Summary
Qui è presentato un protocollo per la separazione dell'epidermide dal derma per valutare la produzione di mediatori infiammatori. A seguito dell'infiammazione, l'epidermide della zampa posteriore di ratto viene separata dal derma mediante termolisina a 4 °C. L'epidermide viene quindi utilizzata per l'analisi dell'mRNA mediante RT-PCR e la valutazione delle proteine mediante western blot e immunoistochimica.
Abstract
Sono necessarie tecniche facili da usare e poco costose per determinare la produzione sito-specifica di mediatori infiammatori e neurotrofine durante lesioni cutanee, infiammazione e / o sensibilizzazione. L'obiettivo di questo studio è quello di descrivere un protocollo di separazione epidermico-dermica utilizzando la termolisina, una proteinasi attiva a 4 °C. Per illustrare questa procedura, i ratti Sprague Dawley vengono anestetizzati e le zampe posteriori destre vengono iniettate con carragenina. Sei e dodici ore dopo l'iniezione, i ratti con infiammazione e ratti ingenui vengono eutanasizzati e un pezzo di zampa posteriore, la pelle glabra viene posto nel freddo Dulbecco's Modified Eagle Medium. L'epidermide viene quindi separata dalla membrana basale dal derma dalla termolisina in PBS con cloruro di calcio. Successivamente, il derma è protetto da una pinca di microdissezione e l'epidermide viene delicatamente presa in giro. La colorazione blu toluidina delle sezioni tissutali mostra che l'epidermide è separata in modo pulito dal derma nella membrana basale. Tutti gli strati cellulari di cheratinociti rimangono intatti e le creste della rete epidermica insieme alle rientranze delle papille dermiche sono chiaramente osservate. La RT-PCR qualitativa e in tempo reale viene utilizzata per determinare il fattore di crescita nervoso e i livelli di espressione dell'interleuchina-6. Western blotting e immunoistochimica vengono infine eseguiti per rilevare quantità di fattore di crescita nervoso. Questo rapporto illustra che la digestione della termolisina fredda è un metodo efficace per separare l'epidermide dal derma per la valutazione dell'mRNA e delle alterazioni proteiche durante l'infiammazione.
Introduction
La valutazione dei mediatori infiammatori e dei fattori neurotrofici dalla pelle può essere limitata a causa dell'eterogeneità dei tipi di cellule presenti nel derma infiammato e nell'epidermide1,2,3. Diversi enzimi, tecniche chimiche, termiche o meccaniche che comportano la separazione dei due strati o per eseguire la dissociazione cellulare per la valutazione sono stati recentemente esaminati4. Acido, alcali, sale neutro e calore possono dividere rapidamente l'epidermide dal derma, ma il gonfiore cellulare ed extracellulare si verifica spesso5,6. Tripsina, pancreatina, elastasi, cheratinasi, collagenasi, pronasi, dispasi e termolisina sono enzimi che sono stati utilizzati per la separazione epidermico-dermica4,7. La tripsina e altri enzimi proteolitici su larga scala sono attivi a 37-40 °C, ma devono essere monitorati attentamente per prevenire la dissociazione degli strati epidermici. La dispasi fende l'epidermide alla lamina densa, ma richiede 24 ore per la separazione nel freddo4,8 o punti temporali più brevi a 37 °C4,9. Una caratteristica limitante di tutte queste tecniche è la potenziale interruzione della morfologia dei tessuti e la perdita di integrità di mRNA e proteine.
Per mantenere l'integrità dell'mRNA e delle proteine, è necessario eseguire un metodo di separazione cutanea al freddo per un breve periodo di tempo. Nella valutazione delle tecniche di separazione cutanea per gli studi sull'infiammazione, la termolisina è un enzima efficace per separare l'epidermide dal derma a basse temperature4. La termolisi è attiva a 4 °C, scinde gli emidesmosomi epidermici dalla lamina lucida e separa l'epidermide dal derma entro 1-3 h4,8,10. L'obiettivo di questo rapporto è ottimizzare l'uso della termolisina per la separazione dell'epidermide di ratto infiammata dal derma per rilevare i livelli di mRNA e proteine per mediatori infiammatori e fattori neurotrofici. Sono state presentate diverse relazioni preliminari11,12,13,14,15. L'obiettivo di questo manoscritto è descrivere una tecnica ottimale di separazione cutanea utilizzando la termolisina e dimostrare il rilevamento di 1) marcatori di infiammazione, 2) interleuchina-6 (IL-6) mRNA e 3) mRNA e proteine del fattore di crescita nervoso (NGF) nell'epidermide di ratti con infiammazione indotta da carragenina (C-II)16,17. Un rapporto preliminare che utilizza il modello adiuvante completo di Freund indica che i livelli di mRNA e proteine NGF aumentano precocemente durante l'infiammazione15. Nei topi, la sensibilizzazione cutanea con l'applicazione topica di oxazolone provoca un aumento precoce dell'mRNA IL-6 utilizzando l'ibridazione in situ36. Sia IL-6 che NGF sono stati implicati in C-II18,19, ma non ci sono state segnalazioni che descrivono livelli di mRNA o proteine per IL-6 o NGF specificamente dall'epidermide durante le fasi acute di C-II.
La tecnica della termolisina è economica e semplice da eseguire. Inoltre, la separazione termolitica dell'epidermide dal derma consente l'mRNA, il western blot e l'analisi immunoistochimica dei mediatori infiammatori e dei fattori neurotrofici durante il processo di infiammazione15. I ricercatori dovrebbero essere in grado di utilizzare facilmente questa tecnica in studi preclinici e clinici sull'infiammazione della pelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell'Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).
1. Infiammazione indotta da carragenina (C-II)
- Anestetizzare ratti Sprague Dawley maschi e/o femmine (200-250 g; 8-9 settimane) con isoflurano (o anestetico iniettabile).
- Controllare la profondità dell'anestesia toccando la cornea e pizzicando leggermente la zampa posteriore sinistra. Quando l'animale è opportunamente anestetizzato, non si osserverà alcuna risposta corneale o della zampa.
- Iniettare per via sottocutanea la zampa posteriore glabra destra con 100 μL dell'1% (p/v) di λ-carragenina diluita in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)20.
- Assicurarsi che vengano utilizzati controlli appropriati, come i ratti ingenui senza isoflurano in questa relazione. Studi preliminari indicano che i ratti naïve con o senza isoflurano hanno la stessa espressione basale di IL-6 epidermico e NGF.
NOTA: I ratti naïve sono i controlli preferiti per gli studi sull'infiammazione poiché la soluzione salina sottocutanea o pbS causano un'infiammazione locale23,37.
- Assicurarsi che vengano utilizzati controlli appropriati, come i ratti ingenui senza isoflurano in questa relazione. Studi preliminari indicano che i ratti naïve con o senza isoflurano hanno la stessa espressione basale di IL-6 epidermico e NGF.
- Valutare l'edema dei ratti C-II per garantire l'efficacia della carragenina (Figura 1)20. Determinare la quantità di edema misurando lo spessore metatarsale della zampa posteriore con pinze.
- A 6-12 ore, eutanasizzare i ratti con CO2 (o sovradosaggio anestetico iniettabile) e tagliare pezzi di 1 mm x 2 mm di pelle glabra della zampa posteriore con bisturi affilato. Se si utilizza la pelle pelosa, raderla prima di tagliare i pezzi di pelle da 1 mm x 2 mm.
NOTA: Assicurarsi che vengano scelti i timepoint appropriati in base agli studi specifici. - Utilizzando una pinna per microdissezione, trasferire la pelle in 1 mL di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco freddo in un tubo di microcentrifuga su ghiaccio e mantenere freddo per 15-60 minuti.
2. Separazione termolisina dell'epidermide e del derma
- Preparare e attivare la termolisina.
- Preparare una soluzione di termolisina, aggiungendo 5 mg di Geobacillus stearothermophilus a 10 ml di PBS, a pH = 8 (concentrazione 500 μg/mL).
- Preparare una soluzione 1 M di cloruro di calcio (CaCl2 anidro) aggiungendo 1,11 g in 10 ml di H2O distillato.
- Per prevenire l'autolisi della termolisi, aggiungere 10 μL di cloruro di calcio a 10 mL di soluzione di termolisina. La concentrazione finale di cloruro di calcio sarà di 1 mM.
- Aliquota 1 mL di termolisina attivata in 10 pozzetti di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzi su ghiaccio.
- Utilizzare la digestione enzimatica termolisina per separare l'epidermide dal derma.
- Utilizzando una pinza per microdissezione, trasferire un campione di pelle in ciascun pozzetto di termolisina attivata. Assicurarsi di non immergere la pelle nella soluzione di termolisina.
- Picchiettare delicatamente la pelle sul lato del pozzo per aiutare a rilasciare il campione di pelle dalla pinza per galleggiare sulla soluzione di termolisina.
- Far galleggiare la pelle nella soluzione di termolisina con lo strato corneo (epidermide esterna) rivolto verso l'alto e il derma rivolto verso il basso. È fondamentale che il derma sia rivolto verso il basso, o l'effettiva separazione non avrà luogo.
NOTA: La quantità di tempo per l'incubazione della termolisina deve essere determinata empiricamente dall'utente finale. La pelle glabra e posteriore dei ratti Sprague Dawley (200-250 g; 8-9 settimane) richiede spesso 2,0-2,5 ore per la separazione. Il tempo di incubazione dovrebbe variare con la specie e l'età. - Dopo il tempo di incubazione appropriato in termolisina, utilizzare una pinza per microdissezione per trasferire un campione di pelle in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con 7-8 mL di DMEM freddo (4 °C). Ciò consente più spazio per la separazione dell'epidermide dal derma.
- Immergere la pelle nel DMEM.
- Spazzolare delicatamente l'epidermide con la pincia attorno al perimetro della pelle fino a quando l'epidermide quasi traslucida non viene osservata ai bordi. Se ciò non può essere ottenuto, riportare il campione di pelle alla soluzione di termolisina per altri 15-30 minuti.
- Una volta che l'epidermide si separa notevolmente dal derma, quindi tenere con attenzione sia l'epidermide che il derma con una pinca di microdissezione e molto lentamente estrarre l'epidermide dal derma.
- Valutare la traslucenza dell'epidermide isolata e assicurarsi che sia otticamente coerente. Vedere la Figura 2 per un esempio di un campione di 1 mm x 2 mm di epidermide di ratto. Se c'è una variazione nella traslucenza, allora non si è verificata una corretta separazione.
- Inattivare la termolisisina usando l'acido etilendiammitatotraacetico (EDTA) nei pezzi separati di epidermide e derma.
ATTENZIONE: La termolisina che rimane nell'epidermide e nel derma è ancora attiva e può danneggiare gli strati se non inattivata.- Preparare una soluzione stock EDTA da 0,5 M. Per fare ciò, aggiungere lentamente 0,93 g di EDTA in 5 ml di acqua a doppio distillato. Aggiungere idrossido di sodio alla soluzione fino a quando non si schiarisce. Assicurarsi che il pH della soluzione sia ~ 8,0.
- Crea una soluzione EDTA da 5 mM in DMEM. Aggiungere 0,25 mL di soluzione stock edTA da 0,5 M a 25 mL di DMEM.
- Posizionare l'epidermide e il derma separati nella soluzione edta/DMEM da 5 mM a 4 °C per 30 minuti per disattivare l'attività della termolisina.
- Valutare l'epidermide con istologia tintoriale8,9,10.
- Fissare una porzione dell'epidermide in una formalina neutra al 10%, paraformaldeide al 4% o paraformaldeide allo 0,25% con soluzione di acido picrico allo 0,8% per 1 ora a temperatura ambiente (RT) con agitazione.
- Posizionare l'epidermide fissa in saccarosio al 10% in PBS per 1 ora a RT con agitazione.
- Congelare l'epidermide in una matrice di incorporamento del tessuto per il sezionamento. Tagliare sezioni trasversali da 14 μm utilizzando un criostato e sezioni di montaggio del disgelo su vetrini per microscopio rivestiti di gelatina.
- Sezioni asciutte su uno scaldasalviette e macchia con una soluzione di lavoro di blu toluidina (TB; 10% TB in 1% cloruro di sodio) per 90 s. Appose coverslips con un mezzo di montaggio acquoso.
- Osservare l'epidermide con la microscopia a campo luminoso a 50x-250x.
NOTA: Se si è verificata una corretta separazione, l'epidermide sarà divisa in modo pulito dal derma e verranno rilevati i cinque strati: strato basale, strato spinoso,strato granuloso, strato lucidum e strato corneo. Un esempio di epidermide separata della pelle di ratto può essere visto nella Figura 3.
3. Estrazione delle proteine e analisi western blot
- Eseguire western blotting sui campioni di tessuto separati utilizzando il protocollo21precedentemente pubblicato.
- Omogeneizzare l'epidermide in 50 μL di tampone di lisi (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glicerolo e 1% Triton X-100) contenente un cocktail di fosfatasi e inibitore della proteasi.
- Centrifugare i campioni a una velocità massima per 15 minuti a 4 °C e valutare il surnatante per la concentrazione proteica utilizzando un kit di analisi proteica.
- Caricare concentrazioni uguali di proteine (30 μg) su gel SDS, eseguire l'elettroforesi e quindi trasferire le proteine alle membrane di nitrocellulosa o PVDF.
- Bloccare le membrane con il 5% di latte per 2 ore e incubare durante la notte in anticorpi primari (topo anti-NGF, E12, 1:1000).
- Lavare 3 volte con PBS con interpolazione dello 0,3% per 10 minuti ciascuno e incubare con un anticorpo secondario etichettato (ad esempio, fosfatasi alcalina etichettata coniglio anti-topo IgG).
- Utilizzare un sistema di scansione per valutare il segnale western blot (ad esempio, substrato ECF e una piattaforma di imaging).
4. Immunoistochimica
- Posizionare i campioni di tessuto in un fissativo per un'immunoreattività ottimale: 0,96% (p/v) di acido picrico e 0,2% (p/v) di formaldeide in tampone fosfato di sodio 0,1 M, pH = 7,321,22,23 per 4 ore a RT. Trasferimento al 10% di saccarosio in PBS durante la notte a 4 °C.
- Eseguire immunoistochimica standard sulle sezioni tissutali21,22,23.
- Incorporare l'epidermide degli animali in un singolo blocco congelato nella matrice di incorporamento e tagliare sezioni di 10-30 μm su un criostato. Montare le sezioni su vetrini rivestiti di gelatina e asciugare a 37 °C per 2 ore.
- Lavare sezioni per tre risciacqui di 10 minuti in PBS e incubare per 24-96 ore in antisieri primari, [ad esempio, anti-NGF di topo (E12, 1:2000)] e prodotto genetico antiproteico di coniglio 9,9 (PGP 9,5, 1:2000) diluito in PBS contenente 0,3% (p/v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T con 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,5% di polivinilpirrolidone (PVP).
- Dopo l'incubazione primaria dell'antiserum, risciacquare le sezioni tre volte per 10 minuti in PBS e incubare 1 ora a RT in Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio IgG (1:1000) e Alexa Fluor 555 asino anti-mouse IgG (1:1000) diluito in PBS-T.
- Risciacquare le sezioni tre volte in PBS per 10 minuti e apporre le coperture con mezzo di montaggio non sbiadito per ritardare lo sbiadimento dell'immunofluorescenza.
5. Isolamento dell'RNA e sintesi del cDNA
- Eseguire la reazione a catena standard della trascrittasi polimerasi (RT-PCR) sui campioni cutanei21. Isolare l'RNA totale utilizzando una soluzione di fenolo, guanidina isotiocianato.
- Effettuare la sintesi complementare del DNA mediante moloney virus della leucemia murina trascrittasi inversa.
- Utilizzare le seguenti sequenze di primer per l'amplificazione di NGF e IL-6:
NGF (Senso) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
NGF (Antisenso) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
IL-6 (Senso) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
IL-6 (Antisenso) – GTAGAAACGGAACTCCAGAGAGAGAG - Confronta i livelli di mRNA NGF e IL-6 con il gene di pulizia β-actina:
β-ACTIN (Senso) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
β-ACTINA (Antisenso) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA - Valutare con RT-PCR qualitativa utilizzando thermal cycler e PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) utilizzando un sistema qRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'iniezione di carragenina nella zampa posteriore del ratto ha causato sintomi classici di infiammazione come arrossamento ed edema16,17. Il gonfiore della zampa posteriore è stato misurato con pinze meccaniche20. Un valore basale dello spessore della zampa è stato ottenuto per ciascun ratto prima del trattamento con carragenina e misurato di nuovo a 6 h e 12 h. Lo spessore della zampa è stato aumentato in modo significativo rispetto ai valori basali (Figura 1).
L'incubazione della termolisina della pelle glabra della zampa posteriore del ratto ha prodotto un foglio di epidermide. La microscopia a campo luminoso è stata utilizzata per valutare l'efficacia della separazione termolisina dell'epidermide e del derma (Figura 2). Gli strati dell'epidermide potrebbero essere determinati mentre si concentrano attraverso il foglio a un ingrandimento più elevato. La colorazione blu toluidina delle sezioni trasversali epidermiche ha mostrato che l'epidermide era separata dal derma della membrana basale (Figura 3). Le creste epidermiche della rete (pioli epidermici) insieme alle rientranze delle papille dermiche erano intatte. Sono stati osservati tutti gli strati cellulari di cheratinociti.
Il western blotting dell'epidermide termolitica separata ha prodotto risultati coerenti che indicano livelli proteici stabili durante la tecnica a 4 °C. Pochissime proteine NGF sono state rilevate nell'epidermide naïve di ratto, ma i livelli di proteina NGF sono stati sovraregolati (250%) dopo 6 ore di C-II rispetto agli animali naïve (Figura 4). Dopo 12 ore di C-II, i livelli di NGF sono stati ridotti rispetto a 6 ore, ma sono rimasti elevati (55%) rispetto ai controlli. L'immunoistochimica per nGF nell'epidermide separata ha fornito immunostaining affidabile e ha confermato i risultati delle macchie occidentali (Figura 5). L'immunoreattività nGF (ir) non è stata rilevata nell'epidermide di controllo naïve, ma a 6 ore C-II, c'era NGF-ir nella maggior parte dei cheratinociti dello strato granuloso e dello strato lucidum. Alcune cellule per lo strato spinoso erano NGF-immunoreattive (IR) a 6 h C-II. A 12 h C-II, NGF-ir si è verificato nei cheratinociti dello strato granuloso e strato lucidum con alcune cellule nello strato granuloso intensamente NGF-IR. In nessun momento è stato rilevato NGF-ir nello strato basale o nello strato corneo. PGP9.5-IR intraepidermale, le fibre nervose varicose erano presenti nell'epidermide separata dai ratti naïve e C-II (Figura 5).
La RT-PCR qualitativa ha dimostrato che c'era un mRNA di buona qualità dall'epidermide termolitica separata (Figura 6A, Figura 7A). Utilizzando l'actina come gene di pulizia per la PCR quantitativa in tempo reale, l'espressione di mRNA NGF nell'epidermide durante C-II era significativamente elevata (>3 volte) a 6 ore rispetto ai ratti naïve (Figura 6B). A 12 h, l'mRNA NGF è tornato ai livelli basali (Figura 6B). Utilizzando l'actina come gene di pulizia per la PCR quantitativa in tempo reale, l'mRNA IL-6 nell'epidermide durante C-II era significativamente elevato (>6 volte) a 6 ore rispetto ai ratti naïve (Figura 7B). A 12 h, i livelli di mRNA il-6 sono diminuiti significativamente dalle quantità di 6 h, ma sono rimasti elevati (2 volte) rispetto ai ratti naïve (Figura 7B).
Figura 1: L'iniezione di carragenina produce edema della zampa.
Un valore basale è stato ottenuto per ciascun ratto prima del trattamento con carragenina. Dopo 6 ore e 12 ore di trattamento, lo spessore della zampa è aumentato significativamente rispetto ai valori basali. I risultati sono espressi come SEM con sei ratti per trattamento (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; il t-test dello studente, spaiato, a due code, è stato eseguito in ogni punto temporale). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La termolisi produce un foglio di epidermide.
La microscopia a campo luminoso ha rivelato un foglio epidermico traslucido di circa 1 mm x 2 mm. Gli strati dell'epidermide potrebbero essere determinati mentre si concentrano attraverso il foglio a un ingrandimento più elevato. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Colorazione blu toluidina dell'epidermide.
La microscopia a campo luminoso ha determinato che la termolisina ha causato un'efficace separazione dell'epidermide dal derma. Sono state osservate creste di rete epidermica (pioli epidermici; punte di freccia) insieme a rientranze da papille dermiche (frecce). Tutti gli strati cellulari di cheratinociti erano intatti. SB: strato basale, SS: strato spinoso, SG: strato granuloso, SL: strato lucidum, SC: strato corneo. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Espressione della proteina NGF nell'epidermide durante l'infiammazione indotta dalla carragenina.
I livelli di NGF sono aumentati (250%) dopo 6 ore di infiammazione rispetto agli animali naïve. Dopo 12 ore, i livelli sono stati ridotti rispetto a 6 ore, ma erano elevati (55%) in contrasto con gli animali naïve. I risultati sono espressi come SEM con tre ratti per gruppo (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; il t-test dello studente, spaiato, a due code è stato eseguito in ogni momento) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immunoreattività (ir) NGF e PGP9.5 durante C-II.
Le colonne A, B, C mostrano NGF-ir, PGP9.5-ir e DAPI colorazione nucleare, mentre le colonne A1-C1 mostrano solo NGF-ir. In tutte le immagini, lo strato corneo è verso sinistra e lo strato basale verso destra. NGF-ir non è stato rilevato nell'epidermide di controllo naïve (A, A1). A 6 h C-II (B,B1), NGF-ir era presente nella maggior parte dei cheratinociti dello strato granuloso (frecce corte) e dello strato lucidum (frecce lunghe). Alcune cellule per lo strato spinoso erano NGF-ir a 6 h C-II (grandi punte di freccia). A 12 h C-II (C,C1), NGF-ir si è verificato nei cheratinociti dello strato granuloso e dello strato lucidum (frecce lunghe) con alcune cellule nello strato granuloso intensamente NGF-ir (frecce corte). In nessun momento è stato rilevato NGF-ir nello strato basale o nello strato corneo. Le fibre nervose intraepidermiche PGP9.5-ir erano presenti nell'epidermide separata dai ratti naïve e C-II (piccole punte di freccia, A-C). SB: strato basale, SS: strato spinoso, SG: strato granuloso, SL: strato lucidum. Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: MRNA NGF durante l'infiammazione indotta dalla carragenina.
L'espressione di nGF mRNA nell'epidermide termolitica separata durante C-II è stata valutata mediante PCR qualitativa (A) e PCR quantitativa in tempo reale (B). Le macchie qualitative di mRNA (A) per NGF e actina hanno dimostrato che c'era un mRNA di buona qualità che poteva essere valutato durante l'infiammazione. L'espressione di nGF mRNA nell'epidermide durante C-II è stata valutata mediante PCR quantitativa in tempo reale utilizzando l'actina come gene di pulizia (B). L'mRNA NGF è stato significativamente elevato (>3 volte) dopo 6 ore di C-II rispetto ai ratti naïve non trattati, ma i livelli sono tornati al basale a 12 ore (B). I risultati sono espressi come SEM con tre ratti per gruppo (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; il t-test dello studente, spaiato, a due code è stato eseguito in ogni punto temporale). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: MRNA IL-6 durante l'infiammazione indotta da carragenina.
L'espressione di mRNA IL-6 nell'epidermide termolitica separata durante C-II è stata valutata mediante PCR qualitativa (A) e PCR quantitativa in tempo reale (B). Le macchie qualitative di mRNA (A) per IL-6 e actina hanno mostrato che c'era un mRNA di buona qualità per la valutazione durante l'infiammazione. L'espressione di mRNA IL-6 nell'epidermide durante C-II è stata valutata mediante PCR quantitativa in tempo reale utilizzando l'actina come gene di pulizia (B). L'mRNA IL-6 era significativamente elevato (>6 volte) dopo 6 ore di C-II rispetto ai ratti naïve non trattati (B). A 12 ore, i livelli di mRNA il-6 sono stati ridotti significativamente dai livelli di 6 ore, ma sono rimasti elevati (2 volte) rispetto ai ratti naïve (B). I risultati sono espressi come S.E.M. medio con due ratti per gruppo (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, il t-test dello studente, spaiato, a due code è stato eseguito in ogni punto temporale). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lo studio ha determinato che l'epidermide della pelle glabra della zampa posteriore di ratto era facilmente separata dal derma usando termolisina (0,5 mG / mL) in PBS con 1 mM di cloruro di calcio a 4 ° C per 2,5 ore. La valutazione istologica ha indicato che l'epidermide era separata dal derma della membrana basale e che le creste della rete epidermica erano intatte. La termolisina è una metalloendopeptidasi extracellulare prodotta da Gram-positivo (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. La sua attività è stabile a 4 °C ma è funzionale su un ampio intervallo di temperature10,24,25. Questo enzima è stato ampiamente utilizzato per la chimica delle proteine24,25,ma diversi gruppi hanno mostrato la sua applicazione per la separazione cutanea in fogli epidermici e/odermici 4,8,10,26,27. Walzer et al. sono stati i primi a riportare la separazione epidermico-dermica della pelle umana usando termolisina a 4 °C (250-500 μg/mL per 1 ora)10. Con la microscopia ottica ed elettronica, è stata determinata la separazione sulla membrana basale epidermica tra la laminina e il sito dell'antigene pemfigoide bolloso10.
Inoltre, gli emidesmosomi, gli attaccamenti dei cheratinociti basali alla membrana basale, sono stati interrotti selettivamente10,29. Rakhorst et al. hanno confrontato la termolisina (4 °C, 500 μg/mL, durante la notte) con la dispasi per la separazione epidermico-dermica della mucosa buccale del coniglio8. La termolisina era incompleta nel separare l'epidermide della mucosa dal derma, il che significa che possono verificarsi differenze per specie, tempo di incubazione, composizione dellasoluzione (nessuna CaCl 2 per prevenire l'autolisi della termolisina24),fonte di termolisina e/o differenze sito-specifiche indicate da altri studi10,26,27. Gli utenti finali dell'attuale protocollo dovrebbero assicurarsi di utilizzare termolisina fresca e includere sempre cloruro di calcio, ma dovrebbero anche essere consapevoli di queste potenziali limitazioni.
Sebbene alcuni ricercatori abbiano usato termolisina a 37 °C26,29, gli utenti di questo protocollo dovrebbero essere consapevoli di mantenere il tessuto cutaneo a 4 ° C per preservare la stabilità delle proteine e dell'mRNA. Abbiamo usato DMEM a 4 °C come soluzione per la pelle prima e dopo la separazione della termolisina a causa della sua utilità nel mantenimento delle cellule incoltura 28,ed è stato utilizzato in precedenza per la separazione della pelle con termolisina8,26,27,30,31. Tuttavia, Walzer et al. hanno utilizzato PBS sterile integrato con 200 μG / mL di streptomicina, 200 U / mL di penicillina e 2,5 μg / mL fungizone10, mentre altri hanno utilizzato diversi mezzi (ad esempio, mezzi di coltura di cheratinociti privi di fattore di crescita epidermico) seguiti da PBS risciacquo29.
Nel protocollo, la separazione della termolisina è stata eseguita in termolisina da 500 μg/mL e 5 mM di cloruro di calcio in PBS (pH = 8), simile al metodo originale10. DMEM è stato utilizzato come soluzione per la separazione della termolisina a 4 °C (durante la notte)8e il tampone HEPES è stato utilizzato efficacemente con soluzione di termolisina da 500 μG/mL a 37 °C per 2 ore29. Tuttavia, non abbiamo esplorato come il terreno di coltura o altri tamponi influenzino l'attività della termolisina per la separazione epidermico-dermica. Il cloruro di calcio è un'aggiunta importante per ridurre l'autolisi della termolisi della termolisi24,32 e la delezione di questo passaggio può portare a una scissione incompleta dell'epidermide dal derma8.
La dimensione del campione di pelle sembra influenzare il tempo necessario per l'incubazione della termolisina e l'efficacia della scissione enzimatica dell'epidermide dal derma. I ricercatori devono valutare la dimensione del campione appropriata e il tempo di incubazione per i propri tessuti. Far galleggiare i campioni sulla soluzione di termolisina con l'epidermide rivolta verso l'alto è importante per un'efficacia enzimatica ottimale10. Come notato in precedenza, il sito di azione per la termolisina è agli emidesmosomi cheratinociti e alla membrana basale4,10,29; pertanto, la termolisi lavora verso l'interno dai bordi della pelle. Dalla nostra esperienza, i bordi della pelle si separano prima della metà del campione ed è importante concedere abbastanza tempo per una scissione enzimatica completa. Quando la scissione è completa, l'epidermide dovrebbe allontanarsi facilmente dal derma. Se ancora attaccato, tirare gli strati può causare porzioni di derma a venire via con l'epidermide.
Una limitazione della tecnica della termolisina è il tempo richiesto. Aumentare la concentrazione di termolisina oltre i 500 μG/ml non diminuisce il tempo di separazione e c'è scarsa conservazione dell'epidermide a concentrazioni più elevate10. I metodi di separazione epidermico-dermica sono stati recentemente rivisti4e molti metodi richiedono 30-60 minuti a 20-40 °C. La separazione termica (50-60 °C) della pelle avviene rapidamente (da 30 s a 10 min)4, ma è noto che le proteine e l'mRNA si degradano rapidamente a temperature così elevate. In alternativa, il tiocianato di sodio (2 N) a RT può essere una tecnica di separazione rapida accettabile (5 min)4,6, ma l'integrità delle proteine e dell'mRNA non è stata studiata con questo metodo6. Il metodo della termolisina fredda è stato scelto per la conservazione di proteine e mRNA, ma non sono stati effettuati confronti diretti tra l'integrità delle proteine e dell'mRNA utilizzando altre tecniche.
Nel presente studio, la digestione con termolisina fredda ha dimostrato di essere un metodo efficace per separare l'epidermide dal derma per la valutazione dell'mRNA e delle alterazioni proteiche durante l'infiammazione. Durante l'infiammazione indotta dalla carragenina, i livelli di mRNA e proteine NGF e i livelli di mRNA IL-6 sono stati elevati a 6 ore, tornando vicino al basale di 12 ore. Con l'immunoistochimica, l'immunoreattività NGF è aumentata nei cheratinociti a 6 ore e 12 ore. Un vantaggio del metodo della termolisi è la capacità di eseguire analisi selettive del sito. Ad esempio, l'aumento della produzione di NGF e IL-6 nel presente studio proviene dai cheratinociti, poiché le cellule dermiche sono escluse dai test. Questo metodo consente di comprendere la posizione e i tipi di mediatori per la sensibilizzazione dei terminali afferenti primari33. Inoltre, questo metodo consente una migliore comprensione del decorso temporale della produzione di neurotrofine insieme all'assorbimento e al trasporto nelle afferenti primarie durante l'infiammazione34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno divulgazioni.
Acknowledgments
Il finanziamento per questa ricerca è stato fornito dal National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A.
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K.
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E.
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , Volume 1, Chapter 111 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1: Unit 1.2 (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M.
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
