Summary
Nanobodies zijn belangrijke hulpmiddelen in de structurele biologie en vormen een groot potentieel voor de ontwikkeling van therapieën. De selectie van nanobodies met remmende eigenschappen kan echter een uitdaging zijn. Hier demonstreren we het gebruik van solid-supported-membrane (SSM)-gebaseerde elektrofysiologie voor de classificatie van remmende en niet-remmende nanobodies gericht op elektrogene membraantransporters.
Abstract
Single domain antilichamen (nanobodies) zijn op grote schaal gebruikt in mechanistische en structurele studies van eiwitten en ze vormen een enorm potentieel als hulpmiddelen voor het ontwikkelen van klinische therapieën, waarvan er vele afhankelijk zijn van de remming van membraaneiwitten zoals transporters. De meeste methoden die worden gebruikt om de remming van transportactiviteit te bepalen, zijn echter moeilijk uit te voeren in routines met hoge doorvoer en zijn afhankelijk van de beschikbaarheid van gelabelde substraten, waardoor de screening van grote nanobodybibliotheken wordt bemoeilijkt. Solid-supported membrane (SSM) elektrofysiologie is een high-throughput methode, gebruikt voor het karakteriseren van elektrogene transporters en het meten van hun transportkinetiek en remming. Hier tonen we de implementatie van SSM-gebaseerde elektrofysiologie om remmende en niet-remmende nanobodies te selecteren die zich richten op een elektrogene secundaire transporter en om nanobodies remmende constanten te berekenen. Deze techniek kan vooral nuttig zijn voor het selecteren van remmende nanobodies gericht op transporters waarvoor geen gelabelde substraten beschikbaar zijn.
Introduction
Antilichamen bestaan uit twee identieke zware ketens en twee lichte ketens die verantwoordelijk zijn voor de antigeenbinding. Kameelachtigen hebben alleen antilichamen met een zware keten die vergelijkbare affiniteit vertonen voor hun verwante antigeen in vergelijking met conventionele antilichamen1,2. Het single variable domain (VHH) van heavy-chain only antilichamen behoudt de volledige antigeenbindende potentiaal en is zeer stabielgebleken 1,2. Deze geïsoleerde VHH-moleculen of "nanobodies" zijn geïmplementeerd in studies met betrekking tot de biochemie van membraaneiwitten als hulpmiddelen voor het stabiliseren van conformaties3,4,alsremmers 5,6,als stabilisatiemiddelen7en als gadgets voor structuurbepaling8,9,10 . Nanobodies kunnen worden gegenereerd door de immunisatie van kameelachtigen voor de voorverrijking van B-cellen die coderen voor doelspecifieke nanobodies en daaropvolgende isolatie van B-cellen, gevolgd door het klonen van de nanobody-bibliotheek en selectie door faagweergave11,12,13. Een alternatieve manier om nanobodies te genereren is gebaseerd op in vitro selectiemethoden die afhankelijk zijn van de constructie van bibliotheken en selectie door faagweergave, ribosoomweergave of gistweergave14,15,16,17,18,19,20. Deze in vitro methoden vereisen grote bibliotheekgroottes, maar profiteren van het vermijden van dierlijke immunisatie en geven de voorkeur aan de selectie van nanobodies gericht op eiwitten met een relatief lage stabiliteit.
De kleine omvang van nanobodies, hun hoge stabiliteit en oplosbaarheid, sterke antigeenaffiniteit, lage immunogeniciteit en relatief eenvoudige productie, maken ze sterke kandidaten voor de ontwikkeling van therapeutica21,22,23. Met name nanobodies die de activiteit van meerdere membraaneiwitten remmen, zijn potentiële activa voor klinische toepassingen5,24,25,26. In het geval van membraantransporters is het, om te evalueren of een nanolichaam remmende activiteit heeft, noodzakelijk om een test te ontwikkelen die de detectie van getransporteerde substraten en /of co-substraten mogelijk maakt. Dergelijke testen omvatten meestal gelabelde moleculen of het ontwerp van substraatspecifieke detectiemethoden, die mogelijk geen universele toepassing hebben. Bovendien vereist de identificatie van remmende nanobodies over het algemeen de screening van grote aantallen bindmiddelen. Een methode die kan worden gebruikt in een high-throughput-modus en die niet afhankelijk is van gelabelde substraten is dus essentieel voor deze selectie.
SSM-gebaseerde elektrofysiologie is een uiterst gevoelige, zeer tijd-opgeloste techniek die de detectie van beweging van ladingen over membranen (bijv. Ionbinding / transport) mogelijk maakt27,28. Deze techniek is toegepast om elektrogene transporters te karakteriseren, die moeilijk te bestuderen zijn met behulp van andere elektrofysiologische technieken vanwege de relatief lage omzet van deze eiwitten29,30,31,32,33,34,35. SSM-elektrofysiologie vereist geen gebruik van gelabelde substraten, het is geschikt voor screening met hoge doorvoer en proteoliposomen of membraanblaasjes met de transporter van belang kunnen worden gebruikt. Hier tonen we aan dat op SSM gebaseerde elektrofysiologie kan worden gebruikt om transporter-gerichte nanobodies met remmende en niet-remmende eigenschappen te classificeren. Als proof-of-principle beschrijven we de reconstitutie van een bacteriële cholinetransporter in liposomen, gevolgd door gedetailleerde stappen voor immobilisatie van proteoliposomen op de SSM-sensoren. Vervolgens beschrijven we hoe op SSM gebaseerde elektrofysiologische metingen van cholinetransport kunnen worden uitgevoerd en hoe de half-maximale effectieve concentratie kan worden bepaald (EC50). Vervolgens laten we zien hoe we op SSM gebaseerde elektrofysiologie kunnen gebruiken om meerdere nanobodies te screenen en remmers van cholinetransport te identificeren. Ten slotte beschrijven we hoe de half maximale remmende concentraties (IC50) van geselecteerde remmende nanobodies kunnen worden bepaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reconstitutie van membraaneiwitten
- Meng 3 ml E. coli polaire lipiden met 1 ml fosfatidylcholine in een ronde bodemkolf onder een geventileerde kap.
- Droog het lipidenmengsel gedurende 20 minuten onder vacuüm met behulp van een roterende verdamper en een waterbad bij 37 °C om chloroform te verwijderen. Droog indien nodig verder onder stikstof of argongas.
- Met behulp van TS-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) met 2 mM β-mercaptoethanol, resuspend lipiden tot 25 mg / ml.
- Aliquot lipiden in 500 μL aliquots, flash freeze in vloeibare stikstof, en bewaren bij -80 °C.
- Ontdooi één 500 μL aliquot lipiden en verdun 1:1 met behulp van TS-buffer met 2 mM β-mercaptoethanol.
- Extrudeer de lipidensuspensie 15 keer met behulp van een 400 nm-membraan.
- Verdun de lipidensuspensie tot een uiteindelijke lipideconcentratie van 4,4 mg / ml.
- Voeg n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) toe tot een eindconcentratie van 0,2% en laat het 1 uur draaien bij 200 tpm bij kamertemperatuur (RT).
- Voeg het gezuiverde eiwit toe aan de lipiden met behulp van een lipide-eiwitverhouding tussen 1:10 en 1:100 (w:w).
OPMERKING: De verhouding moet worden aangepast afhankelijk van de sterkte van het signaal dat wordt gedetecteerd in SSM-elektrofysiologische metingen van substraattransport (zie hieronder). Om grotere signalen te verkrijgen, gebruikt u kleinere lipide-eiwitverhoudingen. - Incubeer het mengsel draaiend bij 200 tpm gedurende 1 uur bij RT.
- Voeg 30 mg/ml polystyreen adsorberende kralen toe, voorgewassen in TS-buffer.
OPMERKING: Voeg polystyreenkralen stapsgewijs toe. - Incubeer het mengsel van kralen en lipiden gedurende 30 minuten bij RT onder langzaam roeren.
- Om de kralen te verwijderen, laat je het kralen-lipidenmengsel staan zodat de kralen bezinken. Breng de oplossing over in een nieuwe buis en laat de kralen achter. Voeg 30 mg/ml verse polystyreen adsorberende kralen toe aan het gescheiden lipidenmengsel.
- Incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 4 °C onder langzaam roeren.
- Scheid de kralen van het mengsel zoals beschreven in stap 1.13 en voeg 30 mg/ml verse polystyreenadsorberende kralen toe.
- Incubeer het mengsel gedurende 16 uur bij 4 °C.
- Scheid de kralen van het mengsel zoals beschreven in stap 13 en voeg 30 mg/ml verse polystyreenadsorberende kralen toe.
- Incubeer het mengsel gedurende 2 uur bij 4 °C voor een vierde en laatste wasbeurt.
- Centrifugeer bij 110.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Was de pellet met 500 μL TS-buffer met 2 mM β-mercaptoethanol.
- Centrifugeer opnieuw bij 110.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Resuspend de pellet tot een uiteindelijke lipideconcentratie van 25 mg/ml in TS-buffer met 2 mM β-mercaptoethanol.
- Schat de eiwitconcentratie met behulp van een in-gel of amido black assay36.
- Vul de proteoliposomen toe, vries in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
2. Chipbereiding
- Vul een enkele sensorchip met 50-100 μL van 0,5 mM 1-octadecanethioloplossing (geresuspendeerd in isopropanol).
- Incubeer de chip met de oplossing gedurende 30 minuten bij RT.
- Verwijder de thioloplossing door op de chip op een tissue te tikken.
- Spoel de sensor 3 keer af met 5 ml zuiver isopropanol.
- Spoel de sensor 3 keer af met 5 ml dubbel gedestilleerd water.
- Droog de sensor door op een tissuepapier te tikken.
- Breng 1,5 μL van 7,5 μg /μL 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine aan (lipiden gedroogd in een roterende verdamper en geresuspendeerd in n-decane).
- Vul de sensor onmiddellijk daarna met 50 μL niet-activerende SSM-buffer, die het substraat niet bevat. Dit zal leiden tot een spontane vorming van de SSM-laag.
OPMERKING: De SSM-buffer moet vooraf worden geoptimaliseerd om optimale omstandigheden met een laag achtergrondgeluid te bepalen. Een algemene buffer met 30 mM HEPES pH 7,4, 5 mM MgCl2,140 mM NaCl, kan als uitgangspunt worden gebruikt. De SSM-buffer zonder substraat wordt gebruikt voor het wassen voor en na de meting (niet-activerende buffer). Om te voorkomen dat de buffer niet overeenkomt, gebruikt u de niet-activerende buffer om de buffer met het substraat voor te bereiden (activerende buffer). Het substraat kan direct als poeder of in een klein volume uit een voorraad met hoge concentratie worden toegevoegd om verdunningen te voorkomen. - Ontdooi proteoliposomen uit stap 1.24 bij RT.
- Verdun proteoliposomen tussen 1:5 en 1:100 (proteoliposomen:buffer, (v:v)) in de niet-activerende SSM-buffer (hier 1:20).
- Soniceer proteoliposomen gedurende 20-30 s of 3 keer gedurende 10 s, indien nodig, op ijs tussen ultrasoonapparaat. Hier werd een waterbad sonicator op 45 kHz gebruikt.
- Breng 5-10 μL van het verdunde gesoniseerde proteoliposomenmonster aan op het oppervlak van de sensor zonder het aan te raken.
- Centrifugeer de chips met de oplossing bij RT gedurende 30 minuten met een snelheid tussen 2.000 en 3.000 x g.
OPMERKING: Gebruik buizen van 50 ml met een platte bodem. Plaats de sensorchips voorzichtig rechtop met een pincet. 6-well platen en een centrifuge met een platenhouder kunnen ook worden gebruikt. - Gebruik de sensorchips op dezelfde dag.
3. Meting van het vervoer van de opgeloste stof: bepaling van de verzadigingsomstandigheden
OPMERKING: Als proof-of-principle werden deze experimenten uitgevoerd met behulp van een bacteriële cholinetransporter gereconstitueerd in liposomen volgens het hierboven beschreven protocol. Het stapsgewijze proces van het bepalen van de verzadigingscondities van het substraat choline voorafgaand aan de meting van remming door nanobodies wordt hier getoond.
- Bereid 1-2 L van de niet-activerende SSM-buffer voor.
OPMERKING: Bereid dezelfde SSM-buffervoorraad voor en gebruik deze voor alle activerende en niet-activerende buffers tijdens alle metingen. - Neem 10 schone buizen en breng 10 ml van de niet-activerende SSM-buffer over in elk.
- Voeg het substraat toe aan de buizen van stap 3.2 met behulp van een reeks concentraties rond de verwachte halve maximale concentratie (hier 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 mM choline) om de activerende SSM-buffers voor te bereiden. Gebruik een voorraad met een hoge concentratie om verdunningen te voorkomen.
- Schakel de SSM-machine in.
- Start de SSM-software en laat de machine automatisch initialiseren. Stel het opslagpad voor gegevens in en bevestig door op de knop OK te drukken. Selecteer het standaard Initial Cleaning Protocol in de workflowopties en klik op Uitvoeren.
- Monteer de proteoliposome gecoate chip op de socket, beweeg de arm om de chip te vergrendelen en sluit de gemonteerde chip met de dop.
- Selecteer het programma CapCom in de workflow en laat het uitvoeren om de geleidbaarheid en capaciteit te bepalen. Controleer of de geleidbaarheid lager is dan 5 nS en de capaciteit tussen 15 en 35 nF voordat u deze voor de meting gebruikt.
OPMERKING: Een capaciteitswaarde van 15-35 nF en geleidingswaarde lager dan 5 nS worden door de fabrikant aanbevolen bij gebruik van een chip van 3 mm. - Breng de activerende oplossingen over in injectieflacons en plaats de buffers in de sondebemonsteraar.
- Breng de niet-activerende buffer over in een reservoir en plaats deze naast de spaanhouder op de reservoirpositie aan de rechterkant.
- Maak een protocol voor de workflow met behulp van een reeks niet-activerende (B), activerende (A) en niet-activerende (B)-oplossingen (B-A-B-reeks) en een lus die drie metingen uitvoert en naar de volgende activerende buffer gaat voor alle 10 buffers die zijn voorbereid in stap 3.3. Gebruik het standaarddebiet bij 200 μL/s met 1 s - 1 s - 1 s - 1 s stroomtijden voor de B-A-B-sequentie. Klik op Afspelen om de meting te starten.
OPMERKING: Een typisch experiment bestaat uit de sequentiële stroom van niet-activerende (B), activerende (A) en niet-activerende (B) oplossingen (geschreven als B-A-B; zie figuur 1A). De geïmmobiliseerde proteoliposomen op de sensor worden gewassen met de oplossingen. Daarom genereert de B-A-oplossingsuitwisseling een substraatconcentratiegradiënt, die de elektrogene transportreactie aandrijft. - Sla het protocol op en laat de workflow uitvoeren door op de knop Afspelen te klikken. Voer hetzelfde type experiment uit, maar met behulp van eiwitvrije liposomen. Dit is zeer belangrijk omdat het de intensiteit van achtergrondstromen zou laten zien. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het analyseren van gegevens van elektrogeen transport gemeten met proteoliposomen (figuur 1C).
- Gebruik voorkeurssoftware voor gegevensanalyse om de gemeten stroom versus tijd uit te zetten. Lees de piekstroom handmatig uit, of gebruik bij gebruik van de software de functie voor piekhoogteschatting in het bereik van de toevoeging van de activerende buffer.
- Zet de piekstroom uit tegen de substraatconcentratie om de EC50 van het substraat te bepalen via de niet-lineaire regressie (figuur 1B, C). Lees de laagste concentratie uit waarbij de piekstroom een maximale waarde bereikt, deze concentratie komt overeen met verzadigingsomstandigheden.
OPMERKING: Het is belangrijk om te bedenken dat het aantal proteoliposomen dat geïmmobiliseerd blijft, varieert van chip tot chip. Deze variatie is duidelijk omdat de piekstromen bij identieke meetomstandigheden verschillende amplitudes vertonen. Daarom is het noodzakelijk om de huidige amplitudes van metingen die op elke chip afzonderlijk worden uitgevoerd te normaliseren voordat metingen tussen verschillende chippreparaten worden vergeleken.
4. Seriële classificatie van remmende en niet-remmende nanolichamen
OPMERKING: Deze sectie laat zien hoe choline transport te meten in de aanwezigheid van nanobodies die specifiek binden aan de bacteriële choline transporter. Kleinere piekstromen in de aanwezigheid van nanobodies wijzen op transportremming. Niet-remmende nanobodies hebben geen invloed op het substraattransport, d.w.z. geen afname van het piekstroomsignaal.
- Bereid 1-2 L niet-activerende SSM-buffer voor.
- Breng 50 ml van de niet-activerende SSM-buffer over in een schone buis. Voeg het substraat choline toe aan een eindconcentratie van 5 mM (verzadigingscondities). Gebruik dit voor een positieve controlemeting.
- Breng 10 ml van de niet-activerende SSM-buffer over in een schone buis. Voeg het substraat choline toe aan een eindconcentratie van 5 mM (verzadigingscondities) en voeg nanobody toe aan een eindconcentratie van 500 nM.
- Herhaal stap 4.3 voor elk nanolichaam om de activerende oplossingen voor te bereiden.
OPMERKING: Als de gezuiverde nanobodies opnieuw worden uitgegeven in een andere buffer dan de SSM-buffer, zal hun toevoeging aan de activerende en niet-activerende buffers leiden tot een buffermismatch. Een buffermismatch moet worden vermeden, omdat dit tot veel lawaai kan leiden. Het vervangen van de buffer van de gezuiverde nanobodies met de SSM-buffer kan helpen om dit probleem te voorkomen. Bovendien wordt het gebruik van nanolichaamconcentraties aanbevolen die het mogelijk maken om verzadigingscondities te bereiken. Aangezien de bindingsconstanten van nanobodies over het algemeen lager zijn dan 100 nM, wordt een nanobodyconcentratie van 500 nM aanbevolen voor dit experiment. Wel is het belangrijk om vooraf te screenen op optimale concentraties. - Start de SSM-machine en meet de capaciteit en geleidbaarheid van de met proteoliposoom gecoate chip zoals beschreven in stappen 3.4-3.7.
- Breng de activerende oplossing zonder nanobody over in een injectieflacon en plaats de buffer in de sondebemonsteraar. Breng de niet-activerende buffer zonder nanobody over in een reservoir en plaats deze in de sondebemonsteraar.
- Breng de activerende oplossingen met nanobodies over in injectieflacons en plaats de buffers in de sondebemonsteraar. Breng de niet-activerende buffers met nanobodies over in injectieflacons en plaats de buffers in de sondebemonsteraar.
- Maak een protocol voor de workflow met behulp van een reeks niet-activerende (B), activerende (A) en niet-activerende (B) oplossingen (B-A-B-reeks).
- Maak een lus die het volgende uitvoert: drie metingen van de B-A-B-sequentie met behulp van buffers zonder nanobody, twee metingen van de B-A-B-sequentie met buffers die een nanobody bevatten, 120 s vertragingstijd voor incubatie met het nanobody, vervolgens 3 metingen van de B-A-B-sequentie met buffers die het nanobody bevatten.
- Sla de workflow op en laat deze uitvoeren door op de knop Afspelen te klikken.
OPMERKING: Deze workflow meet de begincondities van het transport zonder remming door het B-A-B-protocol 3 keer uit te voeren met behulp van niet-activerende (B) en activerende buffers (A) zonder het nanolichaam(Figuur 1B,C), gevolgd door de meting van het nanobody-effect op het transport door het B-A-B-protocol 5 keer uit te voeren met de niet-activerende en activerende buffers die nanobodies bevatten (Figuur 2A ). De tweede orde bindende kinetiek dicteert de interactie van nanobodies en hun doeleiwitten. Daarom is het belangrijk om een tijdsvertraging in de B-A-stap te gebruiken om nanobodies voldoende tijd te geven om zich te binden aan transporters in proteoliposomen op de chip. Optimale tijden zijn afhankelijk van de concentratie van het nanolichaam, d.w.z. bij lagere concentraties zijn langere tijden vereist. De eerste twee metingen zijn nodig om het systeem aan te passen aan de nieuwe omstandigheden en de tweede run moet worden uitgevoerd na een vertragingstijd van 120 s. Alleen de volgende drie metingen mogen worden gebruikt voor gegevensanalyse. - Maak een nieuw protocol voor de workflow met behulp van een reeks niet-activerende (B), activerende (A) en niet-activerende (B) oplossingen (B-A-B-sequentie) en een lus van 5 metingen om het reversibel gebonden nanolichaam uit te spoelen.
OPMERKING: Voeg optioneel een incubatiestap toe om dissociatie van nanobodies met langzame kinetiek mogelijk te maken. - Sla de workflow op en laat deze uitvoeren door op de knop Afspelen te klikken.
- Vergelijk de laatste piekstroom van de metingen met de initiële substraat-only meting in stap 4.10. Het nanolichaam is met succes weggespoeld en de begincondities zijn hersteld als de piekstroom de beginwaarde bereikt, anders stap 4.12-4.13 herhaalt of overschakelt naar een nieuwe chip.
- Herhaal stap 4.6-4.13 en gebruik afzonderlijke chips voor elk nanobodyscherm (Figuur 2C) of herhaal met meerdere nanobodies met dezelfde chip (Figuur 2D).
- Gebruik voorkeurssoftware voor gegevensanalyse om de gemeten stroom versus tijd uit te zetten. Lees de piekstroom handmatig uit, of indien beschikbaar, in de gebruikte software, selecteer automatisch de functie voor piekhoogteschatting in het bereik van de toevoeging van de activeringsbuffer.
- Normaliseer de piekstroom in aanwezigheid van het nanolichaam, op basis van de voorafgaande meting van alleen substraat. Plot de piekstromen in een histogram en vergelijk de piekstromen van het substraat alleen metingen met de piekstromen gemeten in de aanwezigheid van nanobodies (Figuur 2C,D) om remmende nanobodies te identificeren.
OPMERKING: Normalisatie van de bepaalde piekstromen van elke individuele run met een nanobody moet worden uitgevoerd rekening houdend met de piekstroom in afwezigheid van het nanolichaam van de vorige meting. Omdat het aantal proteoliposomen dat geïmmobiliseerd blijft van chip tot chip varieert, is het ook belangrijk om de huidige amplitudes van metingen die op elke chip afzonderlijk worden uitgevoerd te normaliseren voordat metingen tussen verschillende chippreparaten worden vergeleken.
5. IC50-meting met remmende nanobodies
OPMERKING: Na het identificeren van remmende nanobodies, is het mogelijk om hun half maximale remmende concentratie te bepalen (IC50). Dit wordt gedaan door het meten van het transport van choline bij constante concentratie, terwijl verschillende concentraties van het remmende nanolichaam.
- Bereid 1-2 L van de niet-activerende SSM-buffer voor.
- Breng 50 ml van de niet-activerende SSM-buffer over in een schone buis. Voeg het substraat choline toe aan een eindconcentratie van 5 mM (verzadigingscondities). Gebruik dit als de activerende oplossing voor positieve controle.
- Neem 8 schone buizen en voeg 5 ml van de niet-activerende oplossing toe aan elk. Voeg het substraat choline toe aan een eindconcentratie van 5 mM (verzadigingscondities). Voeg het remmende nanolichaam toe aan de buizen in concentraties in het verwachte IC50-bereik (hier 500 nM - 1 nM).
- Neem 8 schone buizen en voeg 10 ml van de niet-activerende oplossing toe aan elk. Voeg remmend nanolichaam toe aan elke buis afzonderlijk in dezelfde concentratie als in stap 5.3. Dit komt overeen met de niet-activerende buffer.
OPMERKING: Dit genereert een reeks activerende en niet-activerende bufferparen bij verschillende concentraties van hetzelfde remmende nanolichaam. - Start de SSM-opstelling en meet de capaciteit en geleidbaarheid van de proteoliposoom gecoate chip zoals beschreven in stappen 3.4-3.7.
- Breng de activerende oplossing zonder nanobody over in een injectieflacon en plaats deze in de sondebemonsteraar. Breng de niet-activerende buffer zonder nanobody over in een reservoir en plaats deze op de reservoirpositie naast de chiphouder aan de rechterkant.
- Breng de activerende oplossingen met nanobodies over in injectieflacons en plaats de buffers in de sondebemonsteraar. Breng de niet-activerende buffers met nanobodies over in injectieflacons en plaats de buffers in de sondebemonsteraar.
- Maak een protocol voor de workflow met behulp van een reeks niet-activerende (B), activerende (A) en niet-activerende (B) oplossingen (B-A-B-reeks). Voeg een lus toe om elke concentratie 2 keer te meten, incubateer gedurende 120 s en meet nog 3 keer. De workflow begint met de positieve controle van alleen substraat gevolgd door de laagste concentratie van het nanolichaam. Elke nanobody-meting zal worden gevolgd door een volgende meting van de positieve controle met alleen substraat om de initiële piekamplitude te herstellen, voordat naar de volgende hogere nanobodyconcentratie wordt gegaan.
OPMERKING: De kinetiek van de tweede orde dicteert de binding van nanobodies. Daarom is het belangrijk om een tijdsvertraging te gebruiken in de B-A-stap. Optimale tijden zijn afhankelijk van de concentratie van het nanolichaam, d.w.z. bij lagere concentraties zijn langere tijden vereist; hier werd 120 s gebruikt met bevredigende resultaten. - Gebruik voorkeurssoftware voor gegevensanalyse om de gemeten stroom versus tijd uit te zetten. Lees de piekstroom handmatig uit, of selecteer bij gebruik van software de functie voor de piekhoogteschatting in het bereik van de toevoeging van de activeringsbuffer (Figuur 3A). Zet de piekstromen uit tegen de nanolichaamconcentratie om de IC50 te bepalen via niet-lineaire regressie (figuur 3B).
OPMERKING: Normaliseer de huidige amplitudes van metingen die voor elke afzonderlijke chip worden uitgevoerd voordat u metingen tussen verschillende chippreparaten vergelijkt.
6. Reiniging van sensoren
- Spoel de chips met één sensor na gebruik af met 10 ml gedestilleerd water.
- Droog de chip door erop te tikken op een tissuepapier.
- Vul de sensorholte van de chip met 100 μL zuivere isopropanol en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
- Plaats een wattenstaafje in pure isopropanol en incubeer gedurende 1-3 min.
- Gebruik de voorgekookte wattenstaafjes en draai voorzichtig op het oppervlak van de sensor zonder druk om resten te verwijderen.
- Spoel de sensor af met 5 ml zuivere isopropanol.
- Spoel de sensor af met 10 ml gedestilleerd water.
- Droog de sensor door op de chip op een tissue te tikken.
- Laat de sensor een nacht drogen bij RT en bewaar bij RT onder droge omstandigheden.
OPMERKING: Sensoren kunnen tot 4-5 keer worden hergebruikt wanneer ze op de juiste manier worden gereinigd en opgeslagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SSM-gebaseerde elektrofysiologie is op grote schaal gebruikt voor de karakterisering van elektrogene transporters. In het protocol dat hier wordt gepresenteerd, laten we zien hoe SSM-gebaseerde elektrofysiologie kan worden gebruikt om nanobodies te classificeren die zich richten op een secundaire transporter (hier een bacteriële cholinesymporter) op basis van hun remmende en niet-remmende eigenschappen. Een van de meest nuttige kenmerken van deze techniek is dat het de high-throughput screening van meerdere buffercondities mogelijk maakt. Deze specifieke eigenschap is gunstig voor de analyse van nanobodybibliotheken, die na de selectie van bindmiddelen kunnen worden samengesteld uit enkele tot tientallen nanobodies. In een standaardexperiment wordt een stabiele lipide monolaag geassembleerd op een sensorchip. Na het aanbrengen van het proteoliposomenpreparaat dat de cholinetransporter bevat, wordt een controle op goede geleidbaarheid en capaciteit uitgevoerd, omdat dit essentieel is voor het succes van het experiment. In het geval dat de integriteit van het membraan wordt aangetast tijdens een experiment, wat gemakkelijk kan worden waargenomen vanwege de hoge ruisachtergrondstromen, wordt het overschakelen naar een nieuwe chip aanbevolen omdat het herstellen van lage ruisomstandigheden nogal moeilijk is. Over het algemeen hebben we een zeer goede reproduceerbaarheid waargenomen tussen metingen van transport en remming door nanobodies bij het gebruik van verschillende chips.
Om te beslissen over de substraatconcentratie die moet worden gebruikt tijdens een screening van nanolichamen, werd eerst elektrogeen transport gemeten onder verschillende substraatconcentraties om EC50 te bepalen (figuur 1B,C). Er werd een substraatconcentratie gekozen die overeenkomt met de verzadigingsomstandigheden (figuur 1C). Deze substraatconcentratie werd vervolgens constant gehouden in alle activerende buffers. Voor dit specifieke voorbeeld hebben we 5 mM choline geselecteerd.
Voor de screening van nanobodies moet het nanobody worden toegevoegd aan zowel niet-activerende als activerende buffers. Wanneer nanobodies werden toegevoegd aan alleen de activerende buffer, was het niet mogelijk om remming van het elektrogene transport waar te nemen. We speculeren dat dit te wijten is aan een onvolledige bezetting van alle nanobody-bindingsplaatsen in de transporterpopulatie op de chip, waardoor het belang van pre-incubatie met nanobodies in niet-activerende omstandigheden wordt onthuld. Om ervoor te zorgen dat alle locaties waarschijnlijk bezet zullen zijn, werd een tijdvertragingsstap opgenomen tijdens de toepassing van de eerste niet-activerende bufferstap om de verzadiging van nanobodybindingsplaatsen op de transporterpopulatie mogelijk te maken. Incubatietijden variërend van 2-60 min zijn getest met reproduceerbare resultaten. Houd er rekening mee dat optimale incubatietijden afhankelijk zijn van de aard van het nanolichaambindmiddel en de concentratie ervan tijdens het experiment (evenals de concentratie van transporter in proteoliposomen op de chip). Daarom wordt aanbevolen om verschillende incubatietijden te proberen. In ieder geval geldt als vuistregel: hoe lager de concentratie van het nanolichaam, hoe langer de benodigde incubatietijd. We testten incubatietijden van 2 min, 20 min, 30 min en 60 min voor verschillende nanobodies, maar detecteerden geen verdere transportremming.
Het effect van remmende nanobodies op elektrogeen transport wordt gevisualiseerd uit de afname van piekstromenamplitudes (Figuur 2A, C, D). Niet-remmende nanobodies hebben daarentegen geen invloed op piekstromen. Na het uitvoeren van het wasprotocol om nanobodies los te laten, werd een herstel van 80 tot 95% van de initiële piekstroomamplitude waargenomen(figuur 2A,C, D). We hebben een soortgelijk experiment uitgevoerd, maar in aanwezigheid van liposomen zonder het transporteiwit. Bij het overschakelen van niet-activerende naar activerende omstandigheden werden geen significante artefactstromen geïntroduceerd door nanobodies die aanwezig zijn in deze buffers(figuur 2B). Het uitvoeren van dit besturingsexperiment wordt aanbevolen omdat het belangrijk is om te weten of veranderingen in piekstromen het gevolg zijn van artefacten of niet.
Na de selectie van nanobodies met remmende eigenschappen, bepaalden we IC50-waarden voor individuele nanobodies (Figuur 3A,B). Voor dit specifieke experiment wordt aanbevolen om te beginnen met een lage concentratie nanobodies en vervolgens naar een hoge concentratie te gaan tijdens de test. De berekening van de remming voor elke concentratie werd vervolgens uitgevoerd door piekstromen te vergelijken die voor en na de toepassing van nanobody werden gemeten. Om niet-specifieke binding van nanobodies aan oppervlakken te voorkomen, wat bijzonder problematisch kan zijn bij het gebruik van lage nanolichaamconcentraties, wordt geadviseerd om een soortgelijk protocol te volgen als beschreven door Kermani et al.37, waar 50 μg / ml runderserumalbumine aan de buffers werd toegevoegd, waardoor dit schadelijke effect werd voorkomen. Het toevoegen van detergentia zoals Tween of Triton voor dit doel moet worden vermeden, omdat deze lipidemembranen zouden oplossen.
Figuur 1: Op SSM gebaseerde elektrofysiologie. (A) Protocol voor het meten van transiënte stromen. Een niet-activerende oplossing wordt vervangen door een activerende oplossing, gevolgd door de stroom van niet-activerende oplossingen om de initiële omstandigheden te herstellen. Tijdens de eerste stap binden nanobodies zich aan de transporter. Bij het overschakelen naar de activerende oplossing drijft de substraatgradiënt het elektrogene transport aan (oranje curve). In aanwezigheid van een remmend nanolichaam vertoont de piekstroom een kleinere amplitude (blauwe curve). Na het voltooien van het protocol en het uitvoeren van oplossingen zonder nanobody (wash), treedt het loskoppelen van nanobodies op. In het schema worden proteoliposomen met gereconstitueerd eiwit (blauw) geïmmobiliseerd op de SSM-sensor. Driehoeken en rode cirkels vertegenwoordigen respectievelijk nanobodies en substraat. (B) Elektrogeen choline transport in afwezigheid van nanobodies. Piekstromen gemeten tijdens activerende omstandigheden worden weergegeven voor verschillende substraatconcentraties. (C) Representatieve meting van stromen tijdens activerende omstandigheden in afwezigheid van transporteiwit bij verschillende substraatconcentraties. (D) Plot van substraatconcentratie versus piekstromen amplitude. De EC50 bepaald was 95 ± 11 μM choline. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan (n=3 biologische replicaties, n=3 technische replicaties). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Screening en classificatie van remmende en niet-remmende nanolichamen. (A) Elektrogeen cholinetransport in aanwezigheid van een nanolichaam. Piekstromen gemeten tijdens activerende omstandigheden worden weergegeven in afwezigheid van nanobody (blauw), in de aanwezigheid van een remmend nanobody (rood) en na nanobody unbinding (groen). (B) Meting van stromen tijdens activerende omstandigheden in afwezigheid van transporteiwit. Sporen tonen opnames in afwezigheid van nanobody (blauw), in aanwezigheid van een remmend nanobody (groen) en in aanwezigheid van een niet-remmend nanobody (rood). (C,D). Histogrammen die piekstromen laten zien die worden gemeten tijdens activerende omstandigheden in de aanwezigheid van nanobodies en na nanobody unbinding (herstel). Paneel C toont de resultaten van metingen met individuele chips per nanobody. Paneel D toont de resultaten van een seriële meting met één chip. Nanobodies worden aangegeven als Nb. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan (n=3 biologische replicaties, n=2 technische replicaties). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bepaling van IC50 van een remmend nanolichaam. AElektrogene choline transport en remming door een nanolichaam. Piekstromen gemeten tijdens activerende omstandigheden worden getoond voor verschillende nanolichaamconcentraties. (B) Plot van piekstromen amplitude versus nanolichaam concentratie van een seriële meting met een remmend nanolichaam. De ic50 was 18 ± 2 nM. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan (n=3 biologische replicaties, n=3 technische replicaties). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde techniek classificeert nanobodies met remmende en niet-remmende eigenschappen gericht op elektrogene transporters. Het beoordelen van het substraattransport is mogelijk door de detectie van de beweging van ladingen door de transporter ingebed in het membraan van proteoliposomen. Enkele van de kritieke stappen tijdens het opzetten van een experiment zijn reconstitutie van actief eiwit in liposomen, voorbereiding van stabiele monolagen op SSM-chips en herstel van de begincondities na de toepassing van het wasprotocol om gebonden nanolichaammoleculen te verwijderen. Zodra het membraaneiwit is gereconstitueerd met een geschikte lipide-eiwitverhouding, kan een algemeen SSM-protocol worden vastgesteld met behulp van het inheemse substraat. Het is cruciaal om controle-experimenten uit te voeren met behulp van eiwitvrije liposomen om ruisstromen te onthullen die moeten worden afgetrokken van de stromen die worden gemeten met behulp van proteoliposomen. Als de ruisstromen echter te groot zijn, raden we aan om eiwitreconstitutie te proberen met behulp van verschillende lipiden, of te screenen op bufferomstandigheden die deze schadelijke signalen minimaliseren. Na het succesvol vaststellen van de voorwaarden voor een SSM-test, kan screening van nanobodies worden uitgevoerd. Een zeer nuttige optie die kan helpen bij het sneller screenen van nanobodies is het uitvoeren van high-throughput assays met behulp van een enkele SSM-sensorchip. Dit vermindert de tijd van manipulatie van chips en buffers en verlaagt de kosten. Omdat tijdens dit type test echter meerdere nanobodies achter elkaar worden aangebracht, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het aangebrachte nanolichaam na de meting kan worden weggespoeld. Het kan nodig zijn om een strikte wascyclus te implementeren om sommige nanobodies los te koppelen in het geval dat verminderde piekstroomamplitudes worden gedetecteerd in afwezigheid van nanobody. We raden aan om als uitgangspunt de hier beschreven wasomstandigheden te gebruiken. Als het verhogen van het wasvolume of het aantal cycli niet helpt, moeten individuele chips worden gebruikt om elk nanolichaam afzonderlijk te screenen. In alle hier onderzochte gevallen was de binding van nanobodies omkeerbaar en kon een high-throughput protocol worden toegepast. In onze experimentele opstelling konden we de volledige amplitude van de initiële piekstroom na metingen met nanobodies niet terugwinnen (Figuur 1A; Figuur 2C,D). In de meeste gevallen varieerde de omvang van de teruggewonnen piekstromen echter tussen 80 en 95% van de amplitude gemeten voordat nanobodies werden toegepast (Fig. 2C, D). We speculeren dat dit een gevolg kan zijn van het wegspoelen van een fractie van de proteoliposomen die aan de chip zijn gehecht, of als gevolg van langzame kinetiek van het losmaken van sommige remmende nanobodies, of een combinatie van beide. In beide gevallen was het nog steeds mogelijk om door te gaan met het testen van verdere nanobodies omdat elektrogeen transport meetbaar was. Dit is te zien in figuur 2D,waar we zes nanobodies hebben gescreend met behulp van een enkel chippreparaat.
De high-throughput-eigenschap is een van de belangrijkste ontwikkelingen van de gepresenteerde methode. Bovendien maakt deze methode, in tegenstelling tot andere benaderingen, de selectie mogelijk van remmende nanolichamen gericht op elektrogene transporters waarvoor geen gelabelde substraten beschikbaar zijn. Een snelle identificatie van remmende nanobodies kan helpen om het onderzoek te versnellen dat gericht is op het identificeren van nieuwe toepassingen van nanobodies als geneesmiddelen. Hun schijnbare voordelen in vergelijking met vergelijkbare therapieën zoals antilichaambehandelingen zijn talrijk, te beginnen met een kleiner formaat dat hen helpt zich verder te verspreiden in weefsels of cellen, tot hun lage productiekosten en hoge stabiliteit.
Op SSM gebaseerde elektrofysiologie is in het verleden gebruikt voor de karakterisering van elektrogene transporters in membraanblaasjes29,38. Dit soort experimenten zijn voordelig omdat ze niet afhankelijk zijn van de eiwitzuiverings- en reconstitutieprotocollen. We speculeren dat het uitvoeren van de selectie van remmende nanobodies met behulp van membraanblaasjes haalbaar is. Dit zou helpen om de kosten te verlagen en manipulaties van gezuiverde eiwitten te voorkomen.
SSM-gebaseerde elektrofysiologie is een sterke techniek om te screenen op nanobodyremmers van meerdere membraaneiwitten die elektrogeen transport vertonen. We voorzien dat SSM-gebaseerde elektrofysiologie een belangrijk hulpmiddel zal worden voor de selectie van remmende nanobodies en andere antilichamen met potentiële klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken Cedric A. J. Hutter en Markus A. Seeger van het Instituut voor Medische Microbiologie aan de Universiteit van Zürich, en Gonzalo Cebrero van Biozentrum van de Universiteit van Basel voor de samenwerking bij het genereren van synthetische nanobodies (sybodies). Wij danken Maria Barthmes en Andre Bazzone van NANION Technologies voor de technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door de Swiss National Science Foundation (SNSF) (PP00P3_170607 en NANION Research Grant Initiative to C.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | ----- | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
References
- Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
- Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
- Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
- Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
- Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
- Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
- Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
- Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
- Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
- Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
- Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S.
- Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
- McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
- Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
- Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
- Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
- Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
- Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
- vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
- Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
- Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
- Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
- Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
- Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
- Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K.
- Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
- Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
- Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K.
- Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
- Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
- Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
- Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
- Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
- Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).
