Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Val av transportörriktad hämmande nanokroppar av SSM-baserad elektrofysiologi (Solid-Supported-Membrane)

Published: May 3, 2021 doi: 10.3791/62578
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Nanokroppar är viktiga verktyg inom strukturbiologi och utgör en stor potential för utveckling av terapier. Valet av nanokroppar med hämmande egenskaper kan dock vara utmanande. Här demonstrerar vi användningen av SSM-baserad elektrofysiologi (Solid-supported-membranet) för klassificering av hämmande och icke-hämmande nanokroppar riktade mot elektrogena membrantransportörer.

Abstract

Endomänsantikroppar (nanokroppar) har använts i stor utsträckning i mekanistiska och strukturella studier av proteiner och de utgör en enorm potential som verktyg för att utveckla kliniska terapier, varav många är beroende av hämning av membranproteiner som transportörer. De flesta metoder som används för att bestämma hämningen av transportaktiviteten är dock svåra att utföra i höggenomströmningsrutiner och är beroende av märkta substrattillgänglighet och komplicerar därmed screeningen av stora nanokroppsbibliotek. SSM-elektrofysiologi (Solid-supported membrane) är en metod med hög genomströmning som används för att karakterisera elektrogena transportörer och mäta deras transportkinetik och hämning. Här visar vi implementeringen av SSM-baserad elektrofysiologi för att välja hämmande och icke-hämmande nanokroppar riktade mot en elektrogen sekundär transportör och för att beräkna nanokroppar hämmande konstanter. Denna teknik kan vara särskilt användbar för att välja hämmande nanokroppar riktade mot transportörer för vilka märkta substrat inte är tillgängliga.

Introduction

Antikroppar består av två identiska tunga kedjor och två lätta kedjor som är ansvariga för antigenbindningen. Camelider har endast tunga antikroppar som uppvisar liknande affinitet för deras kognateantigen jämfört med konventionella antikroppar1,2. Det enda variabeldomänen (VHH) för antikroppar med endast tung kedja behåller den fulla antigenbindande potentialen och har visat sig vara mycket stabil1,2. Dessa isolerade VHH-molekyler eller "nanokroppar" har implementerats i studier relaterade till membranproteiner biokemi som verktyg för att stabilisera konformationerna3,4, som inhibitorer5,6, som stabiliseringsmedel7, och som prylar för strukturbestämning8,9,10 . Nanokroppar kan genereras genom immunisering av camelider för förberikning av B-celler som kodar målspecifika nanokroppar och efterföljande isolering av B-celler, följt av kloning av nanokroppsbiblioteket och val av fagdisplay11,12,13. Ett alternativt sätt att generera nanokroppar är baserat på in vitro-urvalsmetoder som förlitar sig på byggandet av bibliotek och val genom fagdisplay, ribosomdisplay eller jästdisplay14,15,16,17,18,19,20. Dessa in vitro-metoder kräver stora biblioteksstorlekar men drar nytta av att undvika djurimmunisering och gynnar valet av nanokroppar som riktar sig mot proteiner med relativt låg stabilitet.

Den lilla storleken på nanokroppar, deras höga stabilitet och löslighet, stark antigen affinitet, låg immunogenicitet och relativt enkel produktion, gör dem starka kandidater för utveckling av terapier21,22,23. I synnerhet är nanokroppar som hämmar aktiviteten hos flera membranproteiner potentiella tillgångar för kliniska tillämpningar5,24,25,26. När det gäller membrantransportörer, för att utvärdera om en nanokropp har hämmande aktivitet, är det nödvändigt att utveckla en analys som gör det möjligt att upptäcka transporterade substrat och/eller samsubstrat. Sådana analyser involverar vanligtvis märkta molekyler eller utformningen av substratspecifika detektionsmetoder, som kan sakna en universell tillämpning. Dessutom kräver identifiering av hämmande nanokroppar i allmänhet screening av ett stort antal bindemedel. Således är en metod som kan användas i ett höggenomströmningsläge och som inte förlitar sig på märkta substrat avgörande för detta val.

SSM-baserad elektrofysiologi är en extremt känslig, mycket tidsupplöst teknik som gör det möjligt att upptäcka förflyttning av laddningar över membran (t.ex. jonbindning/transport)27,28. Denna teknik har tillämpats för att karakterisera elektrogena transportörer, som är svåra att studera med andra elektrofysiologiska tekniker på grund av den relativa låga omsättningen av dessa proteiner29,30,31,32,33,34,35. SSM elektrofysiologi kräver inte användning av märkta substrat, det är lämpligt för screening med hög genomströmning, och antingen proteoliposomer eller membranblåsor som innehåller den transportör av intresse kan användas. Här visar vi att SSM-baserad elektrofysiologi kan användas för att klassificera transportörmålade nanokroppar med hämmande och icke-hämmande egenskaper. Som ett bevis på principer beskriver vi rekonstitution av en bakteriell kolin transportör i liposomer, följt av detaljerade steg för immobilisering av proteoliposomer på SSM sensorer. Vi beskriver därefter hur man utför SSM-baserade elektrofysiologiska mätningar av kolintransport och hur man bestämmer den halv maximala effektiva koncentrationen (EC50). Vi visar sedan hur man använder SSM-baserad elektrofysiologi för att screena flera nanokroppar och för att identifiera hämmare av kolintransport. Slutligen beskriver vi hur man bestämmer hälften maximala hämmande koncentrationer (IC50) av utvalda hämmande nanokroppar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rekonstitution av membranprotein

  1. Blanda 3 ml E. coli polära lipider med 1 ml fosfatidylkolin i en rund bottenkolv under en ventilerad huva.
  2. Torka lipidblandningen i 20 minuter under vakuum med en roterande förångare och ett vattenbad vid 37 °C för att avlägsna kloroform. Torka vid behov ytterligare under kväve- eller argongas.
  3. Använda TS-buffert (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) innehållande 2 mM β-mercaptoethanol, återsuspend lipider till 25 mg/mL.
  4. Aliquot lipider i 500 μL alikvoter, blixtfrysning i flytande kväve och lagra vid -80 °C.
  5. Tina upp en 500 μL alikvot lipider och späd 1:1 med TS-buffert som innehåller 2 mM β-mercaptoethanol.
  6. Extrudera lipidsuspensionen 15 gånger med ett 400 nm membran.
  7. Späd lipidsuspensionen för att ha en slutlig lipidkoncentration på 4,4 mg/ml.
  8. Tillsätt n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM) för att ha en slutlig koncentration på 0,2% och låt den rotera i 1 h vid 200 varv/min vid rumstemperatur (RT).
  9. Tillsätt det renade proteinet till lipiderna med ett lipid-till-protein-förhållande mellan 1:10 och 1:100 (w:w).
    OBS: Förhållandet måste justeras beroende på styrkan hos den signal som detekteras vid SSM-elektrofysiologimätningar av substrattransport (se nedan). För att få större signaler, använd mindre lipid-till-protein-förhållanden.
  10. Inkubera blandningen som roterar vid 200 varv/min i 1 h vid RT.
  11. Tillsätt 30 mg/ml polystyren adsorbentpärlor, förtvättade i TS-buffert.
    OBS: Tillsätt polystyrenpärlor stegvis.
  12. Inkubera blandningen av pärlor och lipider i 30 minuter vid RT under långsam omrörning.
  13. För att ta bort pärlorna, låt pärlor-lipidblandningen stå så att pärlorna sätter sig ner. Överför lösningen till ett nytt rör och lämna pärlorna bakom. Tillsätt 30 mg/ml färska polystyren adsorbentpärlor till den separerade lipidblandningen.
  14. Inkubera blandningen i 1 h vid 4 °C under långsam omrörning.
  15. Separera pärlorna från blandningen enligt beskrivningen i steg 1.13 och tillsätt 30 mg/ml färska polystyren adsorbentpärlor.
  16. Inkubera blandningen i 16 timmar vid 4 °C.
  17. Separera pärlorna från blandningen enligt beskrivningen i steg 13 och tillsätt 30 mg/ml färska polystyren adsorbentpärlor.
  18. Inkubera blandningen i 2 timmar vid 4 °C för en fjärde och sista tvätt.
  19. Centrifug vid 110 000 x g i 30 min vid 4 °C.
  20. Tvätta pelleten med 500 μL TS-buffert som innehåller 2 mM β-mercaptoethanol.
  21. Centrifugera igen vid 110 000 x g i 30 min vid 4 °C.
  22. Återsuspend pelleten till en slutlig lipidkoncentration på 25 mg/ml i TS-buffert med 2 mM β-mercaptoethanol.
  23. Uppskatta proteinkoncentrationen med hjälp av en in-gel eller amido svart analys36.
  24. Aliquot proteoliposomerna, blixtfrys i flytande kväve och lagra vid -80 °C.

2. Spånberedning

  1. Fyll ett enda sensorchip med 50-100 μL 0,5 mM 1-oktadecanethiollösning (återsuspenderad i isopropanol).
  2. Inkubera chipet med lösningen i 30 min på RT.
  3. Ta bort tiaollösningen genom att knacka på chipet på en vävnad.
  4. Skölj sensorn 3 gånger med 5 ml ren isopropanol.
  5. Skölj sensorn 3 gånger med 5 ml dubbeldestillerat vatten.
  6. Torka sensorn genom att trycka på ett vävnadspapper.
  7. Applicera 1,5 μL 7,5 μg/μL 1,2-difytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (lipider torkade i en roterande förångare och återsuspenderade i n-dekantan).
  8. Fyll omedelbart efter sensorn med 50 μL icke-aktiverande SSM-buffert, som inte innehåller substratet. Detta kommer att leda till en spontan bildning av SSM-skiktet.
    OBS: SSM-bufferten bör optimeras i förväg för att bestämma optimala förhållanden med lågt bakgrundsljud. En allmän buffert som innehåller 30 mM HEPES pH 7,4, 5 mM MgCl2, 140 mM NaCl, kan användas som utgångspunkt. SSM-bufferten utan substrat används för tvätt före och efter mätningen (icke-aktiverande buffert). För att undvika buffertfel använder du den icke-aktiverande bufferten för att förbereda bufferten som innehåller substratet (aktiveringsbuffert). Substratet kan tillsättas antingen direkt som pulver eller i en liten volym från ett högt koncentrationslager för att undvika utspädningar.
  9. Tina proteoliposomer från steg 1.24 på RT.
  10. Späd proteoliposomer mellan 1:5 och 1:100 (proteoliposomer:buffer, (v:v)) i den icke-aktiverande SSM-bufferten (här 1:20).
  11. Sonicate proteoliposomer för 20-30 s eller 3 gånger för 10 s, placera på is mellan ultraljudsbehandling, om nödvändigt. Här användes en vattenbad sonicator på 45 kHz.
  12. Applicera 5-10 μL av det utspädda sonicated proteoliposomprovet på sensorns yta utan att röra vid det.
  13. Centrifugera spånorna med lösningen vid RT i 30 minuter med en hastighet mellan 2 000 och 3 000 x g.
    OBS: Använd 50 ml rör med platt botten. Placera försiktigt sensorchipsen upprätt med pincett. 6-brunnsplattor och en centrifug med plåthållare kan också användas.
  14. Använd sensorchipsen samma dag.

3. Mätning av lösningstransporten: bestämning av mättnadsförhållanden

OBS: Som bevis på principen utfördes dessa experiment med hjälp av en bakteriell kolin transportör rekonstituerade i liposomer enligt protokollet beskrivs ovan. Steg-för-steg-processen för att bestämma mättande förhållanden för substratet kolin före mätning av hämning av nanokroppar visas här.

  1. Förbered 1-2 L av den icke-aktiverande SSM-bufferten.
    OBS: Förbered och använd samma SSM-buffertlager för alla aktiverande och icke-aktiverande buffertar i alla mätningar.
  2. Ta 10 rena rör och överför 10 ml av den icke-aktiverande SSM-bufferten till var och en.
  3. Tillsätt substratet i rören från steg 3.2 med en serie koncentrationer runt den förväntade halv maximala koncentrationen (här 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 mM kolin) för att förbereda de aktiverande SSM-buffertarna. Använd ett högt koncentrationslager för att undvika utspädningar.
  4. Slå på SSM-maskinen.
  5. Starta SSM-programvaran och låt maskinen initieras automatiskt. Ställ in sparsökvägen för data och bekräfta genom att trycka på OK-knappen. Välj standardprotokollet för inledande rengöring i arbetsflödesalternativen och klicka på Kör.
  6. Montera det proteoliposombelagda chipet på uttaget, flytta armen för att låsa chipet och stäng det monterade chipet med locket.
  7. Välj programmet CapCom i arbetsflödet och låt det köras för att bestämma konduktivitet och kapacitans. Bekräfta att konduktiviteten är under 5 nS och kapacitansen är mellan 15 och 35 nF innan du använder den för mätningen.
    OBS: Ett kapacitansvärde på 15-35 nF och ledning under 5 nS rekommenderas av tillverkaren vid användning av ett 3 mm chip.
  8. Överför de aktiverande lösningarna till injektionsflaskan och placera buffertarna i sondprovtagaren.
  9. Överför den icke-aktiverande bufferten till en behållare och placera den bredvid spånhållaren vid behållarens läge till höger.
  10. Skapa ett protokoll för arbetsflödet med hjälp av en sekvens av icke-aktiverande (B), aktiverande (A) och icke-aktiverande (B) lösningar (B-A-B-sekvens) och en slinga som utför tre mätningar och flyttar till nästa aktiveringsbuffert för alla 10 buffertar som är förberedda i steg 3.3. Använd standardflödeshastigheten vid 200 μL/s med 1 s - 1 s - 1 s flödestider för B-A-B-sekvensen. Klicka på Spela upp för att starta mätningen.
    OBS: Ett typiskt experiment består av sekventiellt flöde av icke-aktiverande (B), aktiverande (A) och icke-aktiverande (B) lösningar (skrivna som B-A-B; se figur 1A). De immobiliserade proteoliposomerna på sensorn kommer att tvättas med lösningarna. Därför genererar B-A-lösningsutbytet en substratkoncentrationsgradient, vilket driver den elektrogena transportreaktionen.
  11. Spara protokollet och låt arbetsflödet köras genom att klicka på knappen Spela upp. Utför samma typ av experiment men använd proteinfria liposomer. Detta är mycket viktigt eftersom det skulle visa intensiteten i bakgrundsströmmarna. Detta bör beaktas vid analys av data om elektrogen transport mätt med proteoliposomer (figur 1C).
  12. Använd valfri programvara för dataanalys för att rita den uppmätta strömmen kontra tiden. Läs av toppströmmen manuellt, eller om du använder programvaran, använd funktionen för topphöjdsuppskattning i intervallet för tillägget av aktiveringsbufferten.
  13. Plotta toppströmmen mot substratkoncentrationen för att bestämma substratets EC50 via den icke-linjära regressionen(figur 1B,C). Läs av den lägsta koncentrationen vid vilken toppströmmen når ett maximalt värde, denna koncentration motsvarar mättande förhållanden.
    OBS: Det är viktigt att tänka på att antalet proteoliposomer som förblir immobiliserade varierar från chip-till-chip. Denna variation är uppenbar eftersom toppströmmarna vid identiska mätförhållanden visar olika amplituder. Därför är det nödvändigt att normalisera de nuvarande amplituderna av mätningar som utförs på varje chip separat innan mätningar jämförs mellan olika spånpreparat.

4. Seriell klassificering av hämmande och icke-hämmande nanokroppar

OBS: Detta avsnitt visar hur man mäter kolintransport i närvaro av nanokroppar som binder specifikt till bakteriell kolintransportör. Mindre toppströmmar i närvaro av nanokroppar indikerar transporthämning. Icke-hämmande nanokroppar kommer inte att påverka substrattransporten, dvs. ingen minskning av toppströmsignalen.

  1. Förbered 1-2 L icke-aktiverande SSM-buffert.
  2. Överför 50 ml av den icke-aktiverande SSM-bufferten till ett rent rör. Tillsätt substratet kolin till en slutlig koncentration av 5 mM (mättande förhållanden). Använd detta för en positiv kontrollmätning.
  3. Överför 10 ml av den icke-aktiverande SSM-bufferten till ett rent rör. Tillsätt substratet kolin till en slutlig koncentration av 5 mM (mättande förhållanden) och tillsätt nanokropp till en slutlig koncentration på 500 nM.
  4. Upprepa steg 4.3 för varje nanokropp för att förbereda aktiveringslösningarna.
    OBS: Om de renade nanokropparna återanvänds i en annan buffert än SSM-bufferten, kommer deras tillägg till de aktiverande och icke-aktiverande buffertarna att leda till en buffertfel. En buffertfelmatchning bör undvikas eftersom den kan leda till högt brus. Utbyte av bufferten av de renade nanokropparna med SSM-bufferten kan bidra till att undvika detta problem. Dessutom rekommenderas användning av nanokroppskoncentrationer som gör det möjligt att nå mättande förhållanden. Med tanke på att nanokropparnas bindningskonstanter i allmänhet är under 100 nM rekommenderas en nanokroppskoncentration på 500 nM för detta experiment. Det är dock viktigt att förhandsgranska för optimala koncentrationer.
  5. Starta SSM-maskinen och mät kapacitansen och konduktiviteten hos det proteoliposombelagda chipet enligt beskrivningen i steg 3.4-3.7.
  6. Överför aktiveringslösningen utan nanokropp till en flaska och placera bufferten i sondens provtagare. Överför den icke-aktiverande bufferten utan en nanokropp till en behållare och placera den i sondens provtagare.
  7. Överför de aktiverande lösningarna som innehåller nanokroppar till injektionsflaskan och placera buffertarna i sondprovtagaren. Överför de icke-aktiverande buffertarna som innehåller nanokroppar till injektionsflaska och placera buffertarna i sondprovtagaren.
  8. Skapa ett protokoll för arbetsflödet med hjälp av en sekvens av icke-aktiverande (B), aktiverande (A) och icke-aktiverande (B) lösningar (B-A-B-sekvens).
  9. Skapa en slinga som utför följande: tre mätningar av B-A-B-sekvensen med hjälp av buffertar utan nanokropp, två mätningar av B-A-B-sekvensen med buffertar som innehåller en nanokropp, 120 s fördröjningstid för inkubation med nanokroppen, sedan 3 mätningar av B-A-B-sekvensen med buffertar som innehåller nanokroppen.
  10. Spara arbetsflödet och låt det köras genom att klicka på knappen Spela upp.
    OBS: Detta arbetsflöde kommer att mäta de ursprungliga förhållandena för transporten utan hämning genom att köra B-A-B-protokollet 3 gånger med icke-aktiverande (B) och aktivera buffertar (A) utan nanokroppen (figur 1B, C), följt av mätning av nanokroppseffekten på transporten genom att köra B-A-B-protokollet 5 gånger med de icke-aktiverande och aktiverande buffertarna som innehåller nanokroppar ( figur2A ). Den andra ordningen bindande kinetik dikterar interaktionen mellan nanokroppar och deras målproteiner. Därför är det viktigt att använda en tidsfördröjning i B-A-steget för att ge tillräckligt med tid för nanokroppar att binda till transportörer i proteoliposomer på chipet. Optimala tider beror på nanokroppskoncentrationen, dvs. vid lägre koncentrationer krävs längre tider. De två första mätningarna krävs för att anpassa systemet till de nya förhållandena och den andra körningen bör utföras efter en fördröjningstid på 120 s. Endast följande tre mätningar bör användas för dataanalys.
  11. Skapa ett nytt protokoll för arbetsflödet med hjälp av en sekvens av icke-aktiverande (B), aktiverande (A) och icke-aktiverande (B) lösningar (B-A-B-sekvens) och en slinga med 5 mätningar för att tvätta bort den reversibelt bundna nanokroppen.
    OBS: Inkludera eventuellt ett inkubationssteg för att möjliggöra dissociation av nanokroppar med långsam kinetik.
  12. Spara arbetsflödet och låt det köras genom att klicka på knappen Spela upp.
  13. Jämför mätningarnas senaste toppström med den första mätningen av enbart substrat i steg 4.10. Nanokroppen har framgångsrikt tvättats ut och de första förhållandena har återupprättats om toppströmmen når det ursprungliga värdet, annars upprepa steg 4.12-4.13 eller byta till ett nytt chip.
  14. Upprepa steg 4.6-4.13 och använd enskilda chips för varje nanokroppsskärm(bild 2C) eller upprepa med flera nanokroppar med samma chip (figur 2D).
  15. Använd valfri programvara för dataanalys för att rita den uppmätta strömmen kontra tiden. Läs av toppströmmen manuellt, eller om den är tillgänglig, i den använda programvaran, välj automatiskt funktionen för uppskattning av topphöjd i intervallet för tillägget av aktiveringsbufferten.
  16. Normalisera toppströmmen i närvaro av nanokroppen, baserat på föregående mätning endast för substrat. Rita toppströmmarna i ett histogram och jämför substratets toppströmmar endast mätningar med toppströmmarna mätta i närvaro av nanokroppar (figur 2C,D) för att identifiera hämmande nanokroppar.
    OBS: Normalisering av de bestämda toppströmmarna för varje enskild körning med en nanokropp bör utföras med tanke på toppströmmen i avsaknad av nanokroppen från föregående mätning. Eftersom antalet proteoliposomer som förblir immobiliserade varierar från chip-till-chip, är det viktigt att normalisera de nuvarande amplituderna av mätningar som utförs på varje chip separat innan mätningar jämförs mellan olika spånpreparat.

5. IC50-mätning med hämmande nanokroppar

OBS: Efter att ha identifierat hämmande nanokroppar är det möjligt att bestämma deras halv maximala hämmande koncentration (IC50). Detta görs genom att mäta transporten av kolin vid konstant koncentration, samtidigt som varierande koncentrationer av den hämmande nanokroppen.

  1. Förbered 1-2 L av den icke-aktiverande SSM-bufferten.
  2. Överför 50 ml av den icke-aktiverande SSM-bufferten till ett rent rör. Tillsätt substratet kolin till en slutlig koncentration av 5 mM (mättande förhållanden). Använd detta som aktiveringslösning för positiv kontroll.
  3. Ta 8 rena rör och tillsätt 5 ml av den icke-aktiverande lösningen i var och en. Tillsätt substratet kolin till en slutlig koncentration av 5 mM (mättande förhållanden). Tillsätt den hämmande nanokroppen till rören i koncentrationer i det förväntade IC50-intervallet (här 500 nM - 1 nM).
  4. Ta 8 rena rör och tillsätt 10 ml av den icke-aktiverande lösningen i var och en. Tillsätt hämmande nanokropp till varje rör individuellt i samma koncentration som i steg 5.3. Detta motsvarar den icke-aktiverande bufferten.
    OBS: Detta kommer att generera en serie aktiverande och icke-aktiverande buffertpar vid olika koncentrationer av samma hämmande nanokropp.
  5. Starta SSM-installationen och mät kapacitansen och konduktiviteten hos det proteoliposombelagda chipet enligt beskrivningen i steg 3.4-3.7.
  6. Överför aktiveringslösningen utan nanokropp till en flaska och placera den i sondens provtagare. Överför den icke-aktiverande bufferten utan nanokropp till en behållare och placera den i reservoarens läge bredvid spånhållaren till höger.
  7. Överför de aktiverande lösningarna som innehåller nanokroppar till injektionsflaskan och placera buffertarna i sondprovtagaren. Överför de icke-aktiverande buffertarna som innehåller nanokroppar till injektionsflaska och placera buffertarna i sondprovtagaren.
  8. Skapa ett protokoll för arbetsflödet med hjälp av en sekvens av icke-aktiverande (B), aktiverande (A) och icke-aktiverande (B) lösningar (B-A-B-sekvens). Inkludera en slinga för att mäta varje koncentration 2 gånger, inkubera i 120 s och mät 3 gånger till. Arbetsflödet börjar med den positiva kontrollen av substrat endast följt av nanokroppens lägsta koncentration. Varje nanokroppsmätning kommer att följas av en efterföljande mätning av den positiva kontrollen med endast substrat för att återställa den ursprungliga toppamplituden innan den flyttas till nästa högre nanokroppskoncentration.
    OBS: Den andra ordningens kinetik dikterar bindning av nanokroppar. Därför är det viktigt att använda en tidsfördröjning i B-A-steget. Optimala tider beror på nanokroppskoncentrationen, dvs. vid lägre koncentrationer krävs längre tider; här användes 120 s med tillfredsställande resultat.
  9. Använd valfri programvara för dataanalys för att rita den uppmätta strömmen kontra tiden. Läs av toppströmmen manuellt, eller om du använder programvara, välj funktionen för topphöjdsuppskattningen i intervallet för tillägget av aktiveringsbufferten (figur 3A). Plotta toppströmmarna mot nanokroppskoncentrationen för att bestämma IC50 via icke-linjär regression(figur 3B).
    OBS: Normalisera de aktuella amplituderna för mätningar som utförs för varje enskilt chip innan mätningar jämförs mellan olika spånpreparat.

6. Rengöring av sensorer

  1. Skölj de enda sensorchipsen efter användning med 10 ml destillerat vatten.
  2. Torka chipet genom att knacka på det på ett vävnadspapper.
  3. Fyll chipets sensorhåla med 100 μL ren isopropanol och inkubera i 10 min vid RT.
  4. Placera en bomullspinne i ren isopropanol och inkubera i 1-3 min.
  5. Använd de presoaserade bomullspinnearna och rotera försiktigt på sensorns yta utan tryck för att avlägsna rester.
  6. Skölj sensorn med 5 ml ren isopropanol.
  7. Skölj sensorn med 10 ml destillerat vatten.
  8. Torka sensorn genom att knacka på spånet på en vävnad.
  9. Låt sensorn torka över natten på RT och förvara på RT under torra förhållanden.
    OBS: Sensorer kan återanvändas upp till 4-5 gånger när de rengörs och lagras korrekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SSM-baserad elektrofysiologi har använts i stor utsträckning för karakterisering av elektrogena transportörer. I protokollet som presenteras här visar vi hur man använder SSM-baserad elektrofysiologi för att klassificera nanokroppar som riktar sig mot en sekundär transportör (här en bakteriell kolin symportör) baserat på deras hämmande och icke-hämmande egenskaper. En av de mest användbara funktionerna i denna teknik är att den möjliggör screening med hög genomströmning av flera buffertvillkor. Denna speciella egenskap är fördelaktig för analysen av nanokroppsbibliotek, som efter valet av bindemedel kan bildas från några till dussintals nanokroppar. I ett standardexperiment monteras ett stabilt lipidmonolayer på ett sensorchip. Efter applicering proteoliposomer preparat som innehåller kolintransportören utförs en kontroll för god ledningsförmåga och kapacitans eftersom detta är viktigt för att experimentet ska lyckas. Om membranets integritet äventyras under ett experiment, som lätt observeras på grund av de höga brusbakgrundsströmmarna, rekommenderas byte till ett nytt chip eftersom det är ganska svårt att återställa låga bullerförhållanden. I allmänhet har vi observerat mycket god reproducerbarhet bland mätningar av transport och hämning av nanokroppar vid användning av olika chips.

För att bestämma över den substratkoncentration som ska användas vid en screening av nanokroppar mättes elektrogen transport först under olika substratkoncentrationer för att bestämma EC50 (figur 1B,C). En substratkoncentration som motsvarar mättande förhållanden valdes (figur 1C). Denna substratkoncentration hölls sedan konstant i alla aktiverande buffertar. För det här exemplet valde vi 5 mM kolin.

För screening av nanokroppar måste nanokroppen tillsättas till både icke-aktiverande och aktiverande buffertar. När nanokroppar endast lades till den aktiverande bufferten var det inte möjligt att observera hämning av den elektrogena transporten. Vi spekulerar att detta beror på en ofullständig ockupation av alla nanokropp bindande platser i transportören befolkningen på chipet, vilket avslöjar vikten av pre-inkubation med nanokroppar i icke-aktiverande förhållanden. För att säkerställa att alla platser sannolikt kommer att vara upptagna inkluderades ett steg för tidsfördröjning vid tillämpningen av det första icke-aktiverande buffertsteget för att möjliggöra mättnad av nanokroppsbindningsplatser för transportören. Inkubationstider från 2-60 min har testats med reproducerbara resultat. Tänk på att optimala inkubationstider beror på nanokroppsbindningskaraktären och dess koncentration under experimentet (liksom koncentrationen av transportör i proteoliposomer på chipet). Därför rekommenderas att prova olika inkubationstider. I vilket fall som helst, som en tumregel, ju lägre nanokroppskoncentration, desto längre inkubationstid krävs. Vi testade inkubationstider på 2 min, 20 min, 30 min och 60 min för olika nanokroppar men upptäckte inte ytterligare transporthämning.

Effekten av hämmande nanokroppar på elektrogen transport visualiseras från minskningen av toppströmmar amplituder (figur 2A, C, D). Icke-hämmande nanokroppar påverkar däremot inte toppströmmarna. Efter att ha kört tvättprotokollet för att tillåta nanokroppar som inte binder, observerades en återhämtning på 80 till 95% av den ursprungliga toppströmmens amplitud(figur 2A,C,D). Vi har utfört ett liknande experiment men i närvaro av liposomer utan transportörproteinet. Vid byte från icke-aktiverande till aktiverande förhållanden infördes inga signifikanta artefaktströmmar av nanokroppar som finns i dessa buffertar (figur 2B). Att köra det här kontroll experimentet rekommenderas eftersom det är viktigt att veta om ändringar i topp strömmar uppstår från artefakter eller inte.

Efter valet av nanokroppar med hämmande egenskaper fastställde vi IC50-värden för enskilda nanokroppar (figur 3A,B). För detta speciella experiment rekommenderas att börja med en låg koncentration av nanokroppar och sedan gå mot hög koncentration under analysen. Beräkningen av hämningen för varje koncentration utfördes sedan genom att jämföra toppströmmar som mättes före och efter appliceringen av nanokropp. För att undvika ospecificerad bindning av nanokroppar till ytor, vilket kan vara särskilt problematiskt vid användning av låga nanokroppskoncentrationer, rekommenderas att följa ett liknande protokoll som det som beskrivs av Kermani et al.37, där 50 μg/ml bovint serumalbumin tillsattes i buffertarna, vilket förhindrar denna skadliga effekt. Tillsats av rengöringsmedel som Tween eller Triton för detta ändamål bör undvikas eftersom dessa skulle lösa upp lipidmembran.

Figure 1
Figur 1: SSM-baserad elektrofysiologi. (A) Protokoll för mätning av övergående strömmar. En icke-aktiverande lösning ersätts av en aktiverande lösning följt av flödet av icke-aktiverande lösning för att återställa initiala förhållanden. Under det första steget binder nanokroppar till transportören. Vid byte till aktiveringslösningen driver substratgradienten den elektrogena transporten (orange kurva). I närvaro av en hämmande nanokropp visar toppströmmen en mindre amplitud (blå kurva). Efter avslutad protokoll och löplösningar utan nanokropp (tvätt) uppstår unbinding av nanokroppar. I schematiska immobiliseras proteoliposomer med rekonstituerat protein (blått) på SSM-sensorn. Trianglar och röda cirklar representerar nanokroppar respektive substrat. b)Elektrogen kolintransport i avsaknad av nanokroppar. Toppströmmar som mäts under aktiveringsförhållanden visas för olika substratkoncentrationer. (C) Representativ mätning av strömmar under aktiveringsförhållanden i avsaknad av transportörprotein vid olika substratkoncentrationer. (D) Område med substratkoncentration jämfört med toppströmmar amplitud. EC50 fastställdes var 95 ± 11 μM kolin. Felstaplar anger standardavvikelse (n=3 biologiska replikat, n=3 tekniska replikat). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Screening och klassificering av hämmande och icke-hämmande nanokroppar. Toppströmmar som mäts under aktiveringsförhållanden visas i avsaknad av nanokropp (blå), i närvaro av en hämmande nanokropp (röd) och efter nanokropp som är obindande (grön). (B) Mätning av strömmar under aktiveringsförhållanden i avsaknad av transportprotein. Spår visar inspelningar i avsaknad av nanokropp (blå), i närvaro av en hämmande nanokropp (grön) och i närvaro av en icke-hämmande nanokropp (röd). (C,D). Histogram som visar toppströmmar uppmätta under aktiverande förhållanden i närvaro av nanokroppar och efter nanokropp som inte binder (återhämtning). Panel C visar mätresultaten med enskilda chips per nanokropp. Panel D visar resultaten från en seriell mätning med ett chip. Nanokroppar anges som Nb. Felstaplar anger standardavvikelsen (n=3 biologiska replikat, n=2 tekniska replikat). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Bestämning av IC50 av en hämmande nanokropp. ( A) Elektrogen kolintransport och hämning av en nanokropp. Toppströmmar som mäts under aktiverande förhållanden visas för olika nanokroppskoncentrationer. (B) Plot av toppströmmar amplitud kontra nanokroppskoncentration från en seriell mätning med en hämmande nanokropp. IC50 fastställt var 18 ± 2 nM. Felstaplar anger standardavvikelsen (n=3 biologiska replikat, n=3 tekniska replikat). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tekniken som presenteras här klassificerar nanokroppar med hämmande och icke-hämmande egenskaper riktade mot elektrogena transportörer. Bedömning av substrattransporten är möjlig på grund av detektion av laddningar genom transportören inbäddad i membranet av proteoliposomer. Några av de kritiska stegen under installationen av ett experiment är rekonstitution av aktivt protein i liposomer, beredning av stabila monoskikt på SSM-chips och återhämtning av initiala förhållanden efter appliceringen av tvättprotokollet för att avlägsna bundna nanokroppsmolekyler. När membranproteinet har rekonstituerats med ett lämpligt lipid-till-protein-förhållande kan ett allmänt SSM-protokoll upprättas med hjälp av det ursprungliga substratet. Det är viktigt att utföra kontrollexperiment med proteinfria liposomer för att avslöja bullerströmmar som skulle behöva subtraheras från strömmarna som mäts med hjälp av proteoliposomer. Men om brusströmmarna är för stora rekommenderar vi att du försöker testa proteinrekonstitution med olika lipider, eller skärm för buffertförhållanden som minimerar dessa skadliga signaler. Efter att framgångsrikt ha fastställt villkor för en SSM-analys kan screening av nanokroppar utföras. Ett mycket användbart alternativ som kan hjälpa till vid snabbare screening av nanokroppar är att utföra höggenomströmningsanalyser med hjälp av ett enda SSM-sensorchip. Detta minskar tiden för manipulering av chips och buffertar och minskar kostnaderna. Men eftersom flera nanokroppar appliceras sekventiellt under denna typ av analys är det viktigt att se till att den applicerade nanokroppen kan tvättas bort efter mätningen. En strikt tvättcykel kan behöva genomföras för att lossa vissa nanokroppar om minskade toppströmamplituder upptäcks i avsaknad av nanokropp. Vi rekommenderar att du använder, som utgångspunkt, de tvättförhållanden som beskrivs här. Om det inte hjälper att öka tvättvolymen eller antalet cykler, skulle enskilda chips behöva användas för att screena varje nanokropp separat. I alla fall som undersöktes här var bindningen av nanoorgan reversibel och ett protokoll med hög genomströmning kunde tillämpas. I vår experimentella installation kunde vi inte återställa den fulla amplituden av den ursprungliga toppströmmen efter mätningar med nanokroppar (figur 1A; Bild 2C,D). I de flesta fall varierade dock storleken på de återfunna toppströmmarna mellan 80 och 95 % av den amplitud som uppmättes före applicering av nanokroppar (Fig. 2C,D). Vi spekulerar att detta kan vara en följd av att tvätta bort en bråkdel av de proteoliposomer som följs vid chipet, eller på grund av långsam kinetik av unbinding av vissa hämmande nanokroppar, eller en kombination av båda. I båda fallen var det fortfarande möjligt att fortsätta analysera ytterligare nanokroppar eftersom elektrogen transport var mätbar. Detta visas i figur 2D, där vi screenade sex nanokroppar med en enda spånberedning.

Höggenomströmningsegenskapen är en av de viktigaste framstegen i den metod som presenteras. I motsats till andra metoder möjliggör denna metod dessutom val av hämmande nanokroppar som riktar sig mot elektrogena transportörer för vilka märkta substrat inte är tillgängliga. En snabb identifiering av hämmande nanokroppar kan bidra till att påskynda forskningen som syftar till att identifiera nya tillämpningar av nanokroppar som läkemedel. Deras uppenbara fördelar jämfört med liknande behandlingar som antikroppsbehandlingar är många, med början i en mindre storlek som hjälper dem att sprida sig vidare till vävnader eller celler, till deras låga produktionskostnader och hög stabilitet.

SSM-baserad elektrofysiologi har tidigare använts för karakterisering av elektrogena transportörer i membranblåsor29,38. Dessa typer av experiment är fördelaktiga eftersom de inte är beroende av proteinrenings- och rekonstitutionsprotokollen. Vi spekulerar att det är möjligt att utföra valet av hämmande nanokroppar med membranblåsor. Detta skulle bidra till att minska kostnaderna och undvika manipuleringar av renade proteiner.

SSM-baserad elektrofysiologi är en stark teknik för att screena för nanokroppshämmare av flera membranproteiner som uppvisar elektrogena transporter. Vi föreställer oss att SSM-baserad elektrofysiologi kommer att bli ett viktigt verktyg för val av hämmande nanokroppar och andra antikroppar med potentiella kliniska tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Cedric A. J. Hutter och Markus A. Seeger från Institute of Medical Microbiology vid Zürichs universitet och Gonzalo Cebrero från Biozentrum vid Universitetet i Basel för samarbete i generering av syntetiska nanokroppar (sybodies). Vi tackar Maria Barthmes och Andre Bazzone från NANION Technologies för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (SNSF) (PP00P3_170607 och NANION Research Grant Initiative till C.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octadecanethiol solution Sigma Aldrich O1858-25ML
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) BioRad #152-3920
PD 10 Desalting Columns GE Healthcare GE17-0851-01
Filter 200 nm membrane Whatman Nucleopore WHA800282
2-Propanol Merck 33539-1L-R
n-Decane Sigma Aldrich 8034051000
n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) Avanti Polar Lipids 850520P-25g
Sodium Chloride AppliChem 131659.1211
(SSM setup) SURFE2R N1 Nanion -----
SURFE2R N1 Single Sensor Chips Nanion # 161001
Trizma Base Sigma Aldrich T1503
E. coli Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids 100600C
Egg PC L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
  2. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  3. Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
  4. Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
  5. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
  6. Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
  7. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  8. Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
  9. Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
  10. Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
  11. Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
  12. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
  13. Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
  14. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
  15. McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
  16. Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
  17. Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
  18. Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
  19. Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
  20. Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
  21. vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
  22. Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
  23. Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
  24. Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
  25. Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
  26. Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
  27. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  28. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  29. Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
  30. Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
  31. Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
  32. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
  33. Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
  34. Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
  35. Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
  36. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
  37. Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
  38. Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).

Tags

Biokemi nummer 171 membrantransportör membranproteiner elektrofysiologi med fast stöd nanokroppar hämmande nanokroppar val av nanokroppar
Val av transportörriktad hämmande nanokroppar av SSM-baserad elektrofysiologi (Solid-Supported-Membrane)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bärland, N., Perez, C.… More

Bärland, N., Perez, C. Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (171), e62578, doi:10.3791/62578 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter