Summary
여기에 제시된 표피의 분리를 위한 프로토콜이 진피로부터 염증성 중재자 생산을 평가하기 위한 것이다. 염증에 따라, 쥐 뒷발 표피는 4°C에서 열리신에 의해 진피로부터 분리된다. 표피는 그 때 서쪽 blot 및 면역 작용화학에 의하여 RT-PCR 및 단백질 평가에 의하여 mRNA 분석을 위해 이용됩니다.
Abstract
사용이 간편하고 저렴한 기술은 피부 손상, 염증 및/또는 민감화 중에 염증 성 중재자 및 신경 영양증의 사이트 별 생산을 결정하는 데 필요합니다. 이 연구의 목적은 4°C에서 활성단백질인 써모리신을 사용하여 표피-진피 분리 프로토콜을 설명하는 것이다. 이 절차를 설명하기 위해, 스프라그 Dawley 쥐는 마취되고, 오른쪽 뒷발은 카라지난으로 주입됩니다. 주입 후 6 시간 및 12 시간, 염증과 순진한 쥐를 가진 쥐는 안락사되고, 뒷발, 글라브루스 피부는 차가운 덜벡코의 수정 된 독수리 매체에 배치됩니다. 표피는 염화칼슘을 가진 PBS에 있는 열분해에 의해 진피에서 지하 막에서 분리됩니다. 다음으로, 진피는 미세 절 집게에 의해 고정되고 표피가 부드럽게 조롱됩니다. 조직 섹션의 Toluidine 파란색 염색은 표피가 지하 막의 진피에서 깨끗하게 분리되어 있음을 보여줍니다. 모든 각질 세포 층은 그대로 유지되며, 진피 유두의 들여쓰기와 함께 표피 리트 능선이 명확하게 관찰됩니다. 질적 및 실시간 RT-PCR은 신경 성장 인자와 인터류키-6 발현 수준을 결정하는 데 사용됩니다. 서양 블로팅 및 면역 히토화학은 마침내 신경 성장 인자의 양을 검출하기 위해 수행됩니다. 이 보고는 감기 열분해 소화가 염증 도중 mRNA및 단백질 변경의 평가를 위한 진피에서 표피를 분리하는 효과적인 방법이다는 것을 보여줍니다.
Introduction
염증성 진피 및 표피1,2,3에서발견되는 세포 유형의 이질성으로 인해 피부로부터의 염증성 중식 및 신경영양인의 평가가 제한될 수 있다. 평가를 위해 세포 해리를 수행하기 위해 2층의 분리 또는 수행을 위한 여러 효소, 화학적, 열 또는 기계적 기술이 최근4개검토되고 있다. 산, 알칼리, 중성염 및 열은 표피를 진피로부터 빠르게 나눌 수 있지만 세포 및 세포 외 부종은 종종5,6에서발생합니다. 트립신, 췌장, 엘라스타제, 각질, 콜라게나아제, 프라나제, 디스파제 및 열량리신은 표피-진피 분리4,7에사용된 효소이다. 트립신 및 기타 광범위한 스케일 의 성기 분석 효소는 37-40 °C에서 활성화되지만 표피 층의 해리를 방지하기 위해 주의 깊게 모니터링해야합니다. 디스파스는 라미나 덴사에서 표피를 갈라놓지만, 감기4,8 또는 37°C4,9에서더 짧은 시간점에서 분리를 위해 24h가 필요하다. 이러한 모든 기술의 제한 적인 특징은 조직 형태학의 잠재적인 중단 및 mRNA와 단백질의 무결성의 손실.
mRNA와 단백질의 무결성을 유지하기 위해, 피부 분리 방법은 짧은 시간 동안 추위에서 수행되어야한다. 염증 연구를 위한 피부 분리 기술을 평가할 때, 써모리신은 추운 온도4에서진피로부터 표피를 분리하는 효과적인 효소이다. 열리신은 4°C에서 활성화되며, 라미나 루치다로부터 표피 이미데스모좀을 갈라지고, 표피를 1-3h4,8,10내의 진피로부터 분리한다. 이 보고서의 목표는 염증성 중재자 및 신경 영양 요인에 대한 mRNA 및 단백질 수준을 검출하기 위해 진피에서 염증이 있는 쥐 표피의 분리를 위한 열립혈증의 사용을 최적화하는 것입니다. 여러 예비 보고서는11,12,13,14,15를제시했다. 이 원고의 목적은 열분해신을 이용한 최적의 피부 분리 기법을 설명하고 염증의 1) 마커, 2) 인터류킨-6(IL-6) mRNA, 및 3) 신경 성장 인자(NGF) mRNA 및 단백질을 카라게난 유발 염증(C-II)16,17의표피에서 시연하는 것이다. 완전한 Freund의 보조 모델을 사용하여 예비 보고서는 NGF mRNA및 단백질 수준이 염증15도중 일찌기 증가한다는 것을 나타냅니다. 마우스에서, oxazolone의 국소 적용을 이용한 피부 민감화는 시투혼성화(36)에서사용하는 IL-6 mRNA에서 조기 상승을 일으킨다. IL-6과 NGF 는 모두 C-II18,19에서연루되었지만 C-II의 급성 단계 동안 표피로부터 특히 IL-6 또는 NGF에 대한 mRNA 또는 단백질 수준을 설명하는 보고는 없었습니다.
열리 신 기술은 저렴 하 고 수행 하기 간단. 더욱이, 진피로부터 표피의 열리신 분리는염증(15)의과정에서 염증 중과및 신경영양인의 mRNA, 서부 블롯 및 면역히스트토화학적 분석을 허용한다. 연구원은 쉽게 피부 염증의 전임상 및 임상 연구 모두에서이 기술을 사용할 수 있어야 합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 오클라호마 주립 대학 건강 과학 IACUC (#2016-03)의 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. 카라게난 유발 염증 (C-II)
- 남성 및/또는 여성 스프라그 Dawley 쥐 (200-250 g; 8-9 주 이전) 이소플루란 (또는 주 사용 가능한 마취).
- 각막을 만지고 왼쪽 뒷발을 가볍게 꼬집어 마취의 깊이를 확인하십시오. 동물이 적절하게 마취되면 각막이나 발 반응이 관찰되지 않습니다.
- 피하로 오른쪽 글래브로우스, 힌드 발 100 μL 1% (w/v) 인산완충식식염(PBS)20에서희석된 λ-carrageenan을 피하한다.
- 이 보고서에서 이소플루란이 없는 순진한 쥐와 같은 적절한 컨트롤이 사용되는지 확인하십시오. 예비 연구에 따르면 이소플루란의 유무에 관계없이 순진한 쥐는 표피 IL-6 및 NGF의 기저 식을 가지고 있음을 나타냅니다.
참고: 순진한 쥐는 피하 식염수 또는 PBS가 국소 염증을 유발하기 때문에 염증 연구를 위한 바람직한대조군이다 23,37.
- 이 보고서에서 이소플루란이 없는 순진한 쥐와 같은 적절한 컨트롤이 사용되는지 확인하십시오. 예비 연구에 따르면 이소플루란의 유무에 관계없이 순진한 쥐는 표피 IL-6 및 NGF의 기저 식을 가지고 있음을 나타냅니다.
- 카라게난의 효과를 보장하기 위해 C-II 쥐의 부종을 평가한다(도 1)20. 후드 발 중족골 두께를 캘리퍼로 측정하여 부종의 양을 결정합니다.
- 6-12h에서, CO2 (또는 주 사용 가능한 마취 과다 복용)로 쥐를 안락사시키고 날카로운 메스로 글래브로스 뒷발 피부 1mm x 2mm 조각을 잘라냅니다. 털이 많은 피부를 사용하는 경우 1mm x 2mm 의 피부를 절단하기 전에 면도하십시오.
참고: 특정 연구에 따라 적절한 시간점을 선택해야 합니다. - 미세 절개 집게를 사용하여, 얼음에 미세 원심 분리기 튜브에 차가운 덜벡코의 수정 독수리 매체 (DMEM)의 1 mL로 피부를 전송하고 15-60 분 동안 차가운 유지.
2. 표피와 진피의 열리신 분리
- 열리신을 준비하고 활성화합니다.
- pH = 8 (농도 500 μg /mL)에서 PBS의 10 mL에 지오바실러스 스티어 더모필러스 5 mg을 추가하여 열량분해용액을 준비합니다.
- 1.11g을 증류된 H2O의10mL에 첨가하여 염화칼슘(CaCl2 무수)의 1M 용액을 준비한다.
- 열분해를 방지하기 위해 10 μL의 염화물 칼슘을 열분해 용액 10mL에 추가하십시오. 염화칼슘 최종 농도는 1mM입니다.
- 알리쿼트 1 mL의 활성 열리신10개의 우물로 얼음위에 24개의 잘 된 세포 배양 플레이트.
- 열분해 효소 소화를 사용하여 표피를 진피와 분리하십시오.
- 미세 절 집게를 사용하여, 활성화 된 열량의 각 우물에 하나의 피부 샘플을 전송합니다. 열리 신 용액에 피부에 담그지 않도록 하십시오.
- 부드럽게 우물의 측면에 피부를 탭하여 모립용액에 떠있는 집게에서 피부 샘플을 방출하는 데 도움이됩니다.
- 지층 각질(외부 표피)을 위로 올려 놓고 진피를 아래로 향하게 하여 피부를 열분해액에 넣습니다. 진피가 아래로 향하거나 효과적인 분리가 일어나지 않는 것이 중요합니다.
참고: 열량 분권에 대한 시간 의 양은 최종 사용자가 경험적으로 결정해야 합니다. 글래스브로스, 스프라그 Dawley 쥐의 뒷발 피부 (200-250 g; 8-9 주 이전)는 종종 분리를 위해 2.0-2.5 h가 필요합니다. 인큐베이션 시간은 종과 나이에 따라 달라질 것으로 예상됩니다. - 열량에 적절한 잠복 시간 후, 마이크로 절개 집게를 사용하여 1 개의 피부 샘플을 7-8 mL의 감기 (4 °C) DMEM을 가진 6 웰 세포 배양 판의 우물로 옮춥니다. 이를 통해 진피에서 표피를 분리할 수 있는 더 많은 공간을 확보할 수 있습니다.
- DMEM에 피부를 담그고 있습니다.
- 국경에서 거의 반투명 표피가 관찰될 때까지 피부 둘레의 집게로 표피를 부드럽게 브러시합니다. 이 것을 달성할 수 없는 경우에, 또 다른 15-30 분 동안 열리 신 용액에 피부 견본을 반환합니다.
- 표피가 진피에서 눈에 띄게 분리되면 미세 절 집게로 표피와 진피를 조심스럽게 잡고 진피에서 표피를 매우 천천히 당깁니다.
- 격리된 표피의 투명도를 평가하고 광학적으로 일관되지 않도록 하십시오. 쥐 표피의 1mm x 2mm 샘플의 예를 보려면 그림 2를 참조하십시오. 투명도에 변화가 있는 경우 적절한 분리가 발생하지 않았습니다.
- 표피와 진피의 분리 된 조각에서 에틸렌디아민테트라 아세트산 (EDTA)을 사용하여 열리 신을 비활성화합니다.
주의: 표피와 진피에 남아 있는 열량은 여전히 활성화되어 있으며 비활성화되지 않으면 층을 손상시킬 수 있습니다.- 0.5 M EDTA 스톡 솔루션을 준비합니다. 이렇게 하려면 0.93 g EDTA를 5mL의 이중 증류수에 천천히 넣습니다. 수산화 나트륨이 지울 때까지 용액에 추가합니다. 용액의 pH가 ~8.0인지 확인합니다.
- DMEM에서 5mM EDTA 솔루션을 만드세요. DMEM의 25mL에 0.5 M EDTA 스톡 솔루션0.25mL를 추가합니다.
- 분리된 표피와 진피를 5mM EDTA/DMEM 용액에 4°C에 30분 동안 배치하여 열분해진의 활성을 비활성화합니다.
- 팅크토리술8, 9,10으로표피를 평가한다.
- 표피의 일부를 10% 중립 포름알린, 4% 파라포름알데히드 또는 0.25% 파라포름알데히드에 0.8% 피크산 용액으로 실온(RT)에서 1시간 동안 반으로 수정한다.
- 고정 표피를 PBS에 10% 자당에 배치하여 RT에서 1시간 동안 교반합니다.
- 단면화를 위해 조직 포함 매트릭스에 표피를 동결. 젤라틴 코팅 유리 현미경 슬라이드에 저온 및 해동 마운트 섹션을 사용하여 14 μm 단면을 잘라.
- 90 s에 대 한 toluidine 블루 (TB; 10% 염화 나트륨에서 10% TB)의 작업 용액으로 슬라이드 워머와 얼룩에 건조 섹션. 수성 장착 매체로 커버립을 포지팅합니다.
- 50x-250x에서 밝은 필드 현미경 검사법을 가진 표피를 관찰하십시오.
참고 : 적절한 분리가 발생한 경우, 표피는 진피에서 깨끗하게 분할되고 다섯 층이 검출됩니다 : 층 배세, 지층 스피노섬, 지층 과립, 지층 루시덤 및 지층 각막. 분리된 쥐 피부 표피의 예는 도 3에서볼 수 있다.
3. 단백질 추출 및 서부 얼룩 분석
- 이전에 게시된프로토콜(21)을사용하여 분리된 조직 샘플에서 서부 블로팅을 수행한다.
- 용해 완충제의 50 μL에서 표피를 균질화 (25mM Tris HCl, pH = 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 % 글리세롤, 1 % 트리톤 X-100) 인산염 및 프로테아제 억제제 칵테일을 함유.
- 원심분리기 는 4°C에서 15분 동안 최대 속도로 시료를 측정하고 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도에 대한 상체를 평가한다.
- SDS 젤에 단백질(30 μg)의 동등한 농도를 적재하고, 전기전도를 수행한 다음 단백질을 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인으로 옮긴다.
- 2h용 5% 우유로 막막을 차단하고 1차 항체(마우스 안티NGF, E12, 1:1000)에서 하룻밤 동안 배양한다.
- PBS로 3배 를 10분 동안 세척하고, 라벨이 부착된 이차 항체(예: 알칼리성 인스파타제 라벨이 부착된 토끼 안티마우스 IgG)로 인큐베이션을 한다.
- 스캐닝 시스템을 사용하여 서부 블롯 신호(예: ECF 기판 및 이미징 플랫폼)를 평가합니다.
4. 면역 화학
- 최적의 면역 반응성 고정에 조직 샘플을 배치 : 0.96 % (w / v) 피릭 산과 0.2 % (w / v) 포름 알데히드 0.1 M 나트륨 인산염 완충, pH = 7.321,22,23 RT에서 4 h. RT에서 하룻밤 사이에 PBS에서 10 % 자당으로 전송.
- 조직섹션(21,22,23)에표준 면역 조직 화학을 수행한다.
- 동물의 표피를 포함 매트릭스의 단일 냉동 블록에 포함하고 극저온에 10-30 μm 섹션을 잘라. 젤라틴 코팅, 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 마운트하고 2 시간 동안 37 ° C에서 건조.
- PBS에서 3, 10분 헹구고 1차 항세라에서 24-96h의 배양을 위해 섹션을 세척하고, [예를 들어, 마우스 안티NGF(E12), 1:2000]과 토끼 항단백질 유전자 생성물 9.9(PGP 9.5, 1:2000)는 PBS에서 0.3% (w/v) 트리톤 X-100(PBS-T) PBS-T0.5% 소세루앨범(BSA) 및 0.5%의 폴리비닐(PVP)을 함유하고 있다.
- 1차 항세럼 인큐베이션 후, PBS에서 10분 동안 3회 섹션을 헹구고, 알렉사 플루어 488 당나귀 안티래빗 IgG(1:1000)와 알렉사 플루어 555 당나귀 항마우스 IgG(1:1000)의 RT에서 1h를 PBS에서 3회 배양한다.
- 10분 동안 PBS에서 세 번 헹구고 면역 형광의 변색을 지연시키는 비 퇴색 마운팅 배지가 있는 부착 커버립을 부착합니다.
5. RNA 절연 및 cDNA 합성
- 피부샘플(21)에서표준 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행한다. 페놀, 구아니딘 이소티오카네이트 용액을 사용하여 총 RNA를 분리한다.
- 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 역전사에 의해 보완적인 DNA 합성을 수행하십시오.
- NGF 및 IL-6 증폭에 대해 다음 프라이머 시퀀스를 사용합니다.
NGF (센스) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAAAAAACGGGG
NGF (안티센스) – GTGAGTCCTGTTGAGAGATTGTACCATG
IL-6 (센스) - GCAATTTGATTGTATGAACAGGATGC;
IL-6 (안티센스) – GTAGAAAACGGAACTCCAAGACCAAGA가그 - NGF와 IL-6 mRNA의 수준을 β-액틴 하우스키핑 유전자와 비교하십시오.
β-액틴 (감각) - TGCGTGACATTAAAAGGTGTTATG
β-액틴 (안티 센스) – 가ACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA - qRT-PCR 시스템을 사용하여 열 사이클러및 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 사용하여 질적 RT-PCR로 평가합니다.
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Representative Results
쥐 뒷발에 카라게난 주사는 발적과 부종16,17과같은 염증의 고전적인 증상을 일으켰다. 뒷발의 붓기는 기계식캘리퍼(20)로측정되었다. 발 두께의 기준값은 카라게난 치료 전에 각 쥐에 대해 얻어지고 6h 및 12h에서 다시 측정하였다. 발 두께는 기준값(도1)에비해 크게 증가하였다.
쥐 글래브로스 뒷발 피부의 열량은 표피 시트를 생성했다. 브라이트필드 현미경 검사는 표피 와 진피의 열량 분리의 효과를 평가하기 위해사용되었다(도 2). 표피의 층은 더 높은 배율에서 시트를 통해 초점을 맞추면서 결정될 수 있었다. 표피 단면의 Toluidine 파란색 염색은 표피가 지하 막에서 진피로부터 분리된 것으로나타났다(도 3). 진피 유두의 들여쓰기와 함께 표피 레테 능선 (표피 못)은 그대로 있었다. 모든 각질 세포 층이 관찰되었다.
열량 분분리 표피의 서양 얼룩은 4 °C에서 기술 도중 안정적인 단백질 수준을 나타내는 일관된 결과를 생성했습니다. 아주 작은 NGF 단백질은 순진한 쥐 표피에서 검출되었다, 그러나 NGF 단백질 수준은 순진한 동물에 비해 C-II의 6 시간 후에 (250%) 강화되었다(도 4). C-II의 12 h 후, NGF 수준은 6 h에 비해 감소했지만 컨트롤에 비해 높은 (55%)를 유지했다. 분리된 표피에서 NGF에 대한 면역히스트케미는 신뢰할 수 있는 면역염색을 제공하고 서부 블롯으로부터의 결과를 확인하였다(도5). NGF-면역 반응성(ir)은 순진한 대조표에서 검출되지 않았지만 6h C-II에서는 지층 과립 및 지층 루시덤의 대부분의 각질 세포에 NGF-ir이 있었다. 지층 스피노섬을 위한 몇몇 세포는 6 h C-II에서 NGF 면역반응성(IR)이었다. 12h C-II에서, NGF-ir는 지층 과립 및 지층 루시덤의 각질 세포에서 발생하여 지층 과립에 있는 일부 세포를 강렬하게 NGF-IR하였다. 어느 시점에서도 NGF-ir는 지층 바세일 또는 지층 각막에서 검출되지 않았다. PGP9.5-IR 진피, 정맥류 신경 섬유는 순진한 및 C-II 쥐로부터 분리된 표피(도5)에존재하였다.
질적 RT-PCR은 열량분리 표피(도6A, 도 7A)로부터좋은 품질의 mRNA가있음을 입증하였다. 정량적 실시간 PCR을 위한 가사 유전자로서 액틴을 사용하였고, C-II 중 표피에서 NGF mRNA 발현은 순진한쥐(도 6B)에비해 6h에서 현저히 상승(>3배)되었다. 12h에서, NGF mRNA는 기준선수준(도 6B)으로돌아왔다. 정량적 실시간 PCR을 위한 가사 유전자로서 actin을 사용하여, C-II 중 표피에서 IL-6 mRNA는 순진한쥐(도 7B)에비해 6h에서 현저히 상승(>6배)되었다. 12h에서 IL-6 mRNA 수준은 6h 양에서 크게 떨어졌지만 순진한쥐(도 7B)에비해 상승(2배)으로 유지되었다.
그림 1: 카라게난 주사는 발 부종을 생성합니다.
카라게난 치료 전에 각 쥐에 대해 기준값을 획득하였다. 6h 및 12h의 치료 후, 발 두께는 기준선 값에 비해 크게 증가하였다. 결과는 치료당 6개의 쥐를 가진 SEM으로 표현됩니다 (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; 학생의 t-테스트, 페어링되지 않은, 두 꼬리는 각 시점에서 수행되었다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 써모리신은 표피 한 장을 생성합니다.
브라이트필드 현미경 검사법은 약 1mm x 2mm 크기의 반투명 표피 시트를 밝혀냈습니다. 표피의 층은 더 높은 배율에서 시트를 통해 초점을 맞추면서 결정될 수 있었다. 스케일 바 = 500 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 3: 표피의 Toluidine 블루 염색.
브라이트필드 현미경 검사법은 열립이 진피로부터 표피의 효과적인 분리를 일으켰다는 것을 결정했습니다. 표피 레테 능선 (표피 못; 화살촉)은 진피 유두 (화살표)의 들여쓰기와 함께 관찰되었다. 모든 각질 세포 층은 손상되지 않았습니다. SB: 지층 바세일, SS: 지층 스피노섬, SG: 지층 과립, SL: 지층 루시덤, SC: 지층 각질. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 카라지난 유도 염증 중 표피에서 NGF 단백질 발현.
NGF 수준은 순진한 동물에 비해 염증의 6 시간 후에 증가 (250%) 증가했다. 12시간 후, 6h에 비해 수치가 감소했지만 순진한 동물과 는 대조적으로 상승(55%)되었다. 결과는 그룹당 3개의 쥐(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; 학생의 t-test, 페어링되지 않은, 두 꼬리가 각 시점에서 수행됨)을 가진 SEM으로 표현됩니다.
그림 5: C-II 동안 NGF 및 PGP9.5 면역 반응성(ir).
열 A, B, C는 NGF-ir, PGP9.5-ir 및 DAPI 핵 염색을 표시하지만 열 A1-C1은 NGF-ir만 표시합니다. 모든 이미지에서, 지층 각막은 왼쪽을 향해 하고 오른쪽을 향해 층 배세. NGF-ir는 순진한 대조표(A, A1)에서검출되지 않았다. 6 h-II (B, B1)에서NGF-ir는 지층 과립 (짧은 화살표) 및 지층 루시덤 (긴 화살표)의 대부분의 각질 세포에 존재하였다. 지층 스피노섬에 대한 몇 가지 세포는 6h C-II (큰 화살촉)에서 NGF-ir이었다. 12h C-II(C,C1)에서NGF-ir은 지층 과립 및 지층 루시덤(긴 화살표)의 각질 세포에서 발생했으며, 지층 과립에서 일부 세포가 강렬하게 NGF-ir(짧은 화살표)를 발생하였다. 어느 시점에서도 NGF-ir는 지층 바세일 또는 지층 각막에서 검출되지 않았다. PGP9.5-ir 피피질 신경 섬유는 순진한 및 C-II 쥐 (작은 화살촉, A-C)에서 분리 된 표피에 존재하였다. SB: 지층 바세일, SS: 지층 스피노섬, SG: 지층 과립, SL: 지층 루시덤. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 카라지난 유도 염증 중 NGF mRNA.
C-II 동안 열량분계 분리 표피에서 NGF mRNA 발현은 질적PCR(A)및 정량적 실시간 PCR(B)에 의해 평가되었다. NGF 및 액틴을 위한 질적 mRNA 얼룩(A)은 염증 중에 평가될 수 있는 좋은 품질의 mRNA가 있다는 것을 보여주었습니다. C-II 중 표피에서 NGF mRNA 발현은 가사 유전자(B)로서 액틴을 이용한 정량적 실시간 PCR에 의해 평가되었다. NGF mRNA는 순진한 치료되지 않은 쥐에 비해 C-II6 h 후 (>3 배) 현저하게 상승했지만, 수준은 12 h (B)에서 기준선으로 돌아왔다. 결과는 그룹당 3개의 쥐를 가진 SEM으로 표현됩니다 (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; 학생의 t-테스트, 페어링되지 않은, 두 꼬리는 각 시점에서 수행되었습니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 일-6 mRNA 카라게난 유발 염증 중.
C-II 동안 열량분계 분리 표피에서 IL-6 mRNA 발현은 질적PCR(A)및 정량적 실시간 PCR(B)에 의해 평가되었다. IL-6 및 actin에 대한 질적 mRNA 얼룩(A)은 염증 중 평가를 위한 양질의 mRNA가 있음을 보여주었다. C-II 중 표피에서 IL-6 mRNA 발현은 가사 유전자(B)로서 액틴을 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의해 평가되었다. IL-6 mRNA는 순진한 치료되지 않은 쥐(B)에 비해 C-II6h 후 (>6배) 크게 상승하였다. 12h에서 IL-6 mRNA 수준은 6h 수준에서 크게 감소되었지만 순진한 쥐 (B)에 비해 상승 (2 배)으로 유지되었습니다. 결과는 그룹당 두 마리의 쥐가 있는 평균 S.E.M로 표현됩니다(*p < 0.05, **p < 0.01, *p < 0.001, 학생의 t-test, 페어링되지 않은, 두 꼬리는 각 시점에서 수행되었다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
연구 결과에 따르면, 2.5h에 4°C에서 염화칼슘 1m로 PBS에서 써모리신(0.5 mG/mL)을 사용하여 진피로부터 쥐 뒷발 글래브루스 피부의 표피를 쉽게 분리하였다고 판단했다. 조직학적 평가는 표피가 지하 막의 진피로부터 분리되었고 표피 레테 능선이 손상되지 않았다는 것을 나타냈다. 열량은 그람 양성(Geo)바실러스 열염기 용해성 분석기(24)에의해 생성된 세포 외 금속 loendopeptidase이다. 그 활동은 4 °C에서 안정적이지만10,24,25의넓은 범위에서 기능적입니다. 이 효소는 단백질 화학24,25에광범위하게 사용되어 왔지만, 몇몇 그룹은 표피 및/또는 진피 시트4,8,10,26,27로피부 분리를 위한 그것의 적용을 보여주었습니다. Walzer 등은 4°C(250-500 μg/mL)에서10°C에서열립을 사용하여 인간의 피부의 표피-진피 분리를 최초로 보고했다. 빛과 전자 현미경 검사법을 통해, 분리는 라미닌과 황소 펨피로이드 항원부위(10)사이의 표피 지하 막에서 발생하는 것으로 결정되었다.
더욱이, 지하 막에 기저각막의 부착물인 이미데스모솜은10,29로선택적으로 중단되었다. Rakhorst 외. 써모리신 (4 °C, 500 μg/mL, 하룻밤)을 비교하여 토끼 부칼 점막8의표피 진피 분리를 위해 디스파제하였다. 열분해는 종, 잠복기, 용액 조성(열량량 자동분해24을방지하기 위한 CaCl2 없음), 열분해의 원천 및/또는 다른 연구에서 나타난 사이트별차이(10,26,27)에대해 차이가 발생할 수 있음을 나타내는 진피로부터 점막 표피를 분리하는 데 불완전하였다. 현재 프로토콜의 최종 사용자는 신선한 열분해를 사용하고 항상 염화 칼슘을 포함해야하지만 이러한 잠재적 인 한계를 알고 있어야합니다.
일부 연구자들은 37°C26,29에서열분해신을 사용했지만, 이 프로토콜의 사용자는 단백질과 mRNA의 안정성을 유지하기 위해 피부 조직을 4°C에서 유지하는 데 염두에 두어야 합니다. 문화(28)에서세포를 유지하는 데 유용성 으로 인해 열립 후 피부를 위한 용액으로 4°C에서 DMEM을 사용했으며, 이전에는 열리신8,26,27,30,31로피부 분리를 위해 사용되어 왔다. 그러나, Walzer 등은 200 μG/mL 연쇄상 구균신, 200 U/mL 페니실린, 2.5 μg/mL 균류존10으로보충된 멸균 PBS를 사용했으며, 다른 매체(예: 각질 세포배양배지 무료 표피질성장인자)를 사용했습니다.
프로토콜에서, 열분해는 원래방법(10)과유사한 PBS(pH= 8)에서 500 μg/mL 열분해 및 5mM의 염화칼슘으로 수행되었다. DMEM은 4°C(하룻밤)8에서열립분리용 용액으로 사용되어 왔으며, HEPES 버퍼는 2시간29시에37°C에서 500 μG/mL 열리신 용액으로 효과적으로 사용되고 있다. 그러나, 우리는 배양 매체 또는 그밖 완충이 표피 진피 분리를 위한 열리신의 활동에 어떻게 영향을 미치는지 탐구하지 않았습니다. 염화칼슘은열분해(24,32)의 자동분해를 감소시키고 이 단계의 삭제가 진피8으로부터표피의 불완전한 분열로 이어질 수 있다.
피부 샘플의 크기는 열립분면에 필요한 시간과 진피에서 표피의 효소 분열의 효과에 영향을 미치는 것으로 보입니다. 조사관은 자신의 조직에 대한 적절한 샘플 크기와 잠복기 시간을 평가해야합니다. 표피를 위쪽으로 향하는 써모리신 용액에 시료를 띄워 최적의 효소효과(10)에중요하다. 앞서 언급했듯이, 열리신에 대한 작용 부위는 각질세포 이미드모좀과 지하 막4,10,29에있다. 따라서 열리신은 피부 가장자리에서 안쪽으로 작동합니다. 우리의 경험에서, 피부 가장자리는 샘플의 중간보다 일찍 분리, 그리고 완전한 효소 분열을위한 충분한 시간을 허용하는 것이 중요하다. 골짜기가 완료되면 표피가 진피에서 쉽게 당겨야합니다. 여전히 부착된 경우, 층을 잡아당기면 진피 부분이 표피와 함께 사라질 수 있습니다.
열리 신 기술의 제한은 필요한 시간입니다. 500 μG/mL을 초과하는 열량 농도를 증가시켜 분리 시간을 감소시키지 않으며고농도(10)에서표피의 보존이 불량하다. 표피-진피 분리 방법은 최근4개에서검토되었으며, 많은 방법이 20~40°C에서 30~60분 정도 소요됩니다. 열(50~60°C)의 피부 분리는 빠르게 발생(30내지 10분)4,단백질과 mRNA는 고온에서 빠르게 저하되는 것으로 알려져 있다. 대안적으로, RT에서 티오시네이트 나트륨(2N)은 허용 가능한 급속 분리 기술(5분)4,6일수 있지만, 단백질 및 mRNA 무결성은 이 방법으로 연구되지 않았다6. 감기 열리신 방법은 단백질과 mRNA의 보존을 위해 선택되었지만, 다른 기술을 사용하여 단백질과 mRNA 무결성 사이에 직접 비교는 없었다.
본 연구에서는, 감기 열분해 소화는 염증 중 mRNA 및 단백질 변경의 평가를 위해 진피로부터 표피를 분리하는 효과적인 방법이 입증된다. 카라지난 유도 염증 동안, NGF mRNA 및 단백질 수준 및 IL-6 mRNA 수준은 6h에서 상승하여 기준선에 12h 가까이 돌아왔다. 면역히스토화학을 통해 NGF 면역반응성은 6h 및 12h에서 각질 세포에서 증가하였다. 열리신 방법의 장점은 사이트 선택적 분석을 수행하는 기능입니다. 예를 들어, 현재 연구에서 NGF 및 IL-6의 증가된 생산은 진피 세포가 애사에서 제외되기 때문에 각질 세포로부터 나타다. 이 방법을 사용하면 기본 발포성단자(33)의민감화를 위한 위치 및 중재자 유형에 대한 통찰력을 허용한다. 또한,이 방법은 염증34,35동안 1 차 성구에서 의 흡수 및 수송과 함께 neurotrophin 생산의 시간 과정을 더 잘 이해할 수 있게 한다.
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Disclosures
저자는 공개가 없습니다.
Acknowledgments
이 연구를 위한 자금조달은 건강 NIH-AR047410 (KEM)의 국가 학회에 의해 제공되었습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
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