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Biochemistry

Selección de nanocuerpos inhibitorios dirigidos al transportador mediante electrofisiología basada en membrana sólida soportada (SSM)

Published: May 3, 2021 doi: 10.3791/62578
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Los nanocuerpos son herramientas importantes en biología estructural y suponen un gran potencial para el desarrollo de terapias. Sin embargo, la selección de nanocuerpos con propiedades inhibitorias puede ser un desafío. Aquí demostramos el uso de electrofisiología basada en membranas sólidas soportadas (SSM) para la clasificación de nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios dirigidos a transportadores de membrana electrogénicos.

Abstract

Los anticuerpos de dominio único (nanocuerpos) se han utilizado ampliamente en estudios mecanicistas y estructurales de proteínas y representan un enorme potencial como herramientas para desarrollar terapias clínicas, muchas de las cuales dependen de la inhibición de proteínas de membrana como los transportadores. Sin embargo, la mayoría de los métodos utilizados para determinar la inhibición de la actividad de transporte son difíciles de realizar en rutinas de alto rendimiento y dependen de la disponibilidad de sustratos etiquetados, lo que complica el cribado de grandes bibliotecas de nanocuerpos. La electrofisiología de membrana sólidamente soportada (SSM) es un método de alto rendimiento, utilizado para caracterizar transportadores electrogénicos y medir su cinética e inhibición de transporte. Aquí mostramos la implementación de la electrofisiología basada en SSM para seleccionar nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios dirigidos a un transportador secundario electrogénico y para calcular constantes inhibitorias de nanocuerpos. Esta técnica puede ser especialmente útil para seleccionar nanocuerpos inhibitorios dirigidos a transportadores para los que no se dispone de sustratos marcados.

Introduction

Los anticuerpos están compuestos por dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras que son responsables de la unión del antígeno. Los camélidos tienen anticuerpos de cadena pesada que exhiben una afinidad similar por su antígeno cognado en comparación con los anticuerpos convencionales1,2. El dominio variable único (VHH) de los anticuerpos de cadena pesada solo conserva el potencial completo de unión al antígeno y se ha demostrado que es muy estable1,2. Estas moléculas aisladas de VHH o "nanocuerpos" se han implementado en estudios relacionados con la bioquímica de proteínas de membrana como herramientas para estabilizar conformaciones3,4,como inhibidores5,6,como agentes de estabilización7,y como artilugios para la determinación deestructuras 8,9,10 . Los nanocuerpos pueden generarse mediante la inmunización de camélidos para el preenriquecimiento de células B que codifican nanocuerpos específicos del objetivo y el posterior aislamiento de las células B, seguido de la clonación de la biblioteca de nanocuerpos y la selección por pantalla defagos 11,12,13. Una forma alternativa de generar nanocuerpos se basa en métodos de selección in vitro que se basan en la construcción de bibliotecas y la selección por pantalla de fagos, pantalla de ribosomas o pantalla de levadura14,15,16, 17,18,19,20. Estos métodos in vitro requieren grandes tamaños de biblioteca, pero se benefician de evitar la inmunización animal y favorecen la selección de nanocuerpos dirigidos a proteínas con una estabilidad relativamente baja.

El pequeño tamaño de los nanocuerpos, su alta estabilidad y solubilidad, su fuerte afinidad de antígenos, su baja inmunogenicidad y su producción relativamente fácil, los convierten en fuertes candidatos para el desarrollo de terapias21,22,23. En particular, los nanocuerpos que inhiben la actividad de múltiples proteínas de membrana son activos potenciales para aplicaciones clínicas5,24,25,26. En el caso de los transportadores de membrana, para evaluar si un nanocuerpo tiene actividad inhibitoria, es necesario desarrollar un ensayo que permita la detección de sustratos transportados y/o cosustratos. Tales ensayos generalmente involucran moléculas etiquetadas o el diseño de métodos de detección específicos del sustrato, que pueden carecer de una aplicación universal. Además, la identificación de nanocuerpos inhibitorios generalmente requiere la detección de un gran número de aglutinantes. Por lo tanto, un método que se pueda utilizar en un modo de alto rendimiento y que no dependa de sustratos etiquetados es esencial para esta selección.

La electrofisiología basada en SSM es una técnica extremadamente sensible y altamente resuelta en el tiempo que permite la detección del movimiento de cargas a través de membranas (por ejemplo, unión / transporte deiones) 27,28. Esta técnica se ha aplicado para caracterizar transportadores electrogénicos, que son difíciles de estudiar utilizando otras técnicas de electrofisiología debido al relativo bajo recambio de estas proteínas29,30,31,32,33,34,35. La electrofisiología SSM no requiere el uso de sustratos etiquetados, es adecuada para el cribado de alto rendimiento y se pueden utilizar proteoliposomas o vesículas de membrana que contengan el transportador de interés. Aquí, demostramos que la electrofisiología basada en SSM se puede utilizar para clasificar nanocuerpos dirigidos al transportador con propiedades inhibitorias y no inhibitorias. Como prueba de principio, describimos la reconstitución de un transportador bacteriano de colina en liposomas, seguido de pasos detallados para la inmovilización de proteoliposomas en los sensores SSM. A continuación, describimos cómo realizar mediciones electrofisiológicas basadas en SSM del transporte de colina y cómo determinar la concentración efectiva medio máxima (EC50). Luego mostramos cómo usar la electrofisiología basada en SSM para detectar múltiples nanocuerpos e identificar inhibidores del transporte de colina. Finalmente, describimos cómo determinar las concentraciones inhibitorias medias máximas (IC50)de nanocuerpos inhibitorios seleccionados.

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Protocol

1. Reconstitución de proteínas de membrana

  1. Mezcle 3 ml de lípidos polares de E. coli con 1 ml de fosfatidilcolina en un matraz de fondo redondo debajo de una capucha ventilada.
  2. Seque la mezcla de lípidos durante 20 minutos al vacío utilizando un evaporador rotativo y un baño de agua a 37 °C para eliminar el cloroformo. Si es necesario, seque aún más bajo nitrógeno o gas argón.
  3. Utilizando tampón TS (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) que contiene 2 mM β-mercaptoetanol, resuspend lípidos a 25 mg/mL.
  4. Lípidos alícuotas en alícuotas de 500 μL, congelación instantánea en nitrógeno líquido y almacenamiento a -80 °C.
  5. Descongelar una alícuota de 500 μL de lípidos y diluir 1:1 utilizando un tampón TS que contenga 2 mM β-mercaptoetanol.
  6. Extruir la suspensión lipídica 15 veces utilizando una membrana de 400 nm.
  7. Diluir la suspensión lipídica para tener una concentración final de lípidos de 4,4 mg/ml.
  8. Añadir n-dodecyl-β-D-maltósido (DDM) para tener una concentración final del 0,2% y dejarlo girar durante 1 h a 200 rpm a temperatura ambiente (RT).
  9. Agregue la proteína purificada a los lípidos utilizando una relación lípido-proteína entre 1:10 y 1:100 (w:w).
    NOTA: La relación debe ajustarse en función de la intensidad de la señal detectada en las mediciones de SSM-electrofisiología del transporte de sustrato (ver más abajo). Para obtener señales más grandes, use proporciones más pequeñas de lípidos a proteínas.
  10. Incubar la mezcla girando a 200 rpm durante 1 h en RT.
  11. Añadir 30 mg/ml de perlas adsorbentes de poliestireno, prelavadas en tampón TS.
    NOTA: Agregue perlas de poliestireno paso a paso.
  12. Incubar la mezcla de perlas-lípidos durante 30 min a RT bajo agitación lenta.
  13. Para eliminar las cuentas, deje que la mezcla de cuentas y lípidos se mantenga de pie para que las cuentas se asienten. Transfiera la solución a un tubo nuevo y deje las perlas atrás. Añadir 30 mg/ml de perlas adsorbentes de poliestireno fresco a la mezcla lipídica separada.
  14. Incubar la mezcla durante 1 h a 4 °C con agitación lenta.
  15. Separe las perlas de la mezcla como se describe en la etapa 1.13 y agregue 30 mg/ml de perlas adsorbentes de poliestireno fresco.
  16. Incubar la mezcla durante 16 h a 4 °C.
  17. Separe las perlas de la mezcla como se describe en el paso 13 y agregue 30 mg/ml de perlas adsorbentes de poliestireno fresco.
  18. Incubar la mezcla durante 2 h a 4 °C para un cuarto y último lavado.
  19. Centrifugar a 110.000 x g durante 30 min a 4 °C.
  20. Lave el pellet con 500 μL de tampón TS que contenga 2 mM β-mercaptoetanol.
  21. Centrifugar de nuevo a 110.000 x g durante 30 min a 4 °C.
  22. Resuspend el pellet a una concentración final de lípidos de 25 mg/mL en tampón TS con 2 mM β-mercaptoetanol.
  23. Estimar la concentración de proteínas utilizando un ensayo in-gel o amido negro36.
  24. Alícuota los proteoliposomas, congele en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C.

2. Preparación de chips

  1. Llene un chip de un solo sensor con 50-100 μL de solución de 1-octadecanotiol de 0,5 mM (resuspendida en isopropanol).
  2. Incubar el chip con la solución durante 30 min en RT.
  3. Retire la solución de tiol golpeando el chip en un tejido.
  4. Enjuague el sensor 3 veces con 5 ml de isopropanol puro.
  5. Enjuague el sensor 3 veces con 5 ml de agua destilada doble.
  6. Seque el sensor golpeando un papel de seda.
  7. Aplicar 1,5 μL de 7,5 μg/μL 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (lípidos secados en un evaporador rotatorio y resuspendidos en n-decano).
  8. Inmediatamente después, llene el sensor con 50 μL de tampón SSM no activador, que no contiene el sustrato. Esto conducirá a una formación espontánea de la capa SSM.
    NOTA: El búfer de SSM debe optimizarse de antemano para determinar las condiciones óptimas que tienen bajo ruido de fondo. Un búfer general que contiene 30 mM HEPES pH 7.4, 5 mM MgCl2, 140 mM NaCl, se puede utilizar como punto de partida. El tampón SSM sin el sustrato se utiliza para el lavado antes y después de la medición (tampón no activador). Para evitar la falta de coincidencia del búfer, utilice el búfer que no activa para preparar el búfer que contiene el sustrato (búfer de activación). El sustrato se puede agregar directamente como polvo o en un pequeño volumen a partir de un stock de alta concentración para evitar diluciones.
  9. Descongele los proteoliposomas a partir del paso 1.24 en RT.
  10. Diluir los proteoliposomas entre 1:5 y 1:100 (proteoliposomas:buffer, (v:v)) en el buffer SSM no activador (aquí 1:20).
  11. Sonicate proteoliposomas durante 20-30 s o 3 veces durante 10 s, colocándolos en hielo entre sonicación, si es necesario. Aquí se utilizó un sonicador de baño de agua a 45 kHz.
  12. Aplique 5-10 μL de la muestra de proteoliposomas sonicados diluidos en la superficie del sensor sin tocarlo.
  13. Centrifugar los chips con la solución en RT durante 30 min utilizando una velocidad entre 2.000 y 3.000 x g.
    NOTA: Utilice tubos de 50 ml con un fondo plano. Coloque cuidadosamente los chips del sensor en posición vertical con pinzas. También se pueden usar placas de 6 pocillos y una centrífuga con un soporte para placas.
  14. Utilice los chips del sensor el mismo día.

3. Medición del transporte de solutos: determinación de las condiciones de saturación

NOTA: Como prueba de principio, estos experimentos se realizaron utilizando un transportador de colina bacteriana reconstituido en liposomas siguiendo el protocolo descrito anteriormente. El proceso paso a paso de determinar las condiciones de saturación del sustrato colina antes de la medición de la inhibición por nanocuerpos se muestra aquí.

  1. Prepare 1-2 L del búfer de SSM que no activa.
    NOTA: Prepare y utilice el mismo material de búfer de SSM para todos los búferes activadores y no activadores en todas las mediciones.
  2. Tome 10 tubos limpios y transfiera 10 ml del búfer SSM no activador a cada uno.
  3. Agregue el sustrato en los tubos a partir del paso 3.2 utilizando una serie de concentraciones alrededor de la media concentración máxima esperada (aquí 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 mM de colina) para preparar los tampones SSM activadores. Utilice un caldo de alta concentración para evitar diluciones.
  4. Encienda la máquina SSM.
  5. Inicie el software de SSM y deje que la máquina se inicialice automáticamente. Establezca la ruta de guardado de los datos y confirme presionando el botón Aceptar. Seleccione el protocolo de limpieza inicial estándar en las opciones de flujo de trabajo y haga clic en Ejecutar.
  6. Monte el chip recubierto de proteoliposoma en el zócalo, mueva el brazo para bloquear el chip y cierre el chip montado con la tapa.
  7. Seleccione el programa CapCom en el flujo de trabajo y déjelo ejecutar para determinar la conductividad y la capacitancia. Confirme que la conductividad está por debajo de 5 nS y la capacitancia está entre 15 y 35 nF antes de usarla para la medición.
    NOTA: El fabricante recomienda un valor de capacitancia de 15-35 nF y una conductancia inferior a 5 nS cuando se utiliza un chip de 3 mm.
  8. Transfiera las soluciones de activación a viales y coloque los tampones en el muestreador de sonda.
  9. Transfiera el amortiguador no activador a un depósito y colóquelo junto al soporte del chip en la posición del depósito a la derecha.
  10. Cree un protocolo para el flujo de trabajo utilizando una secuencia de soluciones no activantes (B), activantes (A) y no activadoras (B) (secuencia B-A-B) y un bucle que realice tres mediciones y se mueva al siguiente búfer de activación para los 10 búferes preparados en el paso 3.3. Utilice el caudal predeterminado a 200 μL/s utilizando tiempos de flujo de 1 s - 1 s - 1 s para la secuencia B-A-B. Haga clic en Reproducir para iniciar la medición.
    NOTA: Un experimento típico consiste en el flujo secuencial de soluciones no activantes (B), activantes (A) y no activadoras (B) (escritas como B-A-B; ver Figura 1A). Los proteoliposomas inmovilizados en el sensor se lavarán con las soluciones. Por lo tanto, el intercambio de solución B-A genera un gradiente de concentración de sustrato, que impulsa la reacción de transporte electrogénico.
  11. Guarde el protocolo y deje que el flujo de trabajo se ejecute haciendo clic en el botón Reproducir. Realizar el mismo tipo de experimento pero utilizando liposomas libres de proteínas. Esto es muy importante ya que mostraría la intensidad de las corrientes de fondo. Esto debe tenerse en cuenta al analizar los datos de transporte electrogénico medido con proteoliposomas(Figura 1C).
  12. Utilice cualquier software preferido para el análisis de datos para trazar la corriente medida frente al tiempo. Lea la corriente máxima manualmente, o si usa el software, use la función para la estimación de la altura máxima en el rango de la adición del búfer de activación.
  13. Trazar la corriente máxima contra la concentración de sustrato para determinar la EC50 del sustrato a través de la regresión no lineal (Figura 1B,C). Lea la concentración más baja a la que la corriente máxima alcanza un valor máximo, esta concentración corresponde a condiciones de saturación.
    NOTA: Es importante considerar que el número de proteoliposomas que permanecen inmovilizados varía de un chip a otro. Esta variación es evidente ya que las corrientes máximas en condiciones de medición idénticas mostrarán diferentes amplitudes. Por lo tanto, es necesario normalizar las amplitudes actuales de las mediciones realizadas en cada chip por separado antes de comparar las mediciones entre diferentes preparaciones de chips.

4. Clasificación seriada de nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios

NOTA: Esta sección muestra cómo medir el transporte de colina en presencia de nanocuerpos que se unen específicamente al transportador bacteriano de colina. Corrientes máximas más pequeñas en presencia de nanocuerpos indican inhibición del transporte. Los nanocuerpos no inhibitorios no afectarán el transporte de sustrato, es decir, no disminuirán la señal de corriente máxima.

  1. Prepare 1-2 L de búfer de SSM que no se active.
  2. Transfiera 50 ml del búfer SSM no activador a un tubo limpio. Añadir el sustrato colina a una concentración final de 5 mM (condiciones de saturación). Use esto para una medición de control positivo.
  3. Transfiera 10 ml del búfer SSM no activador a un tubo limpio. Agregue la colina de sustrato a una concentración final de 5 mM (condiciones de saturación) y agregue nanocuerpo a una concentración final de 500 nM.
  4. Repita el paso 4.3 para cada nanocuerpo para preparar las soluciones de activación.
    NOTA: Si los nanocuerpos purificados se resuspenden en un búfer diferente al búfer SSM, su adición a los búferes activadores y no activadores dará lugar a un desajuste del búfer. Se debe evitar un desajuste del búfer, ya que puede provocar un alto nivel de ruido. El intercambio del búfer de los nanocuerpos purificados con el búfer SSM puede ayudar a evitar este problema. Además, se recomienda utilizar concentraciones de nanocuerpos que permitan alcanzar condiciones de saturación. Teniendo en cuenta que las constantes de unión de los nanocuerpos son generalmente inferiores a 100 nM, se recomienda una concentración de nanocuerpos de 500 nM para este experimento. Sin embargo, es importante preseleccionar para detectar concentraciones óptimas.
  5. Inicie la máquina SSM y mida la capacitancia y la conductividad de la viruta recubierta de proteoliposoma como se describe en los pasos 3.4-3.7.
  6. Transfiera la solución activadora sin un nanocuerpo a un vial y coloque el tampón en el muestreador de la sonda. Transfiera el búfer no activador sin un nanocuerpo a un depósito y colóquelo en el muestreador de la sonda.
  7. Transfiera las soluciones activadoras que contienen nanocuerpos a viales y coloque los tampones en el muestreador de la sonda. Transfiera los tampones no activadores que contienen nanocuerpos a viales y coloque los tampones en el muestreador de la sonda.
  8. Cree un protocolo para el flujo de trabajo utilizando una secuencia de soluciones no activantes (B), activantes (A) y no activadoras (B) (secuencia B-A-B).
  9. Cree un bucle que realice lo siguiente: tres mediciones de la secuencia B-A-B utilizando tampones sin nanocuerpo, dos mediciones de la secuencia B-A-B con búferes que contienen un nanocuerpo, un tiempo de retardo de 120 s para la incubación con el nanocuerpo, luego 3 mediciones de la secuencia B-A-B con búferes que contienen el nanocuerpo.
  10. Guarde el flujo de trabajo y deje que se ejecute haciendo clic en el botón Reproducir.
    NOTA: Este flujo de trabajo medirá las condiciones iniciales del transporte sin inhibición ejecutando el protocolo B-A-B 3 veces utilizando búferes no activadores (B) y activadores (A) sin el nanocuerpo(Figura 1B,C),seguido de la medición del efecto nanocuerpo en el transporte ejecutando el protocolo B-A-B 5 veces con los búferes no activadores y activadores que contienen nanocuerpos (Figura 2A ). La cinética de unión de segundo orden dicta la interacción de los nanocuerpos y sus proteínas diana. Por lo tanto, es importante utilizar un retraso de tiempo en el paso B-A para dar tiempo suficiente para que los nanocuerpos se unan a los transportadores en proteoliposomas en el chip. Los tiempos óptimos dependen de la concentración de nanocuerpos, es decir, a concentraciones más bajas se requieren tiempos más largos. Las dos primeras mediciones son necesarias para adaptar el sistema a las nuevas condiciones y la segunda ejecución debe realizarse después de un tiempo de retraso de 120 s. Solo se deben utilizar las siguientes tres mediciones para el análisis de datos.
  11. Cree un nuevo protocolo para el flujo de trabajo utilizando una secuencia de soluciones no activantes (B), activantes (A) y no activadoras (B) (secuencia B-A-B) y un bucle de 5 mediciones para eliminar el nanocuerpo unido reversiblemente.
    NOTA: Opcionalmente, incluya un paso de incubación para permitir la disociación de nanocuerpos con cinética lenta.
  12. Guarde el flujo de trabajo y deje que se ejecute haciendo clic en el botón Reproducir.
  13. Compare la última corriente máxima de las mediciones con la medición inicial de solo sustrato en el paso 4.10. El nanocuerpo se ha lavado con éxito y las condiciones iniciales se han restablecido si la corriente máxima alcanza el valor inicial, de lo contrario, repita los pasos 4.12-4.13 o cambie a un nuevo chip.
  14. Repita los pasos 4.6-4.13 y use chips individuales para cada pantalla de nanocuerpos(Figura 2C)o repita con múltiples nanocuerpos usando el mismo chip(Figura 2D).
  15. Utilice cualquier software preferido para el análisis de datos para trazar la corriente medida frente al tiempo. Lea la corriente máxima manualmente, o si está disponible, en el software utilizado, seleccione automáticamente la función para la estimación de la altura máxima en el rango de la adición del búfer de activación.
  16. Normalice la corriente máxima en presencia del nanocuerpo, basándose en la medición anterior de solo sustrato. Trazar las corrientes máximas en un histograma y comparar las corrientes máximas del sustrato solo mediciones con las corrientes máximas medidas en presencia de nanocuerpos(Figura 2C,D)para identificar nanocuerpos inhibitorios.
    NOTA: La normalización de las corrientes pico determinadas de cada carrera individual con un nanocuerpo debe realizarse teniendo en cuenta la corriente máxima en ausencia del nanocuerpo de la medición anterior. Además, dado que el número de proteoliposomas que permanecen inmovilizados varía de un chip a otro, es importante normalizar las amplitudes actuales de las mediciones realizadas en cada chip por separado antes de comparar las mediciones entre diferentes preparaciones de chips.

5. Medición de IC50 con nanocuerpos inhibitorios

NOTA: Después de identificar nanocuerpos inhibitorios, es posible determinar su concentración inhibitoria máxima de la mitad (IC50). Esto se hace midiendo el transporte de colina a concentración constante, mientras que las concentraciones variables del nanocuerpo inhibitorio.

  1. Prepare 1-2 L del búfer de SSM que no activa.
  2. Transfiera 50 ml del búfer SSM no activador a un tubo limpio. Añadir el sustrato colina a una concentración final de 5 mM (condiciones de saturación). Utilice esto como la solución activadora para el control positivo.
  3. Tome 8 tubos limpios y agregue 5 ml de la solución no activante en cada uno. Añadir el sustrato colina a una concentración final de 5 mM (condiciones de saturación). Agregue el nanocuerpo inhibitorio a los tubos a concentraciones en el rango esperado de IC50 (aquí 500 nM - 1 nM).
  4. Tome 8 tubos limpios y agregue 10 ml de la solución no activante en cada uno. Añadir nanocuerpos inhibitorios a cada tubo individualmente a la misma concentración que en el paso 5.3. Esto corresponde al búfer no activador.
    NOTA: Esto generará una serie de pares tampón activadores y no activadores a diferentes concentraciones del mismo nanocuerpo inhibitorio.
  5. Inicie la configuración de SSM y mida la capacitancia y la conductividad del chip recubierto de proteoliposoma como se describe en los pasos 3.4-3.7.
  6. Transfiera la solución activadora sin nanocuerpo a un vial y colóquela en el muestreador de la sonda. Transfiera el búfer no activador sin nanocuerpo a un depósito y colóquelo en la posición del depósito junto al soporte del chip a la derecha.
  7. Transfiera las soluciones activadoras que contienen nanocuerpos a viales y coloque los tampones en el muestreador de la sonda. Transfiera los tampones no activadores que contienen nanocuerpos a viales y coloque los tampones en el muestreador de la sonda.
  8. Cree un protocolo para el flujo de trabajo utilizando una secuencia de soluciones no activantes (B), activantes (A) y no activadoras (B) (secuencia B-A-B). Incluye un bucle para medir cada concentración 2 veces, incubar durante 120 s y medir 3 veces más. El flujo de trabajo comenzará con el control positivo del sustrato solo seguido de la concentración más baja del nanocuerpo. Cada medición de nanocuerpos será seguida por una medición posterior del control positivo con solo sustrato para restaurar la amplitud máxima inicial, antes de pasar a la siguiente concentración de nanocuerpos más alta.
    NOTA: La cinética de segundo orden dicta la unión de nanocuerpos. Por lo tanto, es importante utilizar un retraso de tiempo en el paso B-A. Los tiempos óptimos dependen de la concentración de nanocuerpos, es decir, a concentraciones más bajas se requieren tiempos más largos; aquí se utilizó 120 s con resultados satisfactorios.
  9. Utilice cualquier software preferido para el análisis de datos para trazar la corriente medida frente al tiempo. Lea la corriente máxima manualmente, o si usa software, seleccione la función para la estimación de la altura máxima en el rango de la adición del búfer de activación (Figura 3A). Trazar las corrientes máximas contra la concentración de nanocuerpos para determinar el CI50 a través de regresión no lineal(Figura 3B).
    NOTA: Normalice las amplitudes actuales de las mediciones realizadas para cada chip individual antes de comparar las mediciones entre diferentes preparaciones de chips.

6. Limpieza de sensores

  1. Enjuague los chips de un solo sensor después de usarlos con 10 ml de agua destilada.
  2. Seque el chip golpeándolo en un papel de seda.
  3. Llene la cavidad del sensor del chip con 100 μL de isopropanol puro e incube durante 10 minutos en RT.
  4. Coloque un hisopo de algodón en isopropanol puro e incube durante 1-3 min.
  5. Use los hisopos de algodón presocados y gire suavemente sobre la superficie del sensor sin presión para eliminar los residuos.
  6. Enjuague el sensor con 5 ml de isopropanol puro.
  7. Enjuague el sensor con 10 ml de agua destilada.
  8. Seque el sensor golpeando el chip en un pañuelo de papel.
  9. Deje que el sensor se seque durante la noche en RT y guárdelo en RT en condiciones secas.
    NOTA: Los sensores se pueden reutilizar hasta 4-5 veces cuando se limpian y almacenan correctamente.

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Representative Results

La electrofisiología basada en SSM se ha utilizado ampliamente para la caracterización de transportadores electrogénicos. En el protocolo presentado aquí, mostramos cómo utilizar la electrofisiología basada en SSM para clasificar los nanocuerpos dirigidos a un transportador secundario (aquí un simportador de colina bacteriana) en función de sus propiedades inhibitorias y no inhibitorias. Una de las características más útiles de esta técnica es que permite el cribado de alto rendimiento de múltiples condiciones de búfer. Esta característica particular es beneficiosa para el análisis de bibliotecas de nanocuerpos, que después de la selección de aglutinantes se pueden constituir de unos pocos a docenas de nanocuerpos. En un experimento estándar, se ensambla una monocapa lipídica estable en un chip sensor. Después de aplicar la preparación de proteoliposomas que contiene el transportador de colina, se realiza una verificación de buena conductividad y capacitancia, ya que esto es esencial para el éxito del experimento. En caso de que la integridad de la membrana se vea comprometida durante un experimento, que se observa fácilmente debido a las altas corrientes de fondo de ruido, se recomienda cambiar a un nuevo chip ya que recuperar las condiciones de bajo ruido es bastante difícil. En general, hemos observado muy buena reproducibilidad entre las mediciones de transporte e inhibición por nanocuerpos cuando se utilizan diferentes chips.

Para decidir sobre la concentración de sustrato que se utilizará durante un cribado de nanocuerpos, el transporte electrogénico se midió primero bajo diferentes concentraciones de sustrato para determinar EC50 (Figura 1B,C). Se seleccionó una concentración de sustrato que corresponde a condiciones de saturación (Figura 1C). Esta concentración de sustrato se mantuvo constante en todos los tampones de activación. Para este ejemplo en particular, seleccionamos 5 mM de colina.

Para el cribado de nanocuerpos, el nanocuerpo debe añadirse tanto a los tampones no activadores como a los activadores. Cuando se agregaron nanocuerpos solo al tampón de activación, no fue posible observar la inhibición del transporte electrogénico. Especulamos que esto se debe a una ocupación incompleta de todos los sitios de unión de nanocuerpos en la población transportadora en el chip, revelando así la importancia de la preincubación con nanocuerpos en condiciones no activadoras. Para garantizar que es probable que todos los sitios estén ocupados, se incluyó un paso de retraso de tiempo durante la aplicación del primer paso de amortiguación no activador para permitir la saturación de los sitios de unión de nanocuerpos en la población transportadora. Los tiempos de incubación que oscilan entre 2 y 60 min se han probado con resultados reproducibles. Tenga en cuenta que los tiempos óptimos de incubación dependen de la naturaleza del aglutinante de nanocuerpos y su concentración durante el experimento (así como de la concentración de transportador en proteoliposomas en el chip). Por lo tanto, se recomienda probar diferentes tiempos de incubación. En cualquier caso, como regla general, cuanto menor sea la concentración de nanocuerpos, mayor será el tiempo de incubación requerido. Probamos tiempos de incubación de 2 min, 20 min, 30 min y 60 min para diferentes nanocuerpos, pero no detectamos una mayor inhibición del transporte.

El efecto de los nanocuerpos inhibitorios sobre el transporte electrogénico se visualiza a partir de la disminución de las amplitudes de las corrientes máximas (Figura 2A,C, D). Los nanocuerpos no inhibitorios, por otro lado, no afectan las corrientes máximas. Después de ejecutar el protocolo de lavado para permitir la desvinculación de nanocuerpos, se observó una recuperación del 80 al 95% de la amplitud de corriente máxima inicial(Figura 2A,C, D). Hemos realizado un experimento similar pero en presencia de liposomas sin la proteína transportadora. Al cambiar de condiciones no activadoras a activadoras, no se introdujeron corrientes de artefacto significativas por los nanocuerpos presentes en estos tampones(Figura 2B). Se recomienda ejecutar este experimento de control, ya que es importante saber si los cambios en las corrientes máximas surgen de los artefactos o no.

Después de la selección de nanocuerpos con propiedades inhibitorias, determinamos los valores de IC50 para nanocuerpos individuales (Figura 3A,B). Para este experimento en particular, se recomienda comenzar con una baja concentración de nanocuerpos y luego avanzar hacia una alta concentración durante el ensayo. El cálculo de la inhibición para cada concentración se realizó comparando las corrientes máximas medidas antes y después de la aplicación de nanocuerpos. Para evitar la unión inespecífica de nanocuerpos a las superficies, que puede ser particularmente problemática cuando se utilizan concentraciones bajas de nanocuerpos, se recomienda seguir un protocolo similar al descrito por Kermani et al.37,donde se agregaron 50 μg / ml de albúmina sérica bovina a los tampones, evitando este efecto perjudicial. Se debe evitar la adición de detergentes como Tween o Triton para este propósito, ya que estos disolverían las membranas lipídicas.

Figure 1
Figura 1: Electrofisiología basada en SSM. (A) Protocolo para la medición de corrientes transitorias. Una solución no activadora se reemplaza por una solución activadora seguida del flujo de solución no activadora para restaurar las condiciones iniciales. Durante el primer paso, los nanocuerpos se unen al transportador. Al cambiar a la solución activadora, el gradiente de sustrato impulsa el transporte electrogénico (curva naranja). En presencia de un nanocuerpo inhibitorio, la corriente máxima muestra una amplitud más pequeña (curva azul). Después de terminar el protocolo y ejecutar soluciones sin nanocuerpo (lavado), se produce la desvinculación de nanocuerpos. En el esquema, los proteoliposomas con proteína reconstituida (azul) se inmovilizan en el sensor SSM. Los triángulos y los círculos rojos representan nanocuerpos y sustrato, respectivamente. (B) Transporte electrogénico de colina en ausencia de nanocuerpos. Las corrientes máximas medidas durante las condiciones de activación se muestran para diferentes concentraciones de sustrato. (C) Medición representativa de las corrientes durante las condiciones de activación en ausencia de proteína transportadora a diferentes concentraciones de sustrato. (D) Gráfica de la concentración del sustrato frente a la amplitud de las corrientes máximas. La CE50 determinada fue de 95 ± 11 μM de colina. Las barras de error indican desviación estándar (n=3 réplicas biológicas, n=3 réplicas técnicas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cribado y clasificación de nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios. (A) Transporte electrogénico de colina en presencia de un nanocuerpo. Las corrientes máximas medidas durante las condiciones de activación se muestran en ausencia de nanocuerpo (azul), en presencia de un nanocuerpo inhibitorio (rojo) y después de la desvinculación de nanocuerpos (verde). (B) Medición de corrientes durante las condiciones de activación en ausencia de proteína transportadora. Los rastros muestran grabaciones en ausencia de nanocuerpo (azul), en presencia de un nanocuerpo inhibitorio (verde) y en presencia de un nanocuerpo no inhibitorio (rojo). (C,D). Histogramas que muestran las corrientes máximas medidas durante las condiciones de activación en presencia de nanocuerpos y después de la desvinculación de nanocuerpos (recuperación). El panel C muestra los resultados de las mediciones utilizando chips individuales por nanocuerpo. El panel D muestra los resultados de una medición en serie utilizando un chip. Los nanocuerpos se indican como Nb. Las barras de error indican la desviación estándar (n = 3 réplicas biológicas, n = 2 réplicas técnicas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Determinación del CI50 de un nanocuerpo inhibitorio. (A) Transporte electrogénico de colina e inhibición por un nanocuerpo. Las corrientes máximas medidas durante las condiciones de activación se muestran para diferentes concentraciones de nanocuerpos. (B) Gráfico de la amplitud de las corrientes máximas frente a la concentración de nanocuerpos a partir de una medición en serie con un nanocuerpo inhibitorio. El CI50 determinado fue de 18 ± 2 nM. Las barras de error indican la desviación estándar (n=3 réplicas biológicas, n=3 réplicas técnicas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La técnica presentada aquí clasifica los nanocuerpos con propiedades inhibitorias y no inhibitorias dirigidas a los transportadores electrogénicos. La evaluación del transporte del sustrato es posible debido a la detección del movimiento de cargas a través del transportador incrustado en la membrana de los proteoliposomas. Algunos de los pasos críticos durante la configuración de un experimento son la reconstitución de proteínas activas en liposomas, la preparación de monocapas estables en chips SSM y la recuperación de las condiciones iniciales después de la aplicación del protocolo de lavado para eliminar las moléculas de nanocuerpos unidas. Una vez que la proteína de membrana se reconstituye en una proporción adecuada de lípidos a proteínas, se puede establecer un protocolo general de SSM utilizando el sustrato nativo. Es crucial realizar experimentos de control utilizando liposomas libres de proteínas para revelar corrientes de ruido que tendrían que restarse de las corrientes medidas utilizando proteoliposomas. Sin embargo, si las corrientes de ruido son demasiado grandes, recomendamos probar la reconstitución de proteínas utilizando diferentes lípidos, o detectar condiciones tampón que minimicen estas señales perjudiciales. Después de establecer con éxito las condiciones para un ensayo de SSM, se puede realizar la detección de nanocuerpos. Una opción muy útil que puede ayudar en la detección más rápida de nanocuerpos es realizar ensayos de alto rendimiento utilizando un solo chip de sensor SSM. Esto reduce el tiempo de manipulación de chips y buffers y reduce los costos. Sin embargo, debido a que durante este tipo de ensayo se aplican múltiples nanocuerpos secuencialmente, es importante asegurarse de que el nanocuerpo aplicado se pueda lavar después de la medición. Es posible que sea necesario implementar un ciclo de lavado estricto para desvincular algunos nanocuerpos en caso de que se detecten amplitudes de corriente máxima reducidas en ausencia de nanocuerpos. Recomendamos utilizar, como punto de partida, las condiciones de lavado aquí descritas. Si aumentar el volumen de lavado o el número de ciclos no ayuda, se deberán usar chips individuales para examinar cada nanocuerpo por separado. En todos los casos examinados aquí, la unión de nanocuerpos fue reversible y se pudo aplicar un protocolo de alto rendimiento. En nuestra configuración experimental, no pudimos recuperar la amplitud completa de la corriente máxima inicial después de las mediciones con nanocuerpos (Figura 1A; Figura 2C,D). Sin embargo, en la mayoría de los casos, la magnitud de las corrientes pico recuperadas osciló entre el 80 y el 95% de la amplitud medida antes de aplicar nanocuerpos(Fig. 2C,D). Especulamos que esto podría ser una consecuencia del lavado de una fracción de los proteoliposomas adheridos al chip, o debido a la lenta cinética de desunión de algunos nanocuerpos inhibitorios, o una combinación de ambos. En cualquier caso, todavía era posible continuar ensayando más nanocuerpos a medida que el transporte electrogénico era medible. Esto se muestra en la Figura 2D,donde examinamos seis nanocuerpos utilizando una sola preparación de chip.

La característica de alto rendimiento es uno de los avances más significativos del método presentado. Además, a diferencia de otros enfoques, este método permite la selección de nanocuerpos inhibitorios dirigidos a transportadores electrogénicos para los que no se dispone de sustratos etiquetados. Una identificación rápida de nanocuerpos inhibitorios puede ayudar a acelerar la investigación con el objetivo de identificar nuevas aplicaciones de nanocuerpos como fármacos. Sus ventajas aparentes en comparación con terapias similares como los tratamientos con anticuerpos son numerosas, comenzando con un tamaño más pequeño que les ayuda a propagarse aún más en tejidos o células, hasta sus bajos costos de producción y alta estabilidad.

La electrofisiología basada en SSM se ha utilizado en el pasado para la caracterización de transportadores electrogénicos en vesículas de membrana29,38. Este tipo de experimentos son ventajosos ya que no dependen de los protocolos de purificación y reconstitución de proteínas. Especulamos que es factible realizar la selección de nanocuerpos inhibitorios utilizando vesículas de membrana. Esto ayudaría a reducir costos y evitar manipulaciones de proteínas purificadas.

La electrofisiología basada en SSM es una técnica sólida para detectar inhibidores de nanocuerpos de proteínas de membrana múltiple que exhiben transporte electrogénico. Prevemos que la electrofisiología basada en SSM se convertirá en una herramienta importante para la selección de nanocuerpos inhibitorios y otros anticuerpos con posibles aplicaciones clínicas.

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Disclosures

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Agradecemos a Cedric A. J. Hutter y Markus A. Seeger del Instituto de Microbiología Médica de la Universidad de Zurich, y a Gonzalo Cebrero de Biozentrum de la Universidad de Basilea por su colaboración en la generación de nanocuerpos sintéticos (sybodies). Agradecemos a Maria Barthmes y Andre Bazzone de NANION Technologies por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (SNSF) (PP00P3_170607 y NANION Research Grant Initiative a C.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octadecanethiol solution Sigma Aldrich O1858-25ML
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) BioRad #152-3920
PD 10 Desalting Columns GE Healthcare GE17-0851-01
Filter 200 nm membrane Whatman Nucleopore WHA800282
2-Propanol Merck 33539-1L-R
n-Decane Sigma Aldrich 8034051000
n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) Avanti Polar Lipids 850520P-25g
Sodium Chloride AppliChem 131659.1211
(SSM setup) SURFE2R N1 Nanion -----
SURFE2R N1 Single Sensor Chips Nanion # 161001
Trizma Base Sigma Aldrich T1503
E. coli Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids 100600C
Egg PC L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C

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Bioquímica Número 171 transportador de membrana proteínas de membrana electrofisiología de membranas sólidas soportadas nanocuerpos nanocuerpos inhibitorios selección de nanocuerpos
Selección de nanocuerpos inhibitorios dirigidos al transportador mediante electrofisiología basada en membrana sólida soportada (SSM)
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Bärland, N., Perez, C. Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (171), e62578, doi:10.3791/62578 (2021).

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