Summary
나노 바디는 구조 생물학에 있는 중요한 공구이고 치료의 발달을 위한 중대한 잠재력을 포즈. 그러나 억제 특성을 가진 나노 체의 선택은 어려울 수 있습니다. 여기서 우리는 전기막 수송기를 표적으로 하는 억제 및 비 억제 나노체의 분류를 위한 고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학의 사용을 입증합니다.
Abstract
단일 도메인 항체 (나노 체)는 단백질의 기계론 및 구조 연구에서 광범위하게 사용되었으며, 그 중 많은 사람들이 수송기와 같은 막 단백질의 억제에 의존하는 임상 치료법을 개발하기위한 도구로 엄청난 잠재력을 제기합니다. 그러나, 수송 활동의 억제를 결정하는 데 사용되는 대부분의 방법은 고처리량 루틴에서 수행하기 어렵고 라벨이 부착된 기판 가용성에 의존하여 대형 nanobody 라이브러리의 스크리닝을 복잡하게 만듭니다. 고체 지원 멤브레인 (SSM) 전기 생리학은 전기 수송기를 특성화하고 수송 운동 및 억제를 측정하는 데 사용되는 고처리량 방법입니다. 여기서 우리는 전기이차 수송기를 표적으로 하는 억제 및 비억제 나노체를 선택하고 나노체 억제 상수를 계산하기 위해 SSM 계 전기생리학의 구현을 보여준다. 이 기술은 표지된 기판을 사용할 수 없는 수송기를 표적으로 하는 억제 나노바디를 선택하는 데 특히 유용할 수 있다.
Introduction
항체는 항원 결합을 담당하는 두 개의 동일한 무거운 사슬과 2개의 광사슬로 구성됩니다. 낙타는 기존의 항체1,2에 비해 그들의 cognate 항원에 대해 유사한 친화력을 나타내는 무거운 사슬 전용 항체를 가지고있다. 중형사슬 전용 항체의 단일 가변 도메인(VHH)은 전체 항원 결합 전위를 유지하고 매우 안정적인1,2로나타났다. 이들 분리된 VHH 분자 또는 "나노바디"는 막 단백질생화학과 관련된 연구에서 구현되어 적합성3,4,억제제5,6,안정화 제제7,구조 결정8,9,10을 위한 가젯으로서 적합성3,4 . 나노체는 표적 특이적 나노체를 인코딩하는 B 세포의 사전 농축을 위한 낙타의 예방접종에 의해 생성될 수 있고, 그 다음에 나노드 라이브러리의 복제및 파지 디스플레이에 의한선택(11,12,13)이다. 나노체를 생성하는 다른 방법은 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이 또는 효모디스플레이(14,15, 17,17,18,19,20)에의해 라이브러리 및 선택에 의존하는 시험관 내 선택 방법을 기반으로 한다. 이러한 체외 방법은 큰 라이브러리 크기를 필요로하지만 동물 예방 접종을 피하는 혜택을 상대적으로 낮은 안정성으로 단백질을 대상으로 나노 체의 선택을 선호.
나노체의 작은 크기, 높은 안정성과 용해도, 강한 항원 친화성, 낮은 면역원성, 비교적 쉬운 생산, 치료21,22,23의개발을 위한 강력한 후보를 만든다. 특히, 다중 막 단백질의 활성을 억제하는 나노체는 임상적용을위한 잠재적자산이다5,24,25,26. 멤브레인 수송기의 경우, nanobody가 억제 활성을 가지고 있는지 여부를 평가하기 위해, 수송 기판 및 / 또는 공동 기판의 검출을 허용하는 분석기를 개발할 필요가있다. 이러한 소법은 일반적으로 표지된 분자 또는 보편적인 응용 프로그램이 부족할 수 있는 기판 특이적 검출 방법의 설계를 포함한다. 더욱이, 억제 나노체의 식별은 일반적으로 많은 바인더의 선별을 필요로 한다. 따라서, 고처리량 모드에서 사용할 수 있고 라벨이 부착된 기판에 의존하지 않는 방법은 이 선택에 필수적이다.
SSM 기반 전기 생리학은 멤브레인(예: 이온 결합/수송)27,28을통해 전하의 이동을 검출할 수 있는 매우민감하고시간 해결된 기술이다. 이 기술은 이러한 단백질의 상대적으로 낮은 회전율로 인해 다른 전기 생리학 기술을 사용하여 연구하기 어려운 전기 생성 수송기를 특성화하기 위해 적용되었으며,이는 29,30,31,32,33,34, 34,35. SSM 전기생리학은 표지된 기판의 사용을 필요로 하지 않으며, 고처리량 스크리닝에 적합하며, 관심있는 수송기를 함유하는 프로테오폴좀 또는 멤브레인 소포를 사용할 수 있다. 여기서, 우리는 SSM 기지를 둔 전기생리학이 억제 및 비 억제 특성을 가진 수송기 표적 나노체를 분류하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다. 원칙의 증거로, 우리는 SSM 센서에 프로테오폴좀의 고정을위한 자세한 단계 다음 리포솜에 세균 콜린 수송기의 재구성을 설명합니다. 다음으로 는 콜린 수송의 SSM 기반 전기 생리학 측정을 수행하는 방법과 반 최대 유효 농도(EC50)를결정하는 방법에 대해 설명합니다. 그런 다음 SSM 기반 전기 생리학을 사용하여 여러 나노 체를 검사하고 콜린 수송 억제제를 식별하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 선택된 억제 나노체의 절반 최대 억제 농도(IC50)를결정하는 방법을 설명한다.
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Protocol
1. 막 단백질 재구성
- 대장균 극지 지질 3mL을 1mL의 포스파디딜콜린을 통풍이 잘 되는 후드 아래 둥근 바닥 플라스크에 섞는다.
- 37°C에서 회전 증발기와 수조를 사용하여 진공 상태에서 20분 동안 지질 혼합물을 건조하여 클로로폼을 제거합니다. 필요한 경우 질소 또는 아르곤 가스 아래에서 더 건조하십시오.
- TS 버퍼(20m Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl)를 사용하여 2mm β-메르카토에탄올을 함유하고, 지질을 25 mg/mL로 재연한다.
- 500 μL 알리쿼트의 알리쿼트 지질, 액체 질소에 플래시 동결, -80°C에 보관하십시오.
- 지질의 500 μL 알리쿼트 하나를 해동하고 2mM β-mercaptoethanol을 포함하는 TS 버퍼를 사용하여 1:1을 희석합니다.
- 400 nm 멤브레인을 사용하여 지질 현탁액을 15 번 돌출하십시오.
- 지질 현탁액을 희석하여 최종 지질 농도가 4.4 mg/mL입니다.
- n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM)를 추가하여 최종 농도가 0.2 %이고 실온 (RT)에서 200 rpm에서 1 시간 동안 회전하게하십시오.
- 1:10에서 1:100 사이의 지질 대 단백질 비율을 사용하여 정제 된 단백질을 지질에 추가하십시오 (w:w).
참고: 기판 수송의 SSM-전기생리학 측정에서 검출된 신호의 강도에 따라 비율을 조정해야 합니다(아래 참조). 더 큰 신호를 얻으려면 더 작은 지질 대 단백질 비율을 사용하십시오. - RT에서 1 시간 동안 200 rpm에서 회전하는 혼합물을 배양합니다.
- TS 버퍼로 미리 세척된 폴리스티렌 흡착 구슬 30 mg/mL을 추가합니다.
참고: 폴리스티렌 구슬을 단계적으로 추가합니다. - 느린 교반 하에서 RT에서 30 분 동안 구슬 지질 혼합물을 배양하십시오.
- 구슬을 제거하려면 구슬 지질 혼합물이 서서 구슬이 정착되도록 하십시오. 솔루션을 새로운 튜브로 옮기고 구슬을 남겨 둡니다. 분리된 지질 혼합물에 신선한 폴리스티렌 흡착 구슬 30 mg/mL를 추가합니다.
- 느린 교반 하에서 4 °C에서 1 시간 동안 혼합물을 배양합니다.
- 1.13 단계에서 설명된 바와 같이 구슬을 혼합물과 분리하고 30 mg/mL의 신선한 폴리스티렌 흡착 구슬을 추가합니다.
- 4°C에서 16시간 동안 혼합물을 배양한다.
- 13단계에서 설명된 바와 같이 비드를 혼합물에서 분리하고 30 mg/mL의 신선한 폴리스티렌 흡착 구슬을 추가합니다.
- 4°C에서 2시간 동안 혼합물을 배양하여 네 번째 및 최종 세척을 합니다.
- 원심분리기는 4°C에서 30분 동안 110,000 x g에서 원심분리기.
- 2mM β-메르카포에탄올을 함유한 500 μL의 TS 버퍼로 펠릿을 세척합니다.
- 원심분리기는 4°C에서 30분 동안 110,000 x g에서 다시 원심분리기.
- 2 mM β-메르카토에탄올로 TS 버퍼에서 25 mg/mL의 최종 지질 농도로 펠릿을 다시 중단합니다.
- 인겔 또는 아미도 블랙분석(36)을사용하여 단백질 농도를 추정한다.
- 프로테올리포좀을 알리쿼트하고, 액체 질소에 플래시 동결하고- 80°C에 보관한다.
2. 칩 준비
- 0.5mMM 1-옥타데카네틸릴 용액의 50-100 μL(이소프로파놀에서 재장중단)으로 단일 센서 칩을 채웁니다.
- RT에서 30분 동안 솔루션으로 칩을 배양합니다.
- 티슈의 칩을 눌러 티올 용액을 제거합니다.
- 5mL의 순수 이소프로판올로 센서를 3번 헹구는 다.
- 이중 증류수 5mL로 센서를 3번 헹구습니다.
- 티슈 페이퍼를 눌러 센서를 건조시다.
- 7.5 μg/μL 1,2-디피타노일-센-글리세로-3-인포콜린(회전 증발기에서 건조및 n-decane에서 재장매)의 1.5 μL을 적용하십시오.
- 직후, 기판을 포함하지 않는 비 활성화 SSM 버퍼의 50 μL로 센서를 채웁니다. 이것은 SSM 층의 자발적인 형성으로 이끌어 낼 것입니다.
참고: SSM 버퍼를 미리 최적화하여 배경 소음이 적은 최적의 조건을 결정해야 합니다. 30m HEPES pH 7.4, 5m MgCl2,140mM NaCl을 포함하는 일반 버퍼는 출발점으로 사용될 수 있다. 기판이 없는 SSM 버퍼는 측정 전후(비활성화 버퍼)를 세척하는 데 사용됩니다. 버퍼 불일치를 방지하려면 비활성화 버퍼를 사용하여 기판을 포함하는 버퍼를 준비합니다(버퍼 활성화). 기판은 희석을 피하기 위해 분말또는 고농도 스톡에서 소량으로 직접 첨가할 수 있다. - RT에서 1.24 단계에서 proteoliposomes를 해동하십시오.
- 비활성화 SSM 버퍼에서 1:5에서 1:100(proteoliposomes:버퍼, (v:v)) 사이에 프로테올리포좀을 희석시(여기 1:20).
- 10초 동안 20-30 s 또는 3회 동안 프로테올리포솜을 초음파 처리하여 필요한 경우 초음파 처리 사이에 얼음위에 놓습니다. 여기에 45 kHz에서 수조 초음파 처리기가 사용되었다.
- 희석된 초음파 처리된 프로테오폴좀 샘플의 5-10 μL을 센서 표면에 만지지 않고 적용합니다.
- 2,000~3,000 x g 의 속도를 사용하여 RT의 용액으로 칩을 원심분리합니다.
참고: 바닥이 평평한 50mL 튜브를 사용합니다. 센서 칩을 핀셋으로 조심스럽게 똑바로 세워 두세요. 플레이트 홀더가 있는 6웰 플레이트와 원심분리기도 사용할 수 있습니다. - 같은 날에 센서 칩을 사용하십시오.
3. 독단적 인 운송 측정 : 포화 조건의 결정
참고: 원리 증명으로서, 이러한 실험은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 리포솜에서 재구성된 세균성 콜린 수송기를 사용하여 수행되었다. 나노체에 의한 억제측정 전에 기판 콜린의 포화 조건을 결정하는 단계별 과정이 여기에 도시된다.
- 활성화되지 않는 SSM 버퍼의 1-2 L을 준비합니다.
참고: 모든 측정에서 버퍼를 활성화하고 비활성화하기 위해 동일한 SSM 버퍼 스톡을 준비하고 사용합니다. - 10개의 깨끗한 튜브를 가지고 비활성화 SSM 버퍼의 10mL를 각각 로 옮킨다.
- 기판을 3.2단계에서 튜브에 추가하여 예상 절반 최대 농도(여기서 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 mMM의 콜린)를 사용하여 활성화SM 버퍼를 준비한다. 희석을 피하기 위해 고농도 스톡을 사용하십시오.
- SSM 기계를 켭킵니다.
- SSM 소프트웨어를 시작하고 컴퓨터가 자동으로 초기화하도록 합니다. 데이터에 대한 저장 경로를 설정하고 확인 버튼을 눌러 확인합니다. 워크플로 옵션에서 표준 초기 정리 프로토콜을 선택하고 실행을 클릭합니다.
- 소켓에 프로테오올리포솜 코팅 칩을 장착하고 팔을 움직여 칩을 잠그고 캡으로 장착 된 칩을 닫습니다.
- 워크플로에서 CapCom 프로그램을 선택하고 실행하여 전도도 및 커패시턴스를 결정합니다. 전도도가 5nS 미만이고 정전 용량이 측정에 사용하기 전에 15에서 35 nF 사이인지 확인합니다.
참고: 3mm 칩을 사용할 때 제조업체에서 15-35 nF의 커패시턴스 값과 5nS 미만의 전도도를 권장합니다. - 활성화 솔루션을 바이알로 전송하고 프로브 샘플러에 버퍼를 배치합니다.
- 비활성화 버퍼를 저수지로 옮기고 오른쪽의 저장소 위치에 있는 칩 홀더 옆에 배치합니다.
- 비활성화(B), 활성화(A), 비활성화(B) 솔루션(B-A-B 시퀀스) 및 3단계에서 준비된 모든 10개의 버퍼에 대해 세 가지 측정을 수행하고 다음 활성화 버퍼로 이동하는 루프를 사용하여 워크플로에 대한 프로토콜을 만듭니다. B-A-B 시퀀스에 대해 1-1 s - 1 의 유동 시간을 사용하여 200 μL/s의 기본 유량을 사용합니다. 재생을 클릭하여 측정을 시작합니다.
참고: 일반적인 실험은 비활성화(B), 활성화(A), 비활성화(B) 솔루션(B-A-B로 작성됨; 도 1A 참조)의 순차적 흐름으로 구성된다. 센서의 고정 된 프로테올리포솜은 솔루션으로 세척됩니다. 따라서, B-A 용액 교환은 기질 농도 그라데이션을 생성하여 전기원수송 반응을 유도한다. - 프로토콜을 저장하고 재생 버튼을 클릭하여 워크플로우를 실행하도록 합니다. 같은 유형의 실험을 수행하지만 단백질이없는 리포솜을 사용하십시오. 이것은 배경 전류의 강도를 보여주기 때문에 매우 중요합니다. 이는 프로테오올리포좀(도1C)으로측정된 전기원수송데이터를 분석할 때 고려해야 한다.
- 데이터 분석을 위해 선호하는 소프트웨어를 사용하여 측정된 전류와 시간을 플롯합니다. 수동으로 피크 전류를 읽거나 소프트웨어를 사용하는 경우 활성화 버퍼의 추가 범위에서 피크 높이 추정을 위해 함수를 사용합니다.
- 기판 농도에 대하여 피크 전류를 플롯하여 비선형 회귀(도1B,C)를통해 기판의 EC50을 결정한다. 피크 전류가 최대 값에 도달하는 가장 낮은 농도를 읽으면 이 농도는 포화 조건에 해당합니다.
참고: 고정된 상태로 유지되는 프로테오올리포좀의 수는 칩대 칩에 따라 다릅니다. 이러한 변화는 동일한 측정 조건에서 피크 전류가 서로 다른 진폭을 나타내기 때문에 분명합니다. 따라서, 다른 칩 제제 중 측정을 비교하기 전에 각 칩에서 수행되는 측정의 현재 진폭을 별도로 정상화할 필요가 있다.
4. 억제 및 비 억제 나노 체의 직렬 분류
참고: 이 섹션에서는 세균 콜린 수송기에 특별히 결합 하는 나노 바디의 존재에 콜린 수송을 측정 하는 방법을 보여줍니다. 나노 체의 존재에 작은 피크 전류 는 전송 억제를 나타냅니다. 비 억제 나노 체기 질 수송에 영향을 미치지 않습니다., 즉, 피크 전류 신호의 감소.
- 활성화되지 않는 SSM 버퍼1-2L을 준비합니다.
- 비활성화 SSM 버퍼의 50mL를 깨끗한 튜브로 옮킨다. 기판 콜린을 5 mM(포화 조건)의 최종 농도에 추가합니다. 이 것을 사용하여 양수 제어 측정에 사용하십시오.
- 비활성화 SSM 버퍼의 10mL를 깨끗한 튜브로 옮킨다. 기판 콜린을 최종 농도 5 mM (포화 조건)에 추가하고 500 nM의 최종 농도에 nanobody를 추가합니다.
- 활성화 솔루션을 준비하기 위해 각 nanobody에 대해 4.3 단계를 반복합니다.
참고: 정제된 나노체가 SSM 버퍼와 다른 버퍼에서 다시 리시징되는 경우 활성화 및 비 활성화 버퍼에 추가하면 버퍼 불일치가 발생할 수 있습니다. 버퍼 불일치가 높은 노이즈로 이어질 수 있으므로 피해야 합니다. 정제된 나노체의 버퍼를 SSM 버퍼와 교환하면 이 문제를 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 포화 조건에 도달할 수 있도록 nanobody 농도를 사용 하 여 것이 좋습니다. 나노 체의 결합 상수는 일반적으로 100 nM 이하임을 고려하면, 이 실험에 대 한 500 nM의 nanobody 농도 권장. 그러나 최적의 농도를 위해 사전 화면을 하는 것이 중요합니다. - SSM 기계를 시작하고 3.4-3.7 단계에 설명된 바와 같이 프로테오폴솜 코팅 칩의 커패시턴성 및 전도도를 측정한다.
- 나아무도 없이 활성화 용액을 바이알로 옮기고 버퍼를 프로브 샘플러에 배치합니다. nanobody없이 비 활성화 버퍼를 저수지로 옮기고 프로브 샘플러에 배치합니다.
- 나노바디를 포함하는 활성화 솔루션을 바이알로 옮기고 프로브 샘플러에 버퍼를 배치합니다. 나노바디를 포함하는 비활성화 버퍼를 바이알로 옮기고 프로브 샘플러에 버퍼를 배치합니다.
- 비활성화(B), 활성화(A), 비활성화(B) 솔루션(B-A-B 시퀀스)을 사용하여 워크플로에 대한 프로토콜을 만듭니다.
- 다음을 수행하는 루프를 만듭니다: nanobody 없이 버퍼를 사용하여 B-A-B 서열의 세 가지 측정, nanobody를 포함하는 버퍼를 포함하는 B-A-B 시퀀스의 두 가지 측정, nanobody와 인큐베이션을 위한 120s 지연 시간, 다음 nanobody를 포함하는 버퍼가 있는 B-A-B 시퀀스의 3가지 측정.
- 워크플로를 저장하고 재생 버튼을 클릭하여 실행하도록 합니다.
참고: 이 워크플로우는 비활성화(B) 및 활성 버퍼(A)를 사용하여 B-A-B 프로토콜을 3번 실행하여 억제없이 수송의 초기 조건을 측정한 다음, nanobody(도1B,C)없이,비작용체와 함께 B-A-B 프로토콜을 5회 실행하여 수송에 미치는 나노효과의 측정을 거쳐 나노애를 억제하는 체(2A)를 억제하는 체형(나노티)의 측정을 통해 나노항체를 함유하고 있다. ). 두 번째 순서 결합 운동은 나노 바디와 그들의 표적 단백질의 상호 작용을 지시합니다. 따라서 나노체가 칩의 프로테오폴좀에서 수송기에 결합할 수 있는 충분한 시간을 주기 위해 B-A 단계에서 시간 지연을 사용하는 것이 중요하다. 최적의 시간은 nanobody 농도 즉, 더 낮은 농도에서 더 긴 시간이 필요합니다. 처음 두 측정은 시스템을 새로운 조건에 맞게 조정해야 하며 두 번째 실행은 120초의 지연 시간 후에 수행해야 합니다. 데이터 분석에는 다음 세 가지 측정만 사용해야 합니다. - 비활성화(B), 활성화(A), 비활성화(B) 솔루션(B-A-B 서열) 및 5개의 측정 루프를 사용하여 워크플로우에 대한 새로운 프로토콜을 만들어 가역적으로 결합된 nanobody를 씻어낸다.
참고: 선택적으로, 느린 운동으로 나노 바디의 해리를 허용하는 잠복기 단계를 포함합니다. - 워크플로를 저장하고 재생 버튼을 클릭하여 실행하도록 합니다.
- 측정의 마지막 피크 전류를 4.10 단계의 초기 기판 전용 측정과 비교합니다. nanobody성공적으로 씻겨졌고 피크 전류가 초기 값에 도달하면 초기 조건이 다시 설정되었거나 그렇지 않으면 단계를 반복4.12-4.13또는 새 칩으로 변경합니다.
- 단계 4.6-4.13을 반복하고 각 nanobody화면(그림 2C)에개별 칩을 사용하거나 동일한칩(도 2D)을사용하여 여러 나노바디로 반복한다.
- 데이터 분석을 위해 선호하는 소프트웨어를 사용하여 측정된 전류와 시간을 플롯합니다. 수동으로 피크 전류를 읽거나 사용 가능한 경우 활성화 버퍼 추가 범위에서 피크 높이 추정기능을 자동으로 선택합니다.
- 앞의 기판 전용 측정을 기반으로 nanobody가 있는 피크 전류를 정규화합니다. 히스토그램에서 피크 전류를 플롯하고 억제 나노체를 식별하기 위해 나노체(도2C,D)의존재에서 측정된 피크 전류에 만 측정된 기판의 피크 전류를 비교한다.
참고: 이전 측정에서 nanobody가 없는 경우 피크 전류를 고려하여 nanobody와 함께 각 개별 실행의 결정된 피크 전류의 정규화를 수행해야 합니다. 또한, 고정된 상태로 유지되는 프로테오폴의 수는 칩대 칩마다 다르기 때문에, 각 칩에서 수행되는 측정의 현재 진폭을 별도로 정상화하는 것이 중요하다.
5. 억제 나노 바디를 가진 IC50 측정
참고: 억제 나노체를 식별한 후, 반 최대 억제 농도(IC50)를결정할 수 있다. 이것은 일정한 농도에서 콜린의 수송을 측정 하 여 이루어집니다., 억제 nanobody의 다양 한 농도 동안.
- 활성화되지 않는 SSM 버퍼의 1-2 L을 준비합니다.
- 비활성화 SSM 버퍼의 50mL를 깨끗한 튜브로 옮킨다. 기판 콜린을 5 mM(포화 조건)의 최종 농도에 추가합니다. 이를 양수 제어를 위한 활성화 솔루션으로 사용합니다.
- 8개의 깨끗한 튜브를 가지고 각 비활성화 용액의 5mL를 추가합니다. 기판 콜린을 5 mM(포화 조건)의 최종 농도에 추가합니다. 예상 IC50 범위 (여기 500 nM - 1 nM)에서 농도에서 튜브에 억제 nanobody를 추가합니다.
- 8개의 깨끗한 튜브를 가지고 비활성화 용액의 10mL를 각각 넣습니다. 단계 5.3과 동일한 농도로 각 튜브에 개별적으로 억제 nanobody를 추가합니다. 이는 비활성화 버퍼에 해당합니다.
참고: 이것은 동일한 억제 nanobody의 다른 농도에서 일련의 활성화 및 비 활성화 완충제 쌍을 생성합니다. - SSM 설정을 시작하고 3.4-3.7 단계에 설명된 바와 같이 프로테오올리포솜 코팅 칩의 커패시턴스 및 전도도를 측정한다.
- 나아무도 없이 활성화 용액을 유리병으로 옮기고 프로브 샘플러에 넣습니다. 나아무도 없이 비활성화 버퍼를 저수지로 옮기고 오른쪽의 칩 홀더 옆에 있는 저장소 위치에 배치합니다.
- 나노바디를 포함하는 활성화 솔루션을 바이알로 옮기고 프로브 샘플러에 버퍼를 배치합니다. 나노바디를 포함하는 비활성화 버퍼를 바이알로 옮기고 프로브 샘플러에 버퍼를 배치합니다.
- 비활성화(B), 활성화(A), 비활성화(B) 솔루션(B-A-B 시퀀스)을 사용하여 워크플로에 대한 프로토콜을 만듭니다. 각 농도를 2회 측정하고, 120s에 대해 배양하고, 3회 더 측정할 수 있는 루프를 포함합니다. 워크플로는 기판 전용의 긍정적 인 제어로 시작하여 nanobody의 가장 낮은 농도로 시작됩니다. 각 nanobody 측정은 기판 전용으로 양수 제어의 후속 측정다음에 초기 피크 진폭을 복원하고 다음 높은 nanobody 농도로 이동합니다.
참고: 두 번째 순서 역학은 나노 바디의 결합을 지시합니다. 따라서 B-A 단계에서 시간 지연을 사용하는 것이 중요합니다. 최적의 시간은 nanobody 농도 즉, 더 낮은 농도에서 더 긴 시간이 필요합니다; 여기서 120 s는 만족스러운 결과로 사용되었습니다. - 데이터 분석을 위해 선호하는 소프트웨어를 사용하여 측정된 전류와 시간을 플롯합니다. 피크 전류를 수동으로 읽거나 소프트웨어를 사용하는 경우 활성화버퍼(그림 3A)의추가 범위에서 피크 높이 추정에 대한 함수를 선택합니다. 비선형 회귀를 통해 IC50을 결정하기 위해 nanobody 농도에 대한 피크 전류를플롯(도 3B).
참고: 각 개별 칩에 대해 수행되는 측정의 현재 진폭을 정규화한 후 다양한 칩 제제 간의 측정값을 비교합니다.
6. 센서 세척
- 10mL의 증류수로 사용한 후 단일 센서 칩을 헹구세요.
- 티슈 페이퍼에 눌러 칩을 건조시다.
- 칩의 센서 캐비티를 순수 이소프로판올 100 μL로 채우고 RT에서 10분 동안 인큐베이션합니다.
- 순수한 이소프로판올에 면봉을 놓고 1-3분 동안 배양합니다.
- 미리 담그고 있는 면봉을 사용하여 잔류물을 제거하기 위해 압력없이 센서 표면에서 부드럽게 회전합니다.
- 5mL의 순수 이소프로판올로 센서를 헹구습니다.
- 10mL의 증류수로 센서를 헹구는 다.
- 조직에 칩을 눌러 센서를 건조.
- 센서가 RT에서 밤새 건조하게 하고 건조한 조건에서 RT에 보관하십시오.
참고: 센서를 올바르게 청소하고 보관할 때 최대 4-5회 재사용할 수 있습니다.
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Representative Results
SSM 기반 전기 생리학은 전기 수송기의 특성화에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 여기에 제시된 프로토콜에서, 우리는 그들의 억제 및 비 억제 특성에 근거를 둔 이차 수송기 (여기 세균 콜린 symporter)를 표적으로 하는 나노 체를 분류하기 위하여 SSM 기지를 둔 전기 생리학을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술의 가장 유용한 기능 중 하나는 여러 버퍼 조건의 높은 처리량 검사를 허용한다는 것입니다. 이 특별한 특성은 바인더의 선택 후에 나노 바디의 수십에서 구성될 수 있는 nanobody 도서관의 분석에 유익합니다. 표준 실험에서 안정적인 지질 단층이 센서 칩위에 조립됩니다. 콜린 수송기를 포함하는 프로테올리포좀 제제를 적용한 후, 좋은 전도도성 및 커패시턴스에 대한 점검이 수행되어 실험의 성공을 위해 필수적이다. 실험 중에 멤브레인의 무결성이 손상된 경우, 소음이 높은 배경 전류로 인해 쉽게 관찰될 수 있으며, 낮은 소음 조건을 복구하는 것이 다소 어렵기 때문에 새로운 칩으로 변경하는 것이 좋습니다. 일반적으로, 우리는 다른 칩을 사용할 때 나노 체에 의한 수송 및 억제의 측정 중 아주 좋은 재현성을 관찰했습니다.
나노체의 스크리닝 중에 사용되는 기판 농도에 대해 결정하기 위해, 전기생성 수송은 EC50(도 1B,C)을결정하기 위해 상이한 기판 농도하에서 먼저 측정하였다. 포화 조건에 해당하는 기판농도(도 1C)를선택하였다. 이 기판 농도는 모든 활성화 버퍼에서 일정하게 유지되었습니다. 이 특정 예제에서는 5mM 콜린을 선택했습니다.
나노 체의 스크리닝을 위해, nanobody는 비 활성화 및 활성화 버퍼 모두에 추가되어야 합니다. 나노체가 활성화 완충제에만 첨가되었을 때, 전기원전의 억제를 관찰할 수 없었다. 우리는 이것이 칩의 수송인구에 있는 모든 nanobody 결합 부위의 불완전한 점령 때문이라고 추측하여 비 활성화 조건에서 나노 바디와 사전 잠복의 중요성을 드러냅니다. 모든 사이트가 점유될 가능성이 있는지 확인하기 위해 첫 번째 비활성화 버퍼 단계를 적용하는 동안 전송자 개체수에 nanobody 바인딩 사이트의 포화를 허용하는 시간 지연 단계가 포함되었습니다. 2-60분에 이르는 인큐베이션 시간은 재현 가능한 결과로 테스트되었습니다. 인큐베이션의 최적의 시간은 실험 중 nanobody 바인더의 특성과 농도에 달려 있습니다 (칩의 프로테오폴좀에서 수송기의 농도). 따라서 다른 인큐베이션 시간을 시도하는 것이 좋습니다. 어쨌든, 엄지 손가락의 규칙으로, nanobody 농도가 낮을수록 잠복기가 길어질수록 더 오래 필요합니다. 우리는 다른 나노 바디를 위해 2 분, 20 분, 30 분 및 60 분의 잠복 시간을 시험했지만 추가 수송 억제를 검출하지 않았습니다.
전기원전수송에 대한 억제 나노체의 효과는 피크 전류 진폭(도2A,C, D)의감소로부터 시각화된다. 비 억제 나노 체, 다른 한편으로는, 피크 전류에 영향을 주지 않습니다. 나노체가 결합되지 않도록 세척 프로토콜을 실행한 후, 초기 피크 전류 진폭의 80~95%의 회복이 관찰되었다(도2A,C, D). 우리는 유사한 실험을 수행하지만 수송 단백질없이 리포솜의 존재. 비활성화 조건에서 활성화조건으로 변경할 때, 이러한 완충제(그림2B)에존재하는 나노체에 의해 중요한 유물 전류가 도입되지 않았다. 이 컨트롤 실험을 실행하는 것은 아티팩트에서 피크 전류의 변화가 발생하는지 여부를 아는 것이 중요하기 때문에 권장됩니다.
억제 특성을 가진 나노체를 선택한 후, 개별 나노체에 대한 IC50 값을 결정하였다(도3A,B). 이 특정 실험에 대 한, 나노 체의 낮은 농도시작 하 고 분석 하는 동안 높은 농도 쪽으로 이동 하는 것이 좋습니다. 각 농도에 대한 억제의 계산은 nanobody의 적용 전후에 측정된 피크 전류를 비교하여 수행되었다. 낮은 nanobody 농도를 사용할 때 특히 문제가 될 수있는 표면에 나노 체체의 특이한 결합을 방지하기 위해, 그것은 Kermani외. 37에의해 설명 된 것과 유사한 프로토콜을 따르는 것이 좋습니다, 여기서 50 소 혈청 알부민의 50 μg /mL이 버퍼에 추가된, 이 해로운 효과를 방지. 이러한 지질 막을 용해 것 같은 이 목적을 위해 Tween 또는 Triton와 같은 세제를 추가하는 것은 피해야 합니다.
그림 1: SSM 기반 전기 생리학. (A)과도 전류 측정을 위한 프로토콜. 비활성화 솔루션은 활성화 솔루션으로 대체되고 초기 조건을 복원하기 위한 비활성화 솔루션의 흐름이 뒤따릅니다. 첫 번째 단계에서 나노 체는 수송기에 결합합니다. 활성화 용액으로 전환할 때 기질 그라데이션은 전기 생성 운송(주황색 곡선)을 구동합니다. 억제 nanobody의 존재에서, 피크 전류는 작은 진폭 (파란색 곡선)을 보여줍니다. 프로토콜을 완료하고 nanobody없이 솔루션을 실행 한 후 (세척), 나노 바디의 바인딩되지 않은 발생. 회로도에서, 재구성 된 단백질 (파란색)을 가진 proteoliposomes는 SSM 센서에 고정됩니다. 삼각형과 빨간색 원은 각각 나노 체와 기판을 나타냅니다. (B)나노체가 없는 경우 전기콜린 수송. 활성화 조건 동안 측정된 피크 전류는 다른 기판 농도에 대해 표시됩니다. (C)상이한 기판 농도에서 수송 단백질이 없는 상태에서 활성화 조건 동안 전류의 대표적인 측정. (D)최고 전류 진폭 대 기판 농도의 플롯. EC50은 95± 11 μM 콜린이었다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다(n=3 생물학적 복제, n=3 기술적 복제). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 억제및 비 억제 나노체의 선별 및 분류. (A)전기 콜린 수송의 무너트. 활성화 조건 동안 측정된 피크 전류는 nanobody(파란색)의 부재, 억제 nanobody(빨간색)의 존재, 그리고 나아무도 결합하지 않은 후(녹색)이 없는 것으로 나타난다. (B)수송 단백질이 없는 상태에서 활성화 조건 동안 전류의 측정. 흔적은 나노(파란색)의 부재 시, 억제 나노(녹색)의 존재, 그리고 비억제 나노(빨간색)의 존재가 있는 기록을 보여준다. (C,D). 나노 체의 존재와 nanobody 바인딩 후 조건 활성화 하는 동안 측정 된 피크 전류를 보여주는 히스토그램 (복구). 패널 C는 nanobody 당 개별 칩을 사용하여 측정 결과를 보여줍니다. 패널 D는 하나의 칩을 사용하여 직렬 측정의 결과를 보여줍니다. 나노체는 Nb. Error 막대가 표준 편차를 나타내는 것으로 표시됩니다(n=3 생물학적 복제, n=2 기술적 복제). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 억제 nanobody의 IC50의 결정. (A)전기 콜린 수송 및 nanobody에 의해 억제. 활성화 조건 동안 측정된 피크 전류는 다른 nanobody 농도에 대해 표시됩니다. (B)억제 nanobody와 직렬 측정에서 피크 전류 진폭 대 nanobody 농도의 플롯. 결정된 IC50은 18 ± 2nM이었다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다(n=3 생물학적 복제, n=3 기술적 복제). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 기술은 전기 수송기를 표적으로 하는 억제 및 비 억제 특성으로 나노바디를 분류합니다. 기판 수송을 평가하는 것은 프로테오폴솜의 막에 내장된 수송기를 통해 전하의 이동의 검출으로 인해 가능하다. 실험의 설치 중 중요한 단계 중 일부는 리포솜의 활성 단백질의 재구성, SSM 칩에 안정적인 단층의 준비, 바운드 nanobody 분자를 제거하기 위해 세척 프로토콜의 적용 후 초기 조건의 복구입니다. 멤브레인 단백질이 적절한 지질 대 단백질 비율로 재구성되면, 일반 SSM 프로토콜은 네이티브 기판을 사용하여 확립될 수 있다. 단백질이 없는 리포솜을 사용하여 프로테오이좀을 사용하여 측정된 전류에서 빼야 하는 소음 전류를 드러내는 것이 중요합니다. 그러나 노이즈 전류가 너무 크면 다른 지질을 사용하여 단백질 재구성을 시도하거나 이러한 해로운 신호를 최소화하는 완충 조건에 대한 화면을 시도하는 것이 좋습니다. SSM 분석에 대한 조건을 성공적으로 수립한 후 나노바디의 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 나노 바디의 빠른 스크리닝에 도움이 될 수 있는 매우 유용한 옵션은 단일 SSM 센서 칩을 사용하여 고처리량 분석작업을 수행하는 것입니다. 이렇게 하면 칩과 버퍼를 조작하는 시간이 줄어들고 비용이 절감됩니다. 그러나 이러한 유형의 분석 과정에서 여러 나노바디가 순차적으로 적용되기 때문에, 적용된 nanobody가 측정 후 씻어내도록 하는 것이 중요하다. 엄격한 세척 주기는 nanobody의 부재에서 피크 전류 진폭이 검출되는 경우에 몇몇 나노 바디를 풀어 붙이기 위하여 실행될 필요가 있을 수 있습니다. 여기에 설명된 세탁 조건은 시작점으로 사용하는 것이 좋습니다. 세척 볼륨이나 사이클 수를 늘리는 것이 도움이 되지 않는 경우 개별 칩을 사용하여 각 nanobody를 별도로 검사해야 합니다. 여기에서 검토된 모든 경우에, 나노 바디의 결합은 뒤집을 수 있었고 고처리량 프로토콜을 적용될 수 있었습니다. 우리의 실험 설정에서, 우리는 나노 바디를 가진 측정 후에 초기 피크 전류의 전체 진폭을 복구할 수 없었습니다(그림 1A; 그림2C,D). 그러나, 대부분의 경우, 최고 전류의 크기는 나노체(도2C,D)를적용하기 전에 측정된 진폭의 80~95% 사이였다. 우리는 이것이 칩에 부착된 프로테오올리포좀의 일부를 씻어내거나 일부 억제 나노체의 결합을 느리게 운동하거나 둘 다의 조합으로 인해 씻는 결과일 수 있다고 추측합니다. 두 경우 모두, 전기 원수송이 측정 가능했기 때문에 추가 나노 체체를 계속 말하는 것이 가능했습니다. 이것은 그림 2D에표시되며, 여기서 우리는 단일 칩 준비를 사용하여 6 개의 나노 체를 선별했습니다.
높은 처리량 특성은 제시된 방법의 가장 중요한 발전 중 하나입니다. 또한, 다른 접근법과는 달리, 이 방법은 표지된 기판을 사용할 수 없는 전기 수송기를 대상으로 하는 억제 나노체의 선택을 허용한다. 억제 나노 바디의 빠른 확인은 약으로 나노 바디의 새로운 응용을 확인하는 것을 목표로 하는 연구 속도를 높이는 것을 도울 수 있습니다. 항체 처리와 같은 유사한 치료에 비교된 그들의 명백한 이점은 조직 또는 세포로 더 전파하는 것을 돕는 더 작은 크기로 시작해서, 그들의 낮은 생산 비용 및 높은 안정성에, 수많은 입니다.
SSM 계 전기생리학은 과거에 멤브레인소포(29,38)에서전기 생성 수송기의 특성화를 위해 사용되어 왔다. 이러한 유형의 실험은 단백질 정제 및 재구성 프로토콜에 의존하지 않기 때문에 유리합니다. 우리는 막 소포를 사용하여 억제 나노 체의 선택을 수행하는 것이 가능하다고 추측한다. 이것은 비용을 절감하고 정제 된 단백질의 조작을 피하는 데 도움이 될 것입니다.
SSM 기반 전기 생리학은 전기 원수송을 전시하는 다중 막 단백질의 nanobody 억제제를 선별하는 강력한 기술입니다. 우리는 SSM 기지를 둔 전기 생리학이 잠재적인 임상 응용을 가진 억제 나노 체 및 그밖 항체의 선택을 위한 중요한 공구가 될 것이라는 점을 구상합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
취리히 대학의 의학 미생물학 연구소의 세드릭 A. J. 허터와 마르쿠스 A. 시거, 바젤 대학의 바이오젠트럼의 곤잘로 세브레로(Gonzalo Cebrero)에게 합성 나노바디(sybody)의 세대협력에 감사드립니다. 난니온 테크놀로지스의 마리아 바스메스와 안드레 바조네에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (SNSF)(PP00P3_170607 및 NANION 연구 보조금 이니셔티브에서 C.P.에 의해 지원되었습니다.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | ----- | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
References
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