتصف العينة، وأنه من المهم أن تسمح ما يكفي من الوقت لانزيمية كاملة الانقسام. عندما يكتمل الانقسام ، يجب أن تنسحب البشرة بسهولة من الأدمة. إذا كان لا يزال تعلق، قد يسبب التجاذب على طبقات أجزاء من الأدمة أن يأتي بعيدا مع البشرة.
وهناك قيود على تقنية الترمسين هو الوقت المطلوب. زيادة تركيز الزحم الحراري بعد 500 ميكروغرام / مل لا يقلل من وقت الانفصال وهناك سوء الحفاظ على البشرة بتركيزات أعلى10. تمت مراجعة طرق فصل البشرة الجلدية مؤخرا4، وتأخذ العديد من الطرق 30-60 دقيقة عند 20-40 درجة مئوية. الحرارة (50-60 درجة مئوية) فصل الجلد يحدث بسرعة (30 s إلى 10 دقيقة)4،ولكن من المعروف أن البروتينات ورنا تتحلل بسرعة في مثل هذه درجات الحرارة العالية. بدلا من ذلك، ثيوسيانات الصوديوم (2 N) في RT قد يكون مقبولا تقنية الفصل السريع (5 دقيقة)4،6، ولكن لم تتم دراسة البروتين وسلامة مرنا مع هذه الطريقة6. تم اختيار طريقة الثيرموسين البارد للحفاظ على البروتين والحمار الملكي النيبالي ، ولكن لم تكن هناك مقارنات مباشرة بين سلامة البروتين ورنا باستخدام تقنيات أخرى.
في هذه الدراسة، ثبت الهضم بالحرارة الباردة لتكون وسيلة فعالة لفصل البشرة من الأدمة لتقييم الحمض النووي الريبي وتعديلات البروتين أثناء الالتهاب. خلال الالتهاب الناجم عن الكاراجينان، تم رفع مستويات الحمض النووي الريبي والبروتين ومستويات IL-6 مرنا عند 6 ساعة، وعادت قريبة من خط الأساس بمقدار 12 ساعة. مع الكيمياء المناعية، تم زيادة النشاط المناعي NGF في الخلايا القرنية في 6 ح و 12 ساعة. ميزة طريقة الثيرمولين هي القدرة على إجراء تحليل انتقائي للموقع. على سبيل المثال ، فإن زيادة إنتاج NGF و IL-6 في الدراسة الحالية هي من خلايا القرنية ، حيث يتم استبعاد الخلايا الجلدية من المقايسات. هذه الطريقة تسمح للرؤية في الموقع وأنواع الوسيط لتوعية المحطات afferentالأولية 33. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الطريقة تسمح لفهم أفضل للدورة الزمنية لإنتاج الأعصاب جنبا إلى جنب مع امتصاص والنقل في afferents الأولية خلال التهاب34،35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ أي إفصاحات.
Acknowledgments
تم توفير التمويل لهذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A.
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K.
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E.
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , Volume 1, Chapter 111 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1: Unit 1.2 (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M.
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
