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Biochemistry

Sélection de nanocorps inhibiteurs ciblant les transporteurs par électrophysiologie à membrane solide (SSM)

Published: May 3, 2021 doi: 10.3791/62578
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Les nanocorps sont des outils importants en biologie structurale et présentent un grand potentiel pour le développement de thérapies. Cependant, la sélection de nanocorps ayant des propriétés inhibitrices peut être difficile. Nous démontrons ici l’utilisation de l’électrophysiologie à membrane solide (SSM) pour la classification des nanocorps inhibiteurs et non inhibiteurs ciblant les transporteurs membranaires électrogéniques.

Abstract

Les anticorps à domaine unique (nanocorps) ont été largement utilisés dans les études mécanistes et structurelles des protéines et ils présentent un énorme potentiel en tant qu’outils pour le développement de thérapies cliniques, dont beaucoup dépendent de l’inhibition des protéines membranaires telles que les transporteurs. Cependant, la plupart des méthodes utilisées pour déterminer l’inhibition de l’activité de transport sont difficiles à effectuer dans les routines à haut débit et dépendent de la disponibilité des substrats marqués, ce qui complique le criblage de grandes bibliothèques de nanocorps. L’électrophysiologie à membrane solide (SSM) est une méthode à haut débit, utilisée pour caractériser les transporteurs électrogéniques et mesurer leur cinétique de transport et leur inhibition. Nous montrons ici la mise en œuvre de l’électrophysiologie basée sur le MSU pour sélectionner des nanocorps inhibiteurs et non inhibiteurs ciblant un transporteur secondaire électrogénique et pour calculer les constantes inhibitrices des nanocorps. Cette technique peut être particulièrement utile pour sélectionner des nanocorps inhibiteurs ciblant des transporteurs pour lesquels des substrats marqués ne sont pas disponibles.

Introduction

Les anticorps sont composés de deux chaînes lourdes identiques et de deux chaînes légères responsables de la liaison à l’antigène. Les camélidés ont des anticorps à chaîne lourde seulement qui présentent une affinité similaire pour leur antigène apparenté par rapport aux anticorps conventionnels1,2. Le domaine variable unique (VHH) des anticorps à chaîne lourde conserve le plein potentiel de liaison à l’antigène et s’est avéré très stable1,2. Ces molécules VHH isolées ou « nanocorps » ont été mises en œuvre dans des études liées à la biochimie des protéines membranaires comme outils de stabilisation des conformations3,4,comme inhibiteurs5,6,comme agents de stabilisation7,et comme gadgets pour la détermination de la structure8,9,10 . Les nanocorps peuvent être générés par l’immunisation des camélidés pour le pré-enrichissement des cellules B qui codent des nanocorps spécifiques à la cible et l’isolement ultérieur des cellules B, suivi du clonage de la bibliothèque de nanocorps et de la sélection par affichage dephages 11,12,13. Une autre façon de générer des nanocorps est basée sur des méthodes de sélection in vitro qui reposent sur la construction de bibliothèques et la sélection par affichage de phages, affichage de ribosomes ou affichage de levure14,15,16,17,18,19,20. Ces méthodes in vitro nécessitent de grandes bibliothèques mais bénéficient d’éviter l’immunisation animale et favorisent la sélection de nanocorps ciblant des protéines relativement peu stables.

La petite taille des nanocorps, leur grande stabilité et solubilité, leur forte affinité antigénique, leur faible immunogénicité et leur production relativement facile en font de bons candidats pour le développement de thérapies21,22,23. En particulier, les nanocorps inhibant l’activité de protéines membranaires multiples sont des atouts potentiels pour des applications cliniques5,24,25,26. Dans le cas des transporteurs membranaires, pour évaluer si un nanocorps a une activité inhibitrice, il est nécessaire de développer un test permettant la détection de substrats transportés et/ou de co-substrats. De tels tests impliquent généralement des molécules marquées ou la conception de méthodes de détection spécifiques au substrat, qui peuvent ne pas avoir d’application universelle. De plus, l’identification de nanocorps inhibiteurs nécessite généralement le criblage d’un grand nombre de liants. Ainsi, une méthode qui peut être utilisée en mode haut débit et qui ne repose pas sur des substrats étiquetés est essentielle pour cette sélection.

L’électrophysiologie basée sur le MSU est une technique extrêmement sensible et très résolue dans le temps qui permet de détecter le mouvement des charges à travers les membranes (par exemple, la liaison /transport d’ions)27,28. Cette technique a été appliquée pour caractériser les transporteurs électrogéniques, qui sont difficiles à étudier en utilisant d’autres techniques d’électrophysiologie en raison du renouvellement relativement faible de ces protéines29,30,31,32,33,34,35. L’électrophysiologie SSM ne nécessite pas l’utilisation de substrats marqués, elle convient au criblage à haut débit et des protéoliposomes ou des vésicules membranaires contenant le transporteur d’intérêt peuvent être utilisés. Ici, nous démontrons que l’électrophysiologie basée sur le MSU peut être utilisée pour classer les nanocorps ciblés par les transporteurs avec des propriétés inhibitrices et non inhibitrices. Comme preuve de principe, nous décrivons la reconstitution d’un transporteur de choline bactérienne en liposomes, suivie d’étapes détaillées pour l’immobilisation des protéoliposomes sur les capteurs SSM. Nous décrivons ensuite comment effectuer des mesures électrophysiologiques basées sur le MSU du transport de la choline et comment déterminer la concentration efficace demi-maximale (EC50). Nous montrons ensuite comment utiliser l’électrophysiologie basée sur le MSU pour dépister plusieurs nanocorps et identifier les inhibiteurs du transport de la choline. Enfin, nous décrivons comment déterminer les concentrations inhibitrices demi-maximales (IC50)de nanocorps inhibiteurs sélectionnés.

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Protocol

1. Reconstitution des protéines membranaires

  1. Mélanger 3 mL de lipides polaires d’E. coli avec 1 mL de phosphatidylcholine dans une fiole à fond rond sous une hotte ventilée.
  2. Sécher le mélange lipidique pendant 20 min sous vide à l’aide d’un évaporateur rotatif et d’un bain-marie à 37 °C pour éliminer le chloroforme. Si nécessaire, sécher davantage sous azote ou argon gazeux.
  3. À l’aide d’un tampon TS (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) contenant 2 mM β-mercaptoéthanol, ressusciter les lipides à 25 mg/mL.
  4. Aliquote lipides dans des aliquotes de 500 μL, congeler instantanément dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C.
  5. Décongeler une aliquote de 500 μL de lipides et diluer 1:1 à l’aide d’un tampon TS contenant 2 mM de β-mercaptoéthanol.
  6. Extruder la suspension lipidique 15 fois à l’aide d’une membrane de 400 nm.
  7. Diluer la suspension lipidique pour obtenir une concentration lipidique finale de 4,4 mg/mL.
  8. Ajouter le n-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) pour obtenir une concentration finale de 0,2 % et laisser tourner pendant 1 h à 200 tr/min à température ambiante (RT).
  9. Ajouter la protéine purifiée aux lipides en utilisant un rapport lipide-protéine compris entre 1:10 et 1:100 (w:w).
    REMARQUE: Le rapport doit être ajusté en fonction de la force du signal détecté dans les mesures SSM-électrophysiologie du transport du substrat (voir ci-dessous). Pour obtenir des signaux plus importants, utilisez des rapports lipides/protéines plus petits.
  10. Incuber le mélange en tournant à 200 tr/min pendant 1 h à RT.
  11. Ajouter 30 mg/mL de billes adsorbantes de polystyrène, prélavées dans un tampon TS.
    REMARQUE: Ajouter des perles de polystyrène dans les deux sens.
  12. Incuber le mélange perles-lipides pendant 30 min à RT sous agitation lente.
  13. Pour enlever les perles, laissez reposer le mélange perles-lipides afin que les perles se déposent. Transférez la solution dans un nouveau tube et laissez les perles derrière. Ajouter 30 mg/mL de billes adsorbantes de polystyrène frais au mélange lipidique séparé.
  14. Incuber le mélange pendant 1 h à 4 °C sous agitation lente.
  15. Séparer les billes du mélange comme décrit à l’étape 1.13 et ajouter 30 mg/mL de billes adsorbantes de polystyrène frais.
  16. Incuber le mélange pendant 16 h à 4 °C.
  17. Séparer les billes du mélange comme décrit à l’étape 13 et ajouter 30 mg/mL de billes adsorbantes de polystyrène frais.
  18. Incuber le mélange pendant 2 h à 4 °C pour un quatrième et dernier lavage.
  19. Centrifuger à 110 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
  20. Laver la pastille avec 500 μL de tampon TS contenant 2 mM de β-mercaptoéthanol.
  21. Centrifuger à nouveau à 110 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
  22. Remettre la pastille à une concentration lipidique finale de 25 mg/mL dans un tampon TS avec 2 mM de β-mercaptoéthanol.
  23. Estimer la concentration en protéines à l’aide d’un dosage noir en gel ou amido36.
  24. Aliquoter les protéoliposomes, congeler brusquement dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C.

2. Préparation des copeaux

  1. Remplissez une seule puce de capteur avec 50-100 μL de solution de 0,5 mM de 1-octadécanéthiol (remise en suspension dans l’isopropanol).
  2. Incuber la puce avec la solution pendant 30 min à RT.
  3. Retirez la solution de thiol en tapotant la puce sur un tissu.
  4. Rincez le capteur 3 fois avec 5 mL d’isopropanol pur.
  5. Rincez le capteur 3 fois avec 5 mL d’eau double distillée.
  6. Séchez le capteur en tapotant sur un papier de soie.
  7. Appliquer 1,5 μL de 7,5 μg/μL de 1,2-diphytananoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (lipides séchés dans un évaporateur rotatif et remis en suspension dans du n-décane).
  8. Immédiatement après, remplissez le capteur avec 50 μL de tampon SSM non activateur, qui ne contient pas le substrat. Cela conduira à une formation spontanée de la couche SSM.
    REMARQUE: Le tampon SSM doit être optimisé au préalable pour déterminer les conditions optimales avec un faible bruit de fond. Un tampon général contenant 30 mM HEPES pH 7,4, 5 mM MgCl2,140 mM NaCl, peut être utilisé comme point de départ. Le tampon SSM sans substrat est utilisé pour le lavage avant et après la mesure (tampon non activateur). Pour éviter toute incompatibilité de tampon, utilisez le tampon non activateur pour préparer le tampon contenant le substrat (tampon d’activation). Le substrat peut être ajouté soit directement sous forme de poudre, soit dans un petit volume à partir d’un stock à forte concentration pour éviter les dilutions.
  9. Décongeler les protéoliposomes à partir de l’étape 1.24 à RT.
  10. Diluer les protéoliposomes entre 1:5 et 1:100 (protéoliposomes:tampon, (v:v)) dans le tampon SSM non activateur (ici 1:20).
  11. Protéoliposomes sonicate pendant 20-30 s ou 3 fois pendant 10 s, en les plaçant sur de la glace entre les sonications, si nécessaire. Ici, un sonificateur de bain d’eau à 45 kHz a été utilisé.
  12. Appliquer 5 à 10 μL de l’échantillon de protéoliposomes soniques dilués sur la surface du capteur sans le toucher.
  13. Centrifuger les puces avec la solution à RT pendant 30 min en utilisant une vitesse comprise entre 2 000 et 3 000 x g.
    REMARQUE: Utilisez des tubes de 50 mL avec un fond plat. Placez soigneusement les puces du capteur à l’aide d’une pince à épiler. Des plaques à 6 puits et une centrifugeuse avec un porte-plaques peuvent également être utilisées.
  14. Utilisez les puces du capteur le même jour.

3. Mesure du transport du soluté : détermination des conditions de saturation

NOTE: Comme preuve de principe, ces expériences ont été réalisées à l’aide d’un transporteur de choline bactérienne reconstitué dans des liposomes suivant le protocole décrit ci-dessus. Le processus étape par étape de détermination des conditions saturantes du substrat choline avant la mesure de l’inhibition par les nanocorps est montré ici.

  1. Préparez 1 à 2 L de la mémoire tampon SSM non active.
    REMARQUE : Préparez et utilisez le même stock tampon MSU pour tous les tampons activateurs et non activateurs dans toutes les mesures.
  2. Prenez 10 tubes propres et transférez 10 mL du tampon SSM non activateur dans chacun d’eux.
  3. Ajouter le substrat dans les tubes à partir de l’étape 3.2 en utilisant une série de concentrations autour de la demi-concentration maximale attendue (ici 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 mM de choline) pour préparer les tampons SSM activateurs. Utilisez un bouillon à haute concentration pour éviter les dilutions.
  4. Allumez la machine SSM.
  5. Démarrez le logiciel SSM et laissez la machine s’initialiser automatiquement. Définissez le chemin d’enregistrement des données et confirmez en appuyant sur le bouton OK. Sélectionnez le protocole de nettoyage initial standard dans les options de flux de travail et cliquez sur Exécuter.
  6. Montez la puce revêtue de protéoliposome sur la douille, déplacez le bras pour verrouiller la puce et fermez la puce montée avec le capuchon.
  7. Sélectionnez le programme CapCom dans le flux de travail et laissez-le s’exécuter pour déterminer la conductivité et la capacité. Vérifiez que la conductivité est inférieure à 5 nS et que la capacité est comprise entre 15 et 35 nF avant de l’utiliser pour la mesure.
    REMARQUE: Une valeur de capacité de 15-35 nF et une conductance inférieure à 5 nS sont recommandées par le fabricant lors de l’utilisation d’une puce de 3 mm.
  8. Transférez les solutions d’activation dans des flacons et positionnez les tampons dans l’échantillonneur de sonde.
  9. Transférez le tampon non activateur dans un réservoir et placez-le à côté du porte-puce à la position du réservoir à droite.
  10. Créez un protocole pour le flux de travail à l’aide d’une séquence de solutions non actives (B), activantes (A) et non actives (séquence B-A-B) et d’une boucle qui effectue trois mesures et passe au tampon d’activation suivant pour les 10 tampons préparés à l’étape 3.3. Utilisez le débit par défaut à 200 μL/s en utilisant des temps d’écoulement de 1 s - 1 s - 1 s pour la séquence B-A-B. Cliquez sur Lecture pour démarrer la mesure.
    REMARQUE: Une expérience typique consiste en un flux séquentiel de solutions non actives (B), activantes (A) et non actives (B) (écrites B-A-B; voir figure 1A). Les protéoliposomes immobilisés sur le capteur seront lavés avec les solutions. Par conséquent, l’échange de solution B-A génère un gradient de concentration du substrat, qui entraîne la réaction de transport électrogénique.
  11. Enregistrez le protocole et laissez le flux de travail s’exécuter en cliquant sur le bouton Lecture. Effectuez le même type d’expérience, mais en utilisant des liposomes sans protéines. Ceci est très important car cela montrerait l’intensité des courants de fond. Ceci doit être pris en compte lors de l’analyse des données de transport électrogénique mesurées avec des protéoliposomes (Figure 1C).
  12. Utilisez n’importe quel logiciel préféré pour l’analyse des données afin de tracer le courant mesuré par rapport au temps. Lisez le courant de crête manuellement ou, si vous utilisez le logiciel, utilisez la fonction d’estimation de la hauteur de crête dans la plage de l’ajout du tampon d’activation.
  13. Tracer le courant de crête par rapport à la concentration du substrat pour déterminer la CE50 du substrat via la régression non linéaire (Figure 1B, C). Lisez la concentration la plus basse à laquelle le courant de crête atteint une valeur maximale, cette concentration correspond à des conditions saturantes.
    REMARQUE: Il est important de considérer que le nombre de protéoliposomes qui restent immobilisés varie d’une puce à l’autre. Cette variation est évidente car les courants de crête dans des conditions de mesure identiques montreront des amplitudes différentes. Par conséquent, il est nécessaire de normaliser les amplitudes actuelles des mesures effectuées sur chaque puce séparément avant de comparer les mesures entre différentes préparations de puces.

4. Classification en série des nanocorps inhibiteurs et non inhibiteurs

REMARQUE: Cette section montre comment mesurer le transport de la choline en présence de nanocorps qui se lient spécifiquement au transporteur bactérien de choline. Des courants de crête plus petits en présence de nanocorps indiquent une inhibition du transport. Les nanocorps non inhibiteurs n’auront pas d’impact sur le transport du substrat, c’est-à-dire aucune diminution du signal de courant de crête.

  1. Préparez 1 à 2 L de mémoire tampon SSM non active.
  2. Transférer 50 mL du tampon SSM non activateur dans un tube propre. Ajouter le substrat choline à une concentration finale de 5 mM (conditions saturantes). Utilisez-le pour une mesure de contrôle positif.
  3. Transférer 10 mL du tampon SSM non activateur dans un tube propre. Ajouter la choline de substrat à une concentration finale de 5 mM (conditions saturantes) et ajouter le nanocorps à une concentration finale de 500 nM.
  4. Répétez l’étape 4.3 pour chaque nanocorps afin de préparer les solutions d’activation.
    REMARQUE: Si les nanocorps purifiés sont remis en suspension dans un tampon différent de celui du tampon SSM, leur ajout aux tampons d’activation et de non-activation entraînera une incompatibilité de tampon. Une incompatibilité de tampon doit être évitée car elle peut entraîner un bruit élevé. L’échange du tampon des nanocorps purifiés avec le tampon SSM peut aider à éviter ce problème. De plus, il est recommandé d’utiliser des concentrations de nanocorps permettant d’atteindre des conditions saturantes. Considérant que les constantes de liaison des nanocorps sont généralement inférieures à 100 nM, une concentration de nanocorps de 500 nM est recommandée pour cette expérience. Cependant, il est important de présélectionner les concentrations optimales.
  5. Démarrez la machine SSM et mesurez la capacité et la conductivité de la puce revêtue de protéoliposome comme décrit aux étapes 3.4-3.7.
  6. Transférez la solution activatrice sans nanocorps dans un flacon et placez le tampon dans l’échantillonneur de sonde. Transférez le tampon non activateur sans nanocorps dans un réservoir et positionnez-le dans l’échantillonneur de sonde.
  7. Transférer les solutions d’activation contenant des nanocorps dans des flacons et positionner les tampons dans l’échantillonneur de sonde. Transférez les tampons non activateurs contenant des nanocorps dans des flacons et positionnez les tampons dans l’échantillonneur de sonde.
  8. Créez un protocole pour le flux de travail à l’aide d’une séquence de solutions non actives (B), activatrices (A) et non actives (B) (séquence B-A-B).
  9. Créez une boucle qui effectue les opérations suivantes : trois mesures de la séquence B-A-B à l’aide de tampons sans nanocorps, deux mesures de la séquence B-A-B avec des tampons contenant un nanocorps, un délai de 120 s pour l’incubation avec le nanocorps, puis 3 mesures de la séquence B-A-B avec des tampons contenant le nanocorps.
  10. Enregistrez le flux de travail et laissez-le s’exécuter en cliquant sur le bouton Lecture.
    REMARQUE: Ce flux de travail mesurera les conditions initiales du transport sans inhibition en exécutant le protocole B-A-B 3 fois en utilisant des tampons non activateurs (B) et en activant des tampons (A) sans le nanocorps (Figure 1B, C), suivi de la mesure de l’effet du nanocorps sur le transport en exécutant le protocole B-A-B 5 fois avec les tampons non activateurs et activateurs contenant des nanocorps ( Figure2A ). La cinétique de liaison du deuxième ordre dicte l’interaction des nanocorps et de leurs protéines cibles. Par conséquent, il est important d’utiliser un délai dans l’étape B-A afin de donner suffisamment de temps aux nanocorps pour se lier aux transporteurs dans les protéoliposomes sur la puce. Les temps optimaux dépendent de la concentration du nanocorps, c’est-à-dire qu’à des concentrations plus faibles, des temps plus longs sont nécessaires. Les deux premières mesures sont nécessaires pour adapter le système aux nouvelles conditions et la deuxième série doit être effectuée après un délai de 120 s. Seules les trois mesures suivantes doivent être utilisées pour l’analyse des données.
  11. Créez un nouveau protocole pour le flux de travail à l’aide d’une séquence de solutions non actives (B), activatrices (A) et non actives (séquence B-A-B) et d’une boucle de 5 mesures pour éliminer le nanocorps lié de manière réversible.
    REMARQUE: En option, incluez une étape d’incubation pour permettre la dissociation des nanocorps à cinétique lente.
  12. Enregistrez le flux de travail et laissez-le s’exécuter en cliquant sur le bouton Lecture.
  13. Comparez le dernier courant de crête des mesures avec la mesure initiale du substrat uniquement à l’étape 4.10. Le nanocorps a été lavé avec succès et les conditions initiales ont été rétablies si le courant de crête atteint la valeur initiale, sinon répétez les étapes 4.12 à 4.13 ou passez à une nouvelle puce.
  14. Répétez les étapes 4.6 à 4.13 et utilisez des puces individuelles pour chaque écran de nanocorps(Figure 2C)ou répétez avec plusieurs nanocorps utilisant la même puce (Figure 2D).
  15. Utilisez n’importe quel logiciel préféré pour l’analyse des données afin de tracer le courant mesuré par rapport au temps. Lisez le courant de crête manuellement ou, si disponible, dans le logiciel utilisé, sélectionnez automatiquement la fonction d’estimation de la hauteur de crête dans la plage de l’ajout du tampon d’activation.
  16. Normaliser le courant de crête en présence du nanocorps, sur la base de la mesure précédente du substrat uniquement. Tracez les courants de crête dans un histogramme et comparez les courants de crête du substrat uniquement aux courants de crête mesurés en présence de nanocorps(Figure 2C,D)pour identifier les nanocorps inhibiteurs.
    REMARQUE: La normalisation des courants de crête déterminés de chaque course individuelle avec un nanocorps doit être effectuée en tenant compte du courant de crête en l’absence du nanocorps de la mesure précédente. De plus, étant donné que le nombre de protéoliposomes qui restent immobilisés varie d’une puce à l’autre, il est important de normaliser les amplitudes actuelles des mesures effectuées sur chaque puce séparément avant de comparer les mesures entre différentes préparations de puces.

5. Mesure de laCI 50 avec des nanocorps inhibiteurs

REMARQUE: Après avoir identifié les nanocorps inhibiteurs, il est possible de déterminer leur demi-concentration inhibitrice maximale (IC50). Cela se fait en mesurant le transport de la choline à concentration constante, tout en faisant varier les concentrations du nanocorps inhibiteur.

  1. Préparez 1 à 2 L de la mémoire tampon SSM non active.
  2. Transférer 50 mL du tampon SSM non activateur dans un tube propre. Ajouter le substrat choline à une concentration finale de 5 mM (conditions saturantes). Utilisez-le comme solution d’activation pour le contrôle positif.
  3. Prenez 8 tubes propres et ajoutez 5 mL de la solution non activatrice dans chacun. Ajouter le substrat choline à une concentration finale de 5 mM (conditions saturantes). Ajouter le nanocorps inhibiteur aux tubes à des concentrations dans la gamme IC50 attendue (ici 500 nM - 1 nM).
  4. Prenez 8 tubes propres et ajoutez 10 mL de la solution non activatrice dans chacun. Ajouter un nanocorps inhibiteur à chaque tube individuellement à la même concentration qu’à l’étape 5.3. Cela correspond au tampon non activateur.
    REMARQUE: Cela générera une série de paires de tampons activateurs et non activateurs à différentes concentrations du même nanocorps inhibiteur.
  5. Démarrez la configuration SSM et mesurez la capacité et la conductivité de la puce revêtue de protéoliposome comme décrit aux étapes 3.4-3.7.
  6. Transférez la solution activatrice sans nanocorps dans un flacon et placez-la dans l’échantillonneur de sonde. Transférez le tampon non activateur sans nanocorps dans un réservoir et positionnez-le à la position du réservoir à côté du porte-puce à droite.
  7. Transférer les solutions d’activation contenant des nanocorps dans des flacons et positionner les tampons dans l’échantillonneur de sonde. Transférez les tampons non activateurs contenant des nanocorps dans des flacons et positionnez les tampons dans l’échantillonneur de sonde.
  8. Créez un protocole pour le flux de travail à l’aide d’une séquence de solutions non actives (B), activatrices (A) et non actives (B) (séquence B-A-B). Inclure une boucle pour mesurer chaque concentration 2 fois, incuber pendant 120 s et mesurer 3 fois de plus. Le flux de travail commencera par le contrôle positif du substrat uniquement, suivi de la concentration la plus faible du nanocorps. Chaque mesure de nanocorps sera suivie d’une mesure ultérieure du contrôle positif avec substrat uniquement pour restaurer l’amplitude de crête initiale, avant de passer à la concentration de nanocorps supérieure suivante.
    REMARQUE: La cinétique du deuxième ordre dicte la liaison des nanocorps. Par conséquent, il est important d’utiliser un délai dans l’étape B-A. Les temps optimaux dépendent de la concentration du nanocorps, c’est-à-dire qu’à des concentrations plus faibles, des temps plus longs sont nécessaires; ici 120 s a été utilisé avec des résultats satisfaisants.
  9. Utilisez n’importe quel logiciel préféré pour l’analyse des données afin de tracer le courant mesuré par rapport au temps. Lisez le courant de crête manuellement ou, si vous utilisez un logiciel, sélectionnez la fonction d’estimation de la hauteur de crête dans la plage de l’ajout du tampon d’activation (Figure 3A). Tracer les courants de crête par rapport à la concentration de nanocorps pour déterminer l’IC50 par régression non linéaire(Figure 3B).
    REMARQUE: Normalisez les amplitudes actuelles des mesures effectuées pour chaque puce individuelle avant de comparer les mesures entre différentes préparations de puces.

6. Nettoyage des capteurs

  1. Rincez les copeaux du capteur unique après utilisation avec 10 mL d’eau distillée.
  2. Séchez la puce en la tapotant sur un papier de soie.
  3. Remplissez la cavité du capteur de la puce avec 100 μL d’isopropanol pur et incubez pendant 10 min à RT.
  4. Placez un coton-tige dans de l’isopropanol pur et incubez pendant 1 à 3 min.
  5. Utilisez les cotons-tiges pré-trempés et faites pivoter doucement sur la surface du capteur sans pression pour éliminer les résidus.
  6. Rincez le capteur avec 5 mL d’isopropanol pur.
  7. Rincer le capteur avec 10 mL d’eau distillée.
  8. Séchez le capteur en tapotant la puce sur un mouchoir.
  9. Laissez le capteur sécher pendant la nuit à RT et stockez-le à RT dans des conditions sèches.
    REMARQUE: Les capteurs peuvent être réutilisés jusqu’à 4-5 fois lorsqu’ils sont nettoyés et stockés correctement.

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Representative Results

L’électrophysiologie basée sur le MSU a été largement utilisée pour la caractérisation des transporteurs électrogéniques. Dans le protocole présenté ici, nous montrons comment utiliser l’électrophysiologie basée sur le MSU pour classer les nanocorps ciblant un transporteur secondaire (ici un symporteur de choline bactérienne) en fonction de leurs propriétés inhibitrices et non inhibitrices. L’une des caractéristiques les plus utiles de cette technique est qu’elle permet le criblage à haut débit de plusieurs conditions tampons. Cette caractéristique particulière est bénéfique pour l’analyse des bibliothèques de nanocorps, qui, après la sélection des liants, peuvent être constituées de quelques à des dizaines de nanocorps. Dans une expérience standard, une monocouche lipidique stable est assemblée sur une puce de capteur. Après avoir appliqué la préparation de protéoliposomes contenant le transporteur de choline, un contrôle de la bonne conductivité et de la capacité est effectué car cela est essentiel pour le succès de l’expérience. Dans le cas où l’intégrité de la membrane est compromise au cours d’une expérience, ce qui est facilement observé en raison des courants de fond de bruit élevés, le passage à une nouvelle puce est recommandé car il est plutôt difficile de récupérer des conditions de faible bruit. En général, nous avons observé une très bonne reproductibilité parmi les mesures de transport et d’inhibition par des nanocorps lors de l’utilisation de différentes puces.

Pour décider de la concentration du substrat à utiliser lors d’un criblage de nanocorps, le transport électrogénique a d’abord été mesuré sous différentes concentrations de substrat pour déterminer EC50 (Figure 1B, C). Une concentration de substrat correspondant à des conditions de saturation a été sélectionnée (Figure 1C). Cette concentration de substrat a ensuite été maintenue constante dans tous les tampons d’activation. Pour cet exemple particulier, nous avons sélectionné 5 mM de choline.

Pour le criblage des nanocorps, le nanocorps doit être ajouté aux tampons non activateurs et activateurs. Lorsque des nanocorps ont été ajoutés uniquement au tampon d’activation, il n’a pas été possible d’observer une inhibition du transport électrogénique. Nous supposons que cela est dû à une occupation incomplète de tous les sites de liaison de nanocorps dans la population de transporteurs sur la puce, révélant ainsi l’importance de la pré-incubation avec des nanocorps dans des conditions non actives. Pour s’assurer que tous les sites sont susceptibles d’être occupés, une étape de délai a été incluse lors de l’application de la première étape tampon non activatrice pour permettre la saturation des sites de liaison de nanocorps sur la population de transporteurs. Des temps d’incubation allant de 2 à 60 minutes ont été testés avec des résultats reproductibles. Gardez à l’esprit que les temps optimaux d’incubation dépendent de la nature du liant nanocorps et de sa concentration au cours de l’expérience (ainsi que de la concentration du transporteur dans les protéoliposomes sur la puce). Par conséquent, il est recommandé d’essayer différents temps d’incubation. Dans tous les cas, en règle générale, plus la concentration de nanocorps est faible, plus le temps d’incubation requis est long. Nous avons testé des temps d’incubation de 2 min, 20 min, 30 min et 60 min pour différents nanocorps, mais nous n’avons pas détecté d’inhibition supplémentaire du transport.

L’effet des nanocorps inhibiteurs sur le transport électrogénique est visualisé à partir de la diminution des amplitudes des courants de crête(Figure 2A,C, D). Les nanocorps non inhibiteurs, en revanche, n’affectent pas les courants de crête. Après avoir exécuté le protocole de lavage pour permettre aux nanocorps de se délier, une récupération de 80 à 95% de l’amplitude initiale du courant de crête a été observée(Figure 2A,C, D). Nous avons réalisé une expérience similaire mais en présence de liposomes sans la protéine transporteuse. Lors du passage de conditions de non-activation à des conditions d’activation, aucun courant d’artefact significatif n’a été introduit par les nanocorps présents dans ces tampons(Figure 2B). L’exécution de cette expérience de contrôle est recommandée car il est important de savoir si les changements dans les courants de crête proviennent d’artefacts ou non.

Après la sélection de nanocorps ayant des propriétés inhibitrices, nous avons déterminé les valeurs IC50 pour les nanocorps individuels(Figure 3A,B). Pour cette expérience particulière, il est recommandé de commencer avec une faible concentration de nanocorps, puis de passer à une concentration élevée pendant le test. Le calcul de l’inhibition pour chaque concentration a ensuite été effectué en comparant les courants de crête mesurés avant et après l’application du nanocorps. Pour éviter une liaison non spécifique des nanocorps aux surfaces, ce qui peut être particulièrement problématique lors de l’utilisation de faibles concentrations de nanocorps, il est conseillé de suivre un protocole similaire à celui décrit par Kermani et al.37, où 50 μg / mL d’albumine sérique bovine ont été ajoutés aux tampons, empêchant cet effet délétère. L’ajout de détergents tels que Tween ou Triton à cette fin doit être évité car ils dissoudraient les membranes lipidiques.

Figure 1
Figure 1: Électrophysiologie basée sur le MSU. (A) Protocole pour la mesure des courants transitoires. Une solution non activatrice est remplacée par une solution activatrice suivie du flux de solution non activatrice pour rétablir les conditions initiales. Au cours de la première étape, les nanocorps se lient au transporteur. Lors du passage à la solution d’activation, le gradient de substrat entraîne le transport électrogénique (courbe orange). En présence d’un nanocorps inhibiteur, le courant de crête montre une amplitude plus faible (courbe bleue). Après avoir terminé le protocole et exécuté des solutions sans nanocorps (lavage), le déliaison des nanocorps se produit. Dans le schéma, les protéoliposomes avec protéine reconstituée (bleu) sont immobilisés sur le capteur SSM. Les triangles et les cercles rouges représentent respectivement les nanocorps et le substrat. (B) Transport électrogénique de la choline en l’absence de nanocorps. Les courants de crête mesurés dans des conditions d’activation sont indiqués pour différentes concentrations de substrat. (C) Mesure représentative des courants lors des conditions d’activation en l’absence de protéine transporteuse à différentes concentrations du substrat. (D) Graphique de la concentration du substrat par rapport à l’amplitude des courants de crête. La CE50 déterminée était de 95 ± 11 μM de choline. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (n = 3 répliques biologiques, n = 3 répliques techniques). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Criblage et classification des nanocorps inhibiteurs et non inhibiteurs. (A) Transport électrogénique de la choline en présence d’un nanocorps. Les courants de crête mesurés dans les conditions d’activation sont indiqués en l’absence de nanocorps (bleu), en présence d’un nanocorps inhibiteur (rouge) et après le déliaison du nanocorps (vert). (B) Mesure des courants lors des conditions d’activation en l’absence de protéine transporteuse. Les traces montrent des enregistrements en l’absence de nanocorps (bleu), en présence d’un nanocorps inhibiteur (vert) et en présence d’un nanocorps non inhibiteur (rouge). (C,D). Histogrammes montrant les courants de crête mesurés lors de conditions d’activation en présence de nanocorps et après le déliaison des nanocorps (récupération). Le panneau C montre les résultats des mesures utilisant des puces individuelles par nanocorps. Le panneau D montre les résultats d’une mesure en série à l’aide d’une seule puce. Les nanocorps sont indiqués sous la forme Nb. Les barres d’erreur indiquent l’écart type (n = 3 réplicats biologiques, n = 2 réplicats techniques). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Détermination de la CI50 d’un nanocorps inhibiteur. (A) Transport électrogénique de la choline et inhibition par un nanocorps. Les courants de crête mesurés dans des conditions d’activation sont indiqués pour différentes concentrations de nanocorps. (B) Graphique de l’amplitude des courants de crête par rapport à la concentration du nanocorps à partir d’une mesure en série avec un nanocorps inhibiteur. L’IC50 déterminé était de 18 ± 2 nM. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (n = 3 répliques biologiques, n = 3 répliques techniques). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La technique présentée ici classe les nanocorps aux propriétés inhibitrices et non inhibitrices ciblant les transporteurs électrogéniques. L’évaluation du transport du substrat est possible grâce à la détection du mouvement des charges à travers le transporteur intégré dans la membrane des protéoliposomes. Certaines des étapes critiques lors de la mise en place d’une expérience sont la reconstitution de protéines actives dans les liposomes, la préparation de monocouches stables sur des puces SSM et la récupération des conditions initiales après l’application du protocole de lavage pour éliminer les molécules de nanocorps liées. Une fois que la protéine membranaire est reconstituée à un rapport lipide/protéine approprié, un protocole SSM général peut être établi en utilisant le substrat natif. Il est crucial d’effectuer des expériences de contrôle en utilisant des liposomes sans protéines pour révéler les courants sonores qui devraient être soustraits des courants mesurés à l’aide de protéoliposomes. Cependant, si les courants de bruit sont trop importants, nous vous recommandons d’essayer la reconstitution des protéines en utilisant différents lipides, ou de rechercher des conditions tampons qui minimisent ces signaux délétères. Après avoir établi avec succès les conditions d’un test SSM, le criblage des nanocorps peut être effectué. Une option très utile qui peut aider à un criblage plus rapide des nanocorps est d’effectuer des tests à haut débit à l’aide d’une seule puce de capteur SSM. Cela réduit le temps de manipulation des puces et des tampons et réduit les coûts. Cependant, étant donné que lors de ce type de test, plusieurs nanocorps sont appliqués séquentiellement, il est important de s’assurer que le nanocorps appliqué peut être emporté après la mesure. Un cycle de lavage rigoureux peut être nécessaire pour dissocier certains nanocorps au cas où des amplitudes de courant de crête réduites seraient détectées en l’absence de nanocorps. Nous vous recommandons d’utiliser, comme point de départ, les conditions de lavage décrites ici. Si l’augmentation du volume de lavage ou du nombre de cycles n’aide pas, des puces individuelles devraient être utilisées pour filtrer chaque nanocorps séparément. Dans tous les cas examinés ici, la liaison des nanocorps était réversible et un protocole à haut débit pouvait être appliqué. Dans notre configuration expérimentale, nous n’avons pas pu récupérer toute l’amplitude du courant de crête initial après des mesures avec des nanocorps (Figure 1A; Figure 2C,D). Cependant, dans la plupart des cas, l’amplitude des courants de crête récupérés variait entre 80 et 95% de l’amplitude mesurée avant l’application de nanocorps (Fig. 2C, D). Nous supposons que cela pourrait être une conséquence du lavage d’une fraction des protéoliposomes adhérés à la puce, ou en raison de la cinétique lente de la dissociation de certains nanocorps inhibiteurs, ou d’une combinaison des deux. Dans les deux cas, il était encore possible de continuer à tester d’autres nanocorps car le transport électrogénique était mesurable. Ceci est illustré à la figure 2D, où nous avons passé au crible six nanocorps à l’aide d’une seule préparation de puce.

La caractéristique de haut débit est l’une des avancées les plus significatives de la méthode présentée. De plus, contrairement à d’autres approches, cette méthode permet de sélectionner des nanocorps inhibiteurs ciblant les transporteurs électrogéniques pour lesquels des substrats marqués ne sont pas disponibles. Une identification rapide des nanocorps inhibiteurs peut aider à accélérer la recherche visant à identifier de nouvelles applications des nanocorps en tant que médicaments. Leurs avantages apparents par rapport à des thérapies similaires telles que les traitements par anticorps sont nombreux, à commencer par une taille plus petite qui les aide à se propager davantage dans les tissus ou les cellules, à leurs faibles coûts de production et à leur grande stabilité.

L’électrophysiologie basée sur le MSU a été utilisée dans le passé pour la caractérisation des transporteurs électrogéniques dans les vésiculesmembranaires 29,38. Ces types d’expériences sont avantageux car ils ne dépendent pas des protocoles de purification et de reconstitution des protéines. Nous supposons qu’il est possible d’effectuer la sélection de nanocorps inhibiteurs à l’aide de vésicules membranaires. Cela aiderait à réduire les coûts et à éviter les manipulations de protéines purifiées.

L’électrophysiologie basée sur le MSU est une technique puissante pour dépister les inhibiteurs de nanocorps de protéines membranaires multiples qui présentent un transport électrogénique. Nous envisageons que l’électrophysiologie basée sur le MSU deviendra un outil important pour la sélection de nanocorps inhibiteurs et d’autres anticorps ayant des applications cliniques potentielles.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Nous remercions Cedric A. J. Hutter et Markus A. Seeger de l’Institut de microbiologie médicale de l’Université de Zurich, et Gonzalo Cebrero du Biozentrum de l’Université de Bâle pour leur collaboration dans la génération de nanocorps synthétiques (corps sybodies). Nous remercions Maria Barthmes et André Bazzone de NANION Technologies pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse (FNS) (PP00P3_170607 et NANION Research Grant Initiative to C.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octadecanethiol solution Sigma Aldrich O1858-25ML
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) BioRad #152-3920
PD 10 Desalting Columns GE Healthcare GE17-0851-01
Filter 200 nm membrane Whatman Nucleopore WHA800282
2-Propanol Merck 33539-1L-R
n-Decane Sigma Aldrich 8034051000
n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) Avanti Polar Lipids 850520P-25g
Sodium Chloride AppliChem 131659.1211
(SSM setup) SURFE2R N1 Nanion -----
SURFE2R N1 Single Sensor Chips Nanion # 161001
Trizma Base Sigma Aldrich T1503
E. coli Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids 100600C
Egg PC L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C

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References

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Bärland, N., Perez, C. Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (171), e62578, doi:10.3791/62578 (2021).

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