Summary
I nanocorpi sono strumenti importanti in biologia strutturale e rappresentano un grande potenziale per lo sviluppo di terapie. Tuttavia, la selezione di nanocorpi con proprietà inibitorie può essere impegnativa. Qui dimostriamo l'uso dell'elettrofisiologia basata sulla membrana supportata da solidi (SSM) per la classificazione di nanocorpi inibitori e non inibitori che prendono di mira i trasportatori di membrana elettrogenici.
Abstract
Gli anticorpi a dominio singolo (nanocorpi) sono stati ampiamente utilizzati negli studi meccanicistici e strutturali delle proteine e rappresentano un enorme potenziale come strumenti per lo sviluppo di terapie cliniche, molte delle quali dipendono dall'inibizione delle proteine di membrana come i trasportatori. Tuttavia, la maggior parte dei metodi utilizzati per determinare l'inibizione dell'attività di trasporto sono difficili da eseguire in routine ad alto rendimento e dipendono dalla disponibilità di substrati etichettati, complicando così lo screening di grandi librerie di nanocorpi. L'elettrofisiologia a membrana a supporto solido (SSM) è un metodo ad alto rendimento, utilizzato per caratterizzare i trasportatori elettrogenici e misurarne la cinetica di trasporto e l'inibizione. Qui mostriamo l'implementazione dell'elettrofisiologia basata sull'SSM per selezionare nanocorpi inibitori e non inibitori che prendono di mira un trasportatore secondario elettrogenico e per calcolare costanti inibitorie dei nanocorpi. Questa tecnica può essere particolarmente utile per selezionare nanocorpi inibitori mirati ai trasportatori per i quali non sono disponibili substrati marcati.
Introduction
Gli anticorpi sono composti da due catene pesanti identiche e due catene leggere che sono responsabili del legame con l'antigene. I camelidi hanno solo anticorpi a catena pesante che mostrano affinità simili per il loro antigene affine rispetto agli anticorpi convenzionali1,2. Il dominio variabile singolo (VHH) degli anticorpi a catena pesante mantiene il pieno potenziale di legame con l'antigene e ha dimostrato di essere molto stabile1,2. Queste molecole VHH isolate o "nanocorpi" sono state implementate in studi relativi alla biochimica delle proteine di membrana come strumenti per stabilizzare le conformazioni3,4,come inibitori5,6,come agenti di stabilizzazione7e come gadget per la determinazione della struttura8,9,10 . I nanocorpi possono essere generati dall'immunizzazione dei camelidi per il pre-arricchimento delle cellule B che codificano nanocorpi bersaglio-specifici e il successivo isolamento delle cellule B, seguito dalla clonazione della libreria nanocorporea e dalla selezione mediante visualizzazione fagica11,12,13. Un modo alternativo per generare nanocorpi si basa su metodi di selezione in vitro che si basano sulla costruzione di librerie e selezione tramite visualizzazione di fagi, display ribosomi o display di lievito14,15,16,17,18,19,20. Questi metodi in vitro richiedono grandi dimensioni della libreria, ma traggono vantaggio dall'evitare l'immunizzazione animale e favoriscono la selezione di nanocorpi che prendono di mira proteine con stabilità relativamente bassa.
Le piccole dimensioni dei nanocorpi, la loro elevata stabilità e solubilità, la forte affinità antigenica, la bassa immunogenicità e la produzione relativamente facile, li rendono forti candidati per lo sviluppo di terapie21,22,23. In particolare, i nanocorpi che inibiscono l'attività di più proteine di membrana sono potenziali asset per applicazioni cliniche5,24,25,26. Nel caso di trasportatori a membrana, per valutare se un nanocorpo ha attività inibitoria, è necessario sviluppare un saggio che consenta la rilevazione di substrati e/o co-substrati trasportati. Tali saggi di solito coinvolgono molecole etichettate o la progettazione di metodi di rilevamento specifici del substrato, che possono mancare di un'applicazione universale. Inoltre, l'identificazione di nanocorpi inibitori richiede generalmente lo screening di un gran numero di leganti. Pertanto, un metodo che può essere utilizzato in una modalità ad alto rendimento e che non si basa su substrati etichettati è essenziale per questa selezione.
L'elettrofisiologia basata su SSM è una tecnica estremamente sensibile e altamente risolta nel tempo che consente il rilevamento del movimento delle cariche attraverso le membrane (ad esempio, legame / trasporto ionico)27,28. Questa tecnica è stata applicata per caratterizzare i trasportatori elettrogenici, che sono difficili da studiare utilizzando altre tecniche di elettrofisiologia a causa del relativo basso turnover di queste proteine29,30,31,32,33,34,35. L'elettrofisiologia SSM non richiede l'uso di substrati etichettati, è adatta per lo screening ad alta produttività e possono essere utilizzati proteoliposomi o vescicole di membrana contenenti il trasportatore di interesse. Qui, dimostriamo che l'elettrofisiologia basata su SSM può essere utilizzata per classificare nanocorpi mirati al trasportatore con proprietà inibitorie e non inibitorie. Come prova di principio, descriviamo la ricostituzione di un trasportatore di colina batterica in liposomi, seguita da passaggi dettagliati per l'immobilizzazione dei proteolipolismi sui sensori SSM. Descriviamo poi come eseguire misurazioni elettrofisiologiche basate su SSM del trasporto della colina e come determinare la concentrazione effettiva semi-massimale (EC50). Mostriamo quindi come utilizzare l'elettrofisiologia basata su SSM per lo screening di più nanocorpi e per identificare gli inibitori del trasporto della colina. Infine, descriviamo come determinare le concentrazioni inibitorie semimastre massime (IC50) di nanocorpi inibitori selezionati.
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Protocol
1. Ricostituzione delle proteine di membrana
- Mescolare 3 mL di lipidi polari di E. coli con 1 mL di fosfatidilcolina in un matraccio a fondo tondo sotto un cappuccio ventilato.
- Asciugare la miscela lipidica per 20 minuti sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotante e un bagno d'acqua a 37 °C per rimuovere il cloroformio. Se necessario, asciugare ulteriormente sotto azoto o gas argon.
- Utilizzando il tampone TS (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) contenente 2 mM β-mercaptoetanolo, sospendere i lipidi a 25 mg / mL.
- Aliquote lipidi in aliquote da 500 μL, congelamento flash in azoto liquido e conservazione a -80 °C.
- Scongelare un'aliquota di lipidi da 500 μL e diluire 1:1 utilizzando un tampone TS contenente 2 mM di β-mercaptoetanolo.
- Estrudere la sospensione lipidica 15 volte usando una membrana da 400 nm.
- Diluire la sospensione lipidica per avere una concentrazione lipidica finale di 4,4 mg/ml.
- Aggiungere n-dodecil-β-D-maltoside (DDM) per avere una concentrazione finale dello 0,2% e lasciarlo ruotare per 1 ora a 200 giri / min a temperatura ambiente (RT).
- Aggiungere la proteina purificata ai lipidi utilizzando un rapporto lipidico-proteina compreso tra 1:10 e 1:100 (w:w).
NOTA: il rapporto deve essere regolato in base alla potenza del segnale rilevato nelle misurazioni SSM-elettrofisiologiche del trasporto del substrato (vedi sotto). Per ottenere segnali più grandi, utilizzare rapporti lipidi-proteine più piccoli. - Incubare la miscela ruotando a 200 giri/min per 1 ora a RT.
- Aggiungere 30 mg/mL di perline adsorbenti di polistirene, pre-lavate nel tampone TS.
NOTA: Aggiungere perline di polistirene in modo graduale. - Incubare la miscela di perline-lipidi per 30 minuti a RT a fuoco lento.
- Per rimuovere le perline, lasciare riposare la miscela di perline e lipidi in modo che le perline si depositino. Trasferire la soluzione in un nuovo tubo e lasciare le perline dietro. Aggiungere 30 mg/mL di perline adsorbenti di polistirene fresco alla miscela lipidica separata.
- Incubare la miscela per 1 ora a 4 °C mescolando lentamente.
- Separare le perline dalla miscela come descritto al punto 1.13 e aggiungere 30 mg/mL di perline adsorbenti di polistirene fresco.
- Incubare la miscela per 16 ore a 4 °C.
- Separare le perline dalla miscela come descritto al punto 13 e aggiungere 30 mg/mL di perle adsorbenti di polistirene fresco.
- Incubare la miscela per 2 ore a 4 °C per un quarto e ultimo lavaggio.
- Centrifugare a 110.000 x g per 30 min a 4 °C.
- Lavare il pellet con 500 μL di tampone TS contenente 2 mM di β-mercaptoetanolo.
- Centrifugare nuovamente a 110.000 x g per 30 min a 4 °C.
- Risospesere il pellet ad una concentrazione lipidica finale di 25 mg/mL in tampone TS con 2 mM β-mercaptoetanolo.
- Stimare la concentrazione proteica utilizzando un saggio in-gel o amido black36.
- Aliquotare i proteoliposomi, congelare il flash in azoto liquido e conservare a -80 °C.
2. Preparazione del chip
- Riempire un singolo chip del sensore con 50-100 μL di soluzione di 1-ottadecanetiolo da 0,5 mM (risospesa in isopropanolo).
- Incubare il chip con la soluzione per 30 minuti a RT.
- Rimuovere la soluzione di tiolo toccando il chip su un tessuto.
- Risciacquare il sensore 3 volte con 5 ml di isopropanolo puro.
- Risciacquare il sensore 3 volte con 5 ml di acqua doppia distillata.
- Asciugare il sensore toccando una carta velina.
- Applicare 1,5 μL di 7,5 μg/μL 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (lipidi essiccati in un evaporatore rotatorio e risospesi in n-decane).
- Subito dopo, riempire il sensore con 50 μL di buffer SSM non attivante, che non contiene il substrato. Ciò porterà a una formazione spontanea dello strato SSM.
NOTA: il buffer SSM deve essere ottimizzato in anticipo per determinare le condizioni ottimali con basso rumore di fondo. Un tampone generale contenente 30 mM HEPES pH 7,4, 5 mM MgCl2, 140 mM NaCl, può essere utilizzato come punto di partenza. Il tampone SSM senza substrato viene utilizzato per il lavaggio prima e dopo la misurazione (tampone non attivante). Per evitare la mancata corrispondenza del buffer, utilizzare il buffer non attivante per preparare il buffer contenente il substrato (buffer di attivazione). Il substrato può essere aggiunto direttamente come polvere o in un piccolo volume da un stock ad alta concentrazione per evitare diluizioni. - Scongelare i proteoliposomi dal passo 1.24 a RT.
- Diluire i proteolipolisi tra 1:5 e 1:100 (proteolipolisi:buffer, (v:v)) nel buffer SSM non attivante (qui 1:20).
- Proteoliposomi sonicati per 20-30 s o 3 volte per 10 s, mettendo su ghiaccio tra la sonicazione, se necessario. Qui è stato utilizzato un sonicatore a bagno d'acqua a 45 kHz.
- Applicare 5-10 μL del campione di proteoliposomi sonicati diluiti sulla superficie del sensore senza toccarlo.
- Centrifugare i trucioli con la soluzione a RT per 30 min utilizzando una velocità compresa tra 2.000 e 3.000 x g.
NOTA: utilizzare tubi da 50 ml con fondo piatto. Posizionare con attenzione i chip del sensore in posizione verticale utilizzando una pinzetta. Possono essere utilizzate anche piastre a 6 pozzetti e una centrifuga con portapiatti. - Utilizzare i chip del sensore lo stesso giorno.
3. Misurazione del trasporto del soluto: determinazione delle condizioni di saturazione
NOTA: Come prova di principio, questi esperimenti sono stati eseguiti utilizzando un trasportatore di colina batterica ricostituito in liposomi seguendo il protocollo sopra descritto. Il processo passo-passo per determinare le condizioni di saturazione della colina del substrato prima della misurazione dell'inibizione da parte dei nanocorpi è mostrato qui.
- Preparare 1-2 L del buffer SSM non attivante.
NOTA: preparare e utilizzare la stessa scorta tampone dell'MVU per tutti i buffer attivanti e non attivanti durante tutte le misurazioni. - Prendi 10 tubi puliti e trasferisci 10 ml del buffer SSM non attivante in ciascuno.
- Aggiungere il substrato nei tubi dal punto 3.2 utilizzando una serie di concentrazioni intorno alla metà della concentrazione massima prevista (qui 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 mM di colina) per preparare i tamponi SSM attivanti. Utilizzare uno stock ad alta concentrazione per evitare diluizioni.
- Accendere la macchina SSM.
- Avviare il software SSM e consentire all'inizializzazione automatica della macchina. Impostare il percorso di salvataggio dei dati e confermare premendo il pulsante OK. Selezionare il protocollo di pulizia iniziale standard nelle opzioni del flusso di lavoro e fare clic su Esegui.
- Montare il chip rivestito di proteoliposoma sulla presa, spostare il braccio per bloccare il chip e chiudere il chip montato con il cappuccio.
- Selezionare il programma CapCom nel flusso di lavoro e lasciarlo eseguire per determinare la conduttività e la capacità. Verificare che la conduttività sia inferiore a 5 nS e che la capacità sia compresa tra 15 e 35 nF prima di utilizzarla per la misurazione.
NOTA: un valore di capacità di 15-35 nF e una conduttanza inferiore a 5 nS sono raccomandati dal produttore quando si utilizza un chip da 3 mm. - Trasferire le soluzioni attivanti in flaconcini e posizionare i tamponi nel campionatore di sonda.
- Trasferire il buffer non attivante in un serbatoio e posizionarlo accanto al portachip nella posizione del serbatoio a destra.
- Creare un protocollo per il flusso di lavoro utilizzando una sequenza di soluzioni non attivanti (B), attivanti (A) e non attivanti (B) (sequenza B-A-B) e un ciclo che esegue tre misurazioni e passa al buffer di attivazione successivo per tutti i 10 buffer preparati nel passaggio 3.3. Utilizzare la portata predefinita a 200 μL/s utilizzando tempi di flusso 1 s - 1 s - 1 s per la sequenza B-A-B. Fare clic su Riproduci per avviare la misurazione.
NOTA: Un esperimento tipico consiste nel flusso sequenziale di soluzioni non attivanti (B), attivanti (A) e non attivanti (B) (scritte come B-A-B; vedi Figura 1A). I proteolipolisi immobilizzati sul sensore verranno lavati con le soluzioni. Pertanto, lo scambio di soluzioni B-A genera un gradiente di concentrazione del substrato, che guida la reazione di trasporto elettrogenico. - Salvare il protocollo e lasciare che il flusso di lavoro venga eseguito facendo clic sul pulsante Riproduci. Esegui lo stesso tipo di esperimento ma usando liposomi privi di proteine. Questo è molto importante in quanto mostrerebbe l'intensità delle correnti di fondo. Questo dovrebbe essere considerato quando si analizzano i dati del trasporto elettrogenico misurato con proteolipolisi (Figura 1C).
- Utilizzare qualsiasi software preferito per l'analisi dei dati per tracciare la corrente misurata rispetto al tempo. Leggere manualmente la corrente di picco o, se si utilizza il software, utilizzare la funzione per la stima dell'altezza del picco nell'intervallo dell'aggiunta del buffer di attivazione.
- Tracciare la corrente di picco rispetto alla concentrazione del substrato per determinare l'EC50 del substrato tramite la regressione non lineare (Figura 1B,C). Leggere la concentrazione più bassa alla quale la corrente di picco raggiunge un valore massimo, questa concentrazione corrisponde alle condizioni di saturazione.
NOTA: È importante considerare che il numero di proteoliposomi che rimangono immobilizzati varia da chip a chip. Questa variazione è evidente in quanto le correnti di picco in condizioni di misurazione identiche mostreranno ampiezze diverse. Pertanto, è necessario normalizzare le ampiezze di corrente delle misurazioni eseguite su ciascun chip separatamente prima di confrontare le misurazioni tra diversi preparati di chip.
4. Classificazione seriale dei nanocorpi inibitori e non inibitori
NOTA: Questa sezione mostra come misurare il trasporto di colina in presenza di nanocorpi che si legano specificamente al trasportatore di colina batterica. Correnti di picco più piccole in presenza di nanocorpi indicano l'inibizione del trasporto. I nanocorpi non inibitori non avranno alcun impatto sul trasporto del substrato, cioè nessuna diminuzione del segnale di corrente di picco.
- Preparare 1-2 L di buffer SSM non attivante.
- Trasferire 50 mL del buffer SSM non attivante in un tubo pulito. Aggiungere la colina del substrato ad una concentrazione finale di 5 mM (condizioni di saturazione). Utilizzare questo per una misurazione di controllo positivo.
- Trasferire 10 mL del buffer SSM non attivante in un tubo pulito. Aggiungere la colina del substrato ad una concentrazione finale di 5 mM (condizioni di saturazione) e aggiungere nanocorpi a una concentrazione finale di 500 nM.
- Ripetere il passaggio 4.3 per ogni nanocorpo per preparare le soluzioni attivanti.
NOTA: se i nanocorpi purificati vengono risospesi in un buffer diverso dal buffer SSM, la loro aggiunta ai buffer attivanti e non attivanti comporterà una mancata corrispondenza del buffer. Una mancata corrispondenza del buffer dovrebbe essere evitata poiché può portare a un rumore elevato. Lo scambio del buffer dei nanocorpi purificati con il buffer SSM può aiutare a evitare questo problema. Inoltre, si raccomanda l'utilizzo di concentrazioni di nanocorpi che consentano di raggiungere condizioni di saturazione. Considerando che le costanti di legame dei nanocorpi sono generalmente inferiori a 100 nM, per questo esperimento si raccomanda una concentrazione di nanocorpi di 500 nM. Tuttavia, è importante pre-selezionare le concentrazioni ottimali. - Avviare la macchina SSM e misurare la capacità e la conduttività del chip rivestito di proteoliposoma come descritto nei passaggi 3.4-3.7.
- Trasferire la soluzione attivante senza nanocorpo in un flaconcino e posizionare il tampone nel campionatore della sonda. Trasferire il buffer non attivante senza nanocorpo in un serbatoio e posizionarlo nel campionatore della sonda.
- Trasferire le soluzioni attivanti contenenti nanocorpi in flaconcini e posizionare i tamponi nel campionatore della sonda. Trasferire i tamponi non attivanti contenenti nanocorpi in flaconcini e posizionare i tamponi nel campionatore della sonda.
- Creare un protocollo per il flusso di lavoro utilizzando una sequenza di soluzioni non attivanti (B), attivanti (A) e non attivanti (B) (sequenza B-A-B).
- Creare un loop che esegua quanto segue: tre misurazioni della sequenza B-A-B utilizzando buffer senza nanobody, due misurazioni della sequenza B-A-B con buffer contenenti un nanobody, tempo di ritardo di 120 s per l'incubazione con il nanobody, quindi 3 misurazioni della sequenza B-A-B con buffer contenenti il nanobody.
- Salvare il flusso di lavoro e lasciarlo funzionare facendo clic sul pulsante Riproduci.
NOTA: Questo flusso di lavoro misurerà le condizioni iniziali del trasporto senza inibizione eseguendo il protocollo B-A-B 3 volte utilizzando buffer non attivanti (B) e attivanti (A) senza il nanocorpo (Figura 1B,C), seguito dalla misurazione dell'effetto nanocorpo sul trasporto eseguendo il protocollo B-A-B 5 volte con i buffer non attivanti e attivanti contenenti nanocorpi (Figura 2A ). La cinetica di legame del secondo ordine detta l'interazione dei nanocorpi e delle loro proteine bersaglio. Pertanto, è importante utilizzare un ritardo temporale nella fase B-A per dare abbastanza tempo ai nanocorpi di legarsi ai trasportatori nei proteolipolisi sul chip. I tempi ottimali dipendono dalla concentrazione di nanocorpi, cioè a concentrazioni più basse sono necessari tempi più lunghi. Le prime due misurazioni sono necessarie per adattare il sistema alle nuove condizioni e la seconda esecuzione deve essere eseguita dopo un tempo di ritardo di 120 s. Solo le seguenti tre misurazioni devono essere utilizzate per l'analisi dei dati. - Creare un nuovo protocollo per il flusso di lavoro utilizzando una sequenza di soluzioni non attivanti (B), attivanti (A) e non attivanti (B) (sequenza B-A-B) e un ciclo di 5 misurazioni per eliminare il nanocorpo legato in modo reversibile.
NOTA: Facoltativamente, includere una fase di incubazione per consentire la dissociazione di nanocorpi con cinetica lenta. - Salvare il flusso di lavoro e lasciarlo funzionare facendo clic sul pulsante Riproduci.
- Confrontare l'ultima corrente di picco delle misurazioni con la misurazione iniziale del solo substrato nel passaggio 4.10. Il nanocorpo è stato lavato con successo e le condizioni iniziali sono state ristabilite se la corrente di picco raggiunge il valore iniziale, altrimenti ripetere i passaggi 4.12-4.13 o passare a un nuovo chip.
- Ripetere i passaggi 4.6-4.13 e utilizzare singoli chip per ogni schermo nanocorpo (Figura 2C) o ripetere con più nanocorpi utilizzando lo stesso chip (Figura 2D).
- Utilizzare qualsiasi software preferito per l'analisi dei dati per tracciare la corrente misurata rispetto al tempo. Leggere la corrente di picco manualmente o, se disponibile, nel software utilizzato, selezionare automaticamente la funzione per la stima dell'altezza del picco nell'intervallo dell'aggiunta del buffer di attivazione.
- Normalizzare la corrente di picco in presenza del nanocorpo, in base alla precedente misurazione del solo substrato. Tracciare le correnti di picco in un istogramma e confrontare le correnti di picco delle sole misurazioni del substrato con le correnti di picco misurate in presenza di nanocorpi (Figura 2C, D) per identificare nanocorpi inibitori.
NOTA: La normalizzazione delle correnti di picco determinate di ogni singola corsa con un nanocorpo deve essere eseguita considerando la corrente di picco in assenza del nanocorpo dalla misurazione precedente. Inoltre, poiché il numero di proteoliposomi che rimangono immobilizzati varia da chip a chip, è importante normalizzare le ampiezze correnti delle misurazioni eseguite su ciascun chip separatamente prima di confrontare le misurazioni tra diversi preparati di chip.
5. Misurazione IC50 con nanocorpi inibitori
NOTA: Dopo aver identificato i nanocorpi inibitori, è possibile determinare la loro concentrazione inibitoria semi-massima (IC50). Questo viene fatto misurando il trasporto di colina a concentrazione costante, mentre le concentrazioni variabili del nanocorpo inibitorio.
- Preparare 1-2 L del buffer SSM non attivante.
- Trasferire 50 mL del buffer SSM non attivante in un tubo pulito. Aggiungere la colina del substrato ad una concentrazione finale di 5 mM (condizioni di saturazione). Usalo come soluzione attivante per il controllo positivo.
- Prendere 8 tubi puliti e aggiungere 5 ml della soluzione non attivante in ciascuno. Aggiungere la colina del substrato ad una concentrazione finale di 5 mM (condizioni di saturazione). Aggiungere il nanocorpo inibitorio ai tubi a concentrazioni nell'intervallo IC50 previsto (qui 500 nM - 1 nM).
- Prendere 8 tubi puliti e aggiungere 10 ml della soluzione non attivante in ciascuno. Aggiungere nanocorpi inibitori a ciascun tubo singolarmente alla stessa concentrazione del punto 5.3. Questo corrisponde al buffer non attivante.
NOTA: Questo genererà una serie di coppie tampone attivanti e non attivanti a diverse concentrazioni dello stesso nanocorpo inibitorio. - Avviare la configurazione SSM e misurare la capacità e la conduttività del chip rivestito di proteolipolisoma come descritto nei passaggi 3.4-3.7.
- Trasferire la soluzione attivante senza nanocorpo in un flaconcino e posizionarla nel campionatore della sonda. Trasferire il buffer non attivante senza nanocorpo in un serbatoio e posizionarlo nella posizione del serbatoio accanto al portachip sulla destra.
- Trasferire le soluzioni attivanti contenenti nanocorpi in flaconcini e posizionare i tamponi nel campionatore della sonda. Trasferire i tamponi non attivanti contenenti nanocorpi in flaconcini e posizionare i tamponi nel campionatore della sonda.
- Creare un protocollo per il flusso di lavoro utilizzando una sequenza di soluzioni non attivanti (B), attivanti (A) e non attivanti (B) (sequenza B-A-B). Includi un ciclo per misurare ogni concentrazione 2 volte, incuba per 120 s e misura altre 3 volte. Il flusso di lavoro inizierà con il controllo positivo del solo substrato seguito dalla concentrazione più bassa del nanocorpo. Ogni misurazione dei nanocorpi sarà seguita da una successiva misurazione del controllo positivo con solo substrato per ripristinare l'ampiezza di picco iniziale, prima di passare alla successiva concentrazione di nanocorpi più alta.
NOTA: la cinetica del secondo ordine detta il legame dei nanocorpi. Pertanto, è importante utilizzare un ritardo temporale nel passaggio B-A. I tempi ottimali dipendono dalla concentrazione di nanocorpi, cioè a concentrazioni più basse sono necessari tempi più lunghi; qui 120 s è stato utilizzato con risultati soddisfacenti. - Utilizzare qualsiasi software preferito per l'analisi dei dati per tracciare la corrente misurata rispetto al tempo. Leggere manualmente la corrente di picco o, se si utilizza un software, selezionare la funzione per la stima dell'altezza del picco nell'intervallo dell'aggiunta del buffer di attivazione (Figura 3A). Tracciare le correnti di picco rispetto alla concentrazione di nanocorpi per determinare l'IC50 tramite regressione non lineare (Figura 3B).
NOTA: Normalizzare le ampiezze correnti delle misurazioni eseguite per ogni singolo chip prima di confrontare le misurazioni tra diversi preparati di chip.
6. Pulizia dei sensori
- Risciacquare i chip del singolo sensore dopo l'uso con 10 ml di acqua distillata.
- Asciugare il chip toccandolo su una carta velina.
- Riempire la cavità del sensore del chip con 100 μL di isopropanolo puro e incubare per 10 minuti a RT.
- Mettere un batuffolo di cotone in isopropanolo puro e incubare per 1-3 min.
- Utilizzare i tamponi di cotone presoampiato e ruotare delicatamente sulla superficie del sensore senza pressione per rimuovere i residui.
- Risciacquare il sensore con 5 ml di isopropanolo puro.
- Risciacquare il sensore con 10 ml di acqua distillata.
- Asciugare il sensore toccando il chip su un tessuto.
- Lasciare asciugare il sensore durante la notte a RT e conservare a RT in condizioni asciutte.
NOTA: i sensori possono essere riutilizzati fino a 4-5 volte se puliti e conservati correttamente.
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Representative Results
L'elettrofisiologia basata su SSM è stata ampiamente utilizzata per la caratterizzazione di trasportatori elettrogenici. Nel protocollo qui presentato, mostriamo come utilizzare l'elettrofisiologia basata su SSM per classificare i nanocorpi che prendono di mira un trasportatore secondario (qui un symporter batterico di colina) in base alle loro proprietà inibitorie e non inibitorie. Una delle caratteristiche più utili di questa tecnica è che consente lo screening ad alta velocità effettiva di più condizioni di buffer. Questa particolare caratteristica è utile per l'analisi di librerie di nanocorpi, che dopo la selezione dei leganti possono essere costituite da pochi a decine di nanocorpi. In un esperimento standard, un monostrato lipidico stabile viene assemblato su un chip sensore. Dopo aver applicato la preparazione di proteoliposomi contenente il trasportatore di colina, viene eseguito un controllo per una buona conduttività e capacità in quanto ciò è essenziale per il successo dell'esperimento. Nel caso in cui l'integrità della membrana sia compromessa durante un esperimento, che è facilmente osservabile a causa delle elevate correnti di fondo del rumore, si consiglia di passare a un nuovo chip in quanto il recupero di condizioni di basso rumore è piuttosto difficile. In generale, abbiamo osservato un'ottima riproducibilità tra le misurazioni del trasporto e dell'inibizione da parte dei nanocorpi quando si utilizzano chip diversi.
Per decidere la concentrazione del substrato da utilizzare durante uno screening dei nanocorpi, il trasporto elettrogenico è stato prima misurato sotto diverse concentrazioni di substrato per determinare EC50 (Figura 1B,C). È stata selezionata una concentrazione di substrato corrispondente alle condizioni di saturazione (Figura 1C). Questa concentrazione di substrato è stata quindi mantenuta costante in tutti i tamponi attivanti. Per questo particolare esempio, abbiamo selezionato 5 mM di colina.
Per lo screening dei nanocorpi, il nanocorpo deve essere aggiunto sia ai tamponi non attivanti che a quelli attivanti. Quando i nanocorpi sono stati aggiunti solo al tampone attivante, non è stato possibile osservare l'inibizione del trasporto elettrogenico. Ipotizziamo che ciò sia dovuto a un'occupazione incompleta di tutti i siti di legame dei nanocorpi nella popolazione di trasportatori sul chip, rivelando così l'importanza della pre-incubazione con nanocorpi in condizioni non attivanti. Per garantire che tutti i siti siano probabilmente occupati, è stata inclusa una fase di ritardo temporale durante l'applicazione della prima fase tampone non attivante per consentire la saturazione dei siti di legame dei nanocorpi sulla popolazione trasportatrice. I tempi di incubazione che vanno da 2-60 minuti sono stati testati con risultati riproducibili. Tieni presente che i tempi ottimali di incubazione dipendono dalla natura del legante nanocorporeo e dalla sua concentrazione durante l'esperimento (così come dalla concentrazione del trasportatore nei proteoliposomi sul chip). Pertanto, si consiglia di provare diversi tempi di incubazione. In ogni caso, come regola generale, minore è la concentrazione di nanocorpi, più lungo è il tempo di incubazione richiesto. Abbiamo testato tempi di incubazione di 2 min, 20 min, 30 min e 60 min per diversi nanocorpi, ma non abbiamo rilevato un'ulteriore inibizione del trasporto.
L'effetto dei nanocorpi inibitori sul trasporto elettrogenico è visualizzato dalla diminuzione delle ampiezze delle correnti di picco (Figura 2A, C , D). I nanocorpi non inibitori, d'altra parte, non influenzano le correnti di picco. Dopo aver eseguito il protocollo di lavaggio per consentire lo svincolo dei nanocorpi, è stato osservato un recupero dell'80-95% dell'ampiezza iniziale della corrente di picco (Figura 2A, C , D). Abbiamo eseguito un esperimento simile ma in presenza di liposomi senza la proteina trasportatrice. Quando si passa da condizioni di non attivazione a condizioni di attivazione, non sono state introdotte correnti di artefatto significative dai nanocorpi presenti in questi buffer (Figura 2B). Si consiglia di eseguire questo esperimento di controllo in quanto è importante sapere se i cambiamenti nelle correnti di picco derivano da artefatti o meno.
Dopo la selezione dei nanocorpi con proprietà inibitorie, abbiamo determinato i valori IC50 per i singoli nanocorpi (Figura 3A,B). Per questo particolare esperimento, si consiglia di iniziare con una bassa concentrazione di nanocorpi e quindi spostarsi verso un'alta concentrazione durante il test. Il calcolo dell'inibizione per ogni concentrazione è stato quindi eseguito confrontando le correnti di picco misurate prima e dopo l'applicazione del nanocorpo. Per evitare il legame aspecifico dei nanocorpi alle superfici, che può essere particolarmente problematico quando si utilizzano basse concentrazioni di nanocorpi, si consiglia di seguire un protocollo simile a quello descritto da Kermani et al.37, dove 50 μg / mL di albumina sierica bovina sono stati aggiunti ai tamponi, prevenendo questo effetto deleterio. L'aggiunta di detergenti come Tween o Triton per questo scopo dovrebbe essere evitata in quanto questi dissolverebbero le membrane lipidiche.
Figura 1: Elettrofisiologia basata sull'SSM. (A) Protocollo per la misurazione delle correnti transitorie. Una soluzione non attivante viene sostituita da una soluzione attivante seguita dal flusso di soluzione non attivante per ripristinare le condizioni iniziali. Durante la prima fase, i nanocorpi si legano al trasportatore. Quando si passa alla soluzione attivante, il gradiente del substrato guida il trasporto elettrogenico (curva arancione). In presenza di un nanocorpo inibitorio, la corrente di picco mostra un'ampiezza minore (curva blu). Dopo aver terminato il protocollo e aver eseguito soluzioni senza nanocorpi (lavaggio), si verifica lo slegamento dei nanocorpi. Nello schema, i proteolipolisi con proteina ricostituita (blu) sono immobilizzati sul sensore SSM. Triangoli e cerchi rossi rappresentano rispettivamente nanocorpi e substrato. (B) Trasporto elettrogenico della colina in assenza di nanocorpi. Le correnti di picco misurate durante le condizioni di attivazione sono mostrate per diverse concentrazioni di substrato. (C) Misurazione rappresentativa delle correnti durante le condizioni di attivazione in assenza di proteine trasportatrici a diverse concentrazioni di substrato. (D) Grafico della concentrazione del substrato rispetto all'ampiezza delle correnti di picco. La CE50 determinata era 95 ± 11 μM colina. Le barre di errore indicano la deviazione standard (n=3 repliche biologiche, n=3 repliche tecniche). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Screening e classificazione di nanocorpi inibitori e non inibitori. (A) Trasporto elettrogenico di colina in presenza di un nanocorpo. Le correnti di picco misurate durante le condizioni di attivazione sono mostrate in assenza di nanocorpi (blu), in presenza di un nanocorpo inibitorio (rosso) e dopo lo svincolo dei nanocorpi (verde). (B) Misurazione delle correnti durante le condizioni di attivazione in assenza di proteine trasportatrici. Le tracce mostrano registrazioni in assenza di nanocorpi (blu), in presenza di un nanocorpo inibitorio (verde) e in presenza di un nanocorpo non inibitorio (rosso). (C,D). Istogrammi che mostrano correnti di picco misurate durante le condizioni di attivazione in presenza di nanocorpi e dopo lo svincolo dei nanocorpi (recupero). Il pannello C mostra i risultati delle misurazioni utilizzando singoli chip per nanocorpo. Il pannello D mostra i risultati di una misurazione seriale utilizzando un chip. I nanocorpi sono indicati come Nb. Le barre di errore indicano la deviazione standard (n=3 repliche biologiche, n=2 repliche tecniche). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Determinazione dell'IC50 di un nanocorpo inibitorio. (A) Trasporto e inibizione elettrogenica della colina da parte di un nanocorpo. Le correnti di picco misurate durante le condizioni di attivazione sono mostrate per diverse concentrazioni di nanocorpi. (B) Grafico dell'ampiezza delle correnti di picco rispetto alla concentrazione di nanocorpi da una misurazione seriale con un nanocorpo inibitorio. L'IC50 determinato era 18 ± 2 nM. Le barre di errore indicano la deviazione standard (n=3 repliche biologiche, n=3 repliche tecniche). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La tecnica qui presentata classifica i nanocorpi con proprietà inibitorie e non inibitorie mirate ai trasportatori elettrogenici. La valutazione del trasporto del substrato è possibile grazie al rilevamento del movimento delle cariche attraverso il trasportatore incorporato nella membrana dei proteoliposomi. Alcuni dei passaggi critici durante la configurazione di un esperimento sono la ricostituzione di proteine attive nei liposomi, la preparazione di monostrati stabili su chip SSM e il recupero delle condizioni iniziali dopo l'applicazione del protocollo di lavaggio per rimuovere le molecole di nanocorpi legati. Una volta che la proteina di membrana viene ricostituita con un adeguato rapporto lipidico-proteico, è possibile stabilire un protocollo SSM generale utilizzando il substrato nativo. È fondamentale eseguire esperimenti di controllo utilizzando liposomi privi di proteine per rivelare correnti di rumore che dovrebbero essere sottratte dalle correnti misurate utilizzando i proteoliposomi. Tuttavia, se le correnti di rumore sono troppo grandi, si consiglia di provare la ricostituzione proteica utilizzando diversi lipidi o di esaminare le condizioni tampone che riducono al minimo questi segnali deleteri. Dopo aver stabilito con successo le condizioni per un test SSM, è possibile eseguire lo screening dei nanocorpi. Un'opzione molto utile che può aiutare a uno screening più rapido dei nanocorpi è quella di eseguire saggi ad alto rendimento utilizzando un singolo chip sensore SSM. Ciò riduce il tempo di manipolazione di chip e buffer e riduce i costi. Tuttavia, poiché durante questo tipo di test vengono applicati più nanocorpi in sequenza, è importante assicurarsi che il nanocorpo applicato possa essere lavato via dopo la misurazione. Potrebbe essere necessario implementare un ciclo di lavaggio rigoroso per slegare alcuni nanocorpi nel caso in cui vengano rilevate ampiezze di corrente di picco ridotte in assenza di nanocorpi. Si consiglia di utilizzare, come punto di partenza, le condizioni di lavaggio qui descritte. Se aumentare il volume di lavaggio o il numero di cicli non aiuta, i singoli chip dovrebbero essere utilizzati per schermare separatamente ciascun nanocorpo. In tutti i casi qui esaminati, il legame dei nanocorpi era reversibile e poteva essere applicato un protocollo ad alto rendimento. Nella nostra configurazione sperimentale, non siamo riusciti a recuperare l'intera ampiezza della corrente di picco iniziale dopo le misurazioni con nanocorpi (Figura 1A; Figura 2C,D). Tuttavia, nella maggior parte dei casi, l'entità delle correnti di picco recuperate variava tra l'80 e il 95% dell'ampiezza misurata prima di applicare i nanocorpi (Fig. 2C,D). Ipotizziamo che ciò potrebbe essere una conseguenza del lavaggio di una frazione dei proteoliposomi aderenti al chip, o a causa della lenta cinetica di svincolo di alcuni nanocorpi inibitori, o una combinazione di entrambi. In entrambi i casi, era ancora possibile continuare a testare ulteriori nanocorpi poiché il trasporto elettrogenico era misurabile. Questo è mostrato nella Figura 2D, dove abbiamo esaminato sei nanocorpi utilizzando una preparazione a singolo chip.
La caratteristica di alta produttività è uno dei progressi più significativi del metodo presentato. Inoltre, a differenza di altri approcci, questo metodo consente la selezione di nanocorpi inibitori mirati a trasportatori elettrogenici per i quali non sono disponibili substrati etichettati. Una rapida identificazione dei nanocorpi inibitori può aiutare ad accelerare la ricerca volta a identificare nuove applicazioni dei nanocorpi come farmaci. I loro apparenti vantaggi rispetto a terapie simili come i trattamenti anticorpali sono numerosi, a partire da una dimensione più piccola che li aiuta a propagarsi ulteriormente nei tessuti o nelle cellule, ai loro bassi costi di produzione e all'elevata stabilità.
L'elettrofisiologia basata su SSM è stata utilizzata in passato per la caratterizzazione di trasportatori elettrogenici nelle vescicole di membrana29,38. Questi tipi di esperimenti sono vantaggiosi in quanto non dipendono dai protocolli di purificazione e ricostituzione delle proteine. Ipotizziamo che sia possibile eseguire la selezione di nanocorpi inibitori utilizzando vescicole di membrana. Ciò contribuirebbe a ridurre i costi ed evitare manipolazioni di proteine purificate.
L'elettrofisiologia basata su SSM è una tecnica forte per lo screening di inibitori di nanocorpi di più proteine di membrana che mostrano il trasporto elettrogenico. Prevediamo che l'elettrofisiologia basata sull'SSM diventerà uno strumento importante per la selezione di nanocorpi inibitori e altri anticorpi con potenziali applicazioni cliniche.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Cedric A. J. Hutter e Markus A. Seeger dell'Istituto di microbiologia medica dell'Università di Zurigo e Gonzalo Cebrero del Biozentrum dell'Università di Basilea per la collaborazione nella generazione di nanocorpi sintetici (sicorpi). Ringraziamo Maria Barthmes e Andre Bazzone di NANION Technologies per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (FNS) (PP00P3_170607 e nanion Research Grant Initiative to C.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-octadecanethiol solution | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 Desalting Columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filter 200 nm membrane | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| Sodium Chloride | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM setup) SURFE2R N1 | Nanion | ----- | |
| SURFE2R N1 Single Sensor Chips | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
References
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