Summary
ナノボディは構造生物学の重要なツールであり、治療法の開発に大きな可能性を秘めています。しかし、抑制性を有するナノボディの選択は困難であり得る。ここでは、電気原性膜輸送体を標的とする抑制性および非阻害性ナノボディの分類に対する固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学の使用を実証する。
Abstract
単一ドメイン抗体(ナノボディ)は、タンパク質の機械学的研究や構造研究で広く使用されており、臨床療法を開発するためのツールとして大きな可能性を秘めており、その多くはトランスポーターなどの膜タンパク質の阻害に依存しています。しかし、輸送活動の阻害を決定するために使用される方法のほとんどは、ハイスループットルーチンで実行することは困難であり、それによって大規模なnanobodyライブラリのスクリーニングを複雑にする標識基質の可用性に依存する。固体支持膜(SSM)電気生理学は、電気原性輸送体の特性評価や輸送の動態と阻害の測定に使用されるハイスループット法です。ここでは、電気原発性二次輸送体を標的とする阻害性および非阻害性ナノボディを選択し、ナノボディ阻害定数を計算するSSMベースの電気生理学の実施を示す。この技術は、標識された基質が利用できないトランスポーターを標的とする抑制性ナノボディを選択するのに特に有用である可能性がある。
Introduction
抗体は、2つの同一の重鎖と、抗原結合を担う2つの軽鎖から構成される。ラクダは、従来の抗体1,2と比較して、同結合抗原に対して類似した親和性を示す重鎖のみの抗体を有する。重鎖のみの抗体の単一可変ドメイン(VHH)は、完全な抗原結合電位を保持し、非常に安定であることが1、2であることが示されている。これらの単離されたVHH分子または「ナノボディ」は、立体構造を安定化するためのツールとして膜タンパク質生化学に関連する研究に実施されている3,4, 阻害剤として5,6, 安定化剤として7, 構造決定のためのガジェットとして8,9,10.ナノボディは、B細胞の標的特異的ナノボディおよびその後の単離をコードするB細胞の前濃縮のためのカメリッドの免疫化によって生成することができ、続いてnanobodyライブラリのクローニングとファージディスプレイ11、12、13による選択を行う。ナノボディを生成する別の方法は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、または酵母ディスプレイ14、15、16、17、18、19、20によるライブラリおよび選択の構築に依存するインビトロ選択方法に基づく。これらのin vitro法は、大きなライブラリサイズを必要としますが、動物の免疫を回避することから利益を得て、比較的低い安定性を有するタンパク質を標的とするナノボディの選択を好む。
ナノボディの小型化は、その高い安定性および溶解性、強い抗原親和性、低い免疫原性、および比較的容易な産生を、治療21、22、23の開発のための有力な候補となる。特に、複数の膜タンパク質の活性を阻害するナノボディは、臨床応用5、24、25、26の潜在的な資産である。膜輸送体の場合、ナネnobodyが阻害活性を有するかどうかを評価するためには、輸送された基質および/または共基質の検出を可能にするアッセイを開発する必要がある。このようなアッセイは、通常、標識された分子または基質特異的検出方法の設計を伴い、普遍的な適用を欠く可能性がある。さらに、阻害性ナノボディの同定には、一般に多数の結合剤のスクリーニングが必要である。したがって、ハイスループットモードで使用でき、ラベル付き基板に依存しない方法がこの選択に不可欠です。
SSMベースの電気生理学は、膜を越えて電荷の移動(例えば、イオン結合/輸送)27、28を検出することを可能にする非常に敏感で、非常に時間分解された技術である。この技術は、これらのタンパク質の相対的低回転率に起因する他の電気生理学的手法を用いて研究することが困難である電気原性トランスポーターの特徴付けに適用されてきた29、30、31、32、33、34、35。SSM電気生理学は標識された基質の使用を必要とせず、ハイスループットスクリーニングに適しており、また、目的のトランスポーターを含むプロテオリポソームまたは膜小胞のいずれかを使用することができる。ここでは、SSMベースの電気生理学が、トランスポーター標的ナノボディを阻害性および非阻害特性で分類できることを実証する。原理の証明として、我々はリポソームに細菌コリントランスポーターの再構成を記述し、続いてSSMセンサー上のプロテオリポソームの固定化のための詳細なステップを述べています。次に、コリン輸送のSSMベースの電気生理学的測定を行う方法と、半最大有効濃度を決定する方法について説明します(EC50)。次に、SSMベースの電気生理学を用いて、複数のナノボディをスクリーニングし、コリン輸送の阻害剤を同定する方法を示す。最後に、選択した阻害性ナノボディの半最大阻害濃度(IC50)を決定する方法を説明する。
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Protocol
1. 膜タンパク質の再構成
- 通気フードの下の丸底フラスコに1mLのホスファチジルコリンと大 腸菌 極性脂質の3mLを混ぜます。
- 37°Cのロータリーエバポレーターと水浴を使用して、37°Cで脂質混合物を真空下で20分間乾燥させてクロロホルムを除去します。必要に応じて、窒素またはアルゴンガスの下でさらに乾燥させます。
- 2 mM β-メルカプトエタノールを含むTSバッファー(20 mM Tris-HCl pH 8.0,150 mM NaCl)を用い、脂質を25mg/mLに再懸濁した。
- アリコート脂質は500μLアリコートで、フラッシュは液体窒素で凍結し、-80°Cで保存する。
- 2 mM β-メルカプトエタノールを含むTSバッファーを使用して、脂質の1 500 μL アリコートを解凍し、1:1 を希釈します。
- 400nm膜を用いて脂質懸濁液を15回押し出す。
- 脂質懸濁液を希釈して、最終的な脂質濃度を4.4mg/mLにします。
- n-ドデシルβ-D-マルトシド(DDM)を加えて、最終濃度を0.2%にし、室温(RT)で200rpmで1時間回転させます。
- 1:10~1:100の間の脂質対タンパク質比を使用して、精製したタンパク質を脂質に加えます(w:w)。
注:この比率は、基材輸送のSSM-電気生理学測定で検出された信号の強度に応じて調整する必要があります(下記参照)。より大きなシグナルを得るためには、より小さな脂質対タンパク質比を使用してください。 - 200rpmで回転する混合物をRTで1時間インキュベートする。
- 30 mg/mLのポリスチレン吸着剤ビーズを加え、TSバッファーであらかじめ洗浄します。
注:ポリスチレンビーズを段階的に追加します。 - 遅い攪拌下でRTで30分間ビーズ-脂質混合物をインキュベートします。
- ビーズを除去するには、ビーズと脂質の混合物を立たせてビーズが落ち着くようにします。新しいチューブにソリューションを転送し、後ろにビーズを残します。分離した脂質混合物に30mg/mLの新鮮なポリスチレン吸着剤ビーズを加えます。
- ゆっくり撹拌しながら4°Cで1時間培養します。
- ステップ1.13に記載されているように混合物からビーズを分離し、新鮮なポリスチレン吸着ビーズの30mg / mLを加える。
- 4°Cで16時間培養します。
- ステップ13で説明したように混合物からビーズを分離し、新鮮なポリスチレン吸着ビーズの30mg/mLを加える。
- 4°Cで2時間培養し、4回目の最終洗浄を行います。
- 遠心分離機 110,000 x g で 30 分 4 °C.
- ペレットを2 mM β-メルカプトエタノールを含むTSバッファー500 μLで洗浄します。
- 遠心分離機は4°Cで30分間110,000xgで再び。
- ペレットを2 mMのβメルカプトエタノールでTSバッファー内の25mg/mLの最終的な脂質濃度に再懸濁します。
- インゲルまたはアミドブラックアッセイ36を用いてタンパク質濃度を推定する。
- プロテオリポソームをアリコートし、液体窒素中でフラッシュ凍結し、−80°Cで保存する。
2. チップの準備
- 1つのセンサーチップに0.5 mM 1-オクタデカネチオール溶液(イソプロパノールで再懸濁)の50-100 μLを充填します。
- RTで30分間溶液でチップをインキュベートします。
- チオール溶液を組織上のチップをタップして取り除きます。
- 5 mLの純粋なイソプロパノールでセンサーを 3 回リンスします。
- センサーを5mLの二重蒸留水で3回リンスします。
- ティッシュペーパーをタップしてセンサーを乾燥させます。
- 1.5 μLの7.5 μL 1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(ローテートリエバポレーターで乾燥し、n-デカンで再懸濁した脂質)を適用します。
- その直後に、基板を含まない非活性化SSMバッファを50μLで満たします。これは、SSM層の自発的な形成につながります.
メモ:SSMバッファは、バックグラウンドノイズが低い最適条件を決定するために、事前に最適化する必要があります。30 mM HEPES pH 7.4、5 mMMgCl 2、140 mM NaCl を含む一般的なバッファーを出発点として使用できます。基材を含まないSSMバッファーは、測定前後の洗浄(非活性化バッファ)に使用されます。バッファーの不一致を避けるために、非アクティブ化バッファーを使用して、基材(活性化バッファー)を含むバッファーを準備します。基材は、希釈を避けるために、粉末として直接、または高濃度ストックから少量で直接添加することができます。 - RTでステップ1.24からプロテオリポソームを解凍する。
- 非活性SSM緩衝液中の1:5~1:100(プロテオリポソーム:緩衝液(v:v))を希釈するプロテオリポソーム(ここでは1:20)。
- 20-30 sまたは10 sのための3回の超音波処理プロテオリポソームは、必要に応じて超音波処理の間に氷の上に置きます。ここでは45kHzで水浴超音波処理器を使用しました。
- 希釈した超音波処理されたプロテオリポソームサンプルの5~10 μLをセンサーの表面に触れずに塗布します。
- 2,000 ~ 3,000 x gの速度を使用して 30 分間 RT でソリューションを使用してチップを遠心分離します。
注:フラットボトム付き50 mLチューブを使用してください。ピンセットを使用してセンサーチップを直立して慎重に配置します。6ウェルプレートとプレートホルダー付き遠心分離機も使用できます。 - 同じ日にセンサーチップを使用してください。
3. 溶質輸送の測定:飽和状態の決定
注:原理証明として、これらの実験は、上記のプロトコルに従ってリポソームで再構成された細菌コリントランスポーターを使用して行った。ナノボディによる阻害の測定の前に基質コリンの飽和状態を決定するステップバイステップのプロセスがここに示されている。
- 非アクティブ化 SSM バッファーの 1-2 L を準備します。
注:すべての測定を通して、すべてのアクティブ化バッファと非アクティブ化バッファに対して、同じSSMバッファストックを準備し、使用します。 - 10個のクリーンチューブを取り、それぞれに非活性化SSMバッファの10 mLを転送します。
- ステップ3.2から、予想される半極濃度(ここでは15、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.005、0.001 mMのコリン)を使用して、ステップ3.2からチューブに基板を追加し、SSMバッファーを活性化する準備を行います。希釈を避けるために高濃度のストックを使用してください。
- SSM マシンの電源を入れます。
- SSM ソフトウェアを起動し、マシンを自動的に初期化します。データの保存パスを設定し、[OK]ボタンを押して確認します。ワークフローオプションで標準の初期クリーニング プロトコルを選択し、[実行( Run)]をクリックします。
- プロテオリポソームの被覆チップをソケットに取り付け、腕を動かしてチップをロックし、キャップでマウントしたチップを閉じます。
- ワークフロー内のプログラム CapCom を選択し、 実行して導 電率とキャパシタンスを決定します。導電率が5nS以下で、容量が15~35nFの間であることを確認してから、測定に使用してください。
注:3 mmチップを使用する場合、15~35 nFの容量値と5 nS未満のコンダクタンスをお勧めします。 - 活性化ソリューションをバイアルに移し、プローブサンプラーにバッファーを配置します。
- 非活性化バッファーをリザーバに移し、右側のリザーバーの位置にあるチップホルダーの隣に置きます。
- 非アクティブ化 (B)、アクティブ化 (A)、非アクティブ化 (B) ソリューション (B-A-B シーケンス) のシーケンスと、3 つの測定を実行し、ステップ 3.3 で準備されたすべての 10 個のバッファーの次のアクティブ化バッファーに移動するループを使用して、ワークフロー用のプロトコルを作成します。B-A-B シーケンスに 1 s - 1 s - 1 s の流量を使用して、200 μL/s のデフォルトの流量を使用します。[ 再生 ] をクリックして、測定を開始します。
注: 一般的な実験は、非アクティブ化 (B)、アクティブ化 (A)、非アクティブ化 (B) ソリューションの順次フローで構成されます (B-A-B として記述され、 図 1Aを参照)。センサー上の固定化されたプロテオリポソームは、溶液で洗浄されます。したがって、B-A溶液交換は基質濃度勾配を生成し、電気原性輸送反応を駆動する。 - プロトコルを保存し、再生ボタンをクリックしてワークフローを実行させます。同じタイプの実験を行うが、タンパク質を含まないリポソームを使用する。これは、バックグラウンド電流の強度を示すため、非常に重要です。これは、プロテオリポソームで測定した電気起源輸送のデータを分析する際に考慮すべきである(図1C)。
- データ分析に任意の優先ソフトウェアを使用して、測定電流対時間をプロットします。ピーク電流を手動で読み出すか、ソフトウェアを使用する場合は、活性バッファの追加の範囲でピーク高さの推定に関数を使用します。
- 基板濃度に対してピーク電流をプロットし、非線形回帰を介して基板のEC50を決定する(図1B、C)。ピーク電流が最大値に達した最も低い濃度を読み出し、この濃度は飽和状態に対応する。
注:固定化されたままのプロテオリポソームの数は、チップからチップまで異なると考えてください。この変動は、同一の測定条件でのピーク電流が異なる振幅を示すため明らかです。したがって、異なるチップ調製物間で測定を比較する前に、各チップで行われる測定値の現在の振幅を別々に正規化する必要があります。
4. 阻害性および非阻害性ナノボディの連続分類
注: このセクションは、細菌コリントランスポーターに特異的に結合するナノボディの存在下でコリン輸送を測定する方法を示しています。.ナノボディの存在下でのピーク電流が小さい場合は、輸送阻害を示す。非阻害性ナノボディは、基質輸送に影響を与えない、すなわち、ピーク電流信号の減少無し。
- 非アクティブ化 SSM バッファーの 1-2 L を準備します。
- 非活性化SSMバッファーの50 mLをクリーンチューブに移します。5 mM(飽和状態)の最終濃度に基質コリンを追加します。これは、正のコントロール測定に使用します。
- 非活性化SSMバッファーの10 mLをクリーンチューブに移します。5 mM(飽和状態)の最終濃度に基質コリンを加え、500 nMの最終濃度にナネnobodyを加えます。
- 各ナナユーザーごとにステップ 4.3 を繰り返して、アクティブ化ソリューションを準備します。
注: 精製されたナノボディが SSM バッファーとは異なるバッファーに再懸濁された場合、活性化バッファーと非アクティブ化バッファーに追加するとバッファーの不一致が発生します。バッファの不一致は、ノイズが高くなる可能性があるため、避けてください。精製されたナノボディのバッファーをSSMバッファーと交換すると、この問題を回避できます。さらに、飽和状態に達することを可能にするナnobody濃度を使用することが推奨される。ナノボディの結合定数は一般的に100nM以下であることを考慮すると、この実験では500nMのナノミ濃度が推奨される。しかし、最適な濃度を事前にスクリーニングすることが重要です。 - SSMマシンを起動し、ステップ3.4-3.7に記載されているように、プロテオリポソーム被覆チップの容量と導電率を測定します。
- ナ誰もせずに活性化溶液をバイアルに移し、プローブサンプラーにバッファを入れます。ナ誰もせずに非活性化バッファーをリザーバに移し、プローブサンプラーに置きます。
- ナノボディを含む活性化溶液をバイアルに移し、プローブサンプラーにバッファーを配置します。ナノボディを含む非活性化バッファーをバイアルに移し、プローブサンプラーにバッファーを配置します。
- 非アクティブ化 (B)、アクティブ化 (A)、非アクティブ化 (B) ソリューション (B-A-B シーケンス) のシーケンスを使用して、ワークフローのプロトコルを作成します。
- ナノーのないバッファを使用したB-A-Bシーケンスの3つの測定、ナnobodyを含むバッファを含むB-A-B配列の2つの測定値、ナnobodyとのインキュベーションのための120 s遅延時間、そしてナnobodyを含むバッファを含むB-A-B配列の3つの測定を行うループを作成します。
- ワークフローを保存し、[ 再生 ] ボタンをクリックしてワークフローを実行します。
注:このワークフローは、非活性化(B)を使用してB-A-Bプロトコルを3回実行し、nanobodyなしでバッファ(A)を活性化することによって、阻害することなく輸送の初期状態を測定します(図1B、C)、ナノボディを含む非活性化および活性化活性化バッファでB-A-Bプロトコルを5回実行して輸送に対するnanobody効果を測定します(2AA).第2次結合動態は、ナノボディとそれらの標的タンパク質の相互作用を決定する。したがって、ナノボディがチップ上のプロテオリポソーム中のトランスポーターに結合するのに十分な時間を与えるために、B-Aステップで時間遅延を使用することが重要である。最適な時間はナナnobody濃度すなわち、より低い濃度で長い時間が必要とされる。最初の2つの測定は、新しい条件にシステムを適応させるために必要とされ、2番目の実行は120秒の遅延時間の後に実行されるべきです。データ分析には、次の3つの測定値のみを使用する必要があります。 - 非活性化(B)、活性化(A)、非活性化(B)溶液(B-A-B配列)のシーケンスと5つの測定のループを使用して、可逆的に結合されたナノユーザーを洗い流すために、ワークフロー用の新しいプロトコルを作成します。
注:必要に応じて、ナノボディと遅い運動との解離を可能にするインキュベーションステップを含めます。 - ワークフローを保存し、[ 再生 ] ボタンをクリックしてワークフローを実行します。
- 測定の最後のピーク電流と、ステップ4.10の初期基板のみの測定を比較します。ナナ・ノーナは正常に洗い流され、ピーク電流が初期値に達した場合は初期条件が再確立され、それ以外の場合はステップ4.12-4.13を繰り返すか、新しいチップに変更します。
- ステップ 4.6~4.13 を繰り返し、各 nanobody 画面に個別のチップを使用するか (図 2C)を使用するか、同じチップを使用して複数のナノボディを使用して繰り返します (図 2D)。
- データ分析に任意の優先ソフトウェアを使用して、測定電流対時間をプロットします。ピーク電流を手動で読み出すか、使用するソフトウェアで利用可能な場合は、活性化バッファの添加の範囲でピーク高さの推定機能を自動的に選択します。
- 前の基板のみの測定に基づいて、ナノーの存在下でピーク電流を正規化します。ヒストグラム内のピーク電流をプロットし、測定のみの基板のピーク電流を、ナノボディの存在下で測定されたピーク電流(図2C,D)と比較して、抑制性のナノボディを同定します。
注:ナノnobodyを使用して個々の実行の決定されたピーク電流の正規化は、前の測定からnanobodyの不在時のピーク電流を考慮して実行する必要があります。また、固定化されたままのプロテオリポソームの数はチップからチップまで異なるため、チップ調製物間で測定を比較する前に、各チップで行われる測定値の現在の振幅を別々に正規化することが重要です。
5. 阻害性ナノボディによるIC50 測定
注:阻害性ナノボディを同定した後、その半分の最大阻害濃度(IC50)を決定することができる。これは、一定の濃度でコリンの輸送を測定することによって行われます, 阻害nanobodyの濃度を変化させながら.
- 非アクティブ化 SSM バッファーの 1-2 L を準備します。
- 非活性化SSMバッファーの50 mLをクリーンチューブに移します。5 mM(飽和状態)の最終濃度に基質コリンを追加します。これは、ポジティブコントロールの活性化ソリューションとして使用します。
- 8つのきれいな管を取り、それぞれに非活性化溶液の5 mLを加えます。5 mM(飽和状態)の最終濃度に基質コリンを追加します。期待されるIC50 範囲の濃度でチューブに阻害nanobodyを加える(ここでは500 nM - 1 nM)。
- 8つのきれいな管を取り、それぞれに非活性化溶液の10 mLを加えます。ステップ5.3と同じ濃度で各チューブに阻害nanobodyを個別に加えます。これは、非アクティブ化バッファーに対応します。
注:これは、同じ阻害nanobodyの異なる濃度で一連の活性化および非活性化バッファペアを生成します。 - SSMのセットアップを開始し、ステップ3.4-3.7で説明したように、プロテオリポソーム被覆チップの容量と導電率を測定します。
- ナネラなしで活性化溶液をバイアルに移し、プローブサンプラーに入れる。ナ誰もせずに非活性化バッファーをリザーバーに移し、右側のチップホルダーの隣のリザーバーの位置に置きます。
- ナノボディを含む活性化溶液をバイアルに移し、プローブサンプラーにバッファーを配置します。ナノボディを含む非活性化バッファーをバイアルに移し、プローブサンプラーにバッファーを配置します。
- 非アクティブ化 (B)、アクティブ化 (A)、非アクティブ化 (B) ソリューション (B-A-B シーケンス) のシーケンスを使用して、ワークフローのプロトコルを作成します。各濃度を2回測定するループを含み、120sのインキュベートを行い、さらに3回測定する。このワークフローは、基質のみの正の制御から始まり、その後にナナnobodyの最低濃度が続きます。各ナナnobody測定は、次のより高いナノーナ濃度に移動する前に、最初のピーク振幅を復元するために、基板のみで正のコントロールのその後の測定が続きます。
注:2次動態はナノボディの結合を指示する。したがって、B-Aステップで時間遅延を使用することが重要である。最適な時間はナナnobody濃度に依存します すなわち、より低い濃度では長い時間が必要です。ここで120 sは満足のいく結果と共に使用された。 - データ分析に任意の優先ソフトウェアを使用して、測定電流対時間をプロットします。ピーク電流を手動で読み出すか、ソフトウェアを使用する場合は、活性化バッファの添加範囲でピーク高さの推定機能を選択します(図3A)。ナノミの濃度に対してピーク電流をプロットし、非線形回帰を介してIC50を決定する(図3B)。
注:異なるチップ準備間で測定値を比較する前に、個々のチップに対して実行される測定値の現在の振幅を正規化します。
6. センサーのクリーニング
- 10mLの蒸留水で使用後、シングルセンサーチップをリンスします。
- ティッシュペーパーでチップをタップして乾かします。
- チップのセンサーキャビティに100 μLの純粋なイソプロパノールを充填し、RTで10分間インキュベートします。
- 綿棒を純粋なイソプロパノールに入れ、1〜3分間インキュベートします。
- あらかじめ浸した綿棒を使用し、残留物を取り除くために圧力なしでセンサーの表面で穏やかに回転させます。
- 5 mLの純粋なイソプロパノールでセンサーをすすい。
- 10 mLの蒸留水でセンサーをすすい。
- ティッシュのチップをタップしてセンサーを乾かします。
- センサーをRTで一晩乾燥させ、乾燥した条件下でRTで保管します。
メモ:センサーは、クリーニングと保管が適切に行われると、最大4~5回再利用できます。
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Representative Results
SSMベースの電気生理学は、電気系トランスポーターの特性評価に広く使用されています。ここで紹介するプロトコルでは、SSMベースの電気生理学を用いて、阻害性および非阻害特性に基づいて、二次輸送体(ここでは細菌コリンシンポーター)を標的とするナノボディを分類する方法を示す。この手法の最も有用な機能の 1 つは、複数のバッファー条件のハイスループットスクリーニングが可能です。この特定の特性は、結合剤の選択後に数十から数十のナノボディを構成することができるnanobodyライブラリの分析に有益である。標準的な実験では、安定した脂質単層をセンサーチップ上に組み立てます。コリントランスポーターを含むプロテオリポソーム製剤を適用した後、実験の成功に不可欠であるとして良好な導電性および容量性のチェックが行われる。高ノイズのバックグラウンド電流により容易に観察される実験中に膜の完全性が損なわれた場合、低雑音状態の回復が難しいため、新しいチップへの変更が推奨されます。一般に、異なるチップを使用する場合、ナノボディによる輸送と阻害の測定の間で非常に良好な再現性を観察しました。
ナノボディのスクリーニング中に使用される基質濃度について決定するために、電気原性輸送は、EC50を決定するために、まず異なる基質濃度で測定した(図1B、C)。飽和状態に対応する基質濃度を選択した(図1C)。この基質濃度は、次いで、すべての活性化緩衝液において一定に保たれた。この特定の例では、5 mMコリンを選択しました。
ナノボディのスクリーニングのために、nanobodyは非活性化および活性化緩衝液の両方に加えなければならない。ナノボディを活性化緩衝液のみに添加した場合、電気原性輸送の阻害を観察することはできなかった。これは、チップ上のトランスポーター集団における全てのナノnobody結合部位の不完全な占領によるものと推測し、それによって非活性化条件におけるナノボディとの事前インキュベーションの重要性を明らかにする。すべてのサイトが占有される可能性を確実にするために、最初の非アクティブ化バッファステップの適用中に時間遅延ステップが含まれ、トランスポーター集団上のnanobody結合部位の飽和を可能にする。2~60分のインキュベーション時間を再現可能な結果で試験しました。インキュベーションの最適な時間は、ナネグマ結合剤の性質と実験中のその濃度(チップ上のプロテオリポソーム中のトランスポーターの濃度)に依存することに注意してください。したがって、異なるインキュベーション時間を試してみるのが推奨されます。いずれにしても、経験則として、ナナのいずれ濃度が低いほど、必要なインキュベーション時間が長くなる。異なるナノボディについて2分、20分、30分、60分のインキュベーション時間を試験しましたが、それ以上の輸送阻害は検出されませんでした。
電気原性輸送に対する抑制性ナノボディの効果は、ピーク電流の振幅の減少から可視化される(図2A、C、D)。一方、非阻害性ナノボディは、ピーク電流に影響を与えない。ナノボディの結合解除を可能にする洗浄プロトコルを実行した後、初期ピーク電流振幅の80〜95%の回復が観察された(図2A、C、D)。我々は同様の実験を行ったが、トランスポータータンパク質のないリポソームの存在下で。非活性状態から活性化条件に変化する場合、これらのバッファーに存在するナノボディによって有意なアーティファクト電流は導入されなかった(図2B)。ピーク電流の変化がアーティファクトから生じるかどうかを知ることが重要であるため、この制御実験を実行することをお勧めします。
阻害特性を有するナノボディを選択した後、個々のナノボディについてIC50値を決定した(図3A,B)。この特定の実験では、ナノボディの低濃度から始めて、アッセイ中に高濃度に向かって移動することが推奨されます。各濃度の阻害の計算は、ナネnobodyの適用前後で測定されたピーク電流を比較することによって行った。ナノボディの表面への非特異的結合を避けるために、低ナノミ濃度を使用する場合に特に問題となり得る、50μg/mLのウシ血清アルブミンをバッファーに添加したKermaniらら37と同様のプロトコルに従うことをお勧めします。この目的のためにTweenやTritonなどの洗剤を添加することは、脂質膜を溶解するので避けるべきです。
図1:SSMベースの電気生理学(A)過渡電流測定プロトコル。非アクティブ化ソリューションは、アクティブ化ソリューションに置き換えられ、その後に非アクティブ化ソリューションのフローが初期状態を復元します。最初のステップの間に、ナノボディはトランスポーターに結合する。活性化溶液に切り替えるとき、基質勾配は電気原性輸送(オレンジ曲線)を駆動する。阻害性ナノーの存在下では、ピーク電流は小さい振幅(青曲線)を示す。プロトコルを終了し、nanobody(洗浄)せずに溶液を実行した後、ナノボディの結合解除が起こる。概略では、再構成されたタンパク質(青)を有するプロテオリポソームは、SSMセンサーに固定化されている。三角形と赤丸はそれぞれナノボディと基板を表します。(B)ナノボディの不在時の電気起源コリン輸送。活性状態で測定されたピーク電流は、異なる基質濃度について示されている。(C)異なる基質濃度でのトランスポータータンパク質の不在時の活性化条件の流れの代表的な測定。(D)基質濃度対ピーク電流振幅のプロット。EC50は95±11μMコリンであった。誤差範囲は標準偏差を示します(n =3生物学的複製、n=3技術的反復)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:阻害および非阻害性ナノボディのスクリーニングと分類. 活性状態中に測定されたピーク電流は、ナネフ(青)の存在下、抑制性ナnobody(赤)の存在下、およびナネNOBODY非結合(緑色)の後に示される。(B)トランスポータータンパク質の存在しない状態での活性化中の電流の測定。痕跡は、ナノ誰の不在時(青)、阻害nanobody(緑)の存在下、および非阻害nanobody(赤)の存在下での記録を示す。(C,D)ナノボディの存在下での活性状態およびnanobody非結合(回復)後の活性状態で測定されたピーク電流を示すヒストグラム。パネルCは、ナノー1人当たりの個々のチップを用いた測定結果を示す。パネルDは、1チップを使用したシリアル測定の結果を示す。ナノボディはNbとして示されます.エラーバーは標準偏差を示します(n = 3生物学的複製、n = 2技術的反復)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 阻害性ナノーのIC50の測定(A)ナネクナーによる電気起源コリン輸送と阻害。活性状態で測定されたピーク電流は、異なるナナnobody濃度について示されている。(B)阻害性nanobodyを用いる逐次測定からのピーク電流振幅とナナnobody濃度のプロット。IC50は18±2nMと判定した。誤差範囲は標準偏差を示します(n =3生物学的複製、n=3技術的反復)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで提示される技術は、電気原性輸送体を標的とする抑制性および非阻害性を有するナノボディを分類する。基質輸送の評価は、プロテオリポソームの膜に埋め込まれたトランスポーターを介した電荷の移動の検出に可能である。実験のセットアップ中の重要なステップのいくつかは、リポソームにおける活性タンパク質の再構成、SSMチップ上の安定した単層の調製、および結合されたナノnobody分子を除去するための洗浄プロトコルの適用後の初期状態の回復である。膜タンパク質が適切な脂質対タンパク質比で再構成されると、一般的なSSMプロトコルを天然基質を用いて確立することができる。プロテオリポソームを使用して測定した電流から差し引く必要があるノイズ電流を明らかにするために、タンパク質フリーリポソームを用いて制御実験を行うことが重要です。しかし、ノイズ電流が大きすぎる場合は、異なる脂質を使用してタンパク質の再構成を試みるか、これらの有害なシグナルを最小限に抑えるバッファ条件をスクリーニングすることをお勧めします。SSMアッセイの条件を正常に確立した後、ナノボディのスクリーニングを行うことができます。ナノボディのスクリーニングを速くするのに役立つ非常に有用なオプションは、単一のSSMセンサーチップを使用してハイスループットアッセイを実行することです。これにより、チップとバッファの操作時間が短縮され、コストが削減されます。しかし、この種のアッセイ中に複数のナノボディが順次塗布されるため、測定後に適用されたnanobodyを確実に洗い流すことができるようにすることが重要です。ナノの不在時にピーク電流振幅の低下が検出された場合に、一部のナノボディをアンバインドするために、厳格な洗浄サイクルを実装する必要があります。ここで説明する洗浄条件を出発点として使用することをお勧めします。洗浄量を増やしても、サイクル数が役に立たない場合は、個々のチップを使用して各ナユーザーを別々にスクリーニングする必要があります。ここで調べたすべての場合において、ナノボディの結合は可逆的であり、高スループットプロトコルを適用することができた。実験では、ナノボディによる測定後の初期ピーク電流の全振幅を回復できませんでした(図1A;図 2C,D.しかし、ほとんどの場合、回復したピーク電流の大きさは、ナノボディを適用する前に測定した振幅の80~95%の範囲であった(図2C、D)。これは、チップに付着したプロテオリポソームの一部を洗い流した結果、またはいくつかの阻害性ナノボディの結合解除の遅い運動論、またはその両方の組み合わせによる結果である可能性があると推測する。いずれの場合も、電気起源の輸送が測定可能であったとして、さらなるナノボディをアッテリングし続けることは可能であった。この例を図2Dに示し、1つのチップ調製物を用いて6つのナノボディをスクリーニングしました。
ハイスループット特性は、提示される方法の最も重要な進歩の1つです。さらに、他のアプローチとは対照的に、この方法は標識された基質が利用できない電気原性のトランスポーターを標的とする抑制性ナノボディの選択を可能にする。阻害性ナノボディの迅速な同定は、ナノボディの新しい薬物としての応用を特定することを目的とした研究をスピードアップするのに役立ちます。抗体治療などの同様の治療法と比較した彼らの明らかな利点は、組織や細胞にさらに伝播するのに役立つ小さなサイズから始まり、低い生産コストと高い安定性に至る多数のものである。
SSMベースの電気生理学は、膜小胞29、38における電気原性トランスポーターの特性化のために過去に使用されてきた。これらのタイプの実験は、タンパク質精製および再構成プロトコルに依存しないため有利である。我々は、膜小胞を用いて抑制性ナノボディの選択を行うことは実現可能であると推測する。これは、コストを削減し、精製タンパク質の操作を避けるのに役立ちます.
SSMベースの電気生理学は、電気起源の輸送を示す複数の膜タンパク質のnanobody阻害剤をスクリーニングする強力な技術です。SSMベースの電気生理学は、潜在的な臨床応用を有する抑制性ナノボディおよび他の抗体の選択のための重要なツールになると考えています。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。
Acknowledgments
チューリッヒ大学医学微生物学研究所のセドリック・A・J・ハッターとマルクス・A・シーガー、バーゼル大学バイオゼントルムのゴンサロ・セブレロに対し、合成ナノボディ(シボディ)の生成に協力していただきありがとうございます。ナニオン・テクノロジーズのマリア・バルトメスとアンドレ・バッツォーネの技術支援に感謝します。この研究は、スイス国立科学財団(SNSF)(PP00P3_170607とナニオン研究助成イニシアチブからC.P.)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | ----- | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
References
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