Summary
Presenteras här är ett protokoll för separation av epidermis från dermis för att utvärdera inflammatorisk medlarproduktion. Efter inflammation separeras råtta bakpott epidermis från dermis med termolysin vid 4 °C. Epidermis används sedan för mRNA analys av RT-PCR och protein utvärdering av västra fläck och immunohistokemi.
Abstract
Lättanvända och billiga tekniker behövs för att bestämma den platsspecifika produktionen av inflammatoriska medlare och neurotroner under hudskada, inflammation och / eller sensibilisering. Målet med denna studie är att beskriva ett epidermal-dermal separation protokoll med termolysin, ett proteinas som är aktivt vid 4 °C. För att illustrera detta förfarande bedövas Sprague Dawley råttor, och höger bak tassar injiceras med carrageenan. Sex och tolv timmar efter injektion avlivas råttor med inflammation och naiva råttor, och en bit bakpott, glabrous hud placeras i kalla Dulbecco's Modified Eagle Medium. Epidermis separeras sedan vid källarmembranet från dermis med termolysin i PBS med kalciumklorid. Därefter säkras dermis av mikrodissektionstång, och epidermis retas försiktigt bort. Toluidinblå färgning av vävnad avsnitt visar att epidermis separeras rent från dermis vid källarmembranet. Alla keratinocyte cell lager förblir intakt, och epidermal rete åsar tillsammans med indragningar från dermal papillae observeras tydligt. Kvalitativ och realtid RT-PCR används för att bestämma nervtillväxtfaktor och interleukin-6 uttryck nivåer. Western blotting och immunohistochemistry utförs slutligen för att upptäcka mängder av nerv tillväxtfaktor. Denna rapport illustrerar att kall termolysin matsmältning är en effektiv metod för att skilja epidermis från dermis för utvärdering av mRNA och protein förändringar under inflammation.
Introduction
Utvärdering av inflammatoriska medlare och neurotrofa faktorer från huden kan begränsas på grund av heterogeniteten hos celltyper som finns i den inflammerade dermis och epidermis1,2,3. Flera enzymer, kemiska, termiska eller mekaniska tekniker som innebär separation av de två skikten eller för att utföra celldisociation för utvärdering har granskats nyligen4. Syra, alkali, neutralt salt och värme kan dela epidermis från dermis snabbt, men cellulär och extracellulär svullnad förekommerofta 5,6. Trypsin, bukspottkörtel, elastas, keratinas, kollagenas, pronas, dispas och termolysin är enzymer som har använts för epidermal-dermal separation4,7. Trypsin och andra bred skala proteolytiska enzymer är aktiva vid 37-40 °C men måste övervakas noggrant för att förhindra dissociation av epidermala lager. Dispase klyver epidermis vid lamina densa, men kräver 24 h för separation ikylan 4,8 eller kortare tidspunkter vid 37 °C4,9. En begränsande egenskap hos alla dessa tekniker är den potentiella störningen av vävnad morfologi och förlust av integritet av mRNA och protein.
För att upprätthålla mRNA:s och proteinets integritet bör en hudseparationsmetod utföras i kylan under en kort tidsperiod. Vid utvärdering av hudseparationsteknik för inflammationsstudier är termolysin ett effektivt enzym för att separera epidermis från dermis vid kalla temperaturer4. Thermolysin är aktiv vid 4 °C, klyver epidermala hemidesmosomes från lamina lucida och separerar epidermis från dermis inom 1-3 h4,8,10. Målet med denna rapport är att optimera användningen av termolysin för separation av inflammerad råtta epidermis från dermis för att upptäcka mRNA och proteinnivåer för inflammatoriska medlare och neurotrofa faktorer. Flera preliminära rapporter har presenterats11,12,13,14,15. Syftet med detta manuskript är att beskriva en optimal hudseparationsteknik med termolysin och visa detektion av 1) markörer för inflammation, 2) interleukin-6 (IL-6) mRNA och 3) nervtillväxtfaktor (NGF) mRNA och protein i epidermis av råttor med carrageenan-inducerad inflammation (C-II)16,17. En preliminär rapport med den kompletta Freunds adjuvansmodell indikerar att NGF mRNA och proteinnivåer ökar tidigt under inflammation15. Hos möss orsakar hudsensibilisering med den aktuella tillämpningen av oxazolon en tidig ökning av IL-6 mRNA med hjälp av in situ hybridisering36. Både IL-6 och NGF har varit inblandade i C-II18,19, men det har inte förekommit några rapporter som beskriver mRNA eller proteinnivåer för IL-6 eller NGF specifikt från epidermis under de akuta stadierna av C-II.
Termolysintekniken är billig och enkel att utföra. Dessutom tillåter termolysinseparation av epidermis från dermis mRNA, western blot och immunohistochemical analys av inflammatoriska medlare och neurotrofa faktorer underinflammationsprocessen 15. Prövare bör enkelt kunna använda denna teknik i både prekliniska och kliniska studier av hudinflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna för djurvård vid Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).
1. Carrageenan-inducerad inflammation (C-II)
- Sprague Dawley råttor (200–250 g, 8–9 veckor gamla) med isofluran (eller injicerbart bedövningsmedel).
- Kontrollera anestesidjupet genom att vidröra hornhinnan och lätt nypa den vänstra bakpotten. När djuret är lämpligt sövt kommer inget hornhinnans eller tasssvaret att observeras.
- Injicera subkutant rätt glabrous, bakpott med 100 μL 1% (w/v) λ-carrageenan utspädd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)20.
- Se till att lämpliga kontroller används, till exempel naiva råttor utan isofluran i denna rapport. Preliminära studier visar att naiva råttor med eller utan isofluran har samma basala uttryck för epidermal IL-6 och NGF.
OBS: Naiva råttor föredras kontroller för inflammationsstudier eftersom subkutan saltlösning eller PBS orsakar en lokal inflammation23,37.
- Se till att lämpliga kontroller används, till exempel naiva råttor utan isofluran i denna rapport. Preliminära studier visar att naiva råttor med eller utan isofluran har samma basala uttryck för epidermal IL-6 och NGF.
- Utvärdera ödem av C-II-råttor för att garantera carrageenans effektivitet (figur 1)20. Bestäm mängden ödem genom att mäta bakpotens metatarsala tjocklek med bromsok.
- Vid 6–12 timmar avliva råttor med CO2 (eller injicerbar bedövningsöverdos) och skär 1 mm x 2 mm bitar av glabrous bakpotshud med skarp skalpell. Om hårig hud används, raka den innan du skär de 1 mm x 2 mm hudbitarna.
OBS: Se till att lämpliga tidspunkter väljs enligt de specifika studierna. - Använd mikrodissektionstångar, överför huden till 1 ml kallt Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) i ett mikrocentrifugrör på is och håll dig kall i 15-60 min.
2. Termolysinseparation av epidermis och dermis
- Förbered och aktivera termolysin.
- Bered en lösning av termolysin genom att tillsätta 5 mg Geobacillus stearothermophilus till 10 ml PBS, vid pH = 8 (koncentration 500 μg/ml).
- Bered en 1 M lösning av kalciumklorid (CaCl2 vattenfri) genom att tillsätta 1,11 g i 10 ml destillerat H2O.
- För att förhindra autolys av termolysin, tillsätt 10 μL kalciumklorid till 10 ml termolysinlösning. Den slutliga koncentrationen av kalciumklorid kommer att vara 1 mM.
- Aliquot 1 ml aktiverad termolysin i 10 brunnar av en 24 brunns cellkulturplatta på is.
- Använd termolysin enzym matsmältning för att skilja epidermis från dermis.
- Använd mikrodissektionstångar och överför ett hudprov till varje brunn av aktivt termolysin. Se till att inte doppa huden i termolysinlösningen.
- Knacka försiktigt på huden på sidan av brunnen för att hjälpa till att frigöra hudprovet från tången för att flyta på termolysinlösningen.
- Flyta huden in i termolysinlösningen med stratum corneum (yttre epidermis) sida upp och dermis vänd nedåt. Det är viktigt att dermisen vänder sig nedåt, annars kommer den effektiva separationen inte att äga rum.
OBS: Tiden för termolysininkubation måste bestämmas empiriskt av slutanvändaren. Glabrous, bakpotskinn från Sprague Dawley råttor (200-250 g; 8-9 veckor gammal) kräver ofta 2,0-2,5 h för separation. Inkubationstiden förväntas variera med art och ålder. - Efter lämplig inkubationstid i termolysin, använd mikrodissektionstång för att överföra ett hudprov till en brunn av en 6 brunns cellkulturplatta med 7-8 ml kall (4 °C) DMEM. Detta ger mer utrymme för separation av epidermis från dermis.
- Sänk ner huden i DMEM.
- Borsta försiktigt epidermis med tången runt hudens omkrets tills den nästan genomskinliga epidermis observeras vid gränserna. Om detta inte kan uppnås, sätt tillbaka hudprovet på termolysinlösningen i ytterligare 15–30 minuter.
- När epidermis märkbart separerar från dermis, håll försiktigt både epidermis och dermis med mikrodissektionstångor och mycket långsamt dra epidermis från dermis.
- Utvärdera genomskinligheten hos den isolerade epidermis och se till att den är optiskt konsekvent. Se figur 2 för ett exempel på ett prov på 1 mm x 2 mm råtta epidermis. Om det finns en variation i genomskinligheten, har korrekt separation inte inträffat.
- Inaktivera termolysin med etylendiaminetetraacetsyra (EDTA) i de separerade bitarna av epidermis och dermis.
VARNING: Termolysin som finns kvar i epidermis och dermis är fortfarande aktiv och kan skada lagren om de inte inaktiveras.- Förbered en 0,5 M EDTA-lagerlösning. För att göra det, tillsätt långsamt 0,93 g EDTA i 5 ml dubbeldestillerat vatten. Tillsätt natriumhydroxid till lösningen tills den klarnat. Se till att lösningens pH-fördr är ~8,0.
- Gör en 5 mM EDTA-lösning i DMEM. Tillsätt 0,25 ml 0,5 M EDTA-stamlösning till 25 ml DMEM.
- Placera den separerade epidermis och dermis i 5 mM EDTA/DMEM-lösningen vid 4 °C i 30 minuter för att avaktivera termolysins aktivitet.
- Utvärdera epidermis med tinctorial histologi8,9,10.
- Fixera en del av epidermis i en 10% neutral formalin, 4% paraformaldehyd eller 0,25% paraformaldehyd med 0,8% picric syralösning i 1 h vid rumstemperatur (RT) med agitation.
- Placera den fasta epidermis i 10% sackaros i PBS i 1 timme vid RT med agitation.
- Frys epidermis i en vävnad inbäddning matris för sektionering. Skär 14 μm tvärsnitt med hjälp av en kryostat och tina-montera sektioner på gelatinbelagda glasmikroskoprutschbanor.
- Torra sektioner på en glidvärmare och fläck med en fungerande lösning av toluidinblått (TB; 10% TB i 1% natriumklorid) i 90-talet. Appose täcken med ett vattenhaltigt monteringsmedium.
- Observera epidermis med brightfield mikroskopi vid 50x-250x.
OBS: Om korrekt separation har inträffat kommer epidermis att delas rent från dermis och de fem lagren kommer att upptäckas: stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum och stratum corneum. Ett exempel på separerad råtta hud epidermis kan ses i figur 3.
3. Proteinutvinning och western blot-analys
- Utför western blotting på de separerade vävnadsproverna med tidigare publicerat protokoll21.
- Homogenisera epidermis i 50 μL lysbuffert (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glycerol och 1% Triton X-100) som innehåller en fosfatas och proteashämmare.
- Centrifugeringsprover med en maxhastighet på 15 min vid 4 °C och utvärdera supernatanten för proteinkoncentration med hjälp av ett proteinanalyskit.
- Belastning lika koncentrationer av protein (30 μg) på SDS geler, utföra elektrofores och överför sedan proteiner till nitrocellulosa eller PVDF-membran.
- Blockera membran med 5% mjölk i 2 h och inkubera över natten i primär antikropp (musanti-NGF, E12, 1:1000).
- Tvätta 3x med PBS med 0,3% interpolering i 10 min vardera och inkubera med en märkt sekundär antikropp (t.ex. alkalisk fosfatas märkt kanin antimus IgG).
- Använd ett skanningssystem för att utvärdera western blot-signal (t.ex. ECF-substrat och en bildplattform).
4. Immunohistokemi
- Placera vävnadsprover i ett fixativ för optimal immunoreaktivitet: 0,96% (w/v) picricsyra och 0,2% (w/v) formaldehyd i 0,1 M natriumfosfatbuffert, pH = 7,321,22,23 för 4 timmar vid RT. Överför till 10% sackaros i PBS över natten vid 4 °C.
- Utför standard immunohistokemi på vävnadavsnitten 21,22,23.
- Bädda in epidermis från djur i ett enda fruset block i inbäddningsmatrisen och skär 10-30 μm sektioner på en kryostat. Montera sektionerna på gelatinbelagda mikroskopr i glas och torka vid 37 °C i 2 timmar.
- Tvätta sektioner i tre, 10 min sköljning i PBS och inkubera i 24–96 timmar i primär antisera, [t.ex. musanti-NGF (E12, 1:2000)] och kanin antiproteingenprodukt 9.9 (PGP 9.5, 1:2000) utspädd i PBS innehållande 0,3% (w/v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 0,5% polyvinylpyrrolidon (PVP).
- Efter primär antiseruminkubation, skölj sektioner tre gånger i 10 min i PBS och inkubera 1 h vid RT i Alexa Fluor 488 åsna antikanin IgG (1:1000) och Alexa Fluor 555 åsna antimus IgG (1:1000) utspädd i PBS-T.
- Skölj sektionerna tre gånger i PBS i 10 min och anbringa täcken med icke-bleknande monteringsmedium för att fördröja blekning av immunofluorescens.
5. RNA-isolering och cDNA-syntes
- Utför standardreaktion av omvänd transkriptaspolymeraskedja (RT-PCR) på hudproverna21. Isolera totalt RNA med en fenol, guanidin isothiocyanate lösning.
- Utför kompletterande DNA-syntes av Moloney murin leukemi virus omvänd transkriptas.
- Använd följande primersekvenser för NGF- och IL-6-förstärkning:
NGF (Sense) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
NGF (Antisense) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
IL-6 (Sense) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGC;
IL-6 (Antisense) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG - Jämför nivåerna av NGF och IL-6 mRNA med β-actin hushållningsgen:
β-ACTIN (Sense) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
β-ACTIN (Antisense) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA - Utvärdera med kvalitativ RT-PCR med termisk cyklator och kvantitativ pcr i realtid (qRT-PCR) med hjälp av ett qRT-PCR-system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Carrageenan injektion i råtta bakpott orsakade klassiska symtom på inflammation såsom rodnad och ödem16,17. Svullnaden av bakpoten mättes med mekaniska bromsok20. Ett basvärde för tassens tjocklek erhölls för varje råtta före carrageenanbehandling och mättes igen vid 6 h och 12 h. Tasstjockleken ökade betydligt jämfört med utgångsvärdena (figur 1).
Thermolysin inkubation av råtta glabrous bak tass huden producerade ett ark epidermis. Brightfieldmikroskopi användes för att utvärdera effektiviteten av termolysinseparation av epidermis och dermis (figur 2). Epidermis lager kunde bestämmas samtidigt som man fokuserade genom arket vid högre förstoring. Toluidinblå färgning av epidermala tvärsnitt visade att epidermis separerades från dermis vid källarmembranet (Figur 3). Epidermal rete åsar (epidermal pinnar) tillsammans med indragningar från dermal papillae var intakta. Alla keratinocyte cell lager observerades.
Western blotting av thermolysin-separerade epidermis producerade konsekventa resultat som indikerar stabila proteinnivåer under tekniken vid 4 °C. Mycket lite NGF-protein upptäcktes i naiv råtta epidermis, men NGF proteinnivåer var uppreglerade (250%) efter 6 h C-II jämfört med naiva djur (Figur 4). Efter 12 h av C-II, NGF nivåer minskade jämfört med 6 h men förblev förhöjda (55%) i förhållande till kontroller. Immunohistokemi för NGF i den separerade epidermis gav tillförlitlig immunostaining och bekräftade resultaten från västerländska blots(figur 5). NGF-immunoreactivity (ir) upptäcktes inte i naiv kontroll epidermis, men vid 6 h C-II fanns det NGF-ir i de flesta keratinocyter av stratum granulosum och stratum lucidum. Några celler för stratum spinosum var NGF-immunoreactive (IR) vid 6 h C-II. Vid 12 h C-II inträffade NGF-ir i keratinocyter av stratum granulosum och stratum lucidum med vissa celler i stratum granulosum intensivt NGF-IR. Vid ingen tidpunkt upptäcktes NGF-ir i stratum basale eller stratum hornhinnans. PGP9.5-IR intraepidermala, åderbråmfkvarosfibrer fanns i den separerade epidermis från naiva och C-II råttor (Figur 5).
Kvalitativa RT-PCR visade att det fanns mRNA av god kvalitet från termolysinskiljd epidermis(figur 6A, figur 7A). Med hjälp av aktin som hushållningsgen för kvantitativ pcr i realtid höjdes NGF mRNA-uttrycket i epidermis under C-II signifikant (>3-faldigt) vid 6 h jämfört med naiva råttor (Figur 6B). Vid 12 h återgick NGF mRNA till baslinjenivåer (figur 6B). Med hjälp av aktin som städgen för kvantitativ pcr i realtid höjdes IL-6 mRNA i epidermis under C-II signifikant (>6-faldigt) vid 6 h jämfört med naiva råttor (Figur 7B). Vid 12 h sjönk IL-6 mRNA-nivåerna avsevärt från 6 h-mängderna men förblev förhöjda (2-faldiga) jämfört med naiva råttor (Figur 7B).
Figur 1: Carrageenan-injektion producerar tassödem.
Ett utgångsvärde erhölls för varje råtta före behandling med carrageenan. Efter 6 timmar och 12 h behandling ökade tasstjockleken avsevärt jämfört med utgångsvärdena. Resultaten uttrycks som SEM med sex råttor per behandling (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; studentens t-test, unpaired, two-tail, utfördes vid varje tidpunkt). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Thermolysin producerar ett ark epidermis.
Brightfield mikroskopi visade en genomskinlig epidermal ark cirka 1 mm x 2 mm i storlek. Epidermis lager kunde bestämmas samtidigt som man fokuserade genom arket vid högre förstoring. Skalbar = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Toluidinblå färgning av epidermis.
Brightfield mikroskopi bestämde att thermolysin orsakade en effektiv separation av epidermis från dermis. Epidermal rete ridges (epidermal pinnar; pilspetsar) observerades tillsammans med fördjupningar från dermal papillae (pilar). Alla keratinocyte cell lager var intakta. SB: stratum basale, SS: stratum spinosum, SG: stratum granulosum, SL: stratum lucidum, SC: stratum corneum. Skalbar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: NGF protein uttryck i epidermis under carrageenan-inducerad inflammation.
NGF nivåer ökades (250%) efter 6 h inflammation jämfört med naiva djur. Efter 12 h sänktes nivåerna jämfört med 6 h men höjdes (55%) i motsats till naiva djur. Resultaten uttrycks som SEM med tre råttor per grupp (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; studentens t-test, unpaired, two-tail utfördes vid varje tidpunkt) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: NGF och PGP9.5 immunoreaktivitet (ir) under C-II.
Kolumnerna A,B,C visar NGF-ir, PGP9.5-ir och DAPI nukleär färgning, medan kolumnerna A1-C1 visar endast NGF-ir. I alla bilder är stratum corneum mot vänster och stratum basale mot höger. NGF-ir upptäcktes inte i naiv kontroll epidermis (A, A1). Vid 6 h C-II (B, B1),NGF-ir var närvarande i de flesta keratinocyter av stratum granulosum (korta pilar) och stratum lucidum (långa pilar). Några celler för stratum spinosum var NGF-ir vid 6 h C-II (stora pilspetsar). Vid 12 h C-II (C, C1),NGF-ir inträffade i keratinocyter av stratum granulosum och stratum lucidum (långa pilar) med vissa celler i stratum granulosum intensivt NGF-ir (korta pilar). Vid ingen tidpunkt upptäcktes NGF-ir i stratum basale eller stratum hornhinnans. PGP9.5-ir intraepidermal nerv fibrer var närvarande i separerade epidermis från naiva och C-II råttor (små pilspetsar, A-C). SB: stratum basale, SS: stratum spinosum, SG: stratum granulosum, SL: stratum lucidum. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: NGF mRNA under carrageenan-inducerad inflammation.
NGF mRNA uttryck i thermolysin-separerade epidermis under C-II utvärderades av kvalitativa PCR (A) och kvantitativ realtid PCR (B). Kvalitativa mRNA-uppblåsthet (A) för NGF och aktin visade att det fanns god kvalitet mRNA som kunde utvärderas under inflammation. NGF mRNA uttryck i epidermis under C-II utvärderades av kvantitativ realtid PCR med actin som en hushållning gen (B). NGF mRNA var signifikant förhöjda (>3-faldig) efter 6 h C-II jämfört med naiva obehandlade råttor, men nivåerna återvände till baslinjen vid 12 h (B). Resultaten uttrycks som SEM med tre råttor per grupp (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; studentens t-test, unpaired, two-tail utfördes vid varje tidpunkt). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: IL-6 mRNA under carrageenan-inducerad inflammation.
IL-6 mRNA uttryck i thermolysin-separerade epidermis under C-II utvärderades av kvalitativa PCR (A) och kvantitativ realtid PCR (B). Kvalitativa mRNA-uppblåsthet (A) för IL-6 och aktin visade att det fanns god kvalitet mRNA för utvärdering under inflammation. IL-6 mRNA uttryck i epidermis under C-II utvärderades av kvantitativ realtid PCR med hjälp av aktin som en hushållningsgen (B). IL-6 mRNA var signifikant förhöjda (>6-faldiga) efter 6 h C-II jämfört med naiva obehandlade råttor (B). Vid 12 h sänktes IL-6 mRNA nivåer avsevärt från 6 h nivåer men förblev förhöjda (2-faldiga) jämfört med naiva råttor (B). Resultaten uttrycks som medelvärdet S.E.M. med två råttor per grupp (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, studentens t-test, unpaired, två-tail utfördes vid varje tidpunkt). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studien visade att epidermis av råtta bakpott glabrous hud lätt separerades från läderhud med termolysin (0,5 mG/mL) i PBS med 1 mM kalciumklorid vid 4 °C för 2,5 h. Histologiska utvärdering anges att epidermis separerades från läderhuden vid källarmembranet och att epidermal rete åsar var intakt. Thermolysin är en extracellulär metalloendopeptidas producerad av Grampositiv(Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. Dess aktivitet är stabil vid 4 °C men fungerar över ett brett spektrum av temperaturer10,24,25. Detta enzym har använts i stor utsträckning för proteinkemi24,25, men flera grupper har visat sin tillämpning för hudseparation i epidermala och / eller dermal ark4,8,10,26,27. Walzer et al. var de första att rapportera epidermal-dermal separation av mänsklig hud med termolysin vid 4 °C (250-500 μg/mL för 1 h)10. Med ljus- och elektronmikroskopi bestämdes separationen att ske vid det epidermala källarmembranet mellan laminin och den bullous pemphigoid antigen plats10.
Dessutom avbröts hemidesmosomes, tillbehör av basala keratinocyter till källarmembranet, selektivt10,29. Rakhorst et al. jämförde termolysin (4 °C, 500 μg/ml, över natten) med dispase för epidermal-dermal separation av kanin buccal slemhinna8. Thermolysin var ofullständigt i att skilja slemhinnan epidermis från dermis som betecknar att skillnader kan uppstå för arter, inkubationstid, lösningssammansättning (ingen CaCl2 för att förhindra termolysin autolys24), källa till termolysin och/eller platsspecifika skillnader som anges frånandra studier 10,26,27. Slutanvändare av det nuvarande protokollet bör se till att använda färsk termolysin och alltid inkludera kalciumklorid men bör också vara medvetna om dessa potentiella begränsningar.
Även om vissa utredare har använt thermolysin vid 37 °C26,29, användare av detta protokoll bör vara medvetna om att hålla hudvävnad vid 4 °C för att bevara stabiliteten hos protein och mRNA. Vi använde DMEM vid 4 °C som en lösning för huden före och efter termolysinseparation på grund av dess användbarhet för att upprätthålla celleri kultur 28, och det har tidigare använts för hudseparation med termolysin8,26,27,30,31. Walzer et al. använde steril PBS kompletterad med 200 μG/mL streptomycin, 200 U/mL penicillin och 2,5 μg/mL fungizon10, medan andra har använt olika medier (t.ex. keratinocytkulturmedier fria från epidermal tillväxtfaktor) följt av PBS-sköljning29.
I protokollet utfördes termolysinseparation i 500 μg/mL termolysin och 5 mM kalciumklorid i PBS (pH = 8), liknande den ursprungliga metoden10. DMEM har använts som lösning för termolysinseparation vid 4 °C(över natten) 8,och HEPES-buffert har använts effektivt med 500 μG/ml termolysinlösning vid 37 °C i 2 timmar29. Vi undersökte dock inte hur kulturmedium eller andra buffertar påverkar termolysins aktivitet för epidermal-dermal separation. Kalciumklorid är ett viktigt tillägg för att minska autolys av thermolysin24,32 och borttagning av detta steg kan leda till ofullständig klyvning av epidermis från dermis8.
Storleken på hudprovet verkar påverka den tid som behövs för termolysin inkubation och effektiviteten av enzymatisk klyvning av epidermis från dermis. Utredarna måste utvärdera lämplig provstorlek och inkubationstid för sina egna vävnader. Att flytta proverna på termolysinlösningen med epidermisen vänd uppåt är viktigt för optimal enzymeffektivitet10. Som nämnts tidigare är platsen för åtgärder för termolysin vid keratinocyte hemidesmosomes och källarmembran4,10,29; därför fungerar termolysin inåt från hudens kanter. Från vår erfarenhet separerar hudkanterna tidigare än mitten av provet, och det är viktigt att ge tillräckligt med tid för fullständig enzymatisk klyvning. När klyvningen är klar bör epidermis lätt dra bort från dermis. Om det fortfarande är fastsatt kan hängande på lagren orsaka att delar av dermis kommer bort med epidermis.
En begränsning av termolysintekniken är den tid som krävs. Att öka termolysinkoncentrationen över 500 μG/ml minskar inte tiden för separation och epidermis har dåligt bevarande vid högre koncentrationer10. Epidermal-dermal separation metoder har granskats nyligen4, och många metoder tar 30-60 min vid 20-40 °C. Värme (50–60 °C) hudseparation sker snabbt (30 till 10 min)4, men proteiner och mRNA är kända för att brytas ned snabbt vid så höga temperaturer. Alternativt kan natriumtiocyanat (2 N) vid RT vara en acceptabel snabb separationsteknik (5 min)4,6, men protein- och mRNA-integritet har inte studerats med denna metod6. Den kalla termolysinmetoden valdes för bevarande av protein och mRNA, men det fanns inga direkta jämförelser mellan protein och mRNA integritet med andra tekniker.
I denna studie, kall thermolysin matsmältningen visas vara en effektiv metod för att skilja epidermis från dermis för utvärdering av mRNA och protein förändringar under inflammation. Under carrageenan-inducerad inflammation, NGF mRNA och protein nivåer och IL-6 mRNA nivåer höjdes vid 6 h, återvände nära baslinjen med 12 h. Med immunohistokemi ökade NGF immunoreactivity i keratinocyter vid 6 h och 12 h. En fördel med termolysinmetoden är förmågan att utföra platsselektiv analys. Till exempel kommer den ökade produktionen av NGF och IL-6 i den aktuella studien från keratinocyter, eftersom hudceller utesluts från analyserna. Den här metoden möjliggör insikt i plats- och medlartyper för sensibilisering av primära afferenta terminaler33. Dessutom möjliggör denna metod bättre förståelse för tidsföringen för neurotrofiproduktion tillsammans med upptag och transport i primära afferenter under inflammation34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden.
Acknowledgments
Finansiering för denna forskning tillhandahölls av National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A.
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K.
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E.
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , Volume 1, Chapter 111 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1: Unit 1.2 (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M.
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
