Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Udvælgelse af transporter-målrettede hæmmende nanostoffer af Solid-Supported-Membrane (SSM)-baseret elektrofysiologi

Published: May 3, 2021 doi: 10.3791/62578
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Nanobodies er vigtige værktøjer i strukturel biologi og udgør et stort potentiale for udvikling af behandlinger. Udvælgelsen af nanobodies med hæmmende egenskaber kan dog være udfordrende. Her demonstrerer vi brugen af solid-supported-membrane (SSM)-baseret elektrofysiologi til klassificering af hæmmende og ikke-hæmmende nanoboder rettet mod elektrogene membrantransportører.

Abstract

Antistoffer fra enkelte domæner (nanostoffer) er blevet flittigt anvendt i mekanistiske og strukturelle undersøgelser af proteiner, og de udgør et enormt potentiale som redskaber til udvikling af kliniske behandlinger, hvoraf mange er afhængige af hæmning af membranproteiner som transportører. De fleste af de metoder, der anvendes til at bestemme hæmningen af transportaktivitet, er imidlertid vanskelige at udføre i rutiner med høj kapacitet og afhænger af tilgængeligheden af mærkede substrater, hvilket komplicerer screeningen af store nanobodybiblioteker. Solid-supported membran (SSM) elektrofysiologi er en høj-throughput metode, der anvendes til at karakterisere elektrogene transportører og måle deres transport kinetika og hæmning. Her viser vi implementeringen af SSM-baseret elektrofysiologi for at vælge hæmmende og ikke-hæmmende nanostoffer rettet mod en elektrogen sekundær transportør og til at beregne nanobodies hæmmende konstanter. Denne teknik kan især være nyttig til valg af hæmmende nanostoffer rettet mod transportører, for hvilke mærkede substrater ikke er tilgængelige.

Introduction

Antistoffer består af to identiske tunge kæder og to lyskæder, der er ansvarlige for antigenbindingen. Camelids har tunge kæder kun antistoffer, der udviser lignende affinitet for deres cognate antigen sammenlignet med konventionelle antistoffer1,2. Det eneste variable domæne (VHH) af tunge kæde kun antistoffer bevarer det fulde antigenbindende potentiale og har vist sig at være meget stabilt1,2. Disse isolerede VHH-molekyler eller "nanoboder" er blevet implementeret i undersøgelser relateret til membranproteiner biokemi som værktøjer til stabilisering af konformationer3,4, som hæmmere5,6, som stabiliseringsmidler7og som gadgets til strukturbestemmelse8,9,10 . Nanoboder kan genereres ved immunisering af camelids til præberigelse af B-celler, der koder målspecifikke nanostoffer og efterfølgende isolering af B-celler, efterfulgt af kloning af nanobody biblioteket og udvælgelse ved phage display11,12,13. En alternativ måde at generere nanobodies på er baseret på in vitro-udvælgelsesmetoder, der er afhængige af konstruktion af biblioteker og valg af phage-display, ribosomdisplay eller gærdisplay14,15,16,17,18,19,20. Disse in vitro-metoder kræver store biblioteksstørrelser, men drager fordel af at undgå dyrevaccination og favorisere udvælgelsen af nanoboder rettet mod proteiner med relativt lav stabilitet.

Den lille størrelse af nanobodies, deres høje stabilitet og opløselighed, stærk antigen affinitet, lav immunogenicitet og relativt let produktion gør dem til stærke kandidater til udvikling af terapi21,22,23. Især nanostoffer, der hæmmer aktiviteten af flere membranproteiner , er potentielle aktiver til kliniske anvendelser5,24,25,26. For membrantransportører er det nødvendigt at udvikle en analyse, der gør det muligt at påvise transporterede substrater og/eller cosubstrater for at vurdere, om et nanonbody har hæmmende aktivitet. Sådanne analyser involverer normalt mærkede molekyler eller design af substratspecifikke detektionsmetoder, som kan mangle en universel anvendelse. Desuden kræver identifikation af hæmmende nanostoffer generelt screening af et stort antal ringbind. Således er en metode, der kan bruges i en høj-gennemløbstilstand, og som ikke er afhængig af mærkede substrater, afgørende for dette valg.

SSM-baseret elektrofysiologi er en yderst følsom, meget tidsforklaret teknik, der gør det muligt at detektere bevægelser af ladninger på tværs af membraner (f.eks. ionbinding/transport)27,28. Denne teknik er blevet anvendt til at karakterisere elektrogene transportører, som er vanskelige at studere ved hjælp af andre elektrofysiologi teknikker på grund af den relative lave omsætning af disse proteiner29,30,31,32,33,34,35. SSM elektrofysiologi kræver ikke brug af mærkede substrater, det er velegnet til screening med høj gennemløb, og enten proteoliposomes eller membran vesikler, der indeholder transportøren af interesse kan anvendes. Her viser vi, at SSM-baseret elektrofysiologi kan bruges til at klassificere transportør-målrettede nanoboder med hæmmende og ikke-hæmmende egenskaber. Som en proof-of-princip, beskriver vi rekonstitution af en bakteriel cholin transporter i liposomer, efterfulgt af detaljerede trin for immobilisering af proteoliposomes på SSM sensorer. Vi beskriver derefter, hvordan man udfører SSM-baserede elektrofysiologimålinger af cholin transport, og hvordan man bestemmer den halvmaksime effektive koncentration (EF50). Vi viser derefter, hvordan man bruger SSM-baseret elektrofysiologi til at screene flere nanostoffer og til at identificere hæmmere af cholin transport. Endelig beskriver vi, hvordan man bestemmer de halve maksimale hæmmende koncentrationer (IC50) af udvalgte hæmmende nanoboder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Membranprotein rekonstitution

  1. Bland 3 mL E. coli polar lipider med 1 mL fosfatylcholin i en rund bundkolbe under en ventileret hætte.
  2. Lipidblandingen tørres i 20 min under vakuum ved hjælp af en roterende fordamper og et vandbad ved 37 °C for at fjerne kloroform. Tør om nødvendigt yderligere under nitrogen- eller argongas.
  3. Ved hjælp af TS buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl), der indeholder 2 mM β-mercaptoethanol, genbruge lipider til 25 mg/mL.
  4. Aliquot lipider i 500 μL aliquots, flash fryse i flydende nitrogen, og opbevares ved -80 °C.
  5. Optø en 500 μL aliquot lipider og fortynd 1:1 ved hjælp af TS buffer indeholdende 2 mM β-mercaptoethanol.
  6. Ekstrudere lipid suspension 15 gange ved hjælp af en 400 nm membran.
  7. Fortynd lipid suspension til at have en endelig lipid koncentration på 4,4 mg / mL.
  8. Tilsæt n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) for at have en endelig koncentration på 0,2% og lad den rotere i 1 time ved 200 o/min ved stuetemperatur (RT).
  9. Tilsæt det rensede protein til lipiderne ved hjælp af et lipid-til-protein-forhold mellem 1:10 og 1:100 (w:w).
    BEMÆRK: Forholdet skal justeres afhængigt af styrken af det signal, der registreres i SSM-elektrofysiologimålinger af substrattransport (se nedenfor). For at opnå større signaler skal du bruge mindre lipid-til-protein-forhold.
  10. Inkuberes blandingen roterende ved 200 rpm i 1 time på RT.
  11. Tilsæt 30 mg/mL polystyren adsorbent perler, forvasket i TS buffer.
    BEMÆRK: Tilføj polystyren perler trinvis.
  12. Inkubere perler-lipider blandingen i 30 minutter på RT under langsom omrøring.
  13. For at fjerne perlerne, lad perlerne-lipider blandingen stå, så perlerne slå sig ned. Overfør opløsningen til et nyt rør og lad perlerne bag sig. Tilsæt 30 mg/mL friske polystyren adsorbent perler til den adskilte lipid blanding.
  14. Blandingen inkuberes i 1 time ved 4 °C under langsom omrøring.
  15. Adskil perlerne fra blandingen som beskrevet i trin 1.13 og tilsæt 30 mg/mL friske polystyren adsorbent perler.
  16. Inkuberes blandingen i 16 timer ved 4 °C.
  17. Adskil perlerne fra blandingen som beskrevet i trin 13 og tilsæt 30 mg/mL friske polystyren adsorbent perler.
  18. Blandingen inkuberes i 2 timer ved 4 °C til en fjerde og sidste vask.
  19. Centrifuge ved 110.000 x g i 30 min ved 4 °C.
  20. Pellet vaskes med 500 μL TS-buffer, der indeholder 2 mM β-mercaptoethanol.
  21. Centrifuge igen ved 110.000 x g i 30 min ved 4 °C.
  22. Resuspend pellet til en endelig lipidkoncentration på 25 mg/mL i TS-buffer med 2 mM β-mercaptoethanol.
  23. Proteinkoncentrationen estimeres ved hjælp af en i gel- eller amido-sort analyse36.
  24. Aliquot proteoliposomes, flash fryse i flydende nitrogen, og opbevares ved -80 °C.

2. Chip forberedelse

  1. Fyld en enkelt sensorchip med 50-100 μL på 0,5 mM 1-octadecanethiolopløsning (suspenderet igen i isopropanol).
  2. Inkuber chippen med opløsningen i 30 minutter på RT.
  3. Fjern thiolopløsningen ved at trykke på chippen på et væv.
  4. Skyl sensoren 3 gange med 5 mL ren isopropanol.
  5. Skyl sensoren 3 gange med 5 mL dobbelt destilleret vand.
  6. Tør sensoren ved at trykke på et silkepapir.
  7. Påfør 1,5 μL på 7,5 μg/μL 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (lipider tørret i en rotatorisk fordamper og suspenderet i n-decane).
  8. Umiddelbart efter fyldes sensoren med 50 μL ikke-aktiverende SSM-buffer, som ikke indeholder substratet. Dette vil føre til en spontan dannelse af SSM-laget.
    BEMÆRK: SSM-bufferen skal optimeres på forhånd for at bestemme optimale forhold, der har lav baggrundsstøj. En generel buffer, der indeholder 30 mM HEPES pH 7,4, 5 mM MgCl2, 140 mM NaCl, kan bruges som udgangspunkt. SSM-bufferen uden substratet anvendes til vask før og efter målingen (ikke-aktiverende buffer). For at undgå bufferuoverensstemmelse skal du bruge den ikke-aktiverende buffer til at forberede den buffer, der indeholder substratet (aktiveringsbuffer). Substratet kan tilsættes enten direkte som pulver eller i et lille volumen fra en høj koncentrationsbestand for at undgå fortyndinger.
  9. Optø proteoliposomes fra trin 1.24 på RT.
  10. Fortynd proteoliposomes mellem 1:5 og 1:100 (proteoliposomes:buffer, (v:v)) i den ikke-aktiverende SSM-buffer (her 1:20).
  11. Sonikere proteoliposomes til 20-30 s eller 3 gange i 10 s, placere på is i mellem sonikering, hvis det er nødvendigt. Her blev der brugt en vandbads-soniker på 45 kHz.
  12. Påfør 5-10 μL af den fortyndede sonikerede proteoliposomes prøve på overfladen af sensoren uden at røre ved den.
  13. Centrifuge chipsene med opløsningen ved RT i 30 min ved hjælp af en hastighed mellem 2.000 og 3.000 x g.
    BEMÆRK: Brug 50 ML rør med en flad bund. Placer forsigtigt sensorchipsene oprejst ved hjælp af pincet. Der kan også bruges 6-brøndsplader og en centrifuge med pladeholder.
  14. Brug sensorchipsene samme dag.

3. Måling af den opløste transport: bestemmelse af mætningsforhold

BEMÆRK: Som proof-of-princip, disse eksperimenter blev udført ved hjælp af en bakteriel cholin transporter rekonstitueret i liposomer efter protokollen beskrevet ovenfor. Den trinvise proces med at bestemme mættende forhold i substratet cholin forud for måling af hæmning af nanoboder er vist her.

  1. Forbered 1-2 L af den ikke-aktiverende SSM-buffer.
    BEMÆRK: Forbered og brug det samme SSM-bufferlager til alle aktiverende og ikke-aktiverende buffere under alle målinger.
  2. Tag 10 rene rør og overfør 10 mL af den ikke-aktiverende SSM-buffer til hver.
  3. Substratet tilsættes i rørene fra trin 3.2 ved hjælp af en række koncentrationer omkring den forventede halvgrænse koncentration (her 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 mM cholin) for at forberede de aktiverende SSM-buffere. Brug en høj koncentration lager for at undgå fortyndinger.
  4. Tænd SSM-maskinen.
  5. Start SSM-softwaren, og lad maskinen initialisere automatisk. Angiv lagringsstien for data, og bekræft ved at trykke på knappen OK. Vælg standardprotokollen til startrensning i arbejdsprocesindstillingerne, og klik på Kør.
  6. Monter proteoliposome belagt chip på soklen, flytte armen til at låse chippen, og lukke den monterede chip med hætten.
  7. Vælg programmet CapCom i arbejdsprocessen, og lad det køre for at bestemme ledningsevnen og kapacitansen. Bekræft, at ledningsevnen er under 5 nS, og kapacitansen er mellem 15 og 35 nF, før den blev brugt til målingen.
    BEMÆRK: Producenten anbefaler en kapacitansværdi på 15-35 nF og ledning under 5 nS, når der skal være en 3 mm chip.
  8. Overfør de aktiverende opløsninger til hætteglas, og anbring bufferne i sondeprøven.
  9. Overfør den ikke-aktiverende buffer til et reservoir, og placer den ved siden af spånholderen ved beholderpositionen til højre.
  10. Opret en protokol til arbejdsprocessen ved hjælp af en sekvens af ikke-aktiverende (B), aktiverende (A) og ikke-aktiverende (B)-løsninger (B-A-B-sekvens) og en løkke, der udfører tre målinger og flyttes til den næste aktiverende buffer for alle 10 buffere, der er forberedt i trin 3.3. Brug standardflowhastigheden ved 200 μL/s ved hjælp af 1 s - 1 s - 1 s flowtider for B-A-B-sekvensen. Klik på Afspil for at starte målingen.
    BEMÆRK: Et typisk eksperiment består af den sekventielle strøm af ikke-aktiverende (B), aktiverende (A) og ikke-aktiverende (B) opløsninger (skrevet som B-A-B; se figur 1A). De immobiliserede proteoliposomes på sensoren vil blive vasket med løsningerne. Derfor genererer B-A-løsningsudvekslingen en substratkoncentrationsgradient, som driver den elektrogene transportreaktion.
  11. Gem protokollen, og lad arbejdsprocessen køre ved at klikke på knappen Afspil. Udfør den samme type eksperiment, men ved hjælp af proteinfri liposomer. Dette er meget vigtigt, da det ville vise intensiteten af baggrundsstrømme. Dette bør overvejes ved analyse af data for elektrogen transport målt med proteolipoomer (Figur 1C).
  12. Brug enhver foretrukken software til dataanalyse til at afbilde den målte strøm i forhold til tid. Læs topstrømmen manuelt, eller hvis du bruger softwaren, skal du bruge funktionen til tophøjdeestimering i området for tilføjelsen af den aktiverende buffer.
  13. Topstrømmen i forhold til substratkoncentrationen for at bestemme EC50 af substratet via den ikke-lineære regression (Figur 1B, C). Læs den laveste koncentration, hvor topstrømmen når en maksimal værdi, denne koncentration svarer til mættende forhold.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at overveje, at antallet af proteoliposomes, der forbliver immobiliseret, varierer fra chip til chip. Denne variation er tydelig, da topstrømmene ved identiske måleforhold vil vise forskellige amplituder. Derfor er det nødvendigt at normalisere de nuværende amplituder af målinger udført på hver chip separat, før man sammenligner målinger mellem forskellige spånpræparater.

4. Serieklassifikation af hæmmende og ikke-hæmmende nanostoffer

BEMÆRK: Dette afsnit viser, hvordan man måler cholin transport i nærværelse af nanobodies, der binder sig specifikt til bakterielle cholin transporter. Mindre spidsstrøm i nærværelse af nanostoffer indikerer transporthæmning. Ikke-hæmmende nanostoffer vil ikke påvirke substrattransporten, dvs.

  1. Forbered 1-2 L ikke-aktiverende SSM-buffer.
  2. Overfør 50 mL af den ikke-aktiverende SSM-buffer til et rent rør. Tilsættes substrat cholin til en endelig koncentration på 5 mM (mættende betingelser). Brug dette til en positiv kontrolmåling.
  3. Overfør 10 mL af den ikke-aktiverende SSM-buffer til et rent rør. Tilsæt substrat cholin til en endelig koncentration på 5 mM (mættende forhold) og tilsæt nanobody til en endelig koncentration på 500 nM.
  4. Gentag trin 4.3 for hvert nanobody for at forberede de aktiverende løsninger.
    BEMÆRK: Hvis de rensede nanostoffer suspenderes igen i en anden buffer end SSM-bufferen, vil deres tilføjelse til de aktiverende og ikke-aktiverende buffere føre til en bufferuoverensstemmelse. En bufferuoverensstemmelse bør undgås, da det kan føre til høj støj. Udveksling af bufferen af de rensede nanoboder med SSM-bufferen kan hjælpe med at undgå dette problem. Desuden anbefales det at bruge nanobody-koncentrationer, der gør det muligt at nå mættende forhold. I betragtning af at nanostoffers bindende konstanter generelt er under 100 nM, anbefales en nanobody-koncentration på 500 nM til dette eksperiment. Det er dog vigtigt at pre-screene for optimale koncentrationer.
  5. Start SSM-maskinen, og mål kapacitansen og ledningsevnen af den proteoliposomebelagte chip som beskrevet i trin 3.4-3.7.
  6. Den aktiverende opløsning uden nanobody overføres til et hætteglas, og anbring bufferen i sondeprøven. Overfør den ikke-aktiverende buffer uden nanobody i et reservoir, og placer den i sondeprøven.
  7. Overfør de aktiverende opløsninger, der indeholder nanostoffer, til hætteglas, og placer bufferne i sondeprøven. Overfør de ikke-aktiverende buffere, der indeholder nanostoffer, til hætteglas, og anbring bufferne i sondeprøven.
  8. Opret en protokol for arbejdsprocessen ved hjælp af en sekvens af ikke-aktiverende (B), aktiverende (A) og B-løsninger (B-A-B-løsninger), der ikke aktiveres.
  9. Opret en løkke, der udfører følgende: tre målinger af B-A-B-sekvensen ved hjælp af buffere uden nanon), to målinger af B-A-B-sekvensen med buffere, der indeholder et nanorør, 120 s forsinkelsestid for inkubation med nanobody, derefter 3 målinger af B-A-B-sekvensen med buffere, der indeholder nanobody.
  10. Gem arbejdsprocessen, og lad den køre ved at klikke på knappen Afspil.
    BEMÆRK: Denne arbejdsgang måler de oprindelige betingelser for transporten uden hæmning ved at køre B-A-B-protokollen 3 gange ved hjælp af ikke-aktiverende (B) og aktiverende buffere (A) uden nanobody (Figur 1B, C), efterfulgt af måling af nanobody-effekten på transporten ved at køre B-A-B-protokollen 5 gange med de ikke-aktiverende og aktiverende buffere, der indeholder nanostoffer ( Figur2A ). Den anden orden bindende kinetika diktere samspillet mellem nanobodies og deres mål proteiner. Derfor er det vigtigt at bruge en tidsforsinkelse i B-A-trinet for at give nok tid til, at nanoboder binder sig til transportører i proteoliposomes på chippen. Optimale tider afhænger af nanobody-koncentrationen, dvs. ved lavere koncentrationer længere gange er påkrævet. De to første målinger er nødvendige for at tilpasse systemet til de nye forhold, og den anden kørsel skal udføres efter en forsinkelsestid på 120 s. Kun følgende tre målinger bør anvendes til dataanalyse.
  11. Opret en ny protokol for arbejdsprocessen ved hjælp af en sekvens af ikke-aktiverende (B), aktiverende (A) og ikke-aktiverende (B) løsninger (B-A-B-sekvens) og en løkke med 5 målinger for at vaske det genlydt bundne nanobody ud.
    BEMÆRK: Eventuelt skal du inkludere et inkubationstrin for at tillade dissociation af nanostoffer med langsomme kinetikere.
  12. Gem arbejdsprocessen, og lad den køre ved at klikke på knappen Afspil.
  13. Sammenlign den sidste topstrøm af målingerne med den oprindelige substratmåling i trin 4.10. Nanobody er blevet vasket ud, og de oprindelige betingelser er blevet genoprettet, hvis topstrømmen når den oprindelige værdi, ellers gentager trin 4.12-4.13 eller skifter til en ny chip.
  14. Gentag trin 4.6-4.13, og brug individuelle chips til hver nanobody-skærm (Figur 2C), eller gentag med flere nanostoffer ved hjælp af den samme chip (Figur 2D).
  15. Brug enhver foretrukken software til dataanalyse til at afbilde den målte strøm i forhold til tid. Læs topstrømmen manuelt, eller hvis den er tilgængelig, i den anvendte software, skal du automatisk vælge funktionen til estimering af spidshøjde i området for tilføjelsen af aktiveringsbufferen.
  16. Normaliser topstrømmen i nærværelse af nanobody, baseret på den foregående substrat-only måling. Plot peak strømme i et histogramme og sammenligne peak strømme af substratet kun målinger til peak strømme målt i overværelse af nanobodies (Figur 2C,D) for at identificere hæmmende nanostoffer.
    BEMÆRK: Normalisering af de bestemte spidsstrømer for hvert enkelt løb med et nanorør bør udføres i betragtning af topstrømmen i mangel af nanobody fra den foregående måling. Da antallet af proteolipoomer, der forbliver immobiliserede, varierer fra chip-til-chip, er det vigtigt at normalisere de nuværende amplituder af målinger udført på hver chip separat, før man sammenligner målinger mellem forskellige chippræparater.

5. IC50-måling med hæmmende nanostoffer

BEMÆRK: Efter at have identificeret hæmmende nanostoffer er det muligt at bestemme deres halvmaksime hæmmende koncentration (IC50). Dette gøres ved at måle transporten af cholin ved konstant koncentration, mens varierende koncentrationer af det hæmmende nanorør.

  1. Forbered 1-2 L af den ikke-aktiverende SSM-buffer.
  2. Overfør 50 mL af den ikke-aktiverende SSM-buffer til et rent rør. Tilsættes substrat cholin til en endelig koncentration på 5 mM (mættende betingelser). Brug dette som aktiveringsløsning for positiv kontrol.
  3. Tag 8 rene rør og tilsæt 5 mL af den ikke-aktiverende opløsning i hver. Tilsættes substrat cholin til en endelig koncentration på 5 mM (mættende betingelser). Tilsæt det hæmmende nanobody til rørene i koncentrationer i det forventede IC50-område (her 500 nM - 1 nM).
  4. Tag 8 rene rør og tilsæt 10 mL af den ikke-aktiverende opløsning i hver. Tilsæt hæmmende nanobody til hvert rør individuelt i samme koncentration som i trin 5.3. Dette svarer til den ikke-aktiverende buffer.
    BEMÆRK: Dette vil generere en række aktiverende og ikke-aktiverende bufferpar i forskellige koncentrationer af det samme hæmmende nanorør.
  5. Start SSM-opsætningen, og mål kapacitansen og ledningsevnen for den proteoliposomebelagte chip som beskrevet i trin 3.4-3.7.
  6. Overfør den aktiverende opløsning uden nanobody til et hætteglas, og læg den i sondeprøven. Overfør den ikke-aktiverende buffer uden nanobody til et reservoir, og placer den ved reservoirpositionen ved siden af chipholderen til højre.
  7. Overfør de aktiverende opløsninger, der indeholder nanostoffer, til hætteglas, og placer bufferne i sondeprøven. Overfør de ikke-aktiverende buffere, der indeholder nanostoffer, til hætteglas, og anbring bufferne i sondeprøven.
  8. Opret en protokol for arbejdsprocessen ved hjælp af en sekvens af ikke-aktiverende (B), aktiverende (A) og B-løsninger (B-A-B-løsninger), der ikke aktiveres. Medtag en løkke til at måle hver koncentration 2 gange, inkubere i 120 s og måle 3 gange mere. Arbejdsgangen starter med den positive kontrol af substrat-kun efterfulgt af den laveste koncentration af nanobody. Hver nanobody måling vil blive efterfulgt af en efterfølgende måling af den positive kontrol med substrat-only at genoprette den oprindelige peak amplitud, før du flytter til den næste højere nanobody koncentration.
    BEMÆRK: Den anden orden kinetika diktere binding af nanobodies. Derfor er det vigtigt at bruge en tidsforsinkelse i B-A-trinnet. Optimale tider afhænger af nanobodykoncentrationen, dvs. her blev 120 s brugt med tilfredsstillende resultater.
  9. Brug enhver foretrukken software til dataanalyse til at afbilde den målte strøm i forhold til tid. Læs topstrømmen manuelt, eller vælg funktionen til tophøjdeestimatet i området for tilføjelsen af aktiveringsbufferen (Figur 3A). Topstrømerne afbildes i forhold til nanobodykoncentrationen for at bestemme IC50 via ikke-lineær regression (Figur 3B).
    BEMÆRK: Normaliser de aktuelle amplituder af målinger, der udføres for hver enkelt chip, før målingerne sammenlignes mellem forskellige spånpræparater.

6. Rengøring af sensorer

  1. Skyl enkeltsensorchipsene efter brug med 10 mL destilleret vand.
  2. Tør chippen ved at banke den på et silkepapir.
  3. Fyld sensorhulrummet på chippen med 100 μL ren isopropanol og inkuber i 10 min på RT.
  4. Placer en vatpind i ren isopropanol og inkuber i 1-3 min.
  5. Brug de presoaked vatpinde og forsigtigt rotere på sensorens overflade uden tryk for at fjerne rester.
  6. Skyl sensoren med 5 mL ren isopropanol.
  7. Skyl sensoren med 10 mL destilleret vand.
  8. Tør sensoren ved at trykke på chippen på et væv.
  9. Lad sensoren tørre natten over på RT, og opbevar hos RT under tørre forhold.
    BEMÆRK: Sensorer kan genbruges op til 4-5 gange, når de rengøres og opbevares korrekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SSM-baseret elektrofysiologi er blevet flittigt brugt til karakterisering af elektrogene transportører. I protokollen, der præsenteres her, viser vi, hvordan man bruger SSM-baseret elektrofysiologi til at klassificere nanobodies rettet mod en sekundær transportør (her en bakteriel cholin symporter) baseret på deres hæmmende og ikke-hæmmende egenskaber. En af de mest nyttige funktioner i denne teknik er, at det giver mulighed for high-throughput screening af flere buffer betingelser. Denne særlige egenskab er gavnlig for analysen af nanobody biblioteker, som efter udvælgelsen af ringbind kan udgøres fra et par til snesevis af nanobodies. I et standardeksperiment samles en stabil lipidmonmonlayer på en sensorchip. Efter anvendelse af proteoliposomespræparatet, der indeholder cholintransporteren, udføres en kontrol for god ledningsevne og kapacitans, da dette er afgørende for eksperimentets succes. I tilfælde af at membranens integritet kompromitteres under et eksperiment, som let observeres på grund af baggrundsstrømmen med høj støj, anbefales det at skifte til en ny chip, da det er ret vanskeligt at genoprette lave støjforhold. Generelt har vi observeret meget god reproducerbarhed blandt målinger af transport og hæmning af nanoboder, når du bruger forskellige chips.

For at afgøre, hvilken substratkoncentration der skal anvendes under en screening af nanostoffer, blev elektrogen transport først målt under forskellige substratkoncentrationer for at bestemme EF50 (figur 1B, C). Der blev valgt en substratkoncentration, der svarer til mættende forhold (Figur 1C). Denne substratkoncentration blev derefter holdt konstant i alle aktiverende buffere. For dette særlige eksempel valgte vi 5 mM cholin.

Til screening af nanostoffer skal nanobody tilsættes både ikke-aktiverende og aktiverende buffere. Når nanoboder kun blev tilføjet til den aktiverende buffer, var det ikke muligt at observere hæmning af den elektrogene transport. Vi spekulerer i, at dette skyldes en ufuldstændig besættelse af alle nanobody bindingssteder i transportpopulationen på chippen, hvilket afslører vigtigheden af præinkubation med nanobodies under ikke-aktiverende forhold. For at sikre, at alle lokaliteter sandsynligvis vil blive besat, blev der ved anvendelsen af det første ikke-aktiverende buffertrin medtaget et tidsforsinkelsestrin for at tillade mætning af nanobody-bindingssteder på transportpopulationen. Inkubationstiderne fra 2-60 min er blevet testet med reproducerbare resultater. Husk, at optimale inkubationstid afhænger af nanobodybindets art og dets koncentration under eksperimentet (samt koncentrationen af transporter i proteoliposomes på chippen). Derfor anbefales det at prøve forskellige inkubationstider. Under alle omstændigheder, som en tommelfingerregel, jo lavere nanobody koncentration, jo længere inkubationstid kræves. Vi testede inkubationstiderne på 2 min, 20 min, 30 min og 60 min for forskellige nanoboder, men opdagede ikke yderligere transporthæmning.

Virkningen af hæmmende nanostoffer på elektrogen transport visualiseres fra faldet i spidsstrøms amplituder (Figur 2A, C,D). Ikke-hæmmende nanoboder påvirker derimod ikke spidsstrøm. Efter at have kørt vaskeprotokollen for at tillade nanostoffer, der ikke er bindende, blev der observeret en genopretning på 80 til 95 % af den oprindelige amplitud i spidsbelastningsakten (figur 2A,C,D). Vi har udført et lignende eksperiment, men i nærværelse af liposomer uden transportproteinet. Ved skift fra ikke-aktiverende til aktiverende forhold blev der ikke introduceret nogen signifikante artefaktstrømme af nanoboder, der findes i disse buffere (Figur 2B). Det anbefales at køre dette kontroleksperiment, da det er vigtigt at vide, om ændringer i spidsstrømsstrømme skyldes artefakter eller ej.

Efter udvælgelsen af nanostoffer med hæmmende egenskaber fastsatte vi IC50-værdier for individuelle nanostoffer (Figur 3A,B). For dette særlige eksperiment anbefales det at starte med en lav koncentration af nanostoffer og derefter bevæge sig i retning af høj koncentration under analysen. Beregningen af hæmningen for hver koncentration blev derefter udført ved at sammenligne spidsstrømer målt før og efter påføring af nanobody. For at undgå uspecifik binding af nanostoffer til overflader, hvilket kan være særligt problematisk ved brug af lave nanostofkoncentrationer, anbefales det at følge en lignende protokol som den, der er beskrevet af Kermani et al.37, hvor 50 μg/mL kvæg serum albumin blev tilføjet til bufferne, hvilket forhindrede denne skadelige virkning. Tilsætning af vaskemidler som Tween eller Triton til dette formål bør undgås, da disse ville opløse lipidmembraner.

Figure 1
Figur 1: SSM-baseret elektrofysiologi. (A) Protokol til måling af forbigående strømme. En ikke-aktiverende løsning erstattes af en aktiverende løsning efterfulgt af strømmen af ikke-aktiverende løsning for at genoprette de oprindelige forhold. I løbet af det første trin binder nanobodies sig til transportøren. Når du skifter til aktiveringsopløsningen, driver substratgradienten den elektrogene transport (orange kurve). I nærværelse af et hæmmende nanorør viser topstrømmen en mindre amplitud (blå kurve). Efter at have afsluttet protokollen og kører løsninger uden nanobody (vask), unbinding af nanobodies opstår. I de skematiske er proteolipoomer med rekonstitueret protein (blå) immobiliseret på SSM-sensoren. Trekanter og røde cirkler repræsenterer henholdsvis nanostoffer og substrat. (B) Elektrogen cholin transport i mangel af nanobodies. Spidsstrøm målt under aktiveringsforhold er vist for forskellige substratkoncentrationer. (C) Repræsentativ måling af strømme under aktiverende forhold i mangel af transportprotein ved forskellige substratkoncentrationer. (D) Plot af substrat koncentration versus peak strømme amplitud. EF50 blev bestemt 95 ± 11 μM cholin. Fejllinjer angiver standardafvigelse (n=3 biologiske replikeringer, n=3 tekniske replikeringer). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Screening og klassificering af hæmmende og ikke-hæmmende nanostoffer. (A) Elektrogen cholintransport i nærværelse af et nanonino. Spidsstrømer målt under aktiveringsforhold vises i mangel af nanobody (blå), i nærværelse af et hæmmende nanorør (rødt) og efter nanobody unbinding (grøn). (B) Måling af strømme under aktivering af tilstande i mangel af transportprotein. Spor viser optagelser i mangel af nanobody (blå), i nærværelse af et hæmmende nanorør (grønt) og i nærværelse af et ikke-hæmmende nanobody (rødt). (C, D). Histogrammer, der viser topstrømme målt under aktiverende forhold i nærværelse af nanoboder og efter nanobody unbinding (recovery). Panel C viser resultaterne af målinger ved hjælp af individuelle chips pr. nanonbody. Panel D viser resultaterne fra en seriel måling ved hjælp af én chip. Nanobodies er angivet som Nb. Fejllinjer angiver standardafvigelsen (n = 3 biologiske repliker, n = 2 tekniske repliker). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse af IC50 af et hæmmende nanonanon. (A) Elektrogen cholin transport og hæmning af et nanobody. Spidsstrømer målt under aktiveringsforhold vises for forskellige nanobody koncentrationer. (B) Plot af peak strømme amplitud vs nanobody koncentration fra en seriel måling med en hæmmende nanobody. IC50 blev fastsat var 18 ± 2 nM. Fejllinjer angiver standardafvigelsen (n=3 biologiske replikeringer, n=3 tekniske replikeringer). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den teknik, der præsenteres her klassificerer nanobodies med hæmmende og ikke-hæmmende egenskaber rettet mod elektrogene transportører. Vurdering af substrattransporten er mulig på grund af påvisning af transport af afgifter gennem transportøren indlejret i membranen af proteoliposomes. Nogle af de kritiske trin under opsætningen af et eksperiment er rekonstitution af aktivt protein i liposomer, fremstilling af stabile monolag på SSM-chips og genfinding af de oprindelige forhold efter påføring af vaskeprotokollen for at fjerne bundne nanobodymolekyler. Når membranproteinet er rekonstitueret ved et passende lipid-til-protein-forhold, kan der etableres en generel SSM-protokol ved hjælp af det oprindelige substrat. Det er afgørende at udføre kontrolforsøg ved hjælp af proteinfrie liposomer for at afsløre støjstrømme, der skal trækkes fra de strømme, der måles ved hjælp af proteolipoomer. Men hvis støjstrømme er for store, anbefaler vi at prøve protein rekonstitution ved hjælp af forskellige lipider, eller skærm for buffer betingelser, der minimerer disse skadelige signaler. Efter at have etableret betingelser for en SSM-analyse kan screening af nanostoffer udføres. En meget nyttig mulighed, der kan hjælpe med hurtigere screening af nanobodies er at udføre high-throughput assays ved hjælp af en enkelt SSM sensor chip. Dette reducerer tidspunktet for manipulation af chips og buffere og reducerer omkostningerne. Men fordi der i løbet af denne type analyse anvendes flere nanostoffer anvendes sekventielt, er det vigtigt at sikre, at den anvendte nanobody kan vaskes væk efter målingen. Det kan være nødvendigt at implementere en streng vaskecyklus for at adskille nogle nanostoffer, hvis der opdages reducerede spidsstrøms amplituder i mangel af nanostoffer. Vi anbefaler, at du som udgangspunkt bruger de vaskebetingelser, der er beskrevet her. Hvis det ikke hjælper at øge vaskevolumen eller antallet af cyklusser, skal individuelle chips bruges til at screene hvert nanobody separat. I alle de tilfælde, der undersøges her, var bindingen af nanostoffer reversibel, og der kunne anvendes en protokol med høj overførselshastighed. I vores eksperimentelle opsætning kunne vi ikke genvinde den fulde amplitud af den oprindelige topstrøm efter målinger med nanobodies (Figur 1A; Figur 2C, D. I de fleste tilfælde varierede størrelsen af de genvundne topstrømme imidlertid mellem 80 og 95 % af den amplitud, der blev målt, før nanostoffer blev anvendt (fig. 2C,D). Vi spekulerer på, at dette kunne være en konsekvens af at vaske væk en brøkdel af proteoliposomes klæbede til chippen, eller på grund af langsom kinetik af unbinding af nogle hæmmende nanobodies, eller en kombination af begge. I begge tilfælde var det stadig muligt at fortsætte analysen af yderligere nanostoffer, da elektrogen transport var målbar. Dette er vist i figur 2D, hvor vi screenet seks nanobodies ved hjælp af en enkelt chip forberedelse.

Den høje gennemløbskarakteristik er et af de mest betydningsfulde fremskridt i den præsenterede metode. Desuden giver denne metode i modsætning til andre tilgange mulighed for at vælge hæmmende nanostoffer rettet mod elektrogene transportører, for hvilke der ikke er mærkede substrater til rådighed. En hurtig identifikation af hæmmende nanostoffer kan bidrage til at fremskynde forskningen med det formål at identificere nye anvendelser af nanostoffer som lægemidler. Deres tilsyneladende fordele i forhold til lignende behandlinger såsom antistof behandlinger er talrige, begyndende med en mindre størrelse, som hjælper dem med at formere sig yderligere i væv eller celler, til deres lave produktionsomkostninger og høj stabilitet.

SSM-baseret elektrofysiologi er tidligere blevet anvendt til karakterisering af elektrogene transportører i membran vesikler29,38. Disse typer af eksperimenter er fordelagtige, da de ikke afhænger af proteinrensning og rekonstitution protokoller. Vi spekulerer på, at det er muligt at udføre udvælgelsen af hæmmende nanostoffer ved hjælp af membran vesikler. Dette ville bidrage til at reducere omkostningerne og undgå manipulationer af rensede proteiner.

SSM-baseret elektrofysiologi er en stærk teknik til at screene for nanobody-hæmmere af flere membranproteiner, der udviser elektrogen transport. Vi forestiller os, at SSM-baseret elektrofysiologi bliver et vigtigt redskab til udvælgelse af hæmmende nanostoffer og andre antistoffer med potentielle kliniske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Cedric A. J. Hutter og Markus A. Seeger fra Institut for Medicinsk Mikrobiologi ved universitetet i Zürich og Gonzalo Cebrero fra Biozentrum fra Universitetet i Basel for samarbejde i dannelsen af syntetiske nanostoffer (sybodies). Vi takker Maria Barthmes og Andre Bazzone fra NANION Technologies for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Swiss National Science Foundation (SNSF) (PP00P3_170607 og NANION Research Grant Initiative til C.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octadecanethiol solution Sigma Aldrich O1858-25ML
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) BioRad #152-3920
PD 10 Desalting Columns GE Healthcare GE17-0851-01
Filter 200 nm membrane Whatman Nucleopore WHA800282
2-Propanol Merck 33539-1L-R
n-Decane Sigma Aldrich 8034051000
n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) Avanti Polar Lipids 850520P-25g
Sodium Chloride AppliChem 131659.1211
(SSM setup) SURFE2R N1 Nanion -----
SURFE2R N1 Single Sensor Chips Nanion # 161001
Trizma Base Sigma Aldrich T1503
E. coli Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids 100600C
Egg PC L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
  2. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  3. Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
  4. Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
  5. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
  6. Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
  7. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  8. Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
  9. Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
  10. Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
  11. Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
  12. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
  13. Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
  14. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
  15. McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
  16. Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
  17. Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
  18. Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
  19. Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
  20. Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
  21. vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
  22. Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
  23. Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
  24. Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
  25. Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
  26. Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
  27. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  28. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  29. Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
  30. Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
  31. Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
  32. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
  33. Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
  34. Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
  35. Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
  36. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
  37. Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
  38. Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).

Tags

Biokemi Udgave 171 membrantransportør membranproteiner solid-understøttet-membraner elektrofysiologi nanobodies hæmmende nanoboder nanobodies udvælgelse
Udvælgelse af transporter-målrettede hæmmende nanostoffer af Solid-Supported-Membrane (SSM)-baseret elektrofysiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bärland, N., Perez, C.… More

Bärland, N., Perez, C. Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (171), e62578, doi:10.3791/62578 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter