Summary
Presentert her er en protokoll for separasjon av epidermis fra dermis for å evaluere inflammatorisk mediatorproduksjon. Etter betennelse er rotte bakpote epidermis skilt fra dermis ved termolysin ved 4 °C. Epidermis brukes deretter til mRNA-analyse av RT-PCR og proteinevaluering ved vestlig flekk og immunhiistokjemi.
Abstract
Brukervennlige og rimelige teknikker er nødvendig for å bestemme stedsspesifikk produksjon av inflammatoriske mediatorer og nevrotrofiner under hudskade, betennelse og / eller sensibilisering. Målet med denne studien er å beskrive en epidermal-dermal separasjonsprotokoll ved hjelp av termolysin, en proteinase som er aktiv ved 4 °C. For å illustrere denne prosedyren er Sprague Dawley rotter bedøvet, og høyre bakpoter injiseres med carrageenan. Seks og tolv timer etter injeksjon blir rotter med betennelse og naive rotter euthanized, og et stykke bakpote, glabrøs hud er plassert i kaldt Dulbeccos Modified Eagle Medium. Epidermis skilles deretter i kjellermembranen fra dermis ved termolysin i PBS med kalsiumklorid. Deretter er dermis sikret av mikrodesisseksjons tang, og epidermis er forsiktig ertet bort. Toluidinblå farging av vevsseksjoner viser at epidermis er skilt rent fra dermis i kjellermembranen. Alle keratinocyttcellelag forblir intakte, og de epidermale rete ryggene sammen med innrykk fra dermal papiller observeres tydelig. Kvalitativ og sanntids RT-PCR brukes til å bestemme nervevekstfaktor og interleukin-6 uttrykksnivåer. Vestlig blotting og immunhiistokjemi utføres endelig for å oppdage mengder av nervevekstfaktor. Denne rapporten illustrerer at kald termolysin fordøyelse er en effektiv metode for å skille epidermis fra dermis for evaluering av mRNA og protein endringer under betennelse.
Introduction
Evaluering av inflammatoriske mediatorer og nevrotrofiske faktorer fra huden kan begrenses på grunn av heterogeniteten til celletyper som finnes i betent dermis og epidermis1,2,3. Flere enzymer, kjemiske, termiske eller mekaniske teknikker som involverer separasjon av de to lagene eller for å utføre celledissosiasjon for evaluering, har blitt gjennomgått nylig4. Syre, alkali, nøytralt salt og varme kan dele epidermis fra dermis raskt, men cellulær og ekstracellulær hevelse oppstår ofte5,6. Trypsin, pankreatin, elastase, keratinase, kollagenase, pronase, dispase og termolysin er enzymer som har blitt brukt til epidermal-dermal separasjon4,7. Trypsin og andre bredskala proteolytiske enzymer er aktive ved 37-40 °C, men må overvåkes nøye for å forhindre dissosiasjon av epidermale lag. Dispase cleaves epidermis på lamina densa, men krever 24 h for separasjon i kulde4,8 eller kortere tidspunkter ved 37 °C4,9. Et begrensende trekk ved alle disse teknikkene er potensiell forstyrrelse av vevsmorfologi og tap av integritet av mRNA og protein.
For å opprettholde integriteten til mRNA og protein, bør en hudseparasjonsmetode utføres i kulde i en kort periode. Ved evaluering av hudseparasjonsteknikker for betennelsesstudier er termolysin et effektivt enzym for å skille epidermis fra dermis ved kalde temperaturer4. Thermolysin er aktiv ved 4 °C, cleaves epidermale hemidesmosomer fra lamina lucida, og skiller epidermis fra dermis innen 1-3 h4,8,10. Målet med denne rapporten er å optimalisere bruken av termolysin for separasjon av betent rotte epidermis fra dermis for å oppdage mRNA og proteinnivåer for inflammatoriske mediatorer og nevrotrofiske faktorer. Flere foreløpige rapporter er presentert11,12,13,14,15. Målet med dette manuskriptet er å beskrive en optimal hudseparasjonsteknikk ved hjelp av termolysin og demonstrere påvisning av 1) betennelsesmarkører, 2) interleukin-6 (IL-6) mRNA, og 3) nervevekstfaktor (NGF) mRNA og protein i epidermis av rotter med carrageenan-indusert betennelse (C-II)16,17. En foreløpig rapport ved hjelp av den komplette Freunds adjuvansmodell indikerer at NGF mRNA og proteinnivåer øker tidlig under betennelse15. Hos mus forårsaker hudsensibilisering med aktuell påføring av oksazolon en tidlig økning i IL-6 mRNA ved hjelp av in situ hybridisering36. Både IL-6 og NGF har vært involvert i C-II18,19, men det har ikke vært noen rapporter som beskriver mRNA eller proteinnivåer for IL-6 eller NGF spesielt fra epidermis under de akutte stadiene av C-II.
Termolysinteknikken er billig og grei å utføre. Videre tillater termolysinseparasjon av epidermis fra dermis mRNA, vestlig blot og immunhiistokjemisk analyse av inflammatoriske mediatorer og nevrotrofiske faktorer under prosessen med betennelse15. Etterforskere skal enkelt kunne bruke denne teknikken i både prekliniske og kliniske studier av hudbetennelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene for dyrepleie fra Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).
1. Carrageenan-indusert betennelse (C-II)
- Bedøv mannlige og/eller kvinnelige Sprague Dawley-rotter (200–250 g; 8–9 uker gamle) med isofluran (eller injiserbar bedøvelse).
- Kontroller dybden av anestesi ved å berøre hornhinnen og lett klemme venstre bakpote. Når dyret er passende bedøvet, vil det ikke bli observert hornhinnen eller poteresponsen.
- Injiser subkutant riktig glabrøs, bakpote med 100 μL 1% (m/v) λ-carrageenan fortynnet i fosfatbufret saltvann (PBS)20.
- Kontroller at passende kontroller brukes, for eksempel naive rotter uten isofluran i denne rapporten. Foreløpige studier indikerer at naive rotter med eller uten isofluran har samme basale uttrykk for epidermal IL-6 og NGF.
MERK: Naive rotter er foretrukne kontroller for betennelsesstudier siden subkutan saltvann eller PBS forårsaker lokal betennelse23,37.
- Kontroller at passende kontroller brukes, for eksempel naive rotter uten isofluran i denne rapporten. Foreløpige studier indikerer at naive rotter med eller uten isofluran har samme basale uttrykk for epidermal IL-6 og NGF.
- Evaluer ødem av C-II rotter for å garantere effektiviteten av carrageenan (Figur 1)20. Bestem mengden ødem ved å måle bakre pote metatarsal tykkelse med kalipere.
- Ved 6–12 timer avliver du rotter med CO2 (eller injiserbar bedøvelsesoverdose) og kutter 1 mm x 2 mm biter av glabrous bakpotehud med skarp skalpell. Hvis hårete hud brukes, barber den før du klipper de 1 mm x 2 mm hudstykkene.
MERK: Sørg for at de aktuelle tidspunktene velges i henhold til de spesifikke studiene. - Bruk mikrodesisseksjons tang, overfør huden til 1 ml kald Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) i et mikrosenterrør på is og hold den kald i 15–60 minutter.
2. Thermolysin separasjon av epidermis og dermis
- Forbered og aktiver termolysin.
- Forbered en løsning av termolysin, ved å tilsette 5 mg Geobacillus stearothermophilus til 10 ml PBS, ved pH = 8 (konsentrasjon 500 μg/ml).
- Forbered en 1 M løsning av kalsiumklorid (CaCl2 vannfri) ved å tilsette 1,11 g i 10 ml destillert H2O.
- For å forhindre autolyse av termolysin, tilsett 10 μL kalsiumklorid til 10 ml termolysinoppløsning. Den endelige konsentrasjonen av kalsiumklorid vil være 1 mM.
- Aliquot 1 ml aktivert termolysin i 10 brønner av en 24 brønncellekulturplate på is.
- Bruk termolysin enzym fordøyelse for å skille epidermis fra dermis.
- Bruk mikrodesisseksjons tang, overfør en hudprøve til hver brønn med aktivert termolysin. Pass på at du ikke senker huden ned i termolysinoppløsningen.
- Trykk forsiktig på huden på siden av brønnen for å hjelpe til med å frigjøre hudprøven fra tangene for å flyte på termolysinoppløsningen.
- Flyt huden inn i termolysinoppløsningen med stratum corneum (ytre epidermis) side opp og dermis vendt ned. Det er kritisk at dermis vender ned, ellers vil den effektive separasjonen ikke finne sted.
MERK: Tiden for termolysininkubasjon må bestemmes empirisk av sluttbrukeren. Glabrous, bakpotehud fra Sprague Dawley rotter (200-250 g; 8-9 uker gammel) krever ofte 2,0-2,5 timer for separasjon. Inkubasjonstiden forventes å variere med arter og alder. - Etter riktig inkubasjonstid i termolysin, bruk mikrodeseksjons tang for å overføre en hudprøve til en brønn på en 6 brønncellekulturplate med 7-8 ml kald (4 °C) DMEM. Dette gir mer rom for separasjon av epidermis fra dermis.
- Senk huden ned i DMEM.
- Pensle epidermis forsiktig med tangene rundt omkretsen av huden til den nesten gjennomsiktige epidermis observeres ved grensene. Hvis dette ikke kan oppnås, returner hudprøven til termolysinoppløsningen i ytterligere 15-30 min.
- Når epidermis merkbart skiller seg fra dermis, hold deretter forsiktig både epidermis og dermis med mikrodeseksjons tang og trekker forsiktig epidermis fra dermis.
- Evaluer gjennomskinneligheten til den isolerte epidermis og sørg for at den er optisk konsistent. Se figur 2 for et eksempel på en 1 mm x 2 mm prøve av rotteepemis. Hvis det er en variasjon i gjennomskinneligheten, har det ikke skjedd riktig separasjon.
- Inaktiver termolysin ved hjelp av etylendiamintetraketisk syre (EDTA) i de separerte stykkene epidermis og dermis.
FORSIKTIG: Termolysinet som forblir i epidermis og dermis er fortsatt aktivt og kan skade lagene hvis de ikke er inaktivert.- Forbered en 0,5 M EDTA lagerløsning. For å gjøre dette, tilsett sakte 0,93 g EDTA i 5 ml dobbeltdestillert vann. Tilsett natriumhydroksid til løsningen til den er klar. Kontroller at pH-en til oppløsningen er ~8.0.
- Lag en 5 mM EDTA-løsning i DMEM. Tilsett 0,25 ml 0,5 M EDTA lagerløsning til 25 ml DMEM.
- Plasser separert epidermis og dermis i 5 mM EDTA/DMEM-oppløsningen ved 4 °C i 30 minutter for å deaktivere thermolysins aktivitet.
- Evaluer epidermis med tinctorial histologi8,9,10.
- Fest en del av epidermis i en 10% nøytral formalin, 4% paraformaldehyd eller 0,25% paraformaldehyd med 0,8% picrinsyreoppløsning i 1 time ved romtemperatur (RT) med agitasjon.
- Plasser den faste epidermis i 10% sukrose i PBS i 1 time ved RT med agitasjon.
- Frys epidermis i et vev innebygging matrise for seksjonering. Klipp 14 μm tverrsnitt ved hjelp av en kryostat og tinemonteringsseksjoner på gelatinbelagte glassmikroskopsklier.
- Tørre seksjoner på en lysbildevarmer og flekk med en arbeidsløsning av toluidblå (TB; 10% TB i 1% natriumklorid) i 90 s. Appose coverlips med et vandig monteringsmedium.
- Vær oppmerksom på epidermis med brightfield mikroskopi ved 50x-250x.
MERK: Hvis riktig separasjon har skjedd, vil epidermis bli delt rent fra dermis og de fem lagene vil bli oppdaget: stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum og stratum corneum. Et eksempel på separert rottehud epidermis kan ses i figur 3.
3. Proteinutvinning og vestlig blotanalyse
- Utfør vestlig blotting på separerte vevsprøver ved hjelp av tidligere publisert protokoll21.
- Homogeniser epidermis i 50 μL lysisbuffer (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glyserol og 1% Triton X-100) som inneholder en fosfatase og proteasehemmercocktail.
- Sentrifugeprøver med maksimal hastighet i 15 min ved 4 °C og evaluerer supernatanten for proteinkonsentrasjon ved hjelp av et proteinanalysesett.
- Last like konsentrasjoner av protein (30 μg) på SDS geler, utfør elektroforese, og overfør deretter proteiner til nitrocellulose eller PVDF membraner.
- Blokker membraner med 5% melk i 2 timer og inkuber over natten i primært antistoff (mus anti-NGF, E12, 1:1000).
- Vask 3x med PBS med 0,3% tween i 10 min hver og inkuber med et merket sekundært antistoff (f.eks. alkalisk fosfatase merket kanin antimus IgG).
- Bruk et skannesystem til å evaluere vestlig blotsignal (f.eks. ECF-substrat og en bildeplattform).
4. Immunohistokjemi
- Plasser vevsprøver i et fikseringsmiddel for optimal immunoreaktivitet: 0,96 % (w/v) picrinsyre og 0,2 % (w/v) formaldehyd i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH = 7,321,22,23 i 4 timer ved RT. Overfør til 10 % sukrose i PBS over natten ved 4 °C .
- Utfør standard immunhiistokjemi på vevsdelene21,22,23.
- Bygg inn epidermis fra dyr i en enkelt frossen blokk i innbyggingsmatrise og kutt 10-30 μm seksjoner på en kryostat. Monter seksjonene på gelatinbelagte glassmikroskopsklier og tørk ved 37 °C i 2 timer.
- Vask seksjoner i tre, 10 min skyllinger i PBS og inkuber i 24–96 timer i primær antisera, [f.eks. mus anti-NGF (E12, 1:2000)] og kanin antiproteingenprodukt 9,9 (PGP 9,5, 1:2000) fortynnet i PBS som inneholder 0,3% (w/v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 0,5% polyvinylpyrrrolidon (PVP).
- Etter primær antiserum inkubasjon, skyll seksjoner tre ganger i 10 min i PBS og inkuber 1 h ved RT i Alexa Fluor 488 esel anti-kanin IgG (1:1000) og Alexa Fluor 555 esel antimus IgG (1:1000) fortynnet i PBS-T.
- Skyll seksjoner tre ganger i PBS i 10 min og fest deksler med ikke-falmende monteringsmedium til retard falming av immunfluorescens.
5. RNA-isolasjon og cDNA-syntese
- Utfør standard omvendt transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (RT-PCR) på hudprøvene21. Isoler total RNA ved hjelp av en fenol, guanidin isothiocyanate løsning.
- Utfør komplementær DNA-syntese ved Moloney murin leukemivirus omvendt transkripsjonase.
- Bruk følgende primersekvenser for NGF- og IL-6-forsterkning:
NGF (Sense) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
NGF (Antisense) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
IL-6 (Sense) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
IL-6 (Antisense) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG - Sammenlign nivåene av NGF og IL-6 mRNA med β-aktin rengjøringsgen:
β-ACTIN (sense) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
β-ACTIN (Antisense) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA - Evaluer med kvalitativ RT-PCR ved hjelp av termisk syklist og kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR) ved hjelp av et qRT-PCR-system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Carrageenan injeksjon i rotte bakpoten forårsaket klassiske symptomer på betennelse som rødhet og ødem16,17. Hevelsen i bakpoten ble målt med mekaniske kalipere20. En basisverdi av tykkelsen på poten ble oppnådd for hver rotte før carrageenan behandling og målt igjen ved 6 timer og 12 timer. Potetykkelsen ble økt betydelig sammenlignet med grunnlinjeverdiene (figur 1).
Termolysininkubasjon av rotteglabrøs bakpotehud produserte et ark med epidermis. Brightfield mikroskopi ble brukt til å evaluere effektiviteten av termolysin separasjon av epidermis og dermis (Figur 2). Lagene i epidermis kan bestemmes mens du fokuserer gjennom arket ved høyere forstørrelse. Toluidinblå farging av epidermale tverrsnitt viste at epidermis ble skilt fra dermis ved kjellermembranen (Figur 3). De epidermale rete ryggene (epidermale pinner) sammen med innrykkene fra dermal papiller var intakte. Alle keratinocyttcellelag ble observert.
Vestlig blotting av termolysin-separert epidermis ga konsistente resultater som indikerer stabile proteinnivåer under teknikken ved 4 °C. Svært lite NGF-protein ble påvist i naiv rotte epidermis, men NGF proteinnivåer ble oppregulert (250%) etter 6 h C-II sammenlignet med naive dyr (Figur 4). Etter 12 timer med C-II ble NGF-nivåene redusert sammenlignet med 6 timer, men forble forhøyet (55 %) i forhold til kontroller. Immunhistokjemi for NGF i separert epidermis ga pålitelig immunstaining og bekreftet resultatene fra vestlige flekker (Figur 5). NGF-immunoreaktivitet (ir) ble ikke påvist i naiv kontroll epidermis, men ved 6 h C-II var det NGF-ir i de fleste keratinocytter av stratum granulosum og stratum lucidum. Noen få celler for stratum spinosum var NGF-immunoreaktiv (IR) ved 6 h C-II. Ved 12 h C-II skjedde NGF-ir i keratinocytter av stratum granulosum og stratum lucidum med noen celler i stratum granulosum intenst NGF-IR. På ingen tidspunkt ble NGF-ir oppdaget i stratum basale eller stratum corneum. PGP9,5-IR intraepidermale, åreknuterte nervefibre var tilstede i separert epidermis fra naive og C-II rotter (Figur 5).
Kvalitativ RT-PCR viste at det var mRNA av god kvalitet fra termolysindelt epidermis (Figur 6A, figur 7A). Ved å bruke aktin som rengjøringsgen for kvantitativ sanntids-PCR, ble NGF mRNA-uttrykk i epidermis under C-II betydelig forhøyet (>3 ganger) ved 6 timer sammenlignet med naive rotter (figur 6B). Ved 12 timer gikk NGF mRNA tilbake til baseline nivåer (Figur 6B). Ved å bruke aktin som rengjøringsgen for kvantitativ sanntids-PCR, ble IL-6 mRNA i epidermis under C-II betydelig forhøyet (>6 ganger) ved 6 timer sammenlignet med naive rotter (figur 7B). Ved 12 timer falt IL-6 mRNA-nivåene betydelig fra de 6 h mengdene, men forble forhøyet (2 ganger) sammenlignet med naive rotter (Figur 7B).
Figur 1: Carrageenan injeksjon produserer potødem.
En baseline verdi ble oppnådd for hver rotte før carrageenan behandling. Etter 6 timer og 12 timers behandling økte potetykkelsen betydelig sammenlignet med baselineverdier. Resultatene uttrykkes som SEM med seks rotter per behandling (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; studentens t-test, uparret, to-hale, ble utført på hvert tidspunkt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Thermolysin produserer et ark med epidermis.
Brightfield mikroskopi avslørte et gjennomskinnelig epidermalt ark ca. 1 mm x 2 mm i størrelse. Lagene i epidermis kan bestemmes mens du fokuserer gjennom arket ved høyere forstørrelse. Skalalinje = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Toluidinblå farging av epidermis.
Brightfield mikroskopi fastslo at termolysin forårsaket en effektiv separasjon av epidermis fra dermis. Epidermale rete rygger (epidermale pinner; pilspisser) ble observert sammen med innrykk fra dermal papille (piler). Alle keratinocyttcellelag var intakte. SB: stratum basale, SS: stratum spinosum, SG: stratum granulosum, SL: stratum lucidum, SC: stratum corneum. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: NGF-proteinuttrykk i epidermis under carrageenan-indusert betennelse.
NGF-nivåene ble økt (250%) etter 6 timer betennelse sammenlignet med naive dyr. Etter 12 timer ble nivåene redusert sammenlignet med 6 timer, men ble forhøyet (55%) i motsetning til naive dyr. Resultatene uttrykkes som SEM med tre rotter per gruppe (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; studentens t-test, uparret, to-hale ble utført på hvert tidspunkt) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: NGF og PGP9.5 immunoreaktivitet (ir) under C-II.
Kolonne A, B, C viser NGF-ir, PGP9,5-ir og DAPI kjernefysiske flekker, mens kolonne A1-C1 bare viser NGF-ir. I alle bilder er stratum corneum mot venstre og stratum basale mot høyre. NGF-ir ble ikke påvist i naiv kontroll epidermis (A, A1). Ved 6 h C-II (B, B1), var NGF-ir til stede i de fleste keratinocytter av stratum granulosum (korte piler) og stratum lucidum (lange piler). Noen få celler for stratum spinosum var NGF-ir ved 6 h C-II (store pilspisser). Ved 12 h C-II (C, C1), oppstod NGF-ir i keratinocytter av stratum granulosum og stratum lucidum (lange piler) med noen celler i stratum granulosum intenst NGF-ir (korte piler). På ingen tidspunkt ble NGF-ir oppdaget i stratum basale eller stratum corneum. PGP9,5-ir intraepidermale nervefibre var tilstede i separert epidermis fra naive og C-II rotter (små pilspisser, A-C). SB: stratum basale, SS: stratum spinosum, SG: stratum granulosum, SL: stratum lucidum. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: NGF mRNA under carrageenan-indusert betennelse.
NGF mRNA-uttrykk i termolysindelt epidermis under C-II ble evaluert av kvalitativ PCR (A) og kvantitativ sanntids PCR (B). Kvalitative mRNA-flekker (A) for NGF og aktin viste at det var mRNA av god kvalitet som kunne evalueres under betennelse. NGF mRNA uttrykk i epidermis under C-II ble evaluert av kvantitativ sanntid PCR ved hjelp av actin som et rengjøringsgen (B). NGF mRNA ble betydelig forhøyet (>3 ganger) etter 6 timer C-II sammenlignet med naive ubehandlede rotter, men nivåene gikk tilbake til baseline ved 12 timer (B). Resultatene uttrykkes som SEM med tre rotter per gruppe (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; studentens t-test, uparret, to-hale ble utført ved hvert tidspunkt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: IL-6 mRNA under carrageenan-indusert betennelse.
IL-6 mRNA-uttrykk i termolysindelt epidermis under C-II ble evaluert av kvalitativ PCR (A) og kvantitativ sanntids PCR (B). Kvalitative mRNA-flekker (A) for IL-6 og aktin viste at det var mRNA av god kvalitet for evaluering under betennelse. IL-6 mRNA uttrykk i epidermis under C-II ble evaluert av kvantitativ sanntids PCR ved hjelp av aktin som et rengjøringsgen (B). IL-6 mRNA ble betydelig forhøyet (>6 ganger) etter 6 timer C-II sammenlignet med naive ubehandlede rotter (B). Ved 12 timer ble IL-6 mRNA-nivåene redusert betydelig fra 6 h nivåer, men forble forhøyet (2 ganger) sammenlignet med naive rotter (B). Resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig S.E.M. med to rotter per gruppe (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ble studentens t-test, uparret, to-hale utført på hvert tidspunkt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studien fastslo at epidermis av rotte bakpote glabrøs hud lett ble skilt fra dermis ved hjelp av termolysin (0,5 mG / ml) i PBS med 1 mM kalsiumklorid ved 4 °C i 2,5 timer. Histologisk evaluering indikerte at epidermis ble skilt fra dermis ved kjellermembranen og at de epidermale rete ryggene var intakte. Thermolysin er en ekstracellulær metalloendopeptidase produsert av Gram-positiv (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. Aktiviteten er stabil ved 4 °C, men fungerer over et bredt spekter av temperaturer10,24,25. Dette enzymet har blitt brukt mye for proteinkjemi24,25, men flere grupper har vist sin anvendelse for hudseparasjon i epidermale og / eller dermale ark4,8,10,26,27. Walzer et al. var de første som rapporterte epidermal-dermal separasjon av menneskelig hud ved hjelp av termolysin ved 4 °C (250–500 μg/ml i 1 time)10. Med lys og elektronmikroskopi ble separasjon fastslått å forekomme ved den epidermale kjellermembranen mellom laminin og det bulløse pemphigoidantigenstedet10.
Videre ble hemidesmosomer, vedleggene av basale keratinocytter til kjellermembranen, forstyrret selektivt10,29. Rakhorst et al. sammenlignet termolysin (4 °C, 500 μg/ml, over natten) for å dispase for epidermal-dermal separasjon av kaninbulkal slimhinne8. Thermolysin var ufullstendig i å skille mucosal epidermis fra dermis som indikerer at forskjeller kan oppstå for arter, inkubasjonstid, løsningssammensetning (ingen CaCl2 for å forhindre termolysin autolyse24), kilde til termolysin og / eller stedsspesifikke forskjeller angitt fra andre studier10,26,27. Sluttbrukere av den nåværende protokollen bør sørge for å bruke fersk termolysin og alltid inkludere kalsiumklorid, men bør også være klar over disse potensielle begrensningene.
Selv om noen etterforskere har brukt termolysin ved 37 °C26,29, bør brukere av denne protokollen være oppmerksomme på å holde hudvevet ved 4 °C for å bevare stabiliteten til protein og mRNA. Vi brukte DMEM ved 4 °C som en løsning for hud før og etter termolysinseparasjon på grunn av nytten av å opprettholde celler i kultur28, og det har tidligere blitt brukt til hudseparasjon med termolysin8,26,27,30,31. Walzer et al. brukte imidlertid steril PBS supplert med 200 μG/ml streptomycin, 200 U/ml penicillin og 2,5 μg/ml soppsone10, mens andre har brukt forskjellige medier (f.eks. keratinocyttkulturmedier uten epidermal vekstfaktor) etterfulgt av PBS-skylling29.
I protokollen ble termolysinseparasjon utført i 500 μg/ml termolysin og 5 mM kalsiumklorid i PBS (pH = 8), lik den opprinnelige metoden10. DMEM har blitt brukt som en løsning for termolysinseparasjon ved 4 °C (over natten)8, og HEPES-bufferen har blitt brukt effektivt med 500 μG/ml termolysinoppløsning ved 37 °C i 2 timerog 29. Vi undersøkte imidlertid ikke hvordan kulturmedium eller andre buffere påvirker termolysins aktivitet for epidermal-dermal separasjon. Kalsiumklorid er et viktig tillegg for å redusere autolyse av termolysin24,32 og sletting av dette trinnet kan føre til ufullstendig spalting av epidermis fra dermis8.
Størrelsen på hudprøven ser ut til å påvirke tiden som trengs for termolysininkubasjon og effektiviteten av enzymatisk spalting av epidermis fra dermis. Etterforskere må evaluere riktig prøvestørrelse og inkubasjonstid for sitt eget vev. Flytende prøvene på termolysinoppløsningen med epidermis vendt oppover er viktig for optimal enzymeffektivitet10. Som nevnt tidligere er handlingsstedet for termolysin ved keratinocytten hemidesmosomer og kjellermembran4,10,29; Derfor virker termolysin innover fra kantene på huden. Fra vår erfaring skiller hudkantene seg tidligere enn midten av prøven, og det er viktig å gi nok tid til fullstendig enzymatisk spalting. Når spaltingen er fullført, bør epidermis trekke seg lett bort fra dermis. Hvis den fortsatt er festet, kan tugging på lagene føre til at deler av dermis kommer bort med epidermis.
En begrensning av termolysinteknikken er tiden som kreves. Å øke termolysinkonsentrasjonen utover 500 μG / ml reduserer ikke tiden for separasjon, og det er dårlig bevaring av epidermis ved høyere konsentrasjoner10. Epidermal-dermal separasjonsmetoder har blitt gjennomgått nylig4, og mange metoder tar 30-60 min ved 20-40 °C. Varme (50-60 °C) separasjon av huden skjer raskt (30 s til 10 min)4, men proteiner og mRNA er kjent for å forringes raskt ved så høye temperaturer. Alternativt kan natriumtiocyanat (2 N) ved RT være en akseptabel hurtigseparasjonsteknikk (5 min)4,6, men protein- og mRNA-integritet er ikke studert med denne metoden6. Den kalde termolysinmetoden ble valgt for bevaring av protein og mRNA, men det var ingen direkte sammenligninger mellom protein og mRNA-integritet ved hjelp av andre teknikker.
I den nåværende studien er kald termolysin fordøyelse vist å være en effektiv metode for å skille epidermis fra dermis for evaluering av mRNA og proteinendringer under betennelse. Under carrageenan-indusert betennelse ble NGF mRNA og proteinnivåer og IL-6 mRNA-nivåer forhøyet ved 6 timer, og returnerte nær baseline med 12 timer. Med immunhiistokjemi ble NGF-immunoreaktivitet økt i keratinocytter ved 6 timer og 12 timer. En fordel med termolysinmetoden er evnen til å utføre stedselektiv analyse. For eksempel er den økte produksjonen av NGF og IL-6 i den nåværende studien fra keratinocytter, siden dermale celler er utelukket fra analysene. Denne metoden gir innsikt i plasserings- og mediatortyper for sensibilisering av primære afferent terminaler33. I tillegg gir denne metoden bedre forståelse av tidsforløpet for nevrotrofinproduksjon sammen med opptak og transport i primære afferenter under betennelse34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Støtten til denne forskningen ble gitt av National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A.
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K.
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E.
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , Volume 1, Chapter 111 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1: Unit 1.2 (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M.
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
