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Immunology and Infection

साइट-विशिष्ट भड़काऊ एमआरएनए और प्रोटीन का पता लगाने के लिए थर्मोलिसिन के साथ चूहा एपिडर्मिस और डर्मिस का पृथक्करण

Published: September 29, 2021 doi: 10.3791/59708
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, Oklahoma State University Center for Health Sciences, 2Institute for Shock Physics, Washington State University
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत भड़काऊ मध्यस्थ उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए डर्मिस से एपिडर्मिस के अलग होने के लिए एक प्रोटोकॉल है। सूजन के बाद, चूहा हिंद पंजा एपिडर्मिस को थर्मोलिसिन द्वारा डर्मिस से 4 डिग्री सेल्सियस पर अलग किया जाता है। एपिडर्मिस का उपयोग पश्चिमी दाग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा आरटी-पीसीआर और प्रोटीन मूल्यांकन द्वारा एमआरएनए विश्लेषण के लिए किया जाता है।

Abstract

त्वचा की चोट, सूजन, और/या संवेदीकरण के दौरान भड़काऊ मध्यस्थों और न्यूरोट्रोफिन के साइट-विशिष्ट उत्पादन को निर्धारित करने के लिए आसान-से-उपयोग और सस्ती तकनीकों की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन का लक्ष्य थर्मोलिसिन का उपयोग करके एक एपिडर्मल-डर्मल सेपरेशन प्रोटोकॉल का वर्णन करना है, जो एक प्रोटीन है जो 4 डिग्री सेल्सियस पर सक्रिय है। इस प्रक्रिया को समझाने के लिए, स्प्राग डावले चूहों को एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है, और सही हिंद पंजे को कैरागेएन के साथ इंजेक्ट किया जाता है। इंजेक्शन के छह और बारह घंटे बाद, सूजन और भोले चूहों के साथ चूहों को इच्छामृत्यु दी जाती है, और हिंद पंजा, ग्लैब्रोस त्वचा का एक टुकड़ा कोल्ड दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम में रखा जाता है। एपिडर्मिस को तब कैल्शियम क्लोराइड के साथ पीबीएस में थर्मोलिसिन द्वारा डर्मिस से बेसमेंट झिल्ली पर अलग किया जाता है। इसके बाद, डर्मिस को माइक्रोडिसेक्शन संदंश द्वारा सुरक्षित किया जाता है, और एपिडर्मिस को धीरे-धीरे छेड़ा जाता है। ऊतक वर्गों के टोलुइडीन नीले दाग बताते हैं कि एपिडर्मिस को तहखाने की झिल्ली पर डर्मिस से सफाई से अलग किया जाता है। सभी केराटिनोसिटे सेल परतें बरकरार रहती हैं, और डर्मल पैपिली से इंडेंटेशन के साथ एपिडर्मल रेट लकीरें स्पष्ट रूप से देखी जाती हैं। गुणात्मक और वास्तविक समय आरटी-पीसीआर का उपयोग तंत्रिका विकास कारक और इंटरल्यूकिन-6 अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। पश्चिमी ब्लॉटिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अंततः तंत्रिका विकास कारक की मात्रा का पता लगाने के लिए किया जाता है। इस रिपोर्ट से पता चलता है कि कोल्ड थर्मोलिसिन पाचन सूजन के दौरान एमआरएनए और प्रोटीन परिवर्तन के मूल्यांकन के लिए डर्मिस से एपिडर्मिस को अलग करने का एक प्रभावी तरीका है।

Introduction

सूजन वाले डर्मिस और एपिडर्मिस1,2,3में पाए जाने वाले कोशिका प्रकारों की विषमता के कारण त्वचा से भड़काऊ मध्यस्थों और न्यूरोट्रोफिक कारकों का मूल्यांकन सीमित हो सकता है । दो परतों के पृथक्करण या मूल्यांकन के लिए सेल वियोजन प्रदर्शन के लिए कई एंजाइमों, रासायनिक, थर्मल, या यांत्रिक तकनीकों की हाल ही में समीक्षा की गई है4। एसिड, क्षार, तटस्थ नमक, और गर्मी डर्मिस से एपिडर्मिस को जल्दी विभाजित कर सकती है, लेकिन सेलुलर और बाह्य सूजन अक्सर5,6होती है। ट्राइप्सिन, पैंक्रियाज, इलास्टेस, केराटिन, कोलेजनेस, प्रोनेस, डिस्पास, और थर्मोलिसिन एंजाइम हैं जिनका उपयोग एपिडर्मल-डर्मल सेपरेशन4,7के लिए किया गया है। ट्रिप्सिन और अन्य व्यापक पैमाने पर प्रोटियोलिटिक एंजाइम 37-40 डिग्री सेल्सियस पर सक्रिय होते हैं, लेकिन एपिडर्मल परतों के वियोजन को रोकने के लिए सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए। डिसपास ने लैमिना डेन्सा में एपिडर्मिस को क्लीव्स किया, लेकिन 37 डिग्री सेल्सियस4, 9 पर ठंड4,8 या उससे कम समय बिंदुओं में पृथक्करण के लिए24घंटे की आवश्यकता होती है। इन सभी तकनीकों की एक सीमित विशेषता ऊतक आकृति विज्ञान और एमआरएनए और प्रोटीन की अखंडता की हानि की संभावित व्यवधान है।

एमआरएनए और प्रोटीन की अखंडता को बनाए रखने के लिए, थोड़े समय के लिए ठंड में त्वचा से जुदाई विधि को किया जाना चाहिए। सूजन अध्ययन के लिए त्वचा जुदाई तकनीकों का मूल्यांकन करने में, थर्मोलिसिन एक प्रभावी एंजाइम है जो4ठंडे तापमान पर डर्मिस से एपिडर्मिस को अलग करता है। थर्मोलिसिन 4 डिग्री सेल्सियस पर सक्रिय है, लैमिना ल्यूसिडा से एपिव्स एपिडर्मल हेमिडेमोसोम, और 1-3 एच4,8,10के भीतर एपिडर्मिस को डर्मिस से अलग करता है। इस रिपोर्ट का लक्ष्य भड़काऊ मध्यस्थों और न्यूरोट्रोफिक कारकों के लिए एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर का पता लगाने के लिए डर्मिस से सूजन चूहे एपिडर्मिस के पृथक्करण के लिए थर्मोलाइजिन के उपयोग का अनुकूलन करना है। कई प्रारंभिक रिपोर्टें11 , 12,13,14,15प्रस्तुत की गई हैं . इस पांडुलिपि का उद्देश्य थर्मोलिसिन का उपयोग करके एक इष्टतम त्वचा पृथक्करण तकनीक का वर्णन करना है और 1) सूजन के मार्कर, 2) इंटरल्यूकिन-6 (आईएल-6) एमआरएनए, और 3) तंत्रिका विकास कारक (एनजीएफ) एमआरएनए और प्रोटीन के साथ चूहों के एपिडर्मिस में कैरागेनन-प्रेरित सूजन (सी-II)16, 17का पता लगाना है। पूर्ण फ्रायंड के एडजुवेंट मॉडल का उपयोग करके एक प्रारंभिक रिपोर्ट इंगित करती है कि एनजीएफ एमआरएनए और प्रोटीन का स्तर सूजन15 के दौरानजल्दी बढ़ जाता है । चूहों में, ऑक्सज़ोलोन के सामयिक अनुप्रयोग के साथ त्वचा संवेदीकरण सीटू संकरण36में उपयोग करके आईएल-6 एमआरएनए में प्रारंभिक वृद्धि का कारण बनता है। आईएल-6 और एनजीएफ दोनों को सी-II18, 19में फंसाया गया है, लेकिन सी-2 के तीव्र चरणों केदौरानविशेष रूप से एपिडर्मिस से आईएल-6 या एनजीएफ के लिए एमआरएनए या प्रोटीन के स्तर का वर्णन करने वाली कोई रिपोर्ट नहीं आई है ।

थर्मोलिसिन तकनीक सस्ती और प्रदर्शन करने के लिए सीधी है। इसके अलावा, डर्मिस से एपिडर्मिस का थर्मोलिसिन पृथक्करण सूजन15की प्रक्रिया के दौरान एमआरएनए, पश्चिमी दाग और भड़काऊ मध्यस्थों और न्यूरोट्रोफिक कारकों के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण की अनुमति देता है। जांचकर्ताओं को त्वचा सूजन के प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अध्ययन दोनों में इस तकनीक का आसानी से उपयोग करने में सक्षम होना चाहिए।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल ओकलाहोमा स्टेट यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर हेल्थ साइंसेज आईएसीयूसी (#2016-03) के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. कैरागेनन-प्रेरित सूजन (सी-II)

  1. एनेस्थेटाइज पुरुष और/या मादा स्प्राग डावले चूहों (200-250 ग्राम; 8-9 सप्ताह पुराना) आइसोफ्लुरेन (या इंजेक्शन एनेस्थेटिक) के साथ।
  2. कॉर्निया को छूकर संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें और बाएं हिंद पंजा को हल्के से पिंच कर लें। जब जानवर उचित रूप से एनेस्थेटाइज्ड होता है, तो कोई कॉर्नियल या पंजा प्रतिक्रिया नहीं देखी जाएगी।
  3. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) 20 में पतला 1% (w/v) λ-कैरागेनन पतला के१००माइक्रोन के साथ सही चमक, हिंद पंजा के साथ सही चमक, हिंद पंजा इंजेक्ट ।
    1. सुनिश्चित करें कि उचित नियंत्रण का उपयोग किया जाता है, जैसे इस रिपोर्ट में आइसोफलून के बिना भोले चूहे। प्रारंभिक अध्ययनों से संकेत मिलता है कि आइसोफलुरेन के साथ या उसके बिना भोले चूहों में एपिडर्मल आईएल-6 और एनजीएफ की एक ही बेसल अभिव्यक्ति है।
      नोट: भोले चूहों को सूजन अध्ययन के लिए पसंदीदा नियंत्रण पसंद किया जाता है क्योंकि चमड़े के नीचे नमकीन या पीबीएस स्थानीय सूजन23, 37का कारणबनतेहैं।
  4. कैरागीनन(चित्र 1)20की प्रभावशीलता की गारंटी देने के लिए सी - 2 चूहों के एडिमा का मूल्यांकन करें । कैलिपर्स के साथ हिंद पंजा प्रपदिकीय मोटाई को मापने के द्वारा एडिमा की मात्रा निर्धारित करें।
  5. 6-12 घंटे में, सीओ2 (या इंजेक्शन एनेस्थेटिक ओवरडोज) के साथ चूहों को इच्छामृत्यु दें और तेज स्केलपेल के साथ ग्लब्रोस हिंद पंजा त्वचा के 1 मिमी x 2 मिमी टुकड़े काटें। यदि बालों वाली त्वचा का उपयोग किया जाता है, तो त्वचा के 1 मिमी x 2 मिमी टुकड़ों को काटने से पहले इसे शेव करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि विशिष्ट अध्ययनों के अनुसार उचित टाइमपॉइंट चुने जाते हैं।
  6. माइक्रोडिसेक्शन संदंश का उपयोग करके, त्वचा को बर्फ पर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में ठंडे दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के 1 एमएल में स्थानांतरित करें और 15-60 मिनट तक ठंडा रखें।

2. एपिडर्मिस और डर्मिस का थर्मोलिसिन जुदाई

  1. थर्मोलिसिन तैयार करें और सक्रिय करें।
    1. पीएच = 8 (एकाग्रता 500 माइक्रोग्राम/एमएल) में पीबीएस के 10 एमएल में 5 मिलीग्राम जियोबेसिलस स्टेरथरमोफिलस जोड़कर थर्मोलिसिन का समाधान तैयार करें।
    2. डिस्टिल्ड एच2 ओ के 10 एमएल में 1.11 ग्राम जोड़कर कैल्शियम क्लोराइड (सीएसीएल 2 निर्जल) का1एम घोल तैयार करें।
    3. थर्मोलिसिन के ऑटोलिसिस को रोकने के लिए, थर्मोलिसिन समाधान के 10 एमएल में कैल्शियम क्लोराइड के 10 माइक्रोन जोड़ें। कैल्शियम क्लोराइड अंतिम एकाग्रता 1 mM होगा।
    4. अलीकोट बर्फ पर एक 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के 10 कुओं में सक्रिय थर्मोलिसिन के 1 ml ।
  2. डर्मिस से एपिडर्मिस को अलग करने के लिए थर्मोलिसिन एंजाइम पाचन का उपयोग करें।
    1. माइक्रोडिसेक्शन संदंश का उपयोग करके, सक्रिय थर्मोलिसिन के प्रत्येक कुएं में एक त्वचा के नमूने को स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि थर्मोलिसिन समाधान में त्वचा को विसर्जित न करें।
    2. धीरे-धीरे त्वचा को कुएं के किनारे टैप करें ताकि थर्मोलिसिन समाधान पर तैरने के लिए संदंश से त्वचा के नमूने को जारी करने में सहायता की जा सके।
    3. त्वचा को थर्मोलिजिन समाधान में स्ट्रैटम कॉर्नियम (बाहरी एपिडर्मिस) साइड अप और नीचे का सामना करने वाले डर्मिस के साथ फ्लोट करें। यह महत्वपूर्ण है कि डर्मिस नीचे का सामना करते हैं, या प्रभावी अलगाव नहीं होगा।
      नोट: थर्मोलिसिन इनक्यूबेशन के लिए समय की मात्रा अंत उपयोगकर्ता द्वारा अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। ग्लैब्रूस, स्प्राग डावले चूहों (200-250 ग्राम; 8-9 सप्ताह पुराने) से हिंद पंजा त्वचा को अक्सर जुदाई के लिए 2.0-2.5 घंटे की आवश्यकता होती है। इनक्यूबेशन समय प्रजातियों और उम्र के साथ भिन्न होने की उम्मीद है।
    4. थर्मोलिसिन में उचित इनक्यूबेशन समय के बाद, एक त्वचा के नमूने को 6 अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोडिसेक्शन संदंश का उपयोग करें, जिसमें 7-8 मिलील ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) डीएमईएम है। यह डर्मिस से एपिडर्मिस को अलग करने के लिए अधिक कमरे की अनुमति देता है।
    5. त्वचा को डीएमईएम में विसर्जित करें।
    6. सीमाओं पर लगभग पारदर्शी एपिडर्मिस मनाए जाने तक त्वचा की परिधि के चारों ओर संदंश के साथ एपिडर्मिस को धीरे-धीरे ब्रश करें। यदि इसे प्राप्त नहीं किया जा सकता है, तो त्वचा के नमूने को 15-30 मिनट के लिए थर्मोलाइजिन समाधान में वापस करें।
    7. एक बार एपिडर्मिस डर्मिस से काफी अलग हो जाता है, फिर सावधानी से एपिडर्मिस और डर्मिस दोनों को माइक्रोडिसेक्शन संदंश के साथ पकड़ें और बहुत धीरे-धीरे डर्मिस से एपिडर्मिस खींचें।
    8. अलग एपिडर्मिस की पारक्रंतरण का मूल्यांकन करें और सुनिश्चित करें कि यह ऑप्टिकल रूप से सुसंगत है। चूहा एपिडर्मिस के 1 मिमी x 2 मिमी नमूने के उदाहरण के लिए चित्र 2 देखें। यदि पारण में भिन्नता है, तो उचित पृथक्करण नहीं हुआ है ।
  3. एपिडर्मिस और डर्मिस के अलग टुकड़ों में एथिलेंडिमीनटेट्राएक्टेटिक एसिड (ईडीटीए) का उपयोग करके थर्मोलिसिन को निष्क्रिय करें।
    सावधानी: एपिडर्मिस और डर्मिस में रहने वाला थर्मोलिसिन अभी भी सक्रिय है और निष्क्रिय नहीं होने पर परतों को नुकसान पहुंचा सकता है।
    1. 0.5 एम ईडीटीए स्टॉक समाधान तैयार करें। ऐसा करने के लिए, धीरे-धीरे डबल-डिस्टिल्ड पानी के 5 एमएल में 0.93 ग्राम ईडीटीए जोड़ें। समाधान में सोडियम हाइड्रोक्साइड जोड़ें जब तक कि यह साफ न हो जाए। सुनिश्चित करें कि समाधान का पीएच ~ 8.0 है।
    2. डीएमईएम में 5 एमएम ईडीए समाधान बनाएं। डीएमईएम के 25 एमएल में 0.5 एम ईड्टा स्टॉक सॉल्यूशन का 0.25 एमएल जोड़ें।
    3. थर्मोलिसिन की गतिविधि को निष्क्रिय करने के लिए 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 एमएम ईडीटीए/डीएमईएम समाधान में अलग हुए एपिडर्मिस और डर्मिस रखें।
  4. 8 ,9,10के साथ एपिडर्मिस का मूल्यांकन करें ।
    1. 10% तटस्थ फॉर्मेलिन, 4% पैराफॉर्मलडिहाइड, या 0.25% पैराफॉर्मल्डिहाइड में एपिडर्मिस के एक हिस्से को 1 घंटे के लिए 0.8% पिरिक एसिड समाधान के साथ स्थिर करें आंदोलन के साथ कमरे के तापमान (आरटी) पर।
    2. आंदोलन के साथ आरटी में 1 घंटे के लिए पीबीएस में 10% सुक्रोज में फिक्स्ड एपिडर्मिस रखें।
    3. सेक्शनिंग के लिए एक ऊतक एम्बेडिंग मैट्रिक्स में एपिडर्मिस को फ्रीज करें। जिलेटिन-लेपित ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर क्रायोस्टेट और गल-माउंट सेक्शन का उपयोग करके 14 माइक्रोन क्रॉस-सेक्शन काटें।
    4. 90 एस के लिए टोलुइडीन ब्लू (टीबी; 1% सोडियम क्लोराइड में 10% टीबी) के काम के समाधान के साथ एक स्लाइड गर्म और दाग पर शुष्क खंड। एक जलीय बढ़ते माध्यम के साथ Appose कवर्लिप्स।
    5. 50x-250x पर ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ एपिडर्मिस का निरीक्षण करें।
      नोट: यदि उचित अलगाव हुआ है, तो एपिडर्मिस को डर्मिस से साफ-सुथरा किया जाएगा और पांच परतों का पता लगाया जाएगा: स्ट्रैटम बेसले, स्ट्रैटम स्पिनोसम, स्ट्रैटम ग्रेनुलोसम, स्ट्रैटम ल्यूसिडम, और स्ट्रैटम कॉर्नियम। अलग चूहे की त्वचा एपिडर्मिस का एक उदाहरण चित्र 3में देखा जा सकता है।

3. प्रोटीन निष्कर्षण और पश्चिमी दाग विश्लेषण

  1. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल21का उपयोग करके अलग किए गए ऊतक नमूनों पर पश्चिमी धब्बा लगाते हैं ।
  2. लाइसिस बफर (25mM Tris HCl, पीएच = 7.4, 150 mM NaCl, 1 m EDTA, 5% ग्लाइसरोल, और 1% ट्राइटन एक्स-100) के 50 माइक्रोन में एपिडर्मिस को समरूप ढंग से करें जिसमें फॉस्फेट और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल शामिल है।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक अधिकतम गति से सेंट्रलाइज नमूने और एक प्रोटीन परख किट का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता के लिए सुपरनेट का मूल्यांकन ।
  4. एसडीएस जैल पर प्रोटीन (30 माइक्रोग्राम) की समान सांद्रता लोड करें, इलेक्ट्रोफोरेसिस करें, और फिर प्रोटीन को नाइट्रोसेल्यूलोज या पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें।
  5. 2 घंटे के लिए 5% दूध के साथ झिल्ली ब्लॉक और प्राथमिक एंटीबॉडी में रात भर इनक्यूबेट (माउस विरोधी एनजीएफ, E12, 1:1000) ।
  6. 10 मिनट प्रत्येक के लिए 0.3% ट्वीन के साथ पीबीएस के साथ 3x धोएं और एक लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, क्षारीय फॉस्फेट लेबल खरगोश एंटी-माउस आईजीजी)।
  7. पश्चिमी दाग संकेत (जैसे, ईसीएफ सब्सट्रेट और एक इमेजिंग प्लेटफॉर्म) का मूल्यांकन करने के लिए एक स्कैनिंग सिस्टम का उपयोग करें।

4. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. इष्टतम इम्यूनोरेएक्टिविटी के लिए एक फिक्सेटिव में ऊतक के नमूनों को रखें: 0.96% (w/v) पिरिक एसिड और 0.2% (w/v) फॉर्मलडिहाइड में 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच = 7.321,22,23 आरटी में 4 एच के लिए स्थानांतरण।
  2. ऊतक खंड 21 , 22,23पर मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करें ।
  3. जानवरों से एपिडर्मिस को मैट्रिक्स एम्बेड करने में एक जमे हुए ब्लॉक में एम्बेड करें और क्रायोस्टेट पर 10-30 माइक्रोन सेक्शन काट लें। जिलेटिन-लेपित, ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों माउंट और 2 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सूखी ।
  4. पीबीएस में तीन, 10 मिनट कुल्ला के लिए वर्गों को धोएं और प्राथमिक एंटीसेरा में 24-96 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, [उदाहरण के लिए, माउस एंटी-एनजीएफ (E12, 1:2000)] और खरगोश विरोधी प्रोटीन जीन उत्पाद 9.9 (पीजीपी 9.5, 1:2000) 0.3% (w/v) ट्राइटन एक्स-100 (पीबीएस-टी) पीबीएस-टी वाले 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 0.5% पॉलीविनाइलपाइरोलिओलिडोन (पीवीपी) वाले पीबीएस में पतला।
  5. प्राथमिक एंटीसेरम इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस में 10 मिनट के लिए तीन बार वर्गों कुल्ला और एलेक्सा फ्लोर में आरटी में 1 एच इनक्यूबेट ४८८ गधा विरोधी खरगोश IgG (1:1000) और एलेक्सा फ्लोर ५५५ गधा विरोधी माउस IgG (1:1000) PBS-टी में पतला ।
  6. पीबीएस में 10 मिनट के लिए तीन बार अनुभागों कुल्ला और इम्यूनोफ्लोरेसेंस की लुप्त होती मंद करने के लिए गैर लुप्त होती बढ़ते माध्यम के साथ कवर्लिप्स प्रत्यय ।

5. आरएनए अलगाव और सीडीएनए संश्लेषण

  1. त्वचा के नमूनों पर मानक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर)करें 21। एक फिनोल, ग्वानिडीन आइसोथियोसायनेट समाधान का उपयोग करके कुल आरएनए को अलग करें।
  2. मोलोनी मुरीन ल्यूकेमिया वायरस रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस द्वारा पूरक डीएनए संश्लेषण करें।
  3. एनजीएफ और आईएल-6 प्रवर्धन के लिए निम्नलिखित प्राइमर दृश्यों का उपयोग करें:
    एनजीएफ (सेंस) - GTGGACCCCAAACTTTTAAGAAACGG
    एनजीएफ (एंटीसेंस) - जीटीजीजीटीसीटीसीटीजीटीगागागागगटटक्काटैग
    आईएल-6 (सेंस) - GCAATTCTGATTTGATGATGATGC;
    आईएल-6 (एंटीसेंस) - GTAGAAGAAGAAACTAGAAGAAGAAGAAGAAGA
  4. एनजीएफ और आईएल-6 एमआरएनए के स्तरों की तुलना β-ऐक्टिन हाउसकीपिंग जीन से करें:
    β-ACTIN (भावना)-TGCGTGACATTAAGAAGACTGTGCTATG
    β-ऐक्टिन (एंटीसेंस) - GAACCGCTCATCATTGTAGTAGGATGA
  5. क्यूआरटी-पीसीआर सिस्टम का उपयोग करके थर्मल साइकिल चालक और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) का उपयोग करके गुणात्मक आरटी-पीसीआर के साथ मूल्यांकन करें।

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Representative Results

चूहे के पिछले पंजा में कैरागीन इंजेक्शन के कारण सूजन के क्लासिक लक्षण जैसे लालिमा और एडिमा16,17। हिंद पंजा की सूजन को यांत्रिक कैलिपर्स20से मापा गया था । कैरागीन उपचार से पहले प्रत्येक चूहे के लिए पंजा की मोटाई का एक आधारभूत मूल्य प्राप्त किया गया था और 6 एच और 12 घंटे में फिर से मापा गया था। बेसलाइन मूल्यों(चित्र 1)की तुलना में पंजा मोटाई में काफी वृद्धि हुई थी।

थर्मोलिसिन चूहे ग्लैब्रस हिंद पंजा त्वचा के इनक्यूबेशन एपिडर्मिस की एक चादर का उत्पादन किया। ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग एपिडर्मिस और डर्मिस(चित्र 2)के थर्मोलिसिन पृथक्करण की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। उच्च आवर्धन पर शीट के माध्यम से ध्यान केंद्रित करते हुए एपिडर्मिस की परतों का निर्धारण किया जा सकता है। एपिडर्मल क्रॉस सेक्शन के टोलुइडीन ब्लू स्टेनिंग से पता चला कि एपिडर्मिस को बेसमेंट झिल्ली(चित्रा 3)पर डर्मिस से अलग कर दिया गया था। डर्मल पैपिले से इंडेंटेशन के साथ एपिडर्मल रेट रिज (एपिडर्मल खूंटे) बरकरार थे। सभी केराटिनोसिटे सेल परतों को देखा गया।

थर्मोलिसिन-अलग एपिडर्मिस के पश्चिमी ब्लॉटिंग ने 4 डिग्री सेल्सियस पर तकनीक के दौरान स्थिर प्रोटीन के स्तर को दर्शाते हुए लगातार परिणाम का उत्पादन किया। भोले चूहे एपिडर्मिस में बहुत कम एनजीएफ प्रोटीन का पता चला, लेकिन भोले जानवरों(चित्रा 4)की तुलना में सी-II के 6 एच के बाद एनजीएफ प्रोटीन का स्तर (250%) को बढ़ाया गया। सी-II के 12 घंटे के बाद, एनजीएफ का स्तर 6 घंटे की तुलना में कम हो गया था, लेकिन नियंत्रण के सापेक्ष ऊंचा (55%) बना रहा। अलग एपिडिमिस में एनजीएफ के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने विश्वसनीय इम्यूनोदाता प्रदान की और पश्चिमी ब्लॉट्स(चित्र 5)से परिणामों की पुष्टि की। भोले नियंत्रण एपिडर्मिस में एनजीएफ-इम्यूनोरेएक्टिविटी (आईआर) का पता नहीं चला, लेकिन 6 एच सी-II में स्ट्रैटम ग्रैनुलोसम और स्ट्रैटम ल्यूसिडम के अधिकांश केराटिनोसाइट्स में एनजीएफ-आईआर था। स्ट्रैटम स्पाइनोम के लिए कुछ कोशिकाएं 6 एच सी-II में एनजीओएफ-इम्यूनोरेएक्टिव (आईआर) थीं। 12 एच सी-II में, एनजीएफ-आईआर स्ट्रैटम ग्रैनुलोसम और स्ट्रैटम ल्यूसिडम के केराटिनोसाइट्स में हुआ, जिसमें स्ट्रैटम ग्रैनुलोसम तीव्रता से एनजीएफ-आईआर में कुछ कोशिकाओं के साथ हुआ। किसी भी समय पर एनजीएफ-आईआर को स्ट्रैटम बेसेल या स्ट्रैटम कॉर्नियम में पता नहीं लगाया गया था। PGP9.5-IR इंट्रापिडरमल, वैरिकाज़ तंत्रिका फाइबर भोले और सी-II चूहों(चित्रा 5)से अलग एपिडर्मिस में मौजूद थे।

गुणात्मक आरटी-पीसीआर ने दिखा दिया कि थर्मोलिसिन-अलग एपिडर्मिस(चित्रा 6A, चित्रा 7A)से अच्छी गुणवत्ता वाले एमआरएनए थे। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर के लिए एक हाउसकीपिंग जीन के रूप में actin का उपयोग करना, सी-II के दौरान एपिडर्मिस में एनजीएफ एमआरएनए अभिव्यक्ति भोले चूहों(चित्रा 6B)की तुलना में 6 घंटे में काफी ऊंचा (>3 गुना) था। 12 घंटे में, एनजीएफ एमआरएनए बेसलाइन स्तर(चित्र 6B)पर लौट आया। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर के लिए एक हाउसकीपिंग जीन के रूप में ऐक्टिन का उपयोग करना, सी-II के दौरान एपिडर्मिस में आईएल-6 एमआरएनए को भोले चूहों(चित्रा 7B)की तुलना में 6 घंटे में काफी ऊंचा (>6 गुना) किया गया था। 12 घंटे में, आईएल-6 एमआरएनए का स्तर 6 एच मात्रा से काफी गिरा, लेकिन भोले चूहों(चित्रा 7B)की तुलना में ऊंचा (2 गुना) बना रहा।

Figure 1
चित्रा 1: कैरागेएन इंजेक्शन पंजा एडिमा पैदा करता है।
कैरागेएनन उपचार से पहले प्रत्येक चूहे के लिए एक आधारभूत मूल्य प्राप्त किया गया था। उपचार के 6 घंटे और 12 घंटे के बाद, पंजा मोटाई बेसलाइन मूल्यों की तुलना में काफी बढ़ गई। परिणाम उपचार के प्रति छह चूहों के साथ एसईएम के रूप में व्यक्त कर रहे है (* पी < ०.०५, * * पी < ०.०१, * * * पी < ०.००१; छात्र का टी-टेस्ट, अकीदत, दो पूंछ, प्रत्येक समय बिंदु पर किया गया था) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: थर्मोलिसिन एपिडर्मिस की एक चादर पैदा करता है।
ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी ने आकार में लगभग 1 मिमी x 2 मिमी एक पारदर्शी एपिडर्मल शीट का पता चला। उच्च आवर्धन पर शीट के माध्यम से ध्यान केंद्रित करते हुए एपिडर्मिस की परतों का निर्धारण किया जा सकता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एपिडर्मिस का टोलुइडीन ब्लू धुंधला।
ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी ने निर्धारित किया कि थर्मोलिज़िन ने डर्मिस से एपिडर्मिस का प्रभावी अलगाव किया। डर्मल पैपिली (तीर) से इंडेंटेशन के साथ एपिडर्मल रेट लकीरें (एपिडर्मल खूंटे; एरोहेड) देखे गए। सभी केराटिनोसिटे सेल परतें बरकरार थीं। एसबी: स्ट्रैटम बेसले, एसएस: स्ट्रैटम स्पिनोसम, एसजी: स्ट्रैटम ग्रैनुलोसम, एसएल: स्ट्रैटम ल्यूसिडम, एससी: स्ट्रैटम कॉर्नियम। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: कैरागेएन-प्रेरित सूजन के दौरान एपिडर्मिस में एनजीएफ प्रोटीन अभिव्यक्ति।
भोले जानवरों की तुलना में 6 एच सूजन के बाद एनजीएफ का स्तर (250%) बढ़ाया गया था। 12 घंटे के बाद, स्तर 6 घंटे की तुलना में कम हो गए थे, लेकिन भोले जानवरों के विपरीत (५५%) परिणाम प्रति समूह तीन चूहों के साथ SEM के रूप में व्यक्त कर रहे है (* पी < ०.०५, * * पी < ०.०१, * * * पी < ०.००१; छात्र का टी-टेस्ट, अप्रूव्ड, दो पूंछ प्रत्येक समय बिंदु पर किया गया था) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सी-II के दौरान एनजीएफ और पीजीपी9.5 इम्यूनोरेएक्टिविटी (आईआर) ।
कॉलम ए, बी, सी शो एनजीएफ-आईआर, PGP9.5-ir, और DAPI परमाणु धुंधला, जबकि कॉलम एक1-सी1 केवल NGF-ir दिखाते हैं । सभी छवियों में, स्ट्रेटम कॉर्नियम बाईं ओर है और स्ट्रैटम बेसले दाईं ओर है। NGF-ir भोली नियंत्रण एपिडर्मिस (ए, ए1)में पता नहीं चला था । 6 एच सी-II (बी, बी1)में, एनजीएफ-आईआर स्ट्रैटम ग्रैनुलोसम (छोटे तीर) और स्ट्रैटम ल्यूसिडम (लंबे तीर) के अधिकांश केराटिनोसाइट्स में मौजूद था। स्ट्रैटम स्पिनोसम के लिए कुछ कोशिकाएं 6 एच सी-II (बड़े एरोहेड) में एनजीओएफ-आईआर थीं। 12 घंटे सी-II (सी, सी1)में, एनजीएफ-आईआर स्ट्रैटम ग्रैनुलोसम और स्ट्रैटम ल्यूसिडम (लंबे तीर) के केराटिनोसाइट्स में हुआ, जिसमें स्ट्रैटम ग्रैनुलोसम में कुछ कोशिकाओं के साथ तीव्रता से एनजीएफ-आईआर (शॉर्ट एरो) हो गए। किसी भी समय पर एनजीएफ-आईआर को स्ट्रैटम बेसेल या स्ट्रैटम कॉर्नियम में पता नहीं लगाया गया था। PGP9.5-ir इंट्रापिडरमल तंत्रिका फाइबर भोले और सी-II चूहों (छोटे एरोहेड, ए-सी) से अलग एपिडर्मिस में मौजूद थे। एसबी: स्ट्रैटम बेसले, एसएस: स्ट्रैटम स्पिनोसम, एसजी: स्ट्रैटम ग्रैनुलोसम, एसएल: स्ट्रैटम ल्यूसिडम। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: कैरागीन-प्रेरित सूजन के दौरान एनजीएफ एमआरएनए।
सी-2 के दौरान थर्मोलिसिन-अलग एपिडर्मिस में एनजीएफ एमआरएनए अभिव्यक्ति का मूल्यांकन गुणात्मक पीसीआर(ए)और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर(बी)द्वारा किया गया था। एनजीएफ और ऐक्टिन के लिए गुणात्मक एमआरएनए ब्लॉट्स (ए) ने प्रदर्शन किया कि सूजन के दौरान अच्छी गुणवत्ता वाले एमआरएनए का मूल्यांकन किया जा सकता है। सी-II के दौरान एपिडर्मिस में एनजीएफ एमएनए अभिव्यक्ति का मूल्यांकन मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा एक हाउसकीपिंग जीन (बी) के रूप में ऐक्टिन का उपयोग करके किया गया था। NGF mRNA काफी ऊंचा था (>३ गुना) सी के 6 घंटे के बाद-द्वितीय भोली अनुपचारित चूहों की तुलना में, लेकिन स्तर 12 घंटे (बी) पर बेसलाइन पर लौट आए । परिणाम प्रति समूह तीन चूहों के साथ SEM के रूप में व्यक्त कर रहे है (* पी < ०.०५, * * पी < ०.०१, * * * पी < ०.००१; छात्र का टी-टेस्ट, अकर्मित, दो पूंछ हर समय बिंदु पर किया गया था) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: कैरागीन-प्रेरित सूजन के दौरान आईएल-6 एमआरएनए।
सी-2 के दौरान थर्मोलिसिन-अलग एपिडर्मिस में आईएल-6 एमआरएनए अभिव्यक्ति का मूल्यांकन गुणात्मक पीसीआर(ए)और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर(बी)द्वारा किया गया था। आईएल-6 और ऐक्टिन के लिए गुणात्मक एमआरएनए ब्लॉट्स (ए) ने दिखाया कि सूजन के दौरान मूल्यांकन के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले एमआरएनए थे। सी-II के दौरान एपिडर्मिस में आईएल-6 एमआरएनए अभिव्यक्ति का मूल्यांकन मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा एक हाउसकीपिंग जीन (बी) के रूप में ऐक्टिन का उपयोग करके किया गया था। आईएल-6 एमआरएनए को भोली अनुपचारित चूहों (बी) की तुलना में सी-II के 6 घंटे के बाद काफी ऊंचा (>6 गुना) किया गया था। 12 घंटे में, आईएल-6 एमआरएनए का स्तर 6 एच के स्तर से काफी कम हो गया था लेकिन भोले चूहों (बी) की तुलना में ऊंचा (2 गुना) बना रहा। परिणाम प्रति समूह दो चूहों के साथ मतलब एसई.M के रूप में व्यक्त किए जाते हैं (* पी < ०.०५, * * पी < ०.०१, * * * पी < ०.००१, छात्र का टी-टेस्ट, अपॉयर्ड, दो पूंछ हर समय बिंदु पर किया गया था) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

अध्ययन में यह निर्धारित किया गया है कि चूहे हिंद पंजा ग्लैब्रस त्वचा का एपिडर्मिस पीबीएस में थर्मोलिसिन (०.५ एमजी/एमएल) का उपयोग करके डर्मिस से आसानी से अलग हो गया था, जिसमें 2.5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 mm कैल्शियम क्लोराइड था। हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन ने संकेत दिया कि एपिडर्मिस को बेसमेंट झिल्ली पर डर्मिस से अलग किया गया था और एपिडर्मल रेट लकीरें बरकरार थीं। थर्मोलिसिन एक एक्सट्रासेलुलर मेटल्लोएंडोपेप्टिडेस है जो ग्राम-पॉजिटिव(जियो)बैसिलस थर्मोप्रोटेओलिटिकस24द्वारा उत्पादित है। इसकी गतिविधि 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है , लेकिनयह 10,24,25के तापमान की एक विस्तृत श्रृंखला पर कार्य कर रही है । इस एंजाइम का उपयोग प्रोटीनरसायन 24,25के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है , लेकिन कई समूहों ने त्वचा के पृथक्करण के लिए अपने आवेदन को एपिडर्मल और/या डर्मलशीट्स 4, 8 ,10,26,27में दिखाया है । वाल्जर एट अल 4 डिग्री सेल्सियस (250-500 μg/1 h के लिए एमएल)10पर थर्मोलिसिन का उपयोग कर मानव त्वचा के एपिडर्मल-डर्मल जुदाई की रिपोर्ट करने वाले पहले थे । प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ, लेमिनिन और बुलस पेम्फिगोइड एंटीजन साइट10के बीच एपिडर्मल बेसमेंट झिल्ली में पृथक्करण होने की ठान ली थी।

इसके अलावा, हेमिडेमोसोम, बेसल केराटिनोसाइट्स के बेसल केराटिनोसाइट्स के अटैचमेंट, चुनिंदा10,29को बाधित किया गया था। Rakhorst एट अल थर्मोलिसिन (4 डिग्री सेल्सियस, ५०० μg/mL, रातोंरात) की तुलना में खरगोश बुककल म्यूकोसा8के एपिडर्मल-डर्मल जुदाई के लिए dispase । थर्मोलिसिन डर्मिस से म्यूकोसल एपिडर्मिस को अलग करने में अधूरा था, जो यह दर्शाता है कि प्रजातियों के लिए मतभेद हो सकते हैं, इनक्यूबेशन समय, समाधान संरचना (थर्मोलिसिन ऑटोलिसिस24 को रोकने के लिए कोई सीएसीएल2),थर्मोलिसिन का स्रोत, और/या साइट-विशिष्ट अंतर अन्य अध्ययनों से इंगित10,26,27। वर्तमान प्रोटोकॉल के अंतिम उपयोगकर्ताओं को ताजा थर्मोलिसिन का उपयोग करना सुनिश्चित करना चाहिए और हमेशा कैल्शियम क्लोराइड शामिल करना चाहिए लेकिन इन संभावित सीमाओं के बारे में भी पता होना चाहिए।

हालांकि कुछ जांचकर्ताओं ने थर्मोलिसिन का उपयोग 37 डिग्री सेल्सियस26, 29पर किया है, लेकिन इस प्रोटोकॉल के उपयोगकर्ताओं को प्रोटीन और एमआरएनए कीस्थिरताको बनाए रखने के लिए त्वचा के ऊतकों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए ध्यान रखना चाहिए। हमने थर्मोलिसिन पृथक्करण से पहले और बाद में त्वचा के लिए एक समाधान के रूप में डीएमईएम का उपयोग किया क्योंकि संस्कृति 28 में कोशिकाओं को बनाए रखने में इसकी उपयोगिता थी और इसका उपयोग पहले थर्मोलिसिन 8 ,26,27,30,31केसाथ त्वचा के पृथक्करण के लिए किया जाता था। हालांकि, वाल्जर एट अल का इस्तेमाल बाँझ पीबीएस 200 μG/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन, 200 यू/एमएल पेनिसिलिन, और 2.5 μg/mL कवकजोन10के साथ पूरक है, जबकि अन्य ने विभिन्न मीडिया (जैसे, केराटिनोसाइट संस्कृति मीडिया एपिडरलल ग्रोथ फैक्टर से मुक्त) का उपयोग कियाहै।

प्रोटोकॉल में थर्मोलिशिन सेपरेशन 500 माइक्रोग्राम/एमएल थर्मोलिसिन और 5 एमएम कैल्शियम क्लोराइड में पीबीएस (पीएच = 8) में किया गया था, जो मूल विधि10के समान था। डीएमईएम का उपयोग थर्मोलिसिन पृथक्करण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (रात भर)8पर समाधान के रूप में किया गया है, और एचईपीईएस बफर का उपयोग प्रभावी रूप से 2 घंटे29के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 500 μG/एमएल थर्मोलिसिन समाधान के साथ किया गया है। हालांकि, हमने यह पता नहीं लगाया कि कैसे संस्कृति माध्यम या अन्य बफ़र्स एपिडर्मल-डर्मल अलगाव के लिए थर्मोलिसिन की गतिविधि को प्रभावित करते हैं। कैल्शियम क्लोराइडथर्मोलिसिन 24,32 के ऑटोलिसिस को कम करने के लिए एक महत्वपूर्ण जोड़ है और इस कदम को हटाने से डर्मिस8से एपिडर्मिस का अधूरा दरार हो सकता है।

त्वचा के नमूने का आकार थर्मोलिसिन इनक्यूबेशन के लिए आवश्यक समय और डर्मिस से एपिडर्मिस के एंजाइमेटिक दरार की प्रभावशीलता को प्रभावित करता प्रतीत होता है। जांचकर्ताओं को अपने ऊतकों के लिए उपयुक्त नमूना आकार और इनक्यूबेशन समय का मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। थर्मोलिसिन के घोल पर नमूनों को ऊपर की ओर ले जाने वाले एपिडर्मिस के साथ तैरना इष्टतम एंजाइम प्रभावशीलता के लिए महत्वपूर्ण है10. जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, थर्मोलिसिन के लिए कार्रवाई की साइट केराटिनोसाइट हेमिडेमोसोम्स और बेसमेंट झिल्ली4,10,29पर है; इसलिए, थर्मोलिसिन त्वचा के किनारों से अंदर की ओर काम करता है। हमारे अनुभव से, त्वचा किनारों नमूने के बीच की तुलना में पहले अलग है, और यह पूर्ण एंजाइमेटिक दरार के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है । जब दरार पूरी हो जाती है, तो एपिडर्मिस को डर्मिस से आसानी से दूर खींच देना चाहिए। यदि अभी भी संलग्न है, परतों पर tugging डर्मिस के कुछ हिस्सों के कारण एपिडर्मिस के साथ दूर आ सकता है ।

थर्मोलिसिन तकनीक की एक सीमा आवश्यक समय है। थर्मोलिसिन एकाग्रता को 500 माइक्रोन/एमएल से अधिक बढ़ाने से पृथक्करण का समय कम नहीं होता है और उच्च सांद्रता10पर एपिडर्मिस का खराब संरक्षण होता है । एपिडरमल-डर्मल सेपरेशन विधियों की हाल ही में4समीक्षा की गई है, और कई तरीकों में 20-40 डिग्री सेल्सियस पर 30-60 मिनट का समय लग जाता है। गर्मी (50-60 डिग्री सेल्सियस) त्वचा का पृथक्करण जल्दी (30 एस से 10 मिनट) 4 होता है, लेकिन प्रोटीन और एमआरएनए ऐसे उच्च तापमान पर जल्दी से नीचा करने के लिए जानाजाताहै। वैकल्पिक रूप से, आरटी में सोडियम थिओसाइनेट (2 एन) एक स्वीकार्य रैपिड सेपरेशन तकनीक (5 मिनट)4,6हो सकती है, लेकिन इस विधि के साथ प्रोटीन और एमआरएनए अखंडता का अध्ययन नहीं किया गया है6। ठंड थर्मोलिसिन विधि प्रोटीन और एमएनए के संरक्षण के लिए चुना गया था, लेकिन अन्य तकनीकों का उपयोग कर प्रोटीन और एमआरएनए अखंडता के बीच कोई सीधी तुलना नहीं की गई थी।

वर्तमान अध्ययन में, ठंडे थर्मोलिसिन पाचन को सूजन के दौरान एमआरएनए और प्रोटीन परिवर्तन के मूल्यांकन के लिए डर्मिस से एपिडर्मिस को अलग करने के लिए एक प्रभावी तरीका होने का प्रदर्शन किया जाता है। कैरागीन-प्रेरित सूजन के दौरान, एनजीएफ एमआरएनए और प्रोटीन का स्तर और आईएल-6 एमआरएनए स्तर 6 घंटे में ऊंचा किया गया था, जो 12 घंटे तक बेसलाइन के करीब लौट रहा था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ, एनजीएफ इम्यूनोरेएक्टिविटी 6 एच और 12 घंटे में केराटिनोसाइट्स में बढ़ गई थी। थर्मोलिसिन विधि का एक लाभ साइट-चयनात्मक विश्लेषण करने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, वर्तमान अध्ययन में एनजीएफ और आईएल-6 का बढ़ा हुआ उत्पादन केराटिनोसाइट्स से है, क्योंकि डर्मल कोशिकाओं को परख से बाहर रखा गया है। यह विधि प्राथमिक अफ़रीद टर्मिनल33के संवेदीकरण के लिए स्थान और मध्यस्थ प्रकारों की जानकारी देती है । इसके अलावा, यह विधि सूजन34, 35के दौरान प्राथमिक अफरेंट्स में तेज और परिवहन के साथ-साथ न्यूरोट्रोफिन उत्पादन के समय पाठ्यक्रम को बेहतरीसे समझने की अनुमति देती है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई खुलासे नहीं हैं ।

Acknowledgments

इस शोध के लिए वित्तपोषण स्वास्थ्य NIH के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रदान किया गया था-AR047410 (KEM)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
λ-carrageenan Millipore Sigma 22049 Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation
7500 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107 For RT-PCR analysis
Calcium chloride (CaCl2), anhydrous Millipore Sigma 499609 Prevents autolysis of thermolysin
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium Millipore Sigma C0612 Aqueous mounting medium after toluidine blue staining
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A-31570 Secondary antibody for immunohistochemistry
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21206 Secondary antibody for immunohistochemistry
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11966-025 To maintain tissue integrity
Ethylenediaminetetraacetic acid Millipore Sigma E6758 Stops thermolysin reaction
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase Promega M1701 For complementary DNA synthesis
Mouse anti-NGF Antibody (E-12) Santa Cruz Biotechnology sc-365944 For neurotrophin immunohistochemistry
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 To retard immunofluorescence quenching
Rabbit anti-PGP 9.5 Cedarlane Labs CL7756AP For intraepidermal nerve staining
SAS Sprague Dawley Rat Charles River Strain Code 400 Animal used for inflammation studies
Shandon M-1 Embedding Matrix Thermo Fisher Scientific 1310TS Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific A24811 For RT-PCR analysis
SYBR Select Master Mix Thermo Fisher Scientific 4472908 For RT-PCR analysis
Thermolysin Millipore Sigma T7902 From Geobacillus stearothermophilus
Toluidine Blue Millipore Sigma 89640 For tinctorial staining for brightfield microscopy
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 For total RNA extraction for RTPCR

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