Summary
Nanobodies yapısal biyolojide önemli araçlardır ve tedavilerin gelişimi için büyük bir potansiyel oluşturur. Bununla birlikte, inhibitör özelliklere sahip nanobodies seçimi zor olabilir. Burada elektrojenik membran taşıyıcılarını hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodların sınıflandırılması için katı destekli membran (SSM) tabanlı elektrofizyolojinin kullanımını gösteriyoruz.
Abstract
Tek etki alanı antikorları (nanobodies) proteinlerin mekanistik ve yapısal çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır ve çoğu ışınlayıcılar gibi membran proteinlerinin inhibisyonuna bağlı olan klinik tedaviler geliştirmek için araç olarak muazzam bir potansiyel oluşturmaktadır. Bununla birlikte, taşıma etkinliğinin inhibisyonunu belirlemek için kullanılan yöntemlerin çoğunun yüksek verimli rutinlerde gerçekleştirilmesi zordur ve etiketli substratların kullanılabilirliğine bağlıdır, böylece büyük nanobody kütüphanelerinin taranmasını zorlaştırır. Katı destekli membran (SSM) elektrofizyolojisi, elektrojenik taşıyıcıları karakterize etmek ve taşıma kinetiğini ve inhibisyonunu ölçmek için kullanılan yüksek verimli bir yöntemdir. Burada, elektrojenik ikincil taşıyıcıyı hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodileri seçmek ve nanobodies inhibitör sabitlerini hesaplamak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin uygulanmasını gösteriyoruz. Bu teknik özellikle etiketli substratların bulunmadığı taşıyıcıları hedefleyen inhibitör nanobodies seçmek için yararlı olabilir.
Introduction
Antikorlar, antijen bağlanmasından sorumlu iki özdeş ağır zincir ve iki ışık zincirinden oluşur. Kamelyalar sadece konvansiyonel antikorlara kıyasla kognat antijenleri için benzer benzeşim gösteren ağır zincirli antikorlara sahiptir1,2. Sadece ağır zincirli antikorların tek değişken etki alanı (VHH) tam antijen bağlama potansiyelini korur ve çok kararlı olduğu gösterilmiştir1,2. Bu izole VHH molekülleri veya "nanobodies" membran proteinleri biyokimya ile ilgili çalışmalarda konsültasyonları stabilize etmek için araçlar olarakuygulanmıştır 3,4, inhibitörler olarak5,6, stabilizasyon ajanları olarak7, ve yapı belirleme için araçlar olarak8,9,10 . Nanobodies, hedefe özgü nanobodları kodlayan B hücrelerinin önceden zenginleştirilmesi ve daha sonra B hücrelerinin izolasyonu için kamelyaların bağışıklanması ve ardından nanobody kütüphanesinin klonlanması ve faj ekranı ile seçilmesi ile üretilebilir11,12,13. Nanobodies oluşturmanın alternatif bir yolu, kütüphanelerin inşasına ve faj ekranı, ribozom ekran veya maya ekranı 14 , 15,16, 17,18,19,20ile seçime dayanan in vitro seçimyöntemlerinedayanmaktadır. Bu in vitro yöntemler büyük kütüphane boyutları gerektirir, ancak hayvan bağışıklamadan kaçınmaktan yararlanır ve nispeten düşük stabiliteye sahip proteinleri hedefleyen nanobodies seçimini tercih eder.
Nanobodilerin küçük boyutu, yüksek stabilite ve çözünürlükleri, güçlü antijen benzeşimi, düşük immünojeniklik ve nispeten kolay üretim, onları terapötiklerin gelişimi için güçlü adaylar haline getirir21,22,23. Özellikle, çoklu membran proteinlerinin aktivitesini engelleyen nanobodies klinik uygulamalar için potansiyel varlıklardır5,24,25,26. Membran taşıyıcıları söz konusu olduğunda, bir nano gövdenin inhibitör aktiviteye sahip olup olmadığını değerlendirmek için, taşınan substratların ve / veya ko-substratların tespit edilmesine izin veren bir test geliştirmek gerekir. Bu tür tahliller genellikle etiketli molekülleri veya evrensel bir uygulamadan yoksun olabilecek substrata özgü algılama yöntemlerinin tasarımını içerir. Ayrıca, inhibitör nanobodies tanımlanması genellikle bağlayıcıların çok sayıda taranır gerektirir. Bu nedenle, yüksek aktarım hızı modunda kullanılabilen ve etiketli alt tabakalara dayanmayan bir yöntem bu seçim için gereklidir.
SSM tabanlı elektrofizyoloji, membranlar (örneğin, iyon bağlama/taşıma)27,28boyunca yüklerin hareketinin algılanmasını sağlayan son derece hassas, son derece zaman çözülen bir tekniktir. Bu teknik, bu proteinlerin 29 , 30 , 31 ,32, 33 ,34,35'in göreceli düşük cirosu nedeniyle diğer elektrofizyoloji tekniklerini kullanarak çalışması zor olan elektrojenik taşıyıcıları karakterize etmek için uygulanmıştır. SSM elektrofizyolojisi etiketli substratların kullanılmasını gerektirmez, yüksek verimli tarama için uygundur ve ilgi çekici taşıyıcıyı içeren proteolipozomlar veya membran vezikülleri kullanılabilir. Burada, SSM tabanlı elektrofizyolojinin ışınlayıcı hedefli nanobodies'i inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklerle sınıflandırmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz. İlke kanıtı olarak, bakteriyel kolin taşıyıcısının lipozomlara yeniden yapılandırılmasını ve ardından SSM sensörlerindeki proteolipozomların hareketsiz hale getirilmesi için ayrıntılı adımları açıklıyoruz. Daha sonra kolin taşımacılığının SSM tabanlı elektrofizyoloji ölçümlerinin nasıl gerçekleştirildiğini ve yarı maksimal etkili konsantrasyonun nasıl belirlendiğini açıklıyoruz (EC50). Daha sonra birden fazla nanobodiyleri taramak ve kolin taşıma inhibitörlerini tanımlamak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Son olarak, seçilen inhibitör nanobodilerin yarı maksimal inhibitör konsantrasyonlarının(IC 50)nasıl belirlendiğini açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Membran proteini rekonsyh
- 3 mL E. coli polar lipidleri 1 mL fosfatidylcholine ile havalandırılmış bir kaputun altında yuvarlak bir alt şişede karıştırın.
- Lipid karışımını, kloroformu çıkarmak için bir döner evaporatör ve 37 °C'de bir su banyosu kullanarak vakum altında 20 dakika kurutun. Gerekirse, azot veya argon gazı altında daha fazla kurulayın.
- 2 mM β-mercaptoethanol içeren TS tamponu (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) kullanarak lipitleri 25 mg/mL'ye yeniden biriktirin.
- 500 μL aliquots'ta aliquot lipitler, sıvı nitrojende flaş dondurma ve -80 °C'de depolayın.
- Bir adet 500 μL lipit aliquot çözün ve 2 mM β-mercaptoethanol içeren TS tamponu kullanarak 1:1'i seyreltin.
- Lipid süspansiyonunu 400 nm membran kullanarak 15 kez ekstrüde edin.
- Lipid süspansiyonu 4.4 mg/mL'lik son lipit konsantrasyonuna sahip olacak şekilde seyreltin.
- Son konsantrasyonu %0,2 olacak şekilde n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 200 rpm'de 1 saat boyunca dönmeye bırakın.
- 1:10 ile 1:100 (w:w) arasında lipid-protein oranı kullanarak saflaştırılmış proteini lipitlere ekleyin.
NOT: Oranın, substrat taşımacılığının SSM-elektrofizyoloji ölçümlerinde tespit edilen sinyalin gücüne bağlı olarak ayarlanması gerekir (aşağıya bakın). Daha büyük sinyaller elde etmek için daha küçük lipid-protein oranları kullanın. - RT'de 1 saat boyunca 200 rpm'de dönen karışımı kuluçkaya yaslayın.
- TS tamponunda önceden yıkanmış 30 mg/mL polistiren adsorbent boncuk ekleyin.
NOT: Polistiren boncukları adım adım ekleyin. - Boncuk-lipit karışımını yavaş karıştırma altında RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Boncukları çıkarmak için boncuk-lipit karışımının boncukların yerleşmesi için durmasına izin verin. Çözeltiyi yeni bir tüpe aktarın ve boncukları geride bırakın. Ayrılmış lipit karışımına 30 mg/mL taze polistiren adsorbent boncuk ekleyin.
- Karışımı yavaş karıştırma altında 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Boncukları 1.13 adımında açıklandığı gibi karışımdan ayırın ve 30 mg/ mL taze polistiren adsorbent boncuk ekleyin.
- Karışımı 4 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın.
- Boncukları adım 13'te açıklandığı gibi karışımdan ayırın ve 30 mg / mL taze polistiren adsorbent boncuk ekleyin.
- Dördüncü ve son yıkama için karışımı 4 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
- 4 °C'de 30 dakika boyunca 110.000 x g'da santrifüj.
- Peletin 2 mM β-mercaptoethanol içeren 500 μL TS tampon ile yıkayın.
- 4 °C'de 30 dakika boyunca 110.000 x g'da tekrar santrifüj.
- Peletin 2 mM β-mercaptoethanol ile TS tamponunda 25 mg/mL'lik son lipit konsantrasyonuna yeniden harcayın.
- Protein konsantrasyonunun jel veya amido siyahı bir test kullanarak tahminedin 36.
- Proteoliposomes aliquot, sıvı azot flaş dondurma ve -80 °C'de saklayın.
2. Çip hazırlama
- Tek bir sensör çipini 50-100 μL 0,5 mM 1-octadecanethiol çözeltisi (izopropanol ile yeniden kullanılır) ile doldurun.
- Rt'de 30 dakika boyunca çipi çözelti ile kuluçkaya yatırın.
- Çipi bir dokuya dokunarak tiol çözeltisini çıkarın.
- Sensörü 5 mL saf izopropanol ile 3 kez durulayın.
- Sensörü 5 mL çift damıtılmış su ile 3 kez durulayın.
- Bir kağıt mendile dokunarak sensörü kurulayın.
- 1,5 μL 7,5 μg/μL 1,2-diphytanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin uygulayın (lipitler döner evaporatörde kurutulur ve n-dekane ile yeniden depolanır).
- Hemen ardından sensörü, alt tabakayı içermeyen 50 μL aktive olmayan SSM tamponu ile doldurun. Bu, SSM tabakasının kendiliğinden oluşmasına yol açacaktır.
NOT: SSM arabelleği, düşük arka plan gürültüsüne sahip en uygun koşulları belirlemek için önceden optimize edilmelidir. Başlangıç noktası olarak 30 mM HEPES pH 7.4, 5 mM MgCl2, 140 mM NaCl içeren genel bir tampon kullanılabilir. Substratsız SSM tamponu, ölçümden önce ve sonra yıkamak için kullanılır (aktif olmayan tampon). Arabellek uyuşmazlıklarını önlemek için, alt tabakayı içeren arabelleği hazırlamak için etkinleştirilemeyen arabelleği kullanın (arabelleği etkinleştirme). Substrat, seyreltmeleri önlemek için doğrudan bir toz olarak veya yüksek konsantrasyonlu bir stoktan küçük bir hacimde eklenebilir. - RT'de 1.24.
- Proteolipozomları 1:5 ile 1:100 (proteoliposomes:buffer, (v:v)) arasında aktive olmayan SSM tamponunda seyreltin (burada 1:20).
- Sonicate proteoliposomes için 20-30 s veya 3 kez 10 s, gerekirse sonication arasında buz üzerine yerleştirme. Burada 45 kHz'de bir su banyosu sonicator kullanıldı.
- Seyreltilmiş sonik proteolipozom örneğinin 5-10 μL'lik kısmını dokunmadan sensörün yüzeyine uygulayın.
- 2.000 ila 3.000 x g arasında bir hız kullanarak rt'de çözelti ile yongaları 30 dakika santrifüj edin.
NOT: Düz tabanlı 50 mL tüpler kullanın. Sensör yongalarını cımbız kullanarak dikkatlice dik yerleştirin. 6 kuyulu plakalar ve plaka tutuculu bir santrifüj de kullanılabilir. - Sensör çiplerini aynı gün kullanın.
3. Çözünen taşımanın ölçülmesi: doygunluk koşullarının belirlenmesi
NOT: İlke kanıtı olarak, bu deneyler yukarıda açıklanan protokolün ardından lipozomlarda yeniden inşa edilen bakteriyel kolin taşıyıcı kullanılarak gerçeklendirilmiştir. Nanobodiies tarafından inhibisyon ölçümünden önce substrat kolin doygunluk koşullarını belirleme adım adım süreci burada gösterilmiştir.
- Etkinleştirilmeyen SSM tamponunun 1-2 L'sını hazırlayın.
NOT: Tüm ölçümler boyunca tüm etkinleştirme ve etkinleştirmeyen tamponlar için aynı SSM tampon stoğunu hazırlayın ve kullanın. - 10 temiz tüp alın ve her birine 10 mL aktif olmayan SSM tamponu aktarın.
- Aktif SSM tamponlarını hazırlamak için alt tabakayı 3.2 adımından itibaren, beklenen yarım maksimum konsantrasyonun etrafında bir dizi konsantrasyon kullanarak (burada 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 mM kolin) ekleyin. Seyreltmeleri önlemek için yüksek konsantrasyonda bir stok kullanın.
- SSM makinesini aç.
- SSM yazılımını başlatın ve makinenin otomatik olarak başlatılmasına izin verin. Veriler için kaydetme yolunu ayarlayın ve Tamam düğmesine basarak onaylayın. İş akışı seçeneklerinde standart İlk Temizleme İletişim Kuralı'nı seçin ve Çalıştır'ı tıklatın.
- Proteoliposome kaplamalı çipi sokete monte edin, çipi kilitlemek için kolu hareket ettinin ve monte edilen çipi kapakla kapatın.
- İş akışında CapCom programını seçin ve iletkenliği ve kapasitansı belirlemek için Çalışmasına izin verin. İletkenliğin 5 nS'nin altında olduğunu ve ölçüm için kullanmadan önce kapasitansının 15 ila 35 nF arasında olduğunu onaylayın.
NOT: 3 mm çip kullanırken üretici tarafından 15-35 nF kapasitans değeri ve 5 nS'nin altında iletkenlik önerilir. - Etkinleştirme çözümlerini şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin.
- Aktive olmayan tamponu bir rezervuara aktarın ve sağdaki rezervuar konumunda çip tutucunun yanına yerleştirin.
- Etkinleştirilmeyen (B), etkinleştirmeyen (A) ve etkinleştirilmeyen (B-A-B sırası) çözümleri ve üç ölçüm gerçekleştiren ve 3.3 adımında hazırlanan 10 arabelleğin tümü için bir sonraki etkinleştirme arabelleğine taşınan bir döngü kullanarak iş akışı için bir protokol oluşturun. B-A-B dizisi için 1 s - 1 s - 1 s akış sürelerini kullanarak 200 μL/s'de varsayılan akış hızını kullanın. Ölçümü başlatmak için Yürüt'ü tıklatın.
NOT: Tipik bir deney, aktive olmayan (B), etkinleştirme (A) ve etkinleştirilmeyen (B) çözümlerin sıralı akışından oluşur (B-A-B olarak yazılır; bkz. Şekil 1A). Sensördeki hareketsiz proteolipozomlar çözeltilerle yıkanacaktır. Bu nedenle, B-A çözelti değişimi, elektrojenik taşıma reaksiyonunu yönlendiren bir substrat konsantrasyon gradyanı oluşturur. - Protokolü kaydedin ve Yürüt düğmesine tıklayarak iş akışının çalışmasına izin verin. Aynı tür deneyi yapın, ancak protein içermeyen lipozomlar kullanarak. Bu, arka plan akımlarının yoğunluğunu göstereceği için son derece önemlidir. Proteolipozomlarla ölçülen elektrojenik taşıma verilerini analiz ederken bu dikkate alınmalıdır (Şekil 1C).
- Ölçülen akım ile zamanı çizmek için veri analizi için tercih edilen yazılımları kullanın. Tepe akımını manuel olarak okuyun veya yazılımı kullanıyorsanız, etkinleştirme arabelleği ekleme aralığında en yüksek yükseklik tahmini işlevini kullanın.
- Doğrusal olmayan regresyon yoluyla substratın EC50'sini belirlemek için pik akımını substrat konsantrasyonuna karşı çizin (Şekil 1B,C). Tepe akımının maksimum değere ulaştığı en düşük konsantrasyonu okuyun, bu konsantrasyon doygunluk koşullarına karşılık gelir.
NOT: Hareketsiz kalan proteolipozomların sayısının çipten yongaya değiştiğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu varyasyon, aynı ölçüm koşullarındaki tepe akımları farklı genlikler göstereceği için belirgindir. Bu nedenle, ölçümleri farklı talaş preparatları arasında karşılaştırmadan önce her çip üzerinde yapılan ölçümlerin mevcut genliklerini ayrı ayrı normalleştirmek gerekir.
4. Inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodların seri sınıflandırılması
NOT: Bu bölümde, özellikle bakteriyel kolin taşıyıcısına bağlanan nanobodies varlığında kolin taşımacılığının nasıl ölçülecekleri gösterdir. Nanobodilerin varlığında daha küçük tepe akımları taşıma inhibisyonunu gösterir. İnhibisyonel olmayan nanobodies substrat taşımacılığını etkilemez, yani tepe akım sinyalinin azalmasına neden olmaz.
- 1-2 L etkin olmayan SSM tamponu hazırlayın.
- Aktif olmayan SSM tamponunun 50 mL'lik kısmını temiz bir tüpe aktarın. Substrat kolinini 5 mM'lik son konsantrasyona (doygunluk koşulları) ekleyin. Pozitif kontrol ölçümü için bunu kullanın.
- Etkinleştirilmeyen SSM tamponunun 10 mL'lik kısmını temiz bir tüpe aktarın. Alt tabaka kolinini 5 mM'lik (doygunluk koşulları) son konsantrasyona ekleyin ve 500 nM'lik son konsantrasyona nanobody ekleyin.
- Etkinleştirme çözümlerini hazırlamak için her nano gövde için 4.3 adımını yineleyin.
NOT: Saflaştırılmış nanobodies SSM arabellekten farklı bir arabellekte yeniden harcanırsa, etkinleştirme ve etkinleştirmeyen arabelleklere eklenmesi arabellek uyumsuzluğuna yol açar. Yüksek gürültüye yol açabileceğinden tampon uyuşmazlığı önlenmelidir. Saflaştırılmış nanobodies tamponunun SSM tamponu ile takas edilmesi bu sorunu önlemeye yardımcı olabilir. Ayrıca, doygunluk koşullarına ulaşmayı sağlayan nanobody konsantrasyonlarının kullanılması önerilir. Nanobodilerin bağlama sabitlerinin genellikle 100 nM'nin altında olduğu göz önüne alındığında, bu deney için 500 nM'lik bir nano gövde konsantrasyonu önerilir. Bununla birlikte, optimum konsantrasyonlar için ön tarama yapmak önemlidir. - SSM makinesini çalıştırın ve proteolipozom kaplı çipin kapasitansını ve iletkenliğini 3.4-3.7 adımlarında açıklandığı gibi ölçün.
- Aktif hale getirici çözeltiyi nanobody olmadan bir şişeye aktarın ve tamponu prob örnekleyicisine yerleştirin. Aktif olmayan tamponu nanobody olmadan bir rezervuara aktarın ve prob örnekleyicisine yerleştirin.
- Nanobodies içeren aktive edici çözeltileri şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin. Nanobodies içeren aktif olmayan tamponları şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin.
- Etkinleştirilmeyen (B), etkinleştirmeyen (A) ve etkinleştirilmeyen (B) çözümler (B-A-B sırası) dizisini kullanarak iş akışı için bir protokol oluşturun.
- Aşağıdakileri gerçekleştiren bir döngü oluşturun: nanobody içermeyen tamponlar kullanarak B-A-B dizisinin üç ölçümü, nanobody içeren tamponlarla B-A-B dizisinin iki ölçümü, nanobody ile inkübasyon için 120 s gecikme süresi, daha sonra nanobody içeren tamponlarla B-A-B dizisinin 3 ölçümü.
- İş akışını kaydedin ve Yürüt düğmesini tıklatarak çalışmasına izin verin.
NOT: Bu iş akışı, B-A-B protokolünü nanobody olmadan (B) ve aktif tamponları (A) kullanarak 3 kez çalıştırarak taşımanın başlangıç koşullarını ölçecektir (Şekil 1B,C), ardından nanobodiies içeren aktif olmayan ve etkinleştirici tamponlarla B-A-B protokolünü 5 kez çalıştırarak taşıma üzerindeki nanobody etkisinin ölçülmesi (Şekil 2A ). İkinci sıra bağlayıcı kinetikler nanobodies ve hedef proteinlerinin etkileşimini belirler. Bu nedenle, nanobodilerin çip üzerindeki proteolipozomlardaki taşıyıcılara bağlanmaları için yeterli zaman vermek için B-A adımında bir zaman gecikmesi kullanmak önemlidir. Optimum süreler nanobody konsantrasyonuna bağlıdır, yani daha düşük konsantrasyonlarda daha uzun süreler gerekir. Sistemi yeni koşullara uyarlamak için ilk iki ölçüm gereklidir ve ikinci çalıştırma 120 s gecikme süresinden sonra yapılmalıdır. Veri analizi için yalnızca aşağıdaki üç ölçüm kullanılmalıdır. - Ters çevrilebilir şekilde bağlanmış nano gövdeyi yıkamak için bir dizi etkinleştirilmeyen (B), etkinleştirmeyen (A) ve etkinleştirilmeyen (B-A-B dizisi) çözümleri ve 5 ölçümden oluşan bir döngü kullanarak iş akışı için yeni bir protokol oluşturun.
NOT: İsteğe bağlı olarak, nanobodilerin yavaş kinetiklerle ayrışmasına izin vermek için bir kuluçka adımı ekleyin. - İş akışını kaydedin ve Yürüt düğmesini tıklatarak çalışmasına izin verin.
- Ölçümlerin son tepe akımını adım 4.10'daki yalnızca ilk substrat ölçümüyle karşılaştırın. Nanobody başarıyla yıkandı ve tepe akımı başlangıç değerine ulaşırsa ilk koşullar yeniden belirlendi, aksi takdirde 4.12-4.13 adımlarını tekrarlayın veya yeni bir yongaya değiştirin.
- 4.6-4.13 adımlarını tekrarlayın ve her nano gövde ekranı için ayrı yongalar kullanın (Şekil 2C) veya aynı çipi kullanarak birden fazla nanobodies ile tekrarlayın (Şekil 2D).
- Ölçülen akım ile zamanı çizmek için veri analizi için tercih edilen yazılımları kullanın. En yüksek akımı el ile okuyun veya varsa, kullanılan yazılımda, etkinleştirme arabelleği ekleme aralığında en yüksek yükseklik tahmini işlevini otomatik olarak seçin.
- Tepe akımını, önceki substrat ölçümüne bağlı olarak nano gövdenin varlığında normalleştirin. Bir histogramdaki tepe akımlarını çizin ve substrat ölçümlerinin tepe akımlarını, inhibitör nanobodies'i tanımlamak için nanobodies (Şekil 2C, D) varlığında ölçülen tepe akımlarıyla karşılaştırın.
NOT: Nanobody'nin önceki ölçümden yokluğunda pik akım göz önünde bulundurularak, nanobody ile çalıştırılan her bir bireyin belirlenen tepe akımlarının normalleştirilmesi yapılmalıdır. Ayrıca, hareketsiz kalan proteolipozomların sayısı çipten yongaya değiştiğinden, ölçümleri farklı talaş preparatları arasında karşılaştırmadan önce her çipte yapılan ölçümlerin mevcut genliklerini ayrı ayrı normalleştirmek önemlidir.
5. inhibitör nanobodies ileIC 50 ölçümü
NOT: inhibitör nanobodileri tanımladıktan sonra, yarı maksimal inhibitör konsantrasyonlarını belirlemek mümkündür (IC50). Bu, kolinlerin sabit konsantrasyonda taşınmasının ölçülmesi ve inhibitör nano gövdenin konsantrasyonlarının değişmesiyle yapılır.
- Etkinleştirilmeyen SSM tamponunun 1-2 L'sını hazırlayın.
- Aktif olmayan SSM tamponunun 50 mL'lik kısmını temiz bir tüpe aktarın. Substrat kolinini 5 mM'lik son konsantrasyona (doygunluk koşulları) ekleyin. Pozitif kontrol için etkinleştirici çözüm olarak bunu kullanın.
- 8 temiz tüp alın ve her birine 5 mL aktive olmayan çözelti ekleyin. Substrat kolinini 5 mM'lik son konsantrasyona (doygunluk koşulları) ekleyin. Inhibitör nano gövdeyi beklenen IC50 aralığındaki konsantrasyonlarda tüplere ekleyin (burada 500 nM - 1 nM).
- 8 temiz tüp alın ve her birine 10 mL aktive olmayan çözelti ekleyin. Her tüpe ayrı ayrı 5.3 adımında olduğu gibi aynı konsantrasyonda inhibitör nanobody ekleyin. Bu, etkinleştirilmeyen arabelleğe karşılık gelir.
NOT: Bu, aynı inhibitör nano gövdenin farklı konsantrasyonlarında bir dizi aktive edici ve aktive olmayan tampon çifti üretecektir. - SSM kurulumunu başlatın ve proteolipozom kaplı çipin kapasitansını ve iletkenliğini 3.4-3.7 adımlarında açıklandığı gibi ölçün.
- Aktif hale getirici çözeltiyi nanobody olmadan bir şişeye aktarın ve prob örnekleyicisine yerleştirin. Aktif olmayan tamponu nanobody olmadan bir rezervuara aktarın ve sağdaki talaş tutucunun yanındaki rezervuar konumuna yerleştirin.
- Nanobodies içeren aktive edici çözeltileri şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin. Nanobodies içeren aktif olmayan tamponları şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin.
- Etkinleştirilmeyen (B), etkinleştirmeyen (A) ve etkinleştirilmeyen (B) çözümler (B-A-B sırası) dizisini kullanarak iş akışı için bir protokol oluşturun. Her konsantrasyonu 2 kez ölçmek, 120 s kuluçkaya yatırmak ve 3 kez daha ölçmek için bir döngü ekleyin. İş akışı, yalnızca substratın pozitif kontrolü ve ardından nano gövdenin en düşük konsantrasyonu ile başlayacaktır. Her nano gövde ölçümü, bir sonraki daha yüksek nano gövde konsantrasyonuna geçmeden önce, ilk tepe genliğini geri yüklemek için pozitif kontrolün sadece substratla daha sonra ölçüleceği şekilde takip edilecektir.
NOT: İkinci sıra kinetik nanobodies bağlamasını belirler. Bu nedenle, B-A adımında bir zaman gecikmesi kullanmak önemlidir. Optimum süreler nanobody konsantrasyonuna bağlıdır, yani daha düşük konsantrasyonlarda daha uzun süreler gereklidir; burada tatmin edici sonuçlarla 120 s kullanıldı. - Ölçülen akım ile zamanı çizmek için veri analizi için tercih edilen yazılımları kullanın. Tepe akımını manuel olarak okuyun veya yazılım kullanıyorsanız, etkinleştirme arabelleği ekleme aralığındaki tepe yüksekliği tahmini işlevini seçin (Şekil 3A). Doğrusal olmayan regresyon yoluyla IC50'yi belirlemek için pik akımları nanobody konsantrasyonuna karşı çizin (Şekil 3B).
NOT: Ölçümleri farklı talaş preparatları arasında karşılaştırmadan önce her bir çip için gerçekleştirilen ölçümlerin mevcut genliklerini normalleştirin.
6. Sensörlerin temizlenmesi
- Tek sensör yongalarını 10 mL damıtılmış su ile kullandıktan sonra durulayın.
- Çipi bir kağıt mendile dokunarak kurulayın.
- Çipin sensör boşluğunu 100 μL saf izopropanol ile doldurun ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Saf izopropanol içine bir pamuklu çubuk yerleştirin ve 1-3 dakika kuluçkaya yatırın.
- Önceden sulanmış pamuklu çubukları kullanın ve kalıntıları gidermek için sensörün yüzeyinde basınç olmadan hafifçe döndürün.
- Sensörü 5 mL saf izopropanol ile durulayın.
- Sensörü 10 mL damıtılmış su ile durulayın.
- Çipi bir dokuya dokunarak sensörü kurutun.
- Sensörün RT'de bir gecede kurumasına izin verin ve kuru koşullar altında RT'de saklayın.
NOT: Sensörler temizlendiğinde ve düzgün depolandığında 4-5 kata kadar yeniden kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SSM tabanlı elektrofizyoloji, elektrojenik taşıyıcıların karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada sunulan protokolde, sekonder bir taşıyıcıyı (burada bakteriyel kolin symporter) hedefleyen nanobodileri inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklerine göre sınıflandırmak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu tekniğin en kullanışlı özelliklerinden biri, birden çok arabellek koşulunun yüksek verimli taranmasına izin veriyor olmasıdır. Bu özel özellik, bağlayıcıların seçiminden sonra birkaç ila düzinelerce nanobodies oluşturulabilen nanobody kütüphanelerinin analizi için faydalıdır. Standart bir deneyde, kararlı bir lipid monolayer bir sensör çipi üzerine monte edilir. Kolin taşıyıcıyı içeren proteoliposomes preparatını uyguladıktan sonra, deneyin başarısı için gerekli olduğu için iyi iletkenlik ve kapasitans kontrolü yapılır. Yüksek gürültü arka plan akımları nedeniyle kolayca gözlenen bir deney sırasında zarın bütünlüğünün tehlikeye atılması durumunda, düşük gürültü koşullarının kurtarılması oldukça zor olduğu için yeni bir çipe geçilme önerilir. Genel olarak, farklı çipler kullanırken nanobodies tarafından taşıma ve inhibisyon ölçümleri arasında çok iyi tekrarlanabilirlik gözlemledik.
Nanobodilerin taranması sırasında kullanılacak substrat konsantrasyonu hakkında karar vermek için, elektrojenik taşıma ilk olarak EC50'yi belirlemek için farklı substrat konsantrasyonları altında ölçüldü (Şekil 1B,C). Doygunluk koşullarına karşılık gelen bir substrat konsantrasyonu seçildi (Şekil 1C). Bu substrat konsantrasyonu daha sonra tüm aktif tamponlarda sabit tutuldu. Bu özel örnek için 5 mM kolin seçtik.
Nanobodilerin taranması için, nano gövde hem aktive olmayan hem de aktive edici tamponlara eklenmelidir. Nanobodies sadece aktive tampona eklendiğinde, elektrojenik taşımanın inhibisyonunu gözlemlemek mümkün değildi. Bunun, çip üzerindeki taşıyıcı popülasyonundaki tüm nanobody bağlama alanlarının tamamlanmamış bir şekilde işgal edilmesi ve böylece aktive olmayan koşullarda nanobodies ile ön inkübasyonun önemini ortaya koyan bir meslekten kaynaklandığını tahmin ediyoruz. Tüm sitelerin işgal edilebilmesini sağlamak için, taşıyıcı popülasyonu üzerindeki nanobody bağlama sitelerinin doygunluğuna izin vermek için ilk etkinleştirilmeyen tampon adımının uygulanması sırasında bir zaman gecikmesi adımı dahil edildi. 2-60 dk arasında değişen kuluçka süreleri tekrarlanabilir sonuçlarla test edilmiştir. En uygun kuluçka sürelerinin nanobody bağlayıcının doğasına ve deney sırasındaki konsantrasyonuna (ayrıca çip üzerindeki proteolipozomlarda taşıyıcı konsantrasyonuna) bağlı olduğunu unutmayın. Bu nedenle, farklı kuluçka sürelerini denemeniz önerilir. Her durumda, bir kural olarak, nanobody konsantrasyonu ne kadar düşük olursa, kuluçka süresi o kadar uzun sürer. Farklı nanobodies için 2 dakika, 20 dk, 30 dk ve 60 dakikalık kuluçka sürelerini test ettik, ancak daha fazla taşıma inhibisyonu tespit etmedik.
İnhibitör nanobodilerin elektrojenik taşıma üzerindeki etkisi, tepe akımları genliklerinin azalmasından görselleştirilir (Şekil 2A, C,D). Öte yandan, inhibitör olmayan nanobodies, tepe akımlarını etkilemez. Nanobodies unbinding izin vermek için yıkama protokolü çalıştırdıktan sonra, ilk tepe akım genliğinin% 80 ila 95 bir geri kazanım gözlenmiştir(Şekil 2A, C, D). Benzer bir deney yaptık, ancak ışınlayıcı proteini olmayan lipozomların varlığında. Etkinleştirilmeyen koşullardan etkinleştirme koşullarına geçildiğinde, bu tamponlarda bulunan nanobodies tarafından önemli bir yapı akımı uygulanmamıştır (Şekil 2B). Tepe akımlarındaki değişikliklerin yapıtlardan kaynaklanıp kaynaklanmadığını bilmek önemli olduğundan, bu denetim deneyinin çalıştırılıyor olması önerilir.
inhibitör özelliklere sahip nanobodilerin seçiminden sonra, bireysel nanobodies içinIC 50 değerlerini belirledik (Şekil 3A, B). Bu özel deney için, düşük konsantrasyonlu nanobodies ile başlamanız ve daha sonra test sırasında yüksek konsantrasyona doğru hareket etmeniz önerilir. Her konsantrasyon için inhibisyonun hesaplanması daha sonra nanobody uygulamasından önce ve sonra ölçülen tepe akımları karşılaştırılarak gerçekleştirildi. Nanobodilerin yüzeylere spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için, özellikle düşük nanobody konsantrasyonları kullanırken sorunlu olabilen, Kermani ve ark.37tarafından açıklanan benzer bir protokole uyulması tavsiye edilir , burada tamponlara 50 μg / mL sığır serum albümini eklendi ve bu zararlı etkiyi önledi. Bu amaçla Tween veya Triton gibi deterjanların eklenmesinden kaçınılmalıdır, çünkü bunlar lipid zarlarını çözecektir.
Şekil 1: SSM tabanlı elektrofizyoloji. (A) Geçici akım ölçümü için protokol. Etkinleştirilmeyen bir çözüm, etkinleştirmeyen bir çözümle değiştirilir ve ardından ilk koşulları geri yüklemek için etkinleştirilemeyen çözümün akışı yapılır. İlk adım sırasında, nanobodies ışınlayıcıya bağlanır. Aktive edici çözeltiye geçerken, substrat gradyanı elektrojenik taşımayı (turuncu eğri) yönlendirir. İnhibitör bir nano gövdenin varlığında, tepe akımı daha küçük bir genlik (mavi eğri) gösterir. Protokolü bitirdikten ve nanobody (yıkama) olmadan çözeltileri çalıştırdıktan sonra, nanobodies'in bağını kesme meydana gelir. Şemada, yeniden inşa edilmiş protein (mavi) içeren proteolipozomlar SSM sensöründe hareketsiz hale getirilir. Üçgenler ve kırmızı daireler sırasıyla nanobodies ve substratı temsil eder. (B) Nanobodilerin yokluğunda elektrojenik kolin taşınması. Etkinleştirme koşulları sırasında ölçülen tepe akımları farklı substrat konsantrasyonları için gösterilir. (C) Farklı substrat konsantrasyonlarında taşıyıcı proteinin yokluğunda aktif koşullar sırasında akımların temsili ölçümü. (D) Substrat konsantrasyonu ve tepe akımları genliği çizimi. EC50 95 ± 11 μM kolin olarak belirlendi. Hata çubukları standart sapmayı gösterir (n=3 biyolojik çoğaltma, n=3 teknik yineleme). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İnhibitör ve inhibitör olmayan nanobodilerin taranması ve sınıflandırılması. (A) Nanobody varlığında elektrojenik kolin taşınması. Etkinleştirme koşulları sırasında ölçülen tepe akımları nanobody (mavi), inhibitör bir nanobody (kırmızı) varlığında ve nano gövdenin bağını açtıktan sonra (yeşil) gösterilir. (B) Işınlayıcı proteinin yokluğunda aktif koşullar sırasında akımların ölçümü. İzler, nanobody 'nin yokluğunda (mavi), inhibitör bir nanobody (yeşil) varlığında ve inhibitör olmayan bir nanobody (kırmızı) varlığında kayıtları gösterir. (C,D). Nanobodilerin varlığında ve nano gövdenin bağını açtıktan sonra (iyileşme) aktifleştirme koşulları sırasında ölçülen tepe akımlarını gösteren histogramlar. Panel C, nano gövde başına ayrı yongalar kullanarak ölçümlerin sonuçlarını gösterir. Panel D, bir çip kullanarak seri ölçümden elde edilen sonuçları gösterir. Nanobodies Nb olarak belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İnhibitör nano gövdeninIC 50 tayini. (A) Elektrojenik kolin taşınması ve bir nanobody tarafından inhibisyon. Etkinleştirme koşulları sırasında ölçülen tepe akımları farklı nanobody konsantrasyonları için gösterilir. (B) İnhibitör nanobody ile seri bir ölçümden tepe akımları genliği vs nanobody konsantrasyonunun arsası. BelirlenenIC 50 18 ± 2 nM idi. Hata çubukları standart sapmayı gösterir (n=3 biyolojik çoğaltma, n=3 teknik çoğaltma). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan teknik, elektrojenik taşıyıcıları hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklere sahip nanobodları sınıflandırır. Substrat taşımacılığının değerlendirilmesi, proteolipozomların zarlarına gömülü taşıyıcı aracılığıyla yüklerin hareketinin tespit edilmesi nedeniyle mümkündür. Bir deneyin kurulumu sırasındaki kritik adımlardan bazıları, lipozomlardaki aktif proteinin yeniden uzlaştırılması, SSM yongalarında kararlı monolayerlerin hazırlanması ve bağlı nanobody moleküllerini çıkarmak için yıkama protokolünün uygulanmasından sonra ilk koşulların geri kazanılmasıdır. Membran proteini uygun bir lipid-protein oranında yeniden oluşturulduktan sonra, yerel substrat kullanılarak genel bir SSM protokolü oluşturulabilir. Proteolipozomlar kullanılarak ölçülen akımlardan çıkarılması gereken gürültü akımlarını ortaya çıkarmak için protein içermeyen lipozomlar kullanarak kontrol deneyleri yapmak çok önemlidir. Bununla birlikte, gürültü akımları çok büyükse, farklı lipitler kullanarak protein rekonsesi denemenizi veya bu zararlı sinyalleri en aza indiren tampon koşulları taramanızı öneririz. Bir SSM tahlil koşulları başarıyla belirlendikten sonra, nanobodilerin taranabilir. Nanobodies'in daha hızlı taranmasını sağlayan çok kullanışlı bir seçenek, tek bir SSM sensör çipi kullanarak yüksek verimli tahliller yapmaktır. Bu, talaşların ve tamponların manipülasyon süresini azaltır ve maliyetleri azaltır. Bununla birlikte, bu tür bir test sırasında birden fazla nanobodisi sırayla uygulandığından, uygulanan nano gövdenin ölçümden sonra yıkanabilmesini sağlamak önemlidir. Nanobody yokluğunda azaltılmış tepe akım genliklerinin tespit edilmesi durumunda bazı nanobodies'in bağını kesmek için sıkı bir yıkama döngüsü uygulanması gerekebilir. Başlangıç noktası olarak, burada açıklanan yıkama koşullarını kullanmanızı öneririz. Yıkama hacmini veya döngü sayısını artırmak yardımcı olmazsa, her nano gövdeyi ayrı ayrı taramak için ayrı yongaların kullanılması gerekir. Burada incelenen tüm olgularda nanobodilerin bağlanması geri döndürülebilir ve yüksek verimli bir protokol uygulanabilirdi. Deneysel kurulumumuzda nanobodies ile yapılan ölçümlerden sonra ilk tepe akımının tam genliğini kurtaramadık (Şekil 1A; Şekil 2C,D). Bununla birlikte, çoğu durumda, geri kazanılan tepe akımlarının büyüklüğü nanobodiies uygulanmadan önce ölçülen genliklerin% 80 ila% 95'i arasında değişmektedir (Şek. 2C, D). Bunun çipe yapışmış proteolipozomların bir kısmını yıkamanın veya bazı inhibitör nanobodların bağını kaldırmanın yavaş kinetiği veya her ikisinin bir kombinasyonunun bir sonucu olabileceğini tahmin ediyoruz. Her iki durumda da, elektrojenik taşıma ölçülebilir olduğu için daha fazla nanobodiye test etmeye devam etmek mümkündü. Bu şekil 2D, tek bir çip hazırlığı kullanarak altı nanobodiies taradık.
Yüksek aktarım hızı özelliği, sunulan yöntemin en önemli ilerlemelerinden biridir. Ek olarak, diğer yaklaşımların aksine, bu yöntem etiketli substratların bulunmadığı elektrojenik taşıyıcıları hedefleyen inhibitör nanobodların seçilmesine izin verir. İnhibitör nanobodilerin hızlı bir şekilde tanımlanması, nanobodilerin yeni uygulamalarını uyuşturucu olarak tanımlamayı amaçlayan araştırmayı hızlandırmaya yardımcı olabilir. Antikor tedavileri gibi benzer tedavilere kıyasla belirgin avantajları, dokulara veya hücrelere daha fazla yayılmalarına, düşük üretim maliyetlerine ve yüksek stabilitelerine daha fazla yayılmalarına yardımcı olan daha küçük bir boyuttan başlayarak çoktur.
SSM tabanlı elektrofizyoloji geçmişte membran veziküllerinde elektrojenik taşıyıcıların karakterizasyonu için kullanılmıştır29,38. Bu tür deneyler protein saflaştırma ve yeniden yapılanma protokollerine bağlı olmadıkları için avantajlıdır. Membran vezikülleri kullanarak inhibitör nanobodların seçimini gerçekleştirmenin mümkün olduğunu tahmin ediyoruz. Bu, maliyetleri azaltmaya ve saflaştırılmış proteinlerin manipülasyonlarını önlemeye yardımcı olacaktır.
SSM tabanlı elektrofizyoloji, elektrojenik taşıma sergileyen çoklu membran proteinlerinin nano gövde inhibitörlerini taramak için güçlü bir tekniktir. SSM tabanlı elektrofizyolojinin, potansiyel klinik uygulamaları olan inhibitör nanobodies ve diğer antikorların seçimi için önemli bir araç haline geleceğini öngörüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Zürih Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji Enstitüsü'nden Cedric A. J. Hutter ve Markus A. Seeger'a ve Basel Üniversitesi Biozentrum'dan Gonzalo Cebrero'ya sentetik nanobodies (siyadlar) üretimindeki işbirliği için teşekkür ederiz. Nanion Technologies'den Maria Barthmes ve Andre Bazzone'a teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF) (PP00P3_170607 ve NANION Research Grant Initiative tarafından C.P.'ye desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | ----- | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
References
- Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
- Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
- Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
- Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
- Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
- Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
- Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
- Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
- Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
- Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
- Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S.
- Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
- McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
- Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
- Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
- Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
- Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
- Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
- vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
- Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
- Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
- Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
- Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
- Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
- Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K.
- Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
- Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
- Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K.
- Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
- Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
- Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
- Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
- Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
- Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).
