Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Выбор ингибирующих нанотел, нацеленных на транспортер, с помощью электрофизиологии на основе твердой мембраны (SSM)

Published: May 3, 2021 doi: 10.3791/62578
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Нанотела являются важными инструментами в структурной биологии и представляют большой потенциал для развития методов лечения. Однако выбор нанотел с ингибирующими свойствами может быть сложным. Здесь мы демонстрируем использование электрофизиологии на основе твердой поддерживаемой мембраны (SSM) для классификации ингибирующих и неингибирующих нанотел, нацеленных на электрогенные мембранные транспортеры.

Abstract

Однодоменные антитела (нанотела) широко используются в механистических и структурных исследованиях белков, и они представляют собой огромный потенциал в качестве инструментов для разработки клинических методов лечения, многие из которых зависят от ингибирования мембранных белков, таких как транспортеры. Однако большинство методов, используемых для определения ингибирования транспортной активности, трудно выполнить в процедурах с высокой пропускной способностью и зависят от наличия меченых подложек, что усложняет скрининг больших библиотек нанотел. Электрофизиология твердой мембраны (SSM) является высокопроизводительным методом, используемым для характеристики электрогенных транспортеров и измерения их кинетики транспорта и ингибирования. Здесь мы показываем реализацию электрофизиологии на основе SSM для выбора ингибирующих и неингибирующих нанотел, нацеленных на электрогенный вторичный транспортер, и для расчета ингибирующих констант нанотел. Этот метод может быть особенно полезен для выбора ингибирующих нанотел, нацеленных на транспортеры, для которых меченые субстраты недоступны.

Introduction

Антитела состоят из двух одинаковых тяжелых цепей и двух легких цепей, которые отвечают за связывание антигена. Верблюды имеют только тяжелоцепочечные антитела, которые проявляют аналогичное сродство к их родственному антигену по сравнению с обычными антителами1,2. Однопеременный домен (VHH) антител только с тяжелой цепью сохраняет полный антигенсвязывающий потенциал и, как было показано, очень стабилен1,2. Эти изолированные молекулы VHH или «нанотела» были реализованы в исследованиях, связанных с биохимией мембранных белков, в качестве инструментов для стабилизации конформаций3,4,в качестве ингибиторов5,6,в качестве стабилизирующих агентов7и в качестве устройств для определения структуры8,9,10 . Нанотела могут быть получены путем иммунизации верблюдов для предварительного обогащения В-клеток, кодирующих целевые нанотела, и последующей изоляции В-клеток с последующим клонированием библиотеки нанотел и отбором фагового дисплея11,12,13. Альтернативный способ генерации нанотел основан на методах отбора in vitro, которые основаны на построении библиотек и выборе с помощью фагового дисплея, рибосомного дисплея или дрожжевого дисплея14,15,16,17,18,19,20. Эти методы in vitro требуют больших размеров библиотек, но выигрывают от избегания иммунизации животных и способствуют отбору нанотел, нацеленных на белки с относительно низкой стабильностью.

Небольшие размеры нанотел, их высокая стабильность и растворимость, сильное сродство антигенов, низкая иммуногенность и относительно легкая продукция, делают их сильными кандидатами для разработкитерапии 21,22,23. В частности, нанотела, ингибирующие активность множественных мембранных белков, являются потенциальными активами для клинических применений5,24,25,26. В случае мембранных транспортеров, чтобы оценить, обладает ли нанотело ингибирующей активностью, необходимо разработать анализ, который позволяет обнаруживать транспортируемые субстраты и/или сопутствующие субстраты. Такие анализы обычно включают меченые молекулы или разработку методов обнаружения, специфичных для субстрата, которые могут не иметь универсального применения. Кроме того, идентификация ингибирующих нанотел обычно требует скрининга большого количества связующих веществ. Таким образом, метод, который может быть использован в режиме высокой пропускной способности и который не полагается на меченые подложки, имеет важное значение для этого выбора.

Электрофизиология на основе SSM является чрезвычайно чувствительным методом с высоким временным разрешением, который позволяет обнаруживать движение зарядов по мембранам (например, связывание/перенос ионов)27,28. Данная методика была применена для характеристики электрогенных транспортеров, которые трудно изучить с помощью других методов электрофизиологии из-за относительно низкого оборота этих белков29,30,31,32,33,34,35. Электрофизиология SSM не требует использования меченых подложек, она подходит для высокопроизводительного скрининга, и могут использоваться либо протеолипосомы, либо мембранные везикулы, содержащие интересующий транспортер. Здесь мы демонстрируем, что электрофизиология на основе SSM может быть использована для классификации нанотел, нацеленных на транспортер, с ингибирующими и неингибирующими свойствами. В качестве доказательства принципа мы описываем восстановление бактериального холинового транспортера в липосомы с последующими подробными шагами по иммобилизации протеолипосом на датчиках SSM. Далее мы опишем, как выполнить электрофизиологические измерения переноса холина на основе SSM и как определить полумаксимальную эффективную концентрацию (EC50). Затем мы покажем, как использовать электрофизиологию на основе SSM для скрининга нескольких нанотел и идентификации ингибиторов транспорта холина. Наконец, мы описываем, как определить половину максимальных ингибирующих концентраций (IC50)выбранных ингибирующих нанотел.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Восстановление мембранного белка

  1. Смешайте 3 мл полярных липидов E. coli с 1 мл фосфатидилхолина в колбе с круглым дном под вентилируемым капюшоном.
  2. Высушите липидную смесь в течение 20 мин под вакуумом с помощью ротационного испарителя и водяной бани при 37 °C для удаления хлороформа. При необходимости высушите дополнительно под азотом или газообразным аргоном.
  3. Используя буфер TS (20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl), содержащий 2 мМ β-меркаптоэтанола, повторно суспендируют липиды до 25 мг/мл.
  4. Липиды аликвоты в 500 мкл аликвот, мгновенно замораживают в жидком азоте и хранят при -80 °C.
  5. Разморозить одну аликвоту липидов 500 мкл и разбавить 1:1 с помощью буфера TS, содержащего 2 мМ β-меркаптоэтанола.
  6. Экструдируют липидную суспензию 15 раз с помощью мембраны 400 нм.
  7. Разбавить липидную суспензию до конечной концентрации липидов 4,4 мг/мл.
  8. Добавьте n-додецил-β-D-мальтозид (DDM) с конечной концентрацией 0,2% и оставьте его вращающимся в течение 1 ч при 200 об/мин при комнатной температуре (RT).
  9. Добавьте очищенный белок к липидам, используя соотношение липидов к белку от 1:10 до 1:100 (w:w).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение необходимо регулировать в зависимости от силы сигнала, обнаруженного при SSM-электрофизиологических измерениях переноса субстрата (см. ниже). Для получения более крупных сигналов используйте меньшее соотношение липидов и белков.
  10. Инкубировать смесь, вращаясь со скоростью вращения со скоростью 200 об/мин в течение 1 ч при РТ.
  11. Добавьте 30 мг/мл шариков полистирольного адсорбента, предварительно промытых в буфере TS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте полистирольные бусины ступенчато.
  12. Инкубировать смесь шариков и липидов в течение 30 мин при РТ при медленном перемешивании.
  13. Чтобы удалить бусины, дайте смеси бисера и липидов отстоять так, чтобы бусины осели. Переложите раствор на новую трубку и оставьте бусины. Добавьте 30 мг/мл свежих шариков адсорбента полистирола в отделенную липидную смесь.
  14. Инкубировать смесь в течение 1 ч при 4 °С при медленном перемешивании.
  15. Отделите шарики от смеси, как описано на этапе 1.13, и добавьте 30 мг/мл свежих шариков адсорбента полистирола.
  16. Инкубировать смесь в течение 16 ч при 4 °C.
  17. Отделите шарики от смеси, как описано на этапе 13, и добавьте 30 мг/мл свежих шариков адсорбента из полистирола.
  18. Инкубировать смесь в течение 2 ч при 4 °C для четвертой и последней промывки.
  19. Центрифуга при 110 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
  20. Гранулу промыть 500 мкл буфера TS, содержащего 2 мМ β-меркаптоэтанола.
  21. Центрифуга снова при 110 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
  22. Повторно суспендировать гранулу до конечной липидной концентрации 25 мг/мл в буфере TS с 2 мМ β-меркаптоэтанола.
  23. Оцените концентрацию белка с помощью гелевого или амидо-черного анализа36.
  24. Аликвотирует протеолипосомы, мгновенно замораживается в жидком азоте и хранится при -80 °C.

2. Подготовка чипов

  1. Заполните один чип датчика 50-100 мкл раствора 1-октадеканетиола 0,5 мМ (повторно суспендированного в изопропаноле).
  2. Инкубируйте чип с раствором в течение 30 мин при RT.
  3. Удалите раствор тиола, постукивая чипом по ткани.
  4. Промойте датчик 3 раза 5 мл чистого изопропанола.
  5. Промойте датчик 3 раза 5 мл двойной дистиллированной воды.
  6. Высушите датчик, постукивая по папиросной бумаге.
  7. Применяют 1,5 мкл 7,5 мкг/мкл 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (липиды, высушенные во вращающемся испарителе и повторно суспендированные в н-декане).
  8. Сразу после этого заполните датчик 50 мкл неактивирующего буфера SSM, который не содержит подложки. Это приведет к спонтанному образованию слоя SSM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер SSM должен быть предварительно оптимизирован для определения оптимальных условий с низким уровнем фонового шума. В качестве отправной точки может быть использован общий буфер, содержащий 30 мМ HEPES pH7,4,5 мМ MgCl 2, 140 мМ NaCl. Буфер SSM без подложки используется для промывки до и после измерения (неактивирующий буфер). Чтобы избежать несоответствия буфера, используйте неактивирующий буфер для подготовки буфера, содержащего подложку (активирующий буфер). Подложка может быть добавлена либо непосредственно в виде порошка, либо в небольшом объеме из запаса высокой концентрации, чтобы избежать разбавлений.
  9. Оттаивание протеолипосом со стадии 1.24 при RT.
  10. Разбавляйте протеолипосомы между 1:5 и 1:100 (протеолипосомы:буфер, (v:v)) в неактивирующем буфере SSM (здесь 1:20).
  11. Ультразвуковые протеолипосомы в течение 20-30 с или 3 раза в течение 10 с, помещая на лед в перерывах между обработкой ультразвуком, если это необходимо. Здесь использовался анализатор водяной бани на частоте 45 кГц.
  12. Нанесите 5-10 мкл разбавленного ультразвуком образца протеолипосом на поверхность датчика, не прикасаясь к нему.
  13. Центрифугируйте чипы раствором на RT в течение 30 мин, используя скорость от 2000 до 3000 x g.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте трубки по 50 мл с плоским дном. Аккуратно расположите сенсорные чипы в вертикальном положении с помощью пинцета. Также могут быть использованы 6-луночные пластины и центрифуга с держателем пластины.
  14. Используйте сенсорные чипы в тот же день.

3. Измерение транспортировки растворенного вещества: определение условий насыщения

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве доказательства принципа эти эксперименты проводились с использованием бактериального переносчика холина, восстановленного в липосомах в соответствии с протоколом, описанным выше. Здесь показан пошаговый процесс определения условий насыщения холина субстрата до измерения ингибирования нанотелами.

  1. Подготовьте 1-2 л неактивирующего буфера SSM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте и используйте один и тот же буферный запас SSM для всех активирующих и неактивирующих буферов во всех измерениях.
  2. Возьмите 10 чистых пробирок и перенесите 10 мл неактивирующего буфера SSM в каждую.
  3. Добавляют субстрат в пробирки со стадии 3.2, используя ряд концентраций вокруг ожидаемой половины максимальной концентрации (здесь 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 мМ холина) для получения активирующих буферов SSM. Используйте запасы высокой концентрации, чтобы избежать разбавлений.
  4. Включите устройство SSM.
  5. Запустите программное обеспечение SSM и позвольте машине инициализироваться автоматически. Задайте путь сохранения данных и подтвердите, нажав кнопку OK. Выберите стандартный протокол начальной очистки в параметрах рабочего процесса и нажмите кнопку Выполнить.
  6. Установите чип с протеолипосомным покрытием на разъем, переместите руку, чтобы заблокировать чип, и закройте установленный чип колпачком.
  7. Выберите программу CapCom в рабочем процессе и позвольте ей запуститься для определения проводимости и емкости. Убедитесь, что проводимость ниже 5 нс, а емкость составляет от 15 до 35 нФ, прежде чем использовать ее для измерения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значение емкости 15-35 нФ и проводимость ниже 5 нС рекомендуются производителем при использовании 3-мм микросхемы.
  8. Переложите активирующие растворы во флаконы и поместите буферы в пробоотборник.
  9. Переместите неактивирующийся буфер в резервуар и расположите его рядом с держателем стружки в положении резервуара справа.
  10. Создайте протокол для рабочего процесса, используя последовательность неактивирующих (B), активирующих (A) и неактивирующих (B) решений (B-A-B) и цикл, который выполняет три измерения и переходит к следующему активирующему буферу для всех 10 буферов, подготовленных на шаге 3.3. Используйте скорость потока по умолчанию при 200 мкл/с, используя время потока 1 с - 1 с - 1 с для последовательности B-A-B. Нажмите кнопку Воспроизвести, чтобы начать измерение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный эксперимент состоит из последовательного потока неактивирующих (B), активирующих (A) и неактивирующих (B) решений (записанных как B-A-B; см. рисунок 1A). Иммобилизованные протеолипосомы на датчике будут промыты растворами. Таким образом, обмен растворами B-A генерирует градиент концентрации субстрата, который приводит в действие реакцию электрогенного переноса.
  11. Сохраните протокол и позвольте рабочему процессу запуститься, нажав кнопку Play. Проведите тот же тип эксперимента, но с использованием безбелковых липосом. Это очень важно, так как это покажет интенсивность фоновых токов. Это следует учитывать при анализе данных электрогенного переноса, измеренного с помощью протеолипосом(рисунок 1С).
  12. Используйте любое предпочтительное программное обеспечение для анализа данных, чтобы построить измеренный ток по отношению ко времени. Считывание пикового тока вручную, или, если вы используете программное обеспечение, используйте функцию для оценки пиковой высоты в диапазоне добавления активирующего буфера.
  13. Постройте пиковый ток против концентрации субстрата для определения EC50 субстрата с помощью нелинейной регрессии(рисунок 1B,C). Считывают наименьшую концентрацию, при которой пиковый ток достигает максимального значения, эта концентрация соответствует условиям насыщения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно учитывать, что количество протеолипосом, которые остаются обездвиженными, варьируется от чипа к чипу. Это изменение очевидно, поскольку пиковые токи при одинаковых условиях измерения будут показывать разные амплитуды. Поэтому необходимо нормализовать амплитуды тока измерений, выполняемых на каждом чипе отдельно, прежде чем сравнивать измерения между различными препаратами чипов.

4. Серийная классификация ингибирующих и неингибирующих нанотел

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе показано, как измерить транспорт холина в присутствии нанотел, которые связываются конкретно с бактериальным переносчиком холина. Меньшие пиковые токи в присутствии нанотел указывают на ингибирование переноса. Неингибирующие нанотела не будут влиять на транспорт подложки, т.е. не уменьшать сигнал пикового тока.

  1. Подготовьте 1-2 л неактивирующего буфера SSM.
  2. Перенесите 50 мл неактивирующего буфера SSM в чистую трубку. Добавьте подложку холина до конечной концентрации 5 мМ (условия насыщения). Используйте это для положительного контрольного измерения.
  3. Перенесите 10 мл неактивирующего буфера SSM в чистую трубку. Добавляют холин подложки к конечной концентрации 5 мМ (условия насыщения) и добавляют нанотело к конечной концентрации 500 нМ.
  4. Повторите шаг 4.3 для каждого нанотела для приготовления активирующих растворов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если очищенные нанотела повторно суспендируются в буфере, отличном от буфера SSM, их добавление к активирующим и неактивирующим буферам приведет к несоответствию буфера. Следует избегать несоответствия буфера, так как оно может привести к высокому шуму. Обмен буфером очищенных нанотел с буфером SSM может помочь избежать этой проблемы. Кроме того, рекомендуется использовать концентрации нанотел, которые позволяют достичь насыщения. Учитывая, что константы связывания нанотел обычно ниже 100 нМ, для этого эксперимента рекомендуется концентрация нанотел 500 нМ. Тем не менее, важно предварительно провести скрининг для оптимальных концентраций.
  5. Запустите машину SSM и измерьте емкость и проводимость чипа, покрытого протеолипосомой, как описано в шагах 3.4-3.7.
  6. Переложите активирующий раствор без нанотела во флакон и поместите буфер в пробоотборник зонда. Перенесите неактивирующий буфер без нанотела в резервуар и поместите его в пробоотборник зонда.
  7. Переложите активирующие растворы, содержащие нанотела, во флаконы и расположите буферы в пробоотборнике зонда. Перенесите неактивирующие буферы, содержащие нанотела, во флаконы и расположите буферы в пробоотборнике зонда.
  8. Создайте протокол для рабочего процесса, используя последовательность неактивирующих (B), активирующих (A) и неактивирующих (B) решений (B-A-B).
  9. Создайте петлю, которая выполняет следующее: три измерения последовательности B-A-B с использованием буферов без нанотела, два измерения последовательности B-A-B с буферами, содержащими нанотело, время задержки 120 с для инкубации с нанотелом, затем 3 измерения последовательности B-A-B с буферами, содержащими нанотело.
  10. Сохраните рабочий процесс и запустите его, нажав кнопку Воспроизвести.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот рабочий процесс будет измерять начальные условия переноса без ингибирования путем запуска протокола B-A-B 3 раза с использованием неактивирующих (B) и активирующих буферов (A) без нанотела(Рисунок 1B,C),с последующим измерением влияния нанотела на транспорт путем запуска протокола B-A-B 5 раз с неактивирующими и активирующими буферами, содержащими нанотела(рисунок 2A). ). Кинетика связывания второго порядка диктует взаимодействие нанотел и их белков-мишеней. Поэтому важно использовать временную задержку на стадии B-A, чтобы дать достаточно времени для связывания нанотел с транспортерами в протеолипосомах на чипе. Оптимальное время зависит от концентрации нанотела, т.е. при более низких концентрациях требуется больше времени. Первые два измерения необходимы для адаптации системы к новым условиям, а второй запуск должен быть выполнен после времени задержки в 120 с. Для анализа данных следует использовать только следующие три измерения.
  11. Создайте новый протокол для рабочего процесса, используя последовательность неактивирующих (B), активирующих (A) и неактивирующих (B) решений (B-A-B) и петлю из 5 измерений для вымывания обратимо связанного нанотела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно, включите инкубационную стадию, чтобы обеспечить диссоциацию нанотел с медленной кинетикой.
  12. Сохраните рабочий процесс и запустите его, нажав кнопку Воспроизвести.
  13. Сравните последний пиковый ток измерений с начальным измерением только подложки на шаге 4.10. Нанотело было успешно вымыто, и начальные условия были восстановлены, если пиковый ток достигает начального значения, в противном случае повторите шаги 4.12-4.13 или перейдите на новый чип.
  14. Повторите шаги 4.6-4.13 и используйте отдельные чипы для каждого экрана нанотел(рисунок 2C)или повторите с несколькими нанотелами, используя один и тот же чип(рисунок 2D).
  15. Используйте любое предпочтительное программное обеспечение для анализа данных, чтобы построить измеренный ток по отношению ко времени. Считывание пикового тока вручную или, при наличии, в используемом программном обеспечении, автоматически выбирает функцию для оценки пиковой высоты в диапазоне добавления буфера активации.
  16. Нормализуйте пиковый ток в присутствии нанотела, основываясь на предыдущем измерении только подложки. Построить пиковые токи в гистограмме и сравнить пиковые токи только измерений подложки с пиковыми токами, измеренными в присутствии нанотел(рисунок 2C,D)для идентификации тормозных нанотел.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация определенных пиковых токов каждого отдельного пробега с нанотелом должна выполняться с учетом пикового тока в отсутствие нанотела из предыдущего измерения. Кроме того, поскольку количество протеолипосом, которые остаются обездвиженными, варьируется от чипа к чипу, важно нормализовать амплитуды тока измерений, выполняемых на каждом чипе отдельно, прежде чем сравнивать измерения между различными препаратами чипа.

5. Измерение IC50 с ингибирующими нанотелами

ПРИМЕЧАНИЕ: После идентификации ингибирующих нанотел можно определить их половинную максимальную ингибирующую концентрацию (IC50). Это делается путем измерения транспорта холина в постоянной концентрации, при этом изменяются концентрации ингибирующего нанотела.

  1. Подготовьте 1-2 л неактивирующего буфера SSM.
  2. Перенесите 50 мл неактивирующего буфера SSM в чистую трубку. Добавьте подложку холина до конечной концентрации 5 мМ (условия насыщения). Используйте это в качестве активирующего решения для положительного контроля.
  3. Возьмите 8 чистых пробирок и добавьте в каждую по 5 мл неактивирующего раствора. Добавьте подложку холина до конечной концентрации 5 мМ (условия насыщения). Добавляют ингибирующее нанотело в пробирки при концентрациях в ожидаемом диапазоне IC50 (здесь 500 нМ - 1 нМ).
  4. Возьмите 8 чистых пробирок и добавьте в каждую по 10 мл неактивирующего раствора. Добавляют ингибирующее нанотело в каждую трубку по отдельности в той же концентрации, что и на стадии 5.3. Это соответствует неактивирующемуся буферу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это сгенерирует серию активирующих и неактивирующих буферных пар при разных концентрациях одного и того же ингибирующего нанотела.
  5. Запустите установку SSM и измерьте емкость и проводимость чипа, покрытого протеолипосомой, как описано в шагах 3.4-3.7.
  6. Переложите активирующий раствор без нанотела во флакон и поместите его в пробоотборник зонда. Перенесите неактивирующий буфер без нанотела в резервуар и расположите его в положении резервуара рядом с держателем чипа справа.
  7. Переложите активирующие растворы, содержащие нанотела, во флаконы и расположите буферы в пробоотборнике зонда. Перенесите неактивирующие буферы, содержащие нанотела, во флаконы и расположите буферы в пробоотборнике зонда.
  8. Создайте протокол для рабочего процесса, используя последовательность неактивирующих (B), активирующих (A) и неактивирующих (B) решений (B-A-B). Включите петлю для измерения каждой концентрации 2 раза, инкубируйте в течение 120 с и измеряйте еще 3 раза. Рабочий процесс начнется с положительного контроля только субстрата, за которым последует самая низкая концентрация нанотела. За каждым измерением нанотела последует последующее измерение положительного контроля только с подложкой для восстановления начальной пиковой амплитуды, прежде чем перейти к следующей более высокой концентрации нанотела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кинетика второго порядка диктует связывание нанотел. Поэтому важно использовать временную задержку на шаге B-A. Оптимальное время зависит от концентрации нанотела, т.е. при более низких концентрациях требуется более длительное время; здесь было использовано 120 с с удовлетворительными результатами.
  9. Используйте любое предпочтительное программное обеспечение для анализа данных, чтобы построить измеренный ток по отношению ко времени. Считывание пикового тока вручную или, если используется программное обеспечение, выберите функцию для оценки высоты пика в диапазоне добавления буфера активации(рисунок 3А). Построение пиковых токов против концентрации нанотела для определения IC50 с помощью нелинейной регрессии(рисунок 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализуйте амплитуды тока измерений, выполняемых для каждого отдельного чипа, прежде чем сравнивать измерения между различными препаратами чипов.

6. Очистка датчиков

  1. Промывайте чипы одного датчика после использования 10 мл дистиллированной воды.
  2. Высушите чип, постукивая им по папиросной бумаге.
  3. Заполните сенсорную полость чипа 100 мкл чистого изопропанола и инкубируйте в течение 10 мин при RT.
  4. Поместите ватный тампон в чистый изопропанол и инкубируйте в течение 1-3 мин.
  5. Используйте предварительно замоченные ватные тампоны и осторожно вращайте по поверхности датчика без давления, чтобы удалить остатки.
  6. Промойте датчик 5 мл чистого изопропанола.
  7. Промойте датчик 10 мл дистиллированной воды.
  8. Высушите датчик, постукивая чипом по салфетке.
  9. Дайте датчику высохнуть в течение ночи в RT и храните в RT в сухих условиях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Датчики могут быть повторно использованы до 4-5 раз при правильной очистке и хранении.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Электрофизиология на основе SSM широко используется для характеристики электрогенных транспортеров. В протоколе, представленном здесь, мы показываем, как использовать электрофизиологию на основе SSM для классификации нанотел, нацеленных на вторичный транспортер (здесь бактериальный симпортер холина), на основе их ингибирующих и неингибирующих свойств. Одной из наиболее полезных особенностей этого метода является то, что он позволяет проводить высокопроизводительный скрининг нескольких буферных условий. Эта особенность полезна для анализа библиотек нанотел, которые после подбора связующих веществ могут составлять от нескольких до десятков нанотел. В стандартном эксперименте стабильный липидный монослой собирается на чипе датчика. После применения препарата протеолипосом, содержащего холин-транспортер, проводится проверка на хорошую проводимость и емкость, так как это необходимо для успеха эксперимента. В случае, если целостность мембраны нарушена во время эксперимента, что легко наблюдается из-за высоких шумовых фоновых токов, рекомендуется переход на новый чип, так как восстановление условий низкого шума довольно сложно. В целом, мы наблюдали очень хорошую воспроизводимость среди измерений переноса и ингибирования нанотелами при использовании различных чипов.

Чтобы принять решение о концентрации субстрата, которая будет использоваться во время скрининга нанотел, электрогенный транспорт сначала измеряли при различных концентрациях субстрата для определения EC50 (рисунок 1B,C). Была выбрана концентрация субстрата, соответствующая условиям насыщения(рисунок 1С). Эта концентрация субстрата затем поддерживалась постоянной во всех активирующих буферах. Для этого конкретного примера мы выбрали холин 5 мМ.

Для скрининга нанотел нанотело должно быть добавлено как к неактивирующим, так и к активирующим буферам. Когда нанотела добавляли только к активирующему буферу, нельзя было наблюдать ингибирование электрогенного транспорта. Мы предполагаем, что это связано с неполным занятием всех сайтов связывания нанотел в популяции транспортеров на чипе, тем самым раскрывая важность предварительной инкубации с нанотелами в неактивирующих условиях. Для обеспечения того, чтобы все участки, вероятно, были заняты, во время применения первого неактивирующего буферного этапа был включен этап временной задержки, чтобы обеспечить насыщение сайтов связывания нанотел в популяции транспортера. Время инкубации в диапазоне от 2 до 60 мин было протестировано с воспроизводимыми результатами. Имейте в виду, что оптимальные сроки инкубации зависят от природы связующего нанотела и его концентрации во время эксперимента (а также концентрации транспортера в протеолипосомах на чипе). Поэтому рекомендуется попробовать разное время инкубации. В любом случае, как правило, чем ниже концентрация нанотела, тем дольше требуется время инкубации. Мы протестировали время инкубации 2 мин, 20 мин, 30 мин и 60 мин для разных нанотел, но не обнаружили дальнейшего ингибирования транспорта.

Влияние ингибирующих нанотел на электрогенный транспорт визуализируется по уменьшению амплитуд пиковых токов(рис. 2А,С,D). Неингибирующие нанотела, с другой стороны, не влияют на пиковые токи. После запуска протокола промывки, позволяющего нанотелам развязываться, наблюдалось восстановление от 80 до 95% от начальной амплитуды пикового тока(рисунок 2A,C, D). Мы провели аналогичный эксперимент, но в присутствии липосом без белка-транспортера. При переходе от неактивирующих к активирующим условиям нанотела, присутствующие в этих буферах, не вводили значимых токов артефактов(рисунок 2B). Запуск этого контрольного эксперимента рекомендуется, так как важно знать, возникают ли изменения пиковых токов из-за артефактов или нет.

После отбора нанотел с ингибирующими свойствами мы определили значения IC50 для отдельных нанотел(Рисунок 3A,B). Для этого конкретного эксперимента рекомендуется начать с низкой концентрации нанотел, а затем перейти к высокой концентрации во время анализа. Расчет ингибирования для каждой концентрации затем выполняли путем сравнения пиковых токов, измеренных до и после применения нанотела. Чтобы избежать неспецифического связывания нанотел с поверхностями, что может быть особенно проблематичным при использовании низких концентраций нанотел, рекомендуется следовать протоколу, аналогичному описанному Kermani et al.37,где 50 мкг / мл бычьего сывороточного альбумина добавляли в буферы, предотвращая этот вредный эффект. Следует избегать добавления моющих средств, таких как Tween или Triton для этой цели, поскольку они растворяют липидные мембраны.

Figure 1
Рисунок 1:Электрофизиология на основе SSM. (A) Протокол для измерения переходных токов. Неактивирующий раствор заменяют активирующим раствором, за которым следует поток неактивирующего раствора для восстановления начальных условий. На первом этапе нанотела связываются с транспортером. При переходе на активирующий раствор градиент подложки приводит в движение электрогенный транспорт (оранжевая кривая). В присутствии ингибирующего нанотела пиковый ток показывает меньшую амплитуду (синяя кривая). После завершения протокола и запуска растворов без нанотел (промывки) происходит развязывание нанотел. На схеме протеолипосомы с восстановленным белком (синий) иммобилизованы на датчике SSM. Треугольники и красные круги представляют нанотела и подложку соответственно. (B)Электрогенный холиновый транспорт в отсутствие нанотел. Пиковые токи, измеренные в условиях активации, показаны для различных концентраций субстрата. (C)Репрезентативное измерение токов в условиях активации в отсутствие белка-транспортера при различных концентрациях субстрата. (D)График концентрации субстрата в сравнении с амплитудой пиковых токов. EC50 определили 95 ± 11 мкМ холина. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение (n=3 биологические реплики, n=3 технические реплики). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Скрининг и классификация ингибирующих и неингибирующих нанотел. (А)Электрогенный холиновый транспорт в присутствии нанотела. Пиковые токи, измеренные во время условий активации, показаны при отсутствии нанотела (синий), в присутствии ингибирующего нанотела (красный) и после развязывания нанотела (зеленый). (B)Измерение токов в условиях активации при отсутствии белка-транспортера. Следы показывают записи в отсутствие нанотела (синий), в присутствии ингибирующего нанотела (зеленый) и в присутствии неингибирующего нанотела (красный). (C,D). Гистограммы, показывающие пиковые токи, измеренные во время активации условий в присутствии нанотел и после развязывания нанотел (восстановления). Панель C показывает результаты измерений с использованием отдельных чипов на нанотело. Панель D показывает результаты последовательного измерения с использованием одного чипа. Нанотела обозначаются как Nb. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение (n= 3 биологических реплики, n = 2 технических реплики). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Определение IC50 ингибирующего нанотела. (A)Электрогенный перенос и ингибирование холина нанотелом. Пиковые токи, измеренные в условиях активации, показаны для различных концентраций нанотел. (B) График амплитуды пиковых токов против концентрации нанотела из последовательного измерения с ингибирующим нанотелом. Установлен IC50 было 18 ± 2 нМ. Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение (n=3 биологических репликаций, n=3 технических реплики). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод, представленный здесь, классифицирует нанотела с ингибирующими и неингибирующими свойствами, нацеленными на электрогенные транспортеры. Оценка переноса субстрата возможна за счет обнаружения движения зарядов через транспортер, встроенный в мембрану протеолипосом. Некоторые из критических этапов во время установки эксперимента - восстановление активного белка в липосомах, получение стабильных монослоев на чипах SSM и восстановление начальных условий после применения протокола промывки для удаления связанных молекул нанотел. Как только мембранный белок восстанавливается в соответствующем соотношении липидов к белкам, общий протокол SSM может быть установлен с использованием нативного субстрата. Крайне важно проводить контрольные эксперименты с использованием безбелковых липосом для выявления шумовых токов, которые необходимо было бы вычесть из токов, измеренных с использованием протеолипосом. Однако, если шумовые токи слишком велики, мы рекомендуем попробовать восстановление белка с использованием различных липидов или экранировать буферные условия, которые минимизируют эти вредные сигналы. После успешного создания условий для анализа SSM может быть выполнен скрининг нанотел. Очень полезным вариантом, который может помочь в более быстром скрининге нанотел, является выполнение высокопроизводительных анализов с использованием одного чипа датчика SSM. Это сокращает время манипуляций с чипами и буферами и снижает затраты. Однако, поскольку во время этого типа анализа несколько нанотел применяются последовательно, важно убедиться, что нанесенное нанотело может быть смыто после измерения. Может потребоваться строгий цикл промывки для развязывания некоторых нанотел в случае, если уменьшенные пиковые амплитуды тока обнаруживаются в отсутствие нанотела. Мы рекомендуем использовать в качестве отправной точки условия стирки, описанные здесь. Если увеличение объема промывки или количества циклов не поможет, для экранирования каждого нанотела необходимо будет использовать отдельные чипы. Во всех рассмотренных здесь случаях связывание нанотел было обратимым, и можно было применять протокол с высокой пропускной способностью. В нашей экспериментальной установке мы не смогли восстановить полную амплитуду начального пикового тока после измерений с нанотелами(рисунок 1А; Рисунок 2C,D). Однако в большинстве случаев величина пиковых восстановленных токов колебалась между 80 и 95% амплитуды, измеренной до применения нанотел(рис. 2C,D). Мы предполагаем, что это может быть следствием смывания части протеолипосом, прилипших к чипу, или из-за медленной кинетики развязывания некоторых ингибирующих нанотел, или из-за комбинации обоих. В любом случае, все еще можно было продолжать анализ дальнейших нанотел, поскольку электрогенный транспорт можно было измерить. Это показано на рисунке 2D,где мы проверили шесть нанотел с помощью одного чипа.

Высокопроизводительная характеристика является одним из наиболее значительных достижений представленного метода. Кроме того, в отличие от других подходов, этот метод позволяет выбирать ингибирующие нанотела, нацеленные на электрогенные транспортеры, для которых меченые субстраты недоступны. Быстрая идентификация ингибирующих нанотел может помочь ускорить исследования, направленные на выявление новых применений нанотел в качестве лекарств. Их очевидные преимущества по сравнению с аналогичными методами лечения, такими как лечение антителами, многочисленны, начиная с меньшего размера, который помогает им распространяться дальше в ткани или клетки, до их низких производственных затрат и высокой стабильности.

Электрофизиология на основе SSM использовалась в прошлом для характеристики электрогенных транспортеров в мембранных везикулах29,38. Эти типы экспериментов являются преимуществами, поскольку они не зависят от протоколов очистки и восстановления белка. Мы предполагаем, что выполнение отбора ингибирующих нанотел с использованием мембранных везикул возможно. Это помогло бы снизить затраты и избежать манипуляций с очищенными белками.

Электрофизиология на основе SSM является сильным методом скрининга ингибиторов нанотел нескольких мембранных белков, которые проявляют электрогенный транспорт. Мы предполагаем, что электрофизиология на основе SSM станет важным инструментом для отбора ингибирующих нанотел и других антител с потенциальным клиническим применением.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Седрика А. Хуттера и Маркуса А. Сигера из Института медицинской микробиологии Цюрихского университета и Гонсало Чебреро из Biozentrum Базельского университета за сотрудничество в создании синтетических нанотел (сител). Мы благодарим Марию Бартмс и Андре Баззоне из NANION Technologies за техническую помощь. Эта работа была поддержана Швейцарским национальным научным фондом (SNSF) (PP00P3_170607 и NANION Research Grant Initiative to C.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octadecanethiol solution Sigma Aldrich O1858-25ML
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) BioRad #152-3920
PD 10 Desalting Columns GE Healthcare GE17-0851-01
Filter 200 nm membrane Whatman Nucleopore WHA800282
2-Propanol Merck 33539-1L-R
n-Decane Sigma Aldrich 8034051000
n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) Avanti Polar Lipids 850520P-25g
Sodium Chloride AppliChem 131659.1211
(SSM setup) SURFE2R N1 Nanion -----
SURFE2R N1 Single Sensor Chips Nanion # 161001
Trizma Base Sigma Aldrich T1503
E. coli Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids 100600C
Egg PC L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
  2. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  3. Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
  4. Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
  5. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
  6. Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
  7. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  8. Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
  9. Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
  10. Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
  11. Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
  12. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
  13. Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
  14. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
  15. McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
  16. Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
  17. Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
  18. Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
  19. Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
  20. Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
  21. vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
  22. Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
  23. Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
  24. Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
  25. Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
  26. Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
  27. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  28. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  29. Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
  30. Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
  31. Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
  32. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
  33. Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
  34. Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
  35. Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
  36. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
  37. Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
  38. Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).

Tags

Биохимия выпуск 171 мембранный транспортер мембранные белки электрофизиология твердо поддерживаемых мембран нанотела ингибирующие нанотела выбор нанотел
Выбор ингибирующих нанотел, нацеленных на транспортер, с помощью электрофизиологии на основе твердой мембраны (SSM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bärland, N., Perez, C.… More

Bärland, N., Perez, C. Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (171), e62578, doi:10.3791/62578 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter