Summary
Nanobodies er viktige verktøy i strukturell biologi og utgjør et stort potensial for utvikling av terapier. Imidlertid kan valg av nanostoffer med hemmende egenskaper være utfordrende. Her demonstrerer vi bruk av solid-supported-membrane (SSM)-basert elektrofysiologi for klassifisering av hemmende og ikke-hemmende nanostoffer rettet mot elektrogene membrantransportører.
Abstract
Enkeltdomene antistoffer (nanostoffer) har blitt mye brukt i mekanistiske og strukturelle studier av proteiner, og de utgjør et enormt potensial som verktøy for å utvikle kliniske terapier, hvorav mange avhenger av hemming av membranproteiner som transportører. Imidlertid er de fleste metodene som brukes til å bestemme hemming av transportaktivitet vanskelig å utføre i høygjennomstrømningsrutiner og avhenger av merkede substrater tilgjengelighet og dermed komplisere screening av store nanobody biblioteker. Solid-støttet membran (SSM) elektrofysiologi er en høy gjennomstrømningsmetode, som brukes til å karakterisere elektrogene transportører og måle deres transportkinetikk og hemming. Her viser vi implementeringen av SSM-basert elektrofysiologi for å velge hemmende og ikke-hemmende nanostoffer rettet mot en elektrogen sekundærtransportør og for å beregne nanolegemer hemmende konstanter. Denne teknikken kan være spesielt nyttig for å velge hemmende nanostoffer rettet mot transportører som er merket substrater ikke er tilgjengelige for.
Introduction
Antistoffer består av to identiske tunge kjeder og to lette kjeder som er ansvarlige for antigenbindingen. Kamellider har bare tunge antistoffer som har lignende affinitet for deres cognate antigen sammenlignet med konvensjonelle antistoffer1,2. Enkeltvariabeldomenet (VHH) med tunge kjettinger antistoffer beholder det fulle antigenbindende potensialet og har vist seg å være svært stabilt1,2. Disse isolerte VHH-molekylene eller "nanobodies" er implementert i studier relatert til membranproteiner biokjemi som verktøy for stabilisering av konformasjoner3,4, som hemmere5,6, som stabiliseringsmidler7, og som gadgets for strukturbestemmelse8,9,10 . Nanobodies kan genereres ved immunisering av kamellider for pre-berikelse av B-celler som koder målspesifikke nanostoffer og påfølgende isolasjon av B-celler, etterfulgt av kloning av nanobodybiblioteket og valg av phage display11,12,13. En alternativ måte å generere nanobodies på er basert på in vitro-valgmetoder som er avhengige av bygging av biblioteker og valg ved phage-skjerm, ribosomeskjerm eller gjærdisplay14,15,16,17,18,19,20. Disse in vitro-metodene krever store bibliotekstørrelser, men drar nytte av å unngå dyreimmunisering og favorisere valg av nanostoffer rettet mot proteiner med relativt lav stabilitet.
Den lille størrelsen på nanobodies, deres høye stabilitet og løselighet, sterk antigen affinitet, lav immunogenisitet og relativt enkel produksjon, gjør dem sterke kandidater for utvikling av terapeutiskemidler 21,22,23. Spesielt er nanostoffer som hemmer aktiviteten til flere membranproteiner potensielle eiendeler for kliniske applikasjoner5,24,25,26. Når det gjelder membrantransportører, for å vurdere om en nanobody har hemmende aktivitet, er det nødvendig å utvikle en analyse som gjør det mulig å oppdage transporterte substrater og / eller ko-substrater. Slike analyser involverer vanligvis merkede molekyler eller utformingen av substratspesifikke deteksjonsmetoder, som kan mangle en universell anvendelse. Videre krever identifisering av hemmende nanostoffer generelt screening av et stort antall bindemidler. Dermed er en metode som kan brukes i en høygjennomstrømningsmodus, og som ikke er avhengig av merkede substrater, avgjørende for dette valget.
SSM-basert elektrofysiologi er en ekstremt følsom, svært tidsavklart teknikk som gjør det mulig å oppdage bevegelse av ladninger på tvers av membraner (f.eks. ionbinding/transport)27,28. Denne teknikken har blitt brukt til å karakterisere elektrogene transportører, som er vanskelige å studere ved hjelp av andre elektrofysiologiteknikker på grunn av den relative lave omsetningen av disse proteinene29,30,31,32,33,34,35. SSM elektrofysiologi krever ikke bruk av merkede substrater, det er egnet for screening av høy gjennomstrømning, og enten proteoliposomer eller membran vesikler som inneholder transportøren av interesse kan brukes. Her demonstrerer vi at SSM-basert elektrofysiologi kan brukes til å klassifisere transportør-målrettede nanostoffer med hemmende og ikke-hemmende egenskaper. Som et prinsippbevis beskriver vi rekonstituering av en bakteriell kolintransportør i liposomer, etterfulgt av detaljerte trinn for immobilisering av proteoliposomer på SSM-sensorene. Vi beskriver deretter hvordan du utfører SSM-baserte elektrofysiologimålinger av kolintransport og hvordan du bestemmer den halvmaksimale effektive konsentrasjonen (EC50). Vi viser deretter hvordan du bruker SSM-basert elektrofysiologi for å screene flere nanolegemer og for å identifisere hemmere av kolintransport. Til slutt beskriver vi hvordan du bestemmer de halvmaksimale hemmende konsentrasjonene (IC50) av utvalgte hemmende nanostoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rekonstituering av membranprotein
- Bland 3 ml E. coli polarlipider med 1 ml fosfatidylkolin i en rund bunnflaske under en ventilert hette.
- Tørk lipidblandingen i 20 minutter under vakuum ved hjelp av en roterende fordamper og et vannbad ved 37 °C for å fjerne kloroform. Tørk om nødvendig videre under nitrogen eller argongass.
- Bruk av TS buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) som inneholder 2 mM β-mercaptoetanol, resuspend lipider til 25 mg / ml.
- Aliquot lipider i 500 μL aliquots, flash fryse i flytende nitrogen, og lagre ved -80 °C.
- Tine en 500 μL aliquot av lipider og fortynn 1:1 ved hjelp av TS-buffer som inneholder 2 mM β-mercaptoetanol.
- Ekstruder lipidfjæringen 15 ganger ved hjelp av en 400 nm membran.
- Fortynn lipidfjæringen for å ha en endelig lipidkonsentrasjon på 4,4 mg/ml.
- Tilsett n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) for å ha en endelig konsentrasjon på 0,2% og la den rotere i 1 time ved 200 rpm ved romtemperatur (RT).
- Tilsett det rensede proteinet til lipidene ved hjelp av et lipid-til-protein-forhold mellom 1:10 og 1:100 (w:w).
MERK: Forholdet må justeres avhengig av styrken på signalet som oppdages i SSM-elektrofysiologimålinger av substrattransport (se nedenfor). For å oppnå større signaler, bruk mindre lipid-til-protein-forhold. - Inkuber blandingen som roterer ved 200 o/min i 1 time ved RT.
- Tilsett 30 mg/ml polystyren adsorbentperler, forhåndsvasket i TS-buffer.
MERK: Tilsett polystyrenperler trinnvis. - Inkuber perler-lipider blandingen i 30 min ved RT under langsom omrøring.
- For å fjerne perlene, la perler-lipider blandingen stå slik at perlene legger seg ned. Overfør løsningen til et nytt rør og la perlene ligge igjen. Tilsett 30 mg/ml friske polystyren adsorbentperler til den separerte lipidblandingen.
- Inkuber blandingen i 1 time ved 4 °C under langsom omrøring.
- Skill perlene fra blandingen som beskrevet i trinn 1.13 og tilsett 30 mg/ml ferske polystyren adsorbente perler.
- Inkuber blandingen i 16 timer ved 4 °C.
- Skill perlene fra blandingen som beskrevet i trinn 13 og tilsett 30 mg/ml ferske polystyren adsorbentperler.
- Inkuber blandingen i 2 timer ved 4 °C for en fjerde og siste vask.
- Sentrifuge ved 110.000 x g i 30 min ved 4 °C.
- Vask pelletsen med 500 μL TS-buffer som inneholder 2 mM β-mercaptoetanol.
- Sentrifuge igjen ved 110.000 x g i 30 min ved 4 °C.
- Resuspend pellet til en endelig lipid konsentrasjon på 25 mg / ml i TS buffer med 2 mM β-mercaptoethanol.
- Beregn proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en in-gel eller amido svart analyse36.
- Aliquot proteoliposomes, flash fryse i flytende nitrogen, og lagre ved -80 °C.
2. Tilberedning av sjetonger
- Fyll en enkelt sensorbrikke med 50-100 μL 0,5 mM 1-oktadekantetioloppløsning (resuspendert i isopropanol).
- Inkuber brikken med løsningen i 30 min på RT.
- Fjern tioloppløsningen ved å trykke på brikken på et vev.
- Skyll sensoren 3 ganger med 5 ml ren isopropanol.
- Skyll sensoren 3 ganger med 5 ml dobbelt destillert vann.
- Tørk sensoren ved å trykke på et silkepapir.
- Påfør 1,5 μL 7,5 μg/μL 1,2-difytanoyl-sn-glysero-3-fosfocholin (lipider tørket i en roterende fordamper og resuspendert i n-dekanter).
- Umiddelbart etter fyller du sensoren med 50 μL ikke-aktiverende SSM-buffer, som ikke inneholder substratet. Dette vil føre til en spontan dannelse av SSM-laget.
MERK: SSM-bufferen bør optimaliseres på forhånd for å bestemme optimale forhold som har lav bakgrunnsstøy. En generell buffer som inneholder 30 mM HEPES pH 7,4, 5 mM MgCl2, 140 mM NaCl, kan brukes som utgangspunkt. SSM-bufferen uten substratet brukes til vask før og etter målingen (ikke-aktiverende buffer). Hvis du vil unngå bufferkonflikt, bruker du den ikke-aktiverende bufferen til å klargjøre bufferen som inneholder substratet (aktiveringsbuffer). Substratet kan tilsettes enten direkte som pulver eller i et lite volum fra en høy konsentrasjonsmasse for å unngå fortynning. - Tine proteoliposomer fra trinn 1.24 på RT.
- Fortynn proteoliposomer mellom 1:5 og 1:100 (proteoliposomer:buffer, (v:v)) i den ikke-aktiverende SSM-bufferen (her 1:20).
- Soniker proteoliposomer i 20-30 s eller 3 ganger i 10 s, og plasser på is mellom sonikering, om nødvendig. Her ble en vannbadsonator på 45 kHz brukt.
- Påfør 5-10 μL av den fortynnede sonikerte proteoliposomprøven på overflaten av sensoren uten å berøre den.
- Sentrifuger sjetongene med løsningen på RT i 30 minutter ved hjelp av en hastighet mellom 2000 og 3000 x g.
MERK: Bruk 50 ml rør med flat bunn. Plasser sensorbrikkene forsiktig oppreist ved hjelp av pinsett. 6-brønnsplater og en sentrifuge med plateholder kan også brukes. - Bruk sensorbrikkene på samme dag.
3. Måling av løsemiddeltransport: Bestemmelse av metningsforhold
MERK: Som prinsippbevis ble disse eksperimentene utført ved hjelp av en bakteriell kolintransportør rekonstituert i liposomer etter protokollen beskrevet ovenfor. Den trinnvise prosessen med å bestemme mettende forhold til substrat kolinen før måling av hemming av nanostoffer er vist her.
- Klargjør 1-2 L av den ikke-aktiverende SSM-bufferen.
MERK: Klargjør og bruk samme SSM-bufferlager for alle aktiverings- og ikke-aktiverende buffere gjennom alle målinger. - Ta 10 rene rør og overfør 10 ml av den ikke-aktiverende SSM-bufferen til hver.
- Legg substratet i rørene fra trinn 3.2 ved hjelp av en rekke konsentrasjoner rundt forventet halv maksimal konsentrasjon (her 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 mM kolin) for å forberede de aktiverende SSM-bufferne. Bruk en høy konsentrasjonsmasse for å unngå fortynning.
- Slå på SSM-maskinen.
- Start SSM-programvaren og la maskinen initialiseres automatisk. Angi lagringsbanen for data og bekreft ved å trykke på OK-knappen. Velg standardprotokollen for første rengjøring i arbeidsflytalternativene, og klikk Kjør.
- Monter den proteoliposomebelagte brikken på stikkontakten, beveg armen for å låse brikken, og lukk den monterte brikken med hetten.
- Velg programmet CapCom i arbeidsflyten, og la det kjøre for å bestemme konduktivitet og kapasitans. Bekreft at ledningsevnen er under 5 nS og kapasitansen er mellom 15 og 35 nF før du bruker den til målingen.
MERK: En kapasitansverdi på 15-35 nF og ledningsevne under 5 nS anbefales av produsenten ved bruk av en 3 mm brikke. - Overfør aktiveringsløsningene til hetteglass og plasser bufferne i probeprøven.
- Overfør den ikke-aktiverende bufferen til et reservoar og plasser den ved siden av sponholderen i reservoarposisjonen til høyre.
- Opprett en protokoll for arbeidsflyten ved hjelp av en sekvens med ikke-aktiverende (B), aktivering (A) og ikke-aktiverende (B) løsninger (B-A-B-sekvens) og en løkke som utfører tre mål og går til neste aktiveringsbuffer for alle 10 buffere som er klargjort i trinn 3.3. Bruk standard strømningshastighet på 200 μL/s ved hjelp av 1 s - 1 s - 1 s strømningstider for B-A-B-sekvensen. Klikk Spill av for å starte målingen.
MERK: Et typisk eksperiment består av den sekvensielle strømmen av ikke-aktiverende (B), aktiverende (A) og ikke-aktiverende (B) løsninger (skrevet som B-A-B; se figur 1A). De immobiliserte proteoliposomene på sensoren vil bli vasket med løsningene. Derfor genererer B-A-løsningsutvekslingen en substratkonsentrasjonsgradient, som driver den elektrogene transportreaksjonen. - Lagre protokollen og la arbeidsflyten kjøre ved å klikke spill av -knappen. Utfør samme type eksperiment, men bruk proteinfrie liposomer. Dette er svært viktig, da det vil vise intensiteten av bakgrunnsstrømmer. Dette bør vurderes ved analyse av data om elektrogen transport målt med proteoliposomer (figur 1C).
- Bruk en hvilken som helst foretrukket programvare for dataanalyse til å tegne inn den målte strømmen kontra tiden. Les opp toppstrømmen manuelt, eller bruk funksjonen til høyeste høydeestimering i området for tillegg av aktiveringsbufferen hvis du bruker programvaren.
- Plott toppstrømmen mot substratkonsentrasjonen for å bestemme EC50 av substratet via den ikke-lineære regresjonen (Figur 1B,C). Les opp den laveste konsentrasjonen der toppstrømmen når en maksimal verdi, denne konsentrasjonen tilsvarer mettende forhold.
MERK: Det er viktig å vurdere at antall proteoliposomer som forblir immobilisert varierer fra chip-til-chip. Denne variasjonen er tydelig ettersom toppstrømmene ved identiske måleforhold vil vise forskjellige amplituder. Derfor er det nødvendig å normalisere de nåværende amplitudene av målinger utført på hver brikke separat før du sammenligner målinger mellom forskjellige sponpreparater.
4. Seriell klassifisering av hemmende og ikke-hemmende nanostoffer
MERK: Denne delen viser hvordan du måler kolintransport i nærvær av nanostoffer som binder seg spesielt til bakteriell kolintransportør. Mindre toppstrømmer i nærvær av nanostoffer indikerer transporthemming. Ikke-hemmende nanostoffer vil ikke påvirke substrattransport, det vil si ingen reduksjon av toppstrømsignalet.
- Klargjør 1-2 L ikke-aktiverende SSM-buffer.
- Overfør 50 ml av den ikke-aktiverende SSM-bufferen til et rent rør. Tilsett substrat kolinen i en endelig konsentrasjon på 5 mM (mettende forhold). Bruk dette for en positiv kontrollmåling.
- Overfør 10 ml av den ikke-aktiverende SSM-bufferen til et rent rør. Tilsett substrat kolinen i en endelig konsentrasjon på 5 mM (mettende forhold) og tilsett nanobody til en endelig konsentrasjon på 500 nM.
- Gjenta trinn 4.3 for hver nanobody for å forberede aktiveringsløsningene.
MERK: Hvis de rensede nanostoffene resuspenderes i en annen buffer enn SSM-bufferen, vil tillegg til de aktiverende og ikke-aktiverende bufferne føre til en bufferkonflikt. En bufferkonflikt bør unngås siden det kan føre til høy støy. Utveksling av bufferen til de rensede nanostoffene med SSM-bufferen kan bidra til å unngå dette problemet. Videre anbefales det å bruke nanobodykonsentrasjoner som gjør det mulig å nå mettende forhold. Tatt i betraktning at bindingskonstantene til nanobodies generelt er under 100 nM, anbefales en nanobodykonsentrasjon på 500 nM for dette eksperimentet. Det er imidlertid viktig å forhåndsscreene for optimale konsentrasjoner. - Start SSM-maskinen og mål kapasitansen og ledningsevnen til proteoliposomebelagt brikke som beskrevet i trinn 3.4-3.7.
- Overfør aktiveringsløsningen uten nanobody inn i et hetteglass og plasser bufferen i probeprøven. Overfør den ikke-aktiverende bufferen uten nanobody inn i et reservoar og plasser den i probeprøven.
- Overfør aktiveringsløsningene som inneholder nanolegemer, til hetteglass og plasser bufferne i probeprøven. Overfør de ikke-aktiverende bufferne som inneholder nanolegemer, til hetteglass og plasser bufferne i probeprøven.
- Opprett en protokoll for arbeidsflyten ved hjelp av en sekvens med ikke-aktiverende (B), aktiveringsløsninger (A) og ikke-aktiverende (B) (B-A-B-sekvens).
- Lag en løkke som utfører følgende: tre målinger av B-A-B-sekvensen ved hjelp av buffere uten nanobody, to målinger av B-A-B-sekvensen med buffere som inneholder en nanobody, 120 s forsinkelsestid for inkubasjon med nanobody, deretter 3 målinger av B-A-B-sekvensen med buffere som inneholder nanobody.
- Lagre arbeidsflyten, og la den kjøre ved å klikke Spill av -knappen.
MERK: Denne arbeidsflyten måler de opprinnelige transportbetingelsene uten hemming ved å kjøre B-A-B-protokollen 3 ganger ved hjelp av ikke-aktiverende (B) og aktiverende buffere (A) uten nanobody (Figur 1B,C), etterfulgt av måling av nanobody-effekten på transporten ved å kjøre B-A-B-protokollen 5 ganger med de ikke-aktiverende og aktiverende bufferne som inneholder nanobodies (Figur 2A ). Den andre rekkefølgen bindende kinetikk dikterer samspillet mellom nanostoffer og deres målproteiner. Derfor er det viktig å bruke en tidsforsinkelse i B-A-trinnet for å gi nok tid til nanostoffer å binde seg til transportører i proteoliposomer på brikken. Optimale tider avhenger av nanobodykonsentrasjonen, det vil si ved lavere konsentrasjoner er det nødvendig med lengre tider. De to første målingene er nødvendige for å tilpasse systemet til de nye forholdene, og den andre kjøringen skal utføres etter en forsinkelsestid på 120 s. Bare følgende tre målinger bør brukes til dataanalyse. - Opprett en ny protokoll for arbeidsflyten ved hjelp av en sekvens med ikke-aktiverende (B), aktiveringsløsninger (A) og ikke-aktiverende (B) (B-A-B-sekvens) og en løkke med 5 målinger for å bleke den reversibel bundne nanobodyen.
MERK: Ta eventuelt med et inkubasjonstrinn for å tillate dissosiasjon av nanostoffer med langsom kinetikk. - Lagre arbeidsflyten, og la den kjøre ved å klikke Spill av -knappen.
- Sammenlign den siste toppstrømmen for målingene med den opprinnelige målingen bare for underlag i trinn 4.10. Nanobody har blitt vasket ut og de opprinnelige forholdene er gjenopprettet hvis toppstrømmen når startverdien, ellers gjenta trinn 4.12-4.13 eller bytt til en ny brikke.
- Gjenta trinn 4.6-4.13 og bruk individuelle sjetonger for hver nanobodyskjerm (figur 2C) eller gjenta med flere nanostoffer ved hjelp av samme brikke (Figur 2D).
- Bruk en hvilken som helst foretrukket programvare for dataanalyse til å tegne inn den målte strømmen kontra tiden. Les opp toppstrømmen manuelt, eller velg automatisk funksjonen for høyeste høydeestimat i området for tillegging av aktiveringsbufferen i den brukte programvaren.
- Normaliser toppstrømmen i nærvær av nanobody, basert på den foregående substratmålingen. Plott toppstrømmene i et histogram og sammenlign toppstrømmene til substratet bare målinger med toppstrømmene målt i nærvær av nanobodies (Figur 2C,D) for å identifisere hemmende nanostoffer.
MERK: Normalisering av de bestemte toppstrømmene til hvert enkelt løp med nanobody bør utføres med tanke på toppstrømmen i fravær av nanobody fra forrige måling. Siden antall proteoliposomer som forblir immobilisert varierer fra chip-til-chip, er det viktig å normalisere de nåværende amplitudene av målinger utført på hver brikke separat før du sammenligner målinger mellom forskjellige brikkepreparater.
5. IC50-måling med hemmende nanostoffer
MERK: Etter å ha identifisert hemmende nanostoffer, er det mulig å bestemme deres halve maksimale hemmende konsentrasjon (IC50). Dette gjøres ved å måle transport av kolin ved konstant konsentrasjon, mens varierende konsentrasjoner av den hemmende nanobody.
- Klargjør 1-2 L av den ikke-aktiverende SSM-bufferen.
- Overfør 50 ml av den ikke-aktiverende SSM-bufferen til et rent rør. Tilsett substrat kolinen i en endelig konsentrasjon på 5 mM (mettende forhold). Bruk dette som aktiveringsløsning for positiv kontroll.
- Ta 8 rene rør og tilsett 5 ml av den ikke-aktiverende løsningen i hver. Tilsett substrat kolinen i en endelig konsentrasjon på 5 mM (mettende forhold). Tilsett den hemmende nanobodien i rørene ved konsentrasjoner i det forventede IC50-området (her 500 nM - 1 nM).
- Ta 8 rene rør og tilsett 10 ml av den ikke-aktiverende løsningen i hver. Tilsett hemmende nanostoff til hvert rør individuelt i samme konsentrasjon som i trinn 5.3. Dette tilsvarer bufferen som ikke aktiveres.
MERK: Dette vil generere en rekke aktiverende og ikke-aktiverende bufferpar ved forskjellige konsentrasjoner av samme hemmende nanobody. - Start SSM-oppsettet og mål kapasitansen og konduktiviteten til den proteoposomebelagte brikken som beskrevet i trinn 3.4-3.7.
- Overfør aktiveringsløsningen uten nanobody til et hetteglass og legg den i probeprøven. Overfør den ikke-aktiverende bufferen uten nanobody inn i et reservoar og plasser den i reservoarposisjon ved siden av sponholderen til høyre.
- Overfør aktiveringsløsningene som inneholder nanolegemer, til hetteglass og plasser bufferne i probeprøven. Overfør de ikke-aktiverende bufferne som inneholder nanolegemer, til hetteglass og plasser bufferne i probeprøven.
- Opprett en protokoll for arbeidsflyten ved hjelp av en sekvens med ikke-aktiverende (B), aktiveringsløsninger (A) og ikke-aktiverende (B) (B-A-B-sekvens). Inkluder en løkke for å måle hver konsentrasjon 2 ganger, inkubere i 120 s og måle 3 ganger til. Arbeidsflyten starter med positiv kontroll av bare substrat etterfulgt av den laveste konsentrasjonen av nanobody. Hver nanobody måling vil bli etterfulgt av en etterfølgende måling av den positive kontrollen med substrat-bare for å gjenopprette den første topp amplitude, før du går til neste høyere nanobody konsentrasjon.
MERK: Den andre orden kinetikk dikterer bindingen av nanostoffer. Derfor er det viktig å bruke en tidsforsinkelse i B-A-trinnet. Optimale tider avhenger av nanobodykonsentrasjonen, det vil si ved lavere konsentrasjoner er det nødvendig med lengre tider; her ble 120 s brukt med tilfredsstillende resultater. - Bruk en hvilken som helst foretrukket programvare for dataanalyse til å tegne inn den målte strømmen kontra tiden. Les opp toppstrømmen manuelt, eller hvis du bruker programvare, velger du funksjonen for høyeste høydeestimat i området for tillegg av aktiveringsbufferen (Figur 3A). Plott toppstrømmene mot nanobodykonsentrasjonen for å bestemme IC50 via ikke-lineær regresjon (figur 3B).
MERK: Normaliser de nåværende amplitudene for målinger som utføres for hver enkelt brikke før du sammenligner målinger mellom forskjellige brikkepreparater.
6. Rengjøring av sensorer
- Skyll enkeltsensorbrikkene etter bruk med 10 ml destillert vann.
- Tørk brikken ved å trykke på den på et silkepapir.
- Fyll sensorhulen på brikken med 100 μL ren isopropanol og inkuber i 10 min ved RT.
- Legg en bomullspinne i ren isopropanol og inkuber i 1-3 min.
- Bruk presoaked bomullspinne og roter forsiktig på sensorens overflate uten trykk for å fjerne rester.
- Skyll sensoren med 5 ml ren isopropanol.
- Skyll sensoren med 10 ml destillert vann.
- Tørk sensoren ved å trykke på brikken på et vev.
- La sensoren tørke over natten på RT, og oppbevar den på RT under tørre forhold.
MERK: Sensorer kan brukes på nytt opptil 4-5 ganger når de rengjøres og lagres riktig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SSM-basert elektrofysiologi har blitt mye brukt til karakterisering av elektrogene transportører. I protokollen som presenteres her, viser vi hvordan du bruker SSM-basert elektrofysiologi for å klassifisere nanostoffer rettet mot en sekundær transportør (her en bakteriell kolinsympporter) basert på deres hemmende og ikke-hemmende egenskaper. En av de mest nyttige funksjonene i denne teknikken er at den tillater høy gjennomstrømningsscreening av flere bufferforhold. Denne spesielle egenskapen er gunstig for analyse av nanobody biblioteker, som etter valg av bindemidler kan utgjøres fra noen få til dusinvis av nanobodies. I et standardeksperiment er en stabil lipidmonolayer montert på en sensorbrikke. Etter å ha brukt proteoliposompreparatet som inneholder kolintransportøren, utføres en sjekk for god ledningsevne og kapasitans, da dette er viktig for suksessen til eksperimentet. I tilfelle at membranens integritet blir kompromittert under et eksperiment, som lett observeres på grunn av de høye støybakgrunnsstrømmene, anbefales det å bytte til en ny brikke, da det er ganske vanskelig å gjenopprette lave støyforhold. Generelt har vi observert veldig god reproduserbarhet blant målinger av transport og hemming av nanostoffer ved bruk av forskjellige sjetonger.
For å bestemme om substratkonsentrasjonen som skal brukes under en screening av nanostoffer, ble elektrogen transport først målt under forskjellige substratkonsentrasjoner for å bestemme EC50 (Figur 1B,C). En substratkonsentrasjon som tilsvarer mettende tilstander ble valgt (Figur 1C). Denne substratkonsentrasjonen ble deretter holdt konstant i alle aktiveringsbuffere. I dette eksemplet valgte vi 5 mM kolin.
For screening av nanostoffer må nanobody legges til både ikke-aktiverende og aktiverende buffere. Når nanostoffer bare ble lagt til aktiveringsbufferen, var det ikke mulig å observere hemming av den elektrogene transporten. Vi spekulerer i at dette skyldes en ufullstendig okkupasjon av alle nanobody bindende steder i transportørpopulasjonen på brikken, og avslører dermed viktigheten av pre-inkubasjon med nanolegemer under ikke-aktiverende forhold. For å sikre at alle steder sannsynligvis vil bli okkupert, ble det inkludert et tidsforsinkelsestrinn under anvendelsen av det første ikke-aktiverende buffertrinnet for å tillate metning av nanobodybindingssteder på transportørpopulasjonen. Inkubasjonstider fra 2-60 min har blitt testet med reproduserbare resultater. Husk at optimale tider med inkubasjon avhenger av naturen til nanobody-bindemiddelet og konsentrasjonen under eksperimentet (samt konsentrasjonen av transportør i proteoliposomer på brikken). Derfor anbefales det å prøve forskjellige inkubasjonstider. I alle fall, som en tommelfingerregel, jo lavere nanobody konsentrasjon, jo lengre inkubasjonstid kreves. Vi testet inkubasjonstider på 2 min, 20 min, 30 min og 60 min for forskjellige nanostoffer, men oppdaget ikke ytterligere transporthemming.
Effekten av hemmende nanostoffer på elektrogen transport visualiseres fra reduksjonen av toppstrømmer amplituder (Figur 2A, C, D). Ikke-hemmende nanostoffer påvirker derimot ikke toppstrømmene. Etter å ha kjørt vaskeprotokollen for å tillate nanobodies ubinding, ble det observert en gjenoppretting på 80 til 95% av den første toppstrømamplituden (Figur 2A, C, D). Vi har utført et lignende eksperiment, men i nærvær av liposomer uten transportørproteinet. Ved endring fra ikke-aktiverende til aktiverende forhold ble det ikke innført signifikante artefaktstrømmer av nanostoffer i disse bufferne (figur 2B). Det anbefales å kjøre dette kontrolleksperimentet, da det er viktig å vite om endringer i toppstrømmer oppstår fra artefakter eller ikke.
Etter valg av nanostoffer med hemmende egenskaper bestemte vi IC50-verdier for individuelle nanostoffer (Figur 3A,B). For dette spesielle eksperimentet anbefales det å starte med lav konsentrasjon av nanostoffer og deretter bevege seg mot høy konsentrasjon under analysen. Beregningen av hemmingen for hver konsentrasjon ble deretter utført ved å sammenligne toppstrømmer målt før og etter påføring av nanobody. For å unngå uspesifisert binding av nanostoffer til overflater, noe som kan være spesielt problematisk ved bruk av lave nanobodykonsentrasjoner, anbefales det å følge en lignende protokoll som beskrevet av Kermani et al.37, hvor 50 μg / ml bovint serumalbumin ble lagt til bufferne, og forhindrer denne skadelige effekten. Tilsetning av vaskemidler som Tween eller Triton til dette formålet bør unngås, da disse vil oppløse lipidmembraner.
Figur 1: SSM-basert elektrofysiologi. (A) Protokoll for måling av forbigående strømmer. En ikke-aktiverende løsning erstattes av en aktiveringsløsning etterfulgt av flyten av ikke-aktiverende løsning for å gjenopprette innledende forhold. I løpet av det første trinnet binder nanostoffer seg til transportøren. Når du bytter til aktiveringsløsningen, driver substratgradienten den elektrogene transporten (oransje kurve). I nærvær av en hemmende nanobody viser toppstrømmen en mindre amplitude (blå kurve). Etter å ha fullført protokollen og kjører løsninger uten nanobody (vask), oppstår ubinding av nanostoffer. I det skjematiske er proteoliposomer med rekonstituert protein (blå) immobilisert på SSM-sensoren. Trekanter og røde sirkler representerer henholdsvis nanolegemer og substrat. (B) Elektrogen kolintransport i fravær av nanostoffer. Toppstrømmer målt under aktiveringsforhold vises for forskjellige substratkonsentrasjoner. (C) Representativ måling av strømmer under aktiveringsforhold i fravær av transportørprotein ved ulike substratkonsentrasjoner. (D) Plott av substratkonsentrasjon versus toppstrømmer amplitude. EC50 som ble fastslått var 95 ± 11 μM kolin. Feilfelt indikerer standardavvik (n=3 biologiske replikeringer, n=3 tekniske replikeringer). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Screening og klassifisering av hemmende og ikke-hemmende nanostoffer. (A) Elektrogen kolintransport i nærvær av nanobody. Toppstrømmer målt under aktiveringsforhold er vist i fravær av nanobody (blå), i nærvær av en hemmende nanobody (rød), og etter nanobody unbinding (grønn). (B) Måling av strømmer under aktivering av forhold i fravær av transportørprotein. Spor viser opptak i fravær av nanobody (blå), i nærvær av en hemmende nanobody (grønn), og i nærvær av en ikke-hemmende nanobody (rød). (C,D). Histogrammer som viser toppstrømmer målt under aktiveringsforhold i nærvær av nanobodies og etter nanobody unbinding (utvinning). Panel C viser resultatene av målinger ved hjelp av individuelle sjetonger per nanobody. Panel D viser resultatene fra en seriell måling ved hjelp av én brikke. Nanostoffer er angitt som Nb. Feilfelt indikerer standardavviket (n = 3 biologiske replikerer, n = 2 tekniske replikerer). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bestemmelse av IC50 av en hemmende nanobody. (A) Elektrogen kolintransport og hemming av en nanobody. Toppstrømmer målt under aktiveringsforhold vises for forskjellige nanobodykonsentrasjoner. (B) Plott av toppstrømmer amplitude vs nanobody konsentrasjon fra en seriell måling med en hemmende nanobody. IC50 fast bestemt var 18 ± 2 nM. Feilfelt angir standardavviket (n=3 biologiske replikeringer, n=3 tekniske replikeringer). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikken som presenteres her klassifiserer nanostoffer med hemmende og ikke-hemmende egenskaper rettet mot elektrogene transportører. Vurdering av substrattransporten er mulig på grunn av påvisning av bevegelsen av ladninger gjennom transportøren innebygd i membranen av proteoliposomer. Noen av de kritiske trinnene under oppsettet av et eksperiment er rekonstituering av aktivt protein i liposomer, fremstilling av stabile monolayers på SSM-brikker, og gjenoppretting av innledende forhold etter påføring av vaskeprotokollen for å fjerne bundne nanobodymolekyler. Når membranproteinet er rekonstituert med et passende lipid-til-protein-forhold, kan en generell SSM-protokoll etableres ved hjelp av det opprinnelige substratet. Det er avgjørende å utføre kontrolleksperimenter ved hjelp av proteinfrie liposomer for å avdekke støystrømmer som må trekkes fra strømmene målt ved hjelp av proteoliposomer. Hvis støystrømmene er for store, anbefaler vi imidlertid at du prøver proteinrekonstituering ved hjelp av forskjellige lipider, eller skjerm for bufferforhold som minimerer disse skadelige signalene. Etter å ha etablert betingelser for en SSM-analyse, kan screening av nanolegemer utføres. Et veldig nyttig alternativ som kan hjelpe til med raskere screening av nanolegemer, er å utføre analyser med høy gjennomstrømning ved hjelp av en enkelt SSM-sensorbrikke. Dette reduserer tiden for manipulering av sjetonger og buffere og reduserer kostnadene. Men fordi i løpet av denne typen analyse brukes flere nanostoffer sekvensielt, er det viktig å sikre at den påførte nanobodyen kan vaskes bort etter målingen. En streng vaskesyklus må kanskje implementeres for å løsne noen nanostoffer i tilfelle reduserte toppstrømamplituder oppdages i fravær av nanobody. Vi anbefaler at du bruker vaskeforholdene som er beskrevet her, som utgangspunkt. Hvis det ikke hjelper å øke vaskevolumet eller antall sykluser, må individuelle sjetonger brukes til å screene hver nanobody separat. I alle tilfellene som ble undersøkt her, var bindingen av nanolegemer reversibel og en protokoll med høy gjennomstrømning kunne brukes. I vårt eksperimentelle oppsett kunne vi ikke gjenopprette hele amplituden til den første toppstrømmen etter målinger med nanostoffer (Figur 1A; Figur 2C;D). I de fleste tilfeller varierte imidlertid størrelsen på toppstrømmene mellom 80 og 95% av amplituden målt før påføring av nanostoffer (Fig. 2C, D). Vi spekulerer i at dette kan være en konsekvens av å vaske bort en brøkdel av proteoliposomene som følges av brikken, eller på grunn av langsomme kinetikk av ubinding av noen hemmende nanostoffer, eller en kombinasjon av begge deler. I begge tilfeller var det fortsatt mulig å fortsette å analyse av ytterligere nanostoffer da elektrogen transport var målbar. Dette vises i figur 2D, der vi screenet seks nanostoffer ved hjelp av en enkelt brikkeforberedelse.
Høygjennomstrømningskarakteristikken er en av de viktigste fremskrittene i metoden som presenteres. I tillegg, i motsetning til andre tilnærminger, tillater denne metoden valg av hemmende nanostoffer rettet mot elektrogene transportører som merket substrater ikke er tilgjengelige for. En rask identifisering av hemmende nanostoffer kan bidra til å fremskynde forskningen med sikte på å identifisere nye anvendelser av nanostoffer som narkotika. Deres tilsynelatende fordeler sammenlignet med lignende terapier som antistoffbehandlinger er mange, og starter med en mindre størrelse som hjelper dem med å forplante seg videre i vev eller celler, til lave produksjonskostnader og høy stabilitet.
SSM-basert elektrofysiologi har tidligere blitt brukt til karakterisering av elektrogene transportører i membran vesikler29,38. Disse typer eksperimenter er fordelaktige, da de ikke er avhengige av proteinrensing og rekonstitueringsprotokoller. Vi spekulerer i at det er mulig å utføre valg av hemmende nanolegemer ved hjelp av membran vesicles. Dette vil bidra til å redusere kostnadene og unngå manipulasjoner av rensede proteiner.
SSM-basert elektrofysiologi er en sterk teknikk for å screene for nanobodyhemmere av flere membranproteiner som viser elektrogen transport. Vi ser for oss at SSM-basert elektrofysiologi vil bli et viktig verktøy for valg av hemmende nanolegemer og andre antistoffer med potensielle kliniske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Cedric A. J. Hutter og Markus A. Seeger fra Institutt for medisinsk mikrobiologi ved Universitetet i Zürich, og Gonzalo Cebrero fra Biozentrum ved University of Basel for samarbeid i generasjonen syntetiske nanobodies (sybodies). Vi takker Maria Barthmes og Andre Bazzone fra NANION Technologies for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation (SNSF) (PP00P3_170607 og NANION Research Grant Initiative til C.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | ----- | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
References
- Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
- Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
- Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
- Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
- Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
- Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
- Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
- Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
- Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
- Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
- Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S.
- Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
- McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
- Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
- Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
- Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
- Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
- Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
- vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
- Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
- Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
- Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
- Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
- Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
- Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K.
- Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
- Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
- Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K.
- Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
- Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
- Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
- Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
- Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
- Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).
