Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מבחר ננו-בודיות מעכבות ממוקדות טרנספורטר על-ידי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM)

Published: May 3, 2021 doi: 10.3791/62578
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

ננו-בודים הם כלים חשובים בביולוגיה מבנית ומהווים פוטנציאל גדול להתפתחות של מטיפולים. עם זאת, הבחירה של nanobodies עם תכונות מעכבות יכול להיות מאתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM) לסיווג של ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרי ממברנות אלקטרוגניות.

Abstract

נוגדנים חד-תחומיים (ננו-בודים) שימשו בהרחבה במחקרים מכניים ומבניים של חלבונים והם מהווים פוטנציאל עצום ככלים לפיתוח טיפולים קליניים, שרבים מהם תלויים בעיכוב חלבונים ממברנים כגון מובילים. עם זאת, רוב השיטות המשמשות לקביעת עיכוב פעילות התחבורה קשה לבצע בשגרות תפוקה גבוהה ותלויים בזמינות מצעים מסומנים ובכך לסבך את ההקרנה של ספריות ננו-גוף גדולות. אלקטרופיזיולוגיה של ממברנה מוצקה (SSM) היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה, המשמשת לאפיון מובילים אלקטרוגניים ולמדידת קינטיקה ועיכוב ההובלה שלהם. כאן אנו מראים את היישום של אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לבחור ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגר משני אלקטרוגני ולחשב קבועים מעכבי ננו-בונים. טכניקה זו עשויה להיות שימושית במיוחד לבחירת ננו-בומניות מעכבות המתמקדות במשגרים שעבורם מצעים מסומנים אינם זמינים.

Introduction

הנוגדנים מורכבים משתי שרשראות כבדות זהות ושתי שרשראות אור האחראיות על כריכת האנטיגן. לקמלים יש נוגדנים בעלי שרשרת כבדה בלבד שמפגינים זיקה דומה לאנטיגן הקוגנייט שלהם בהשוואה לנוגדנים קונבנציונליים1,2. התחום המשתנה היחיד (VHH) של נוגדנים כבדי שרשרת בלבד שומר על הפוטנציאל המלא של איגוד האנטיגן והוכח כיציב מאוד1,2. מולקולות VHH מבודדות אלה או "ננו-בודים" יושמו במחקרים הקשורים לביוכימיה של חלבוני ממברנה ככלים לייצוב קונפורמציות3,4, כמעכבים5,6, כסוכני ייצוב7, וכקאדג'טים לקביעת מבנה8,9,10 . Nanobodies יכול להיווצר על ידי חיסון של camelids עבור טרום העשרה של תאי B המקודדים ננו-בודים ספציפיים למטרה ובידוד לאחר מכן של תאי B, ואחריו שיבוט של ספריית nanobody ובחירה על ידי תצוגת פאג'11,12,13. דרך חלופית ליצירת ננו-ביגודים מבוססת על שיטות בחירה במבחנה הנשענות על בניית ספריות ובחירה על ידי תצוגת פאג ', תצוגת ריבוזום או תצוגת שמרים14,15,16,17,18,19,20. שיטות הפריה חוץ גופית אלה דורשות גדלי ספרייה גדולים אך נהנות מהימנעות מחיסון בעלי חיים ומעדיפים את בחירת הננו-ביגודים המתמקדים בחלבונים ביציבות נמוכה יחסית.

הגודל הקטן של nanobodies, היציבות הגבוהה שלהם מסיסות, זיקה אנטיגן חזקה, אימונוגניות נמוכה, וייצור קל יחסית, להפוך אותם מועמדים חזקים לפיתוח של טיפולי21,22,23. בפרט, nanobodies המעכב את הפעילות של חלבונים ממברנה מרובים הם נכסים פוטנציאליים עבור יישומים קליניים5,24,25,26. במקרה של מובילי ממברנה, כדי להעריך אם לננו-גוף יש פעילות מעכבת, יש צורך לפתח בבדיקה המאפשרת זיהוי של מצעים מועברים ו/או מצעים משותפים. בדיקות כאלה כרוכות בדרך כלל במולקולות מסומנות או בעיצוב שיטות זיהוי ספציפיות למצע, אשר עשויות להיות חסרות יישום אוניברסלי. יתר על כן, זיהוי של nanobodies מעכב בדרך כלל דורש הקרנה של מספר גדול של קלסרים. לכן, שיטה שניתן להשתמש בה במצב תפוקה גבוהה ואינה מסתמכת על מצעים מסומנים חיונית לבחירה זו.

אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM היא טכניקה רגישה ביותר, פתורה מאוד זמן המאפשר זיהוי של תנועה של מטענים על פני ממברנות (למשל, יונים מחייב / הובלה)27,28. טכניקה זו יושמה כדי לאפיין מובילים אלקטרוגניים, אשר קשה ללמוד באמצעות טכניקות אלקטרופיזיולוגיות אחרות בשל המחזור הנמוך יחסית של חלבונים אלה29,30,31,32,33,34,35. אלקטרופיזיולוגיה SSM אינה דורשת שימוש במצעים מסומנים, היא מתאימה להקרנה בתפוקה גבוהה, וניתן להשתמש בפרוטואוליפוזומים או בשלל ממברנה המכיל את המשגר של עניין. כאן, אנו מדגימים כי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM יכולה לשמש כדי לסווג ננו-בודיות ממוקדות טרנספורטר עם תכונות מעכבות ולא מעכבות. כהוכחה לעקרון, אנו מתארים את השיקום של טרנספורטר כולין חיידקי לליפוזומים, ואחריו צעדים מפורטים לשתקת פרוטאוליפוזומים בחיישני SSM. לאחר מכן אנו מתארים כיצד לבצע מדידות אלקטרופיזיולוגיות מבוססות SSM של הובלת כולין וכיצד לקבוע את הריכוז האפקטיבי למחצה (EC50). לאחר מכן אנו מראים כיצד להשתמש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לסנן ננו-בודיות מרובות ולזהות מעכבים של הובלת כולין. לבסוף, אנו מתארים כיצד לקבוע את ריכוזי המעכבים המקסימליים למחצה (IC50) של ננו-בודיות מעכבות נבחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שחזור חלבון ממברנה

  1. מערבבים 3 מ"ל של שומנים קוטביים E. coli עם 1 מ"ל של פוספטידילכולין בבקבוקון תחתון עגול מתחת למכסה המנוע מאוורר.
  2. יבש את תערובת השומנים במשך 20 דקות תחת ואקום באמצעות מאייד סיבובי ואמבט מים ב 37 °C (50 °F) כדי להסיר כלורופורם. במידת הצורך, יבש עוד יותר תחת חנקן או גז ארגון.
  3. באמצעות חוצץ TS (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) המכיל 2 מ"מ β-mercaptoethanol, שומנים resuspend ל 25 מ"ג / מ"ל.
  4. עליקוט שומנים ב 500 aliquots μL, להקפיא פלאש חנקן נוזלי, ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
  5. להפשיר אחד 500 μL aliquot של שומנים לדלל 1:1 באמצעות חיץ TS המכיל 2 mM β-mercaptoethanol.
  6. לפרט את השעיית השומנים 15 פעמים באמצעות קרום 400 ננומטר.
  7. לדלל את השעיית השומנים יש ריכוז שומנים סופי של 4.4 מ"ג / מ"ל.
  8. הוסף n-דודסיל-β-D-maltoside (DDM) כדי לקבל ריכוז סופי של 0.2% ולהשאיר אותו מסתובב במשך 1 שעה ב 200 סל"ד בטמפרטורת החדר (RT).
  9. מוסיפים את החלבון המטוהר לשומנים באמצעות יחס שומנים לחלבון בין 1:10 ל-1:100 (w:w).
    הערה: יש להתאים את היחס בהתאם לעוצמת האות שזוהה במדידות SSM-אלקטרופיזיולוגיה של הובלת מצע (ראה להלן). כדי להשיג אותות גדולים יותר, השתמש ביחסי שומנים לחלבון קטנים יותר.
  10. לדגור את התערובת מסתובב ב 200 סל"ד עבור 1 שעה ב RT.
  11. יש להוסיף 30 מ"ג/מ"ל של חרוזי ספיח פוליסטירן, שנשטפו מראש במאגר TS.
    הערה: הוסף חרוזי פוליסטירן צעד אחד.
  12. לדגור את תערובת החרוזים-שומנים במשך 30 דקות ב RT תחת ערבוב איטי.
  13. כדי להסיר את החרוזים, תן תערובת חרוזים-שומנים לעמוד, כך החרוזים להתיישב. מעבירים את הפתרון לצינור חדש ומשאירים את החרוזים מאחור. הוסיפו 30 מ"ג/מ"ל של חרוזי פולסטירן טריים לתערובת השומנים המופרדת.
  14. לדגור את התערובת במשך 1 שעות ב 4 °C תחת ערבוב איטי.
  15. להפריד את החרוזים מן התערובת כמתואר בשלב 1.13 ולהוסיף 30 מ"ג / מ"ל של חרוזים ספיח פוליסטירן טרי.
  16. לדגור על התערובת במשך 16 שעות ב 4 °C (70 °F).
  17. להפריד את החרוזים מן התערובת כמתואר בשלב 13 ולהוסיף 30 מ"ג / מ"ל של חרוזים ספיח פוליסטירן טרי.
  18. לדגור את התערובת במשך 2 שעות ב 4 °C (4 °F) עבור שטיפה רביעית ואחרונה.
  19. צנטריפוגה ב 110,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F).
  20. לשטוף את הכדור עם 500 μL של חוצץ TS המכיל 2 mM β-mercaptoethanol.
  21. צנטריפוגה שוב ב 110,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F).
  22. resuspend הכדור לריכוז שומנים סופי של 25 מ"ג / מ"ל במאגר TS עם 2 mM β-mercaptoethanol.
  23. להעריך את ריכוז החלבון באמצעות ג'ל או amido שחור assay36.
  24. Aliquot הפרוטאוליפוזומים, להקפיא פלאש חנקן נוזלי, ולאחסן ב -80 °C (70 °F).

2. הכנת שבב

  1. מלא שבב חיישן יחיד עם 50-100 μL של 0.5 mM 1-octadecanethiol פתרון (resuspended איזופרופנול).
  2. לדגור את השבב עם הפתרון במשך 30 דקות ב RT.
  3. הסר את התמיסה thiol על ידי הקשה על השבב על רקמה.
  4. לשטוף את החיישן 3 פעמים עם 5 מ"ל של איזופרופנול טהור.
  5. יש לשטוף את החיישן 3 פעמים עם 5 מ"ל של מים מזוקקים כפולים.
  6. ייבשו את החיישן על ידי הקשה על נייר טישו.
  7. יש למרוח 1.5 μL של 7.5 מיקרוגרם/מיקרו-לן 1,2-דיפיטנויל-סן-גליצרי-3-פוספוצולין (שומנים מיובשים במאדה מסתובב ומותפנים מחדש ב-n-דקאן).
  8. מיד לאחר מכן, מלא את החיישן עם 50 μL של מאגר SSM שאינו מפעיל, אשר אינו מכיל את המצע. זה יוביל להיווצרות ספונטנית של שכבת SSM.
    הערה: יש למטב מראש את מאגר SSM כדי לקבוע תנאים אופטימליים בעלי רעשי רקע נמוכים. מאגר כללי המכיל 30 mM HEPES pH 7.4, 5 mM MgCl2, 140 mM NaCl, יכול לשמש כנקודת התחלה. מאגר SSM ללא המצע משמש לשטיפה לפני ואחרי המדידה (מאגר שאינו מפעיל). כדי להימנע מאי-התאמה במאגר, השתמש במאגר שאינו מפעיל כדי להכין את המאגר המכיל את המצע (הפעלת המאגר). המצע ניתן להוסיף ישירות כמו אבקה או בנפח קטן מתוך מלאי ריכוז גבוה כדי למנוע דילול.
  9. להפשיר פרוטאוליפוזומים מ שלב 1.24 ב RT.
  10. לדלל proteoliposomes בין 1:5 ו 1:100 (proteoliposomes:buffer, (v:v)) במאגר SSM שאינו מפעיל (כאן 1:20).
  11. Sonicate proteoliposomes עבור 20-30 s או 3 פעמים במשך 10 s, הצבה על קרח בין sonication, במידת הצורך. כאן נעשה שימוש בסוניטור אמבט מים ב 45 kHz.
  12. החל 5-10 μL של דגימת פרוטאוליפוזומים sonicated מדולל על פני השטח של החיישן מבלי לגעת בו.
  13. צנטריפוגות השבבים עם הפתרון ב RT במשך 30 דקות באמצעות מהירות בין 2,000 ל 3,000 x גרם.
    הערה: השתמש בצינורות 50 מ"ל עם תחתית שטוחה. הניחו בזהירות את שבבי החיישן זקופים באמצעות פינצטה. ניתן להשתמש גם בצלחות 6-באר וצנטריפוגה עם מחזיק צלחת.
  14. השתמש בשבבי החיישן באותו היום.

3. מדידת התחבורה הלולית: קביעת תנאי הרוויה

הערה: כהוכחה עקרונית, ניסויים אלה בוצעו באמצעות טרנספורטר כולין חיידקי שחודש בליפוזומים בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל. התהליך שלב אחר שלב של קביעת תנאים רוויים של כולין המצע לפני מדידת עיכוב על ידי nanobodies מוצג כאן.

  1. הכן 1-2 ליטר של מאגר SSM שאינו מפעיל.
    הערה: הכן והשתמש באותו מלאי מאגר SSM עבור כל המאגרים המפעילים והלא-מופעלים בכל המדידות.
  2. קח 10 צינורות נקיים ולהעביר 10 מ"ל של מאגר SSM שאינו מפעיל לתוך כל אחד.
  3. הוסף את המצע לתוך הצינורות מ שלב 3.2 באמצעות סדרה של ריכוזים סביב הריכוז המקסימלי חצי הצפוי (כאן 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 mM של כולין) כדי להכין את מאגרי SSM הפעלת. השתמש במלאי בריכוז גבוה כדי למנוע דילול.
  4. תדליק את מכונת ה-אס.אס.אם.
  5. הפעל את תוכנת ה- SSM ותן למחשב לאתחל באופן אוטומטי. הגדר את נתיב השמירה עבור נתונים ואשר על-ידי לחיצה על לחצן אישור. בחר את פרוטוקול הניקוי ההתחלתי הרגיל באפשרויות זרימת העבודה ולחץ על הפעל.
  6. הר את השבב מצופה proteoliposome על השקע, להזיז את הזרוע כדי לנעול את השבב, ולסגור את השבב רכוב עם הכובע.
  7. בחר את התוכנית CapCom בזרימת העבודה ותן לה לפעול כדי לקבוע את המוליכות והקיביות. ודא כי המוליכות היא מתחת 5 nS ואת הקיבול הוא בין 15 ל 35 nF לפני השימוש בו למדידה.
    הערה: ערך קיבוליות של 15-35 nF ומוליכות מתחת 5 nS מומלצים על ידי היצרן בעת שימוש בשבב 3 מ"מ.
  8. העבר את פתרונות ההפעלה לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה.
  9. העבר את המאגר שאינו מפעיל למאגר והצב אותו ליד מחזיק השבב בעמדת המאגר מימין.
  10. צור פרוטוקול עבור זרימת העבודה באמצעות רצף של פתרונות אי-הפעלה (B), הפעלה (A) ופתרונות שאינם מופעלים (B) (רצף B-A-B) ולולאה המבצעת שלוש מדידות ועוברת למאגר ההפעלה הבא עבור כל 10 המאגרים שהוכנו בשלב 3.3. השתמש בקצב הזרימה המוגדר כברירת מחדל ב- 200 μL/s באמצעות זמני זרימה של 1 s - 1 - 1 s עבור רצף B-A-B. לחץ על הפעל כדי להתחיל את המידה.
    הערה: ניסוי טיפוסי מורכב מהזרימה הרציפה של פתרונות שאינם מופעלים (B), מפעילים (A) ולא מופעלים (B) (שנכתבו כ- B-A-B; ראו איור 1A). הפרוטאוליפוזומים משותקים על החיישן יישטפו עם הפתרונות. לכן, חילופי פתרון B-A מייצר שיפוע ריכוז מצע, אשר מניע את תגובת התחבורה האלקטרוגנית.
  11. שמור את הפרוטוקול ותן לזרימת העבודה לפעול על-ידי לחיצה על לחצן הפעל. בצעו את אותו סוג של ניסוי אך באמצעות ליפוזומים נטולי חלבונים. זה חשוב מאוד כפי שהוא יראה את עוצמת זרמי הרקע. יש לקחת זאת בחשבון בעת ניתוח נתונים של תחבורה אלקטרוגנית הנמדדים עם פרוטאוליפוזומים(איור 1C).
  12. השתמש בכל תוכנה מועדפת לניתוח נתונים כדי להתוות את הזרם הנמדד לעומת הזמן. קרא את זרם השיא באופן ידני, או אם אתה משתמש בתוכנה, השתמש בפונקציה להערכת גובה שיא בטווח של תוספת המאגר המפעיל.
  13. התווה את זרם השיא מול ריכוז המצע כדי לקבוע את EC50 של המצע באמצעות רגרסיה לא ליניארית (איור 1B,C). קרא את הריכוז הנמוך ביותר שבו זרם השיא מגיע לערך מקסימלי, ריכוז זה מתאים לתנאים רוויים.
    הערה: חשוב לקחת בחשבון כי מספר הפרוטאוליפוזומים שנותרו משותקים משתנה משבב לשבב. וריאציה זו ניכרת שכן זרמי השיא בתנאי מדידה זהים יציגו משרעת שונה. לכן, יש צורך לנרמל את המשרעת הנוכחית של מדידות המבוצעות על כל שבב בנפרד לפני השוואת מדידות בין תכשירי שבב שונים.

4. סיווג סדרתי של ננו-בומני מעכבות ולא מעכבות

הערה: סעיף זה מראה כיצד למדוד הובלת כולין בנוכחות ננו-ביגודים שנקשרים במיוחד למשגר כולין החיידקי. זרמי שיא קטנים יותר בנוכחות ננו-בומני מצביעים על עיכוב תחבורה. ננו-בודיות לא מעכבות לא ישפיעו על הובלת המצע, כלומר, אין ירידה באות זרם השיא.

  1. הכן 1-2 ליטר של מאגר SSM שאינו מפעיל.
  2. העבר 50 מ"ל של מאגר SSM שאינו מפעיל לתוך צינור נקי. מוסיפים את כולין המצע לריכוז סופי של 5 מ"מ (תנאי רוויה). השתמש באפשרות זו למדידת בקרה חיובית.
  3. העבר 10 מ"ל של מאגר SSM שאינו מפעיל לתוך צינור נקי. מוסיפים את כולין המצע לריכוז סופי של 5 מ"מ (תנאי רוויה) ומוסיפים ננו-גוף לריכוז סופי של 500 ננומטר.
  4. חזור על שלב 4.3 עבור כל גוף ננו כדי להכין את פתרונות ההפעלה.
    הערה: אם הננו-בודיות המטוהרות יתמזגו מחדש במאגר שונה ממאגר ה- SSM, התוספת שלהם למאגרים ההפעלה והלא-הפעלה תוביל לאי-התאמה במאגר. יש להימנע מאי-התאמה במאגר מכיוון שהוא עלול להוביל לרעש גבוה. החלפת המאגר של nanobodies מטוהר עם מאגר SSM יכול לעזור למנוע בעיה זו. יתר על כן, מומלץ להשתמש בריכוזים ננו-גוף המאפשרים להגיע לתנאים רוויים. בהתחשב בכך הקבועים מחייבים של nanobodies הם בדרך כלל מתחת 100 ננומטריה, ריכוז nanobody של 500 ננומטר מומלץ לניסוי זה. עם זאת, חשוב לסנן מראש לריכוזים אופטימליים.
  5. הפעל את מכונת SSM ומדוד את הקיבול והמוליכות של השבב מצופה proteoliposome כמתואר בשלבים 3.4-3.7.
  6. העבר את פתרון ההפעלה ללא גוף ננו לתוך נביון ומניחים את המאגר בסמפלר הבדיקה. העבר את המאגר שאינו מפעיל ללא גוף ננו למאגר ולמקם אותו בסמפלר הבדיקה.
  7. העבר את פתרונות ההפעלה המכילים ננו-בונים לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה. העבר את המאגרים שאינם מפעילים המכילים ננו-בונים לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה.
  8. צור פרוטוקול עבור זרימת העבודה באמצעות רצף של פתרונות (B) שאינם מופעלים(B), מפעילים (A) ולא מפעילים (B).
  9. צור לולאה המבצעת את הפעולות הבאות: שלוש מדידות של רצף B-A-B באמצעות מאגרים ללא ננו- גוף, שתי מדידות של רצף B-A-B עם מאגרים המכילים ננו- גוף, זמן עיכוב של 120 שניות לדגירה עם הננו-גוף, ואז 3 מדידות של רצף B-A-B עם מאגרים המכילים את הננו- גוף.
  10. שמור את זרימת העבודה ותן לה לפעול על-ידי לחיצה על לחצן הפעל.
    הערה: זרימת עבודה זו תמדוד את התנאים ההתחלתיים של התעבורה ללא עיכוב על ידי הפעלת פרוטוקול B-A-B 3 פעמים באמצעות אי-הפעלה (B) והפעלת מאגרים (A) ללא הננו -בודי (איור 1B,C), ואחריו מדידת אפקט הננו-גוף על התחבורה על ידי הפעלת פרוטוקול B-A-B 5 פעמים עם המאגרים שאינם מופעלים ומפעילים המכילים ננו -בודי (איור 2A ). הקינטיקה המחייבת מסדר שני מכתיבה את האינטראקציה של ננו-בונים וחלבוני היעד שלהם. לכן, חשוב להשתמש בעיכוב זמן בשלב B-A על מנת לתת מספיק זמן עבור nanobodies להיקשר מובילים proteoliposomes על השבב. הזמנים האופטימליים תלויים בריכוז הננו-גוף, כלומר בריכוזים נמוכים יותר נדרשים פעמים ארוכות יותר. שתי המדידות הראשונות נדרשות כדי להתאים את המערכת לתנאים החדשים והריצה השנייה צריכה להתבצע לאחר זמן עיכוב של 120 שניות. יש להשתמש רק בשלוש המדידות הבאות לניתוח נתונים.
  11. צור פרוטוקול חדש עבור זרימת העבודה באמצעות רצף של פתרונות אי-הפעלה (B), הפעלה (A) ופתרונות שאינם מופעלים (B) (רצף B-A-B) ולולאה של 5 מדידות כדי לשטוף את הננו-גוף הכרוך בהיפוך.
    הערה: אופציונלית, לכלול שלב דגירה כדי לאפשר ניתוק של nanobodies עם קינטיקה איטית.
  12. שמור את זרימת העבודה ותן לה לפעול על-ידי לחיצה על לחצן הפעל.
  13. השווה את זרם השיא האחרון של המדידות למדידה הראשונית של המצע בלבד בשלב 4.10. הננו-גוף נשטף בהצלחה והתנאים ההתחלתיים נוצרו מחדש אם זרם השיא מגיע לערך ההתחלתי, אחרת חזור על שלבים 4.12-4.13 או שנה לשבב חדש.
  14. חזור על שלבים 4.6-4.13 והשתמש בשבבים בודדים עבור כל מסך ננו-גוף ( איור 2C)או חזור עם ננו-בודיות מרובות המשתמשות באותו שבב(איור 2D).
  15. השתמש בכל תוכנה מועדפת לניתוח נתונים כדי להתוות את הזרם הנמדד לעומת הזמן. קרא את זרם השיא באופן ידני, או אם זמין, בתוכנה הנמצאת בשימוש, בחר באופן אוטומטי את הפונקציה להערכת גובה שיא בטווח התוספת של מאגר ההפעלה.
  16. לנרמל את זרם השיא בנוכחות הננו, בהתבסס על המדידה הקודמת של המצע בלבד. התווה את זרמי השיא בהיסטוגרמה והשווה את זרמי השיא של המצע רק למדידות לזרמי השיא הנמדדים בנוכחות ננו-בומניות (איור 2C, D) כדי לזהות ננו-בומני מעכבות.
    הערה: נורמליזציה של זרמי השיא שנקבעו של כל ריצה בודדת עם ננו צריך להתבצע בהתחשב בזרם השיא בהיעדר ננו מהמדידה הקודמת. כמו כן, מכיוון שמספר הפרוטאוליפוזומים שנותרו משותקים משתנה משבב לשבב, חשוב לנרמל את המשרעת הנוכחית של המדידות המבוצעות על כל שבב בנפרד לפני השוואת מדידות בין תכשירי שבב שונים.

5.מדידת IC 50 עם ננו-בודיות מעכבות

הערה: לאחר זיהוי ננו-בודיות מעכבות, ניתן לקבוע את ריכוז המעכבים המקסימליים למחצה שלהם (IC50). זה נעשה על ידי מדידת ההובלה של כולין בריכוז מתמיד, תוך ריכוזים שונים של ננו מעכב.

  1. הכן 1-2 ליטר של מאגר SSM שאינו מפעיל.
  2. העבר 50 מ"ל של מאגר SSM שאינו מפעיל לתוך צינור נקי. מוסיפים את כולין המצע לריכוז סופי של 5 מ"מ (תנאי רוויה). השתמש באפשרות זו כפתרון ההפעלה לשליטה חיובית.
  3. קח 8 צינורות נקיים ולהוסיף 5 מ"ל של פתרון שאינו מפעיל לתוך כל אחד. מוסיפים את כולין המצע לריכוז סופי של 5 מ"מ (תנאי רוויה). הוסף את nanobody מעכב לצינורות בריכוזים בטווח IC50 הצפוי (כאן 500 ננומטר - 1 ננומטר).
  4. קח 8 צינורות נקיים ולהוסיף 10 מ"ל של פתרון שאינו מפעיל לתוך כל אחד. הוסף ננו-גוף מעכב לכל צינור בנפרד באותו ריכוז כמו בשלב 5.3. פעולה זו תואמת למאגר שאינו מפעיל.
    הערה: זה ייצור סדרה של זוגות חיץ הפעלה ולא הפעלה בריכוזים שונים של אותו ננו מעכב.
  5. התחל את הגדרת SSM ומדוד את הקיבול והמוליכות של השבב מצופה proteoliposome כמתואר בשלבים 3.4-3.7.
  6. העבר את פתרון ההפעלה ללא גוף ננו לתוך נביון ומניחים אותו בסמפלר הבדיקה. מעבירים את המאגר שאינו מפעיל ללא ננו-גוף למאגר וממקם אותו בעמדת המאגר ליד מחזיק השבב מימין.
  7. העבר את פתרונות ההפעלה המכילים ננו-בונים לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה. העבר את המאגרים שאינם מפעילים המכילים ננו-בונים לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה.
  8. צור פרוטוקול עבור זרימת העבודה באמצעות רצף של פתרונות (B) שאינם מופעלים(B), מפעילים (A) ולא מפעילים (B). כלול לולאה כדי למדוד כל ריכוז 2 פעמים, דגירה במשך 120 s ולמדוד 3 פעמים נוספות. זרימת העבודה תתחיל עם שליטה חיובית של מצע בלבד ואחריו הריכוז הנמוך ביותר של nanobody. כל מדידה ננו-גוף יהיה ואחריו מדידה הבאה של השליטה החיובית עם מצע בלבד כדי לשחזר את משרעת השיא הראשונית, לפני המעבר לריכוז הננו-גוף הגבוה הבא.
    הערה: הקינטיקה מסדר שני מכתיבה את כריכת הננו-ביגודים. לכן, חשוב להשתמש בעיכוב זמן בשלב B-A. הזמנים האופטימליים תלויים בריכוז הננו-גוף, כלומר בריכוזים נמוכים יותר נדרשים פעמים ארוכות יותר; כאן 120 s שימש עם תוצאות משביעות רצון.
  9. השתמש בכל תוכנה מועדפת לניתוח נתונים כדי להתוות את הזרם הנמדד לעומת הזמן. קרא את זרם השיא באופן ידני, או אם אתה משתמש בתוכנה, בחר את הפונקציה להערכת גובה השיא בטווח של הוספת מאגר ההפעלה (איור 3A). התווה את זרמי השיא נגד ריכוז הננו-גוף כדי לקבוע את IC50 באמצעות רגרסיה לא ליניארית (איור 3B).
    הערה: לנרמל את המשרעת הנוכחית של מדידות שבוצעו עבור כל שבב בודד לפני השוואת מדידות בין תכשירי שבב שונים.

6. ניקוי חיישנים

  1. יש לשטוף את שבבי החיישן הבודדים לאחר השימוש במים מזוקקים ב-10 מ"ל.
  2. ייבש את השבב על ידי הקשה עליו על נייר טישו.
  3. מלא את חלל החיישן של השבב עם 100 μL של איזופרופנול טהור ודגרה במשך 10 דקות ב RT.
  4. מניחים צמר גפן באיזופרופנול טהור ודגר במשך 1-3 דקות.
  5. השתמש בצמר גפן ספוגה מראש וסובב בעדינות על פני השטח של החיישן ללא לחץ כדי להסיר שאריות.
  6. לשטוף את החיישן עם 5 מ"ל של איזופרופנול טהור.
  7. לשטוף את החיישן עם 10 מ"ל של מים מזוקקים.
  8. ייבש את החיישן על ידי הקשה על השבב על טישו.
  9. תן לחיישן להתייבש למשך הלילה ב-RT, ולאחסן ב-RT בתנאים יבשים.
    הערה: ניתן להשתמש מחדש בחיישנים עד 4-5 פעמים בעת ניקוי ואחסנה כראוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM שימשה בהרחבה לאפיון של מובילים אלקטרוגניים. בפרוטוקול המוצג כאן, אנו מראים כיצד להשתמש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לסווג ננו-בודיות המתמקדות במשגר משני (כאן סימפורטר כולין חיידקי) בהתבסס על תכונותיהם המעכבות והלא מעכבות. אחת התכונות השימושיות ביותר של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת הקרנה בתפוקה גבוהה של תנאי חיץ מרובים. מאפיין מסוים זה מועיל לניתוח של ספריות ננו- גוף, אשר לאחר בחירת קלסרים ניתן מהווה מכמה עד עשרות ננו-בודיות. בניסוי סטנדרטי, מונולייטר שומנים יציב מורכב על שבב חיישן. לאחר החלת הכנת פרוטאוליפוזומים המכילים את המשגר כולין, בדיקה עבור מוליכות טובה קיבוליות מבוצעת כמו זה חיוני להצלחת הניסוי. במקרה כי שלמות הממברנה נפגעת במהלך ניסוי, אשר נצפה בקלות בשל זרמי רקע רעש גבוה, שינוי לשבב חדש מומלץ כמו שחזור תנאי רעש נמוך הוא די קשה. באופן כללי, ראינו רבייה טובה מאוד בין מדידות של תחבורה ועיכוב על ידי nanobodies בעת שימוש שבבים שונים.

כדי להחליט על ריכוז המצע שישמש במהלך הקרנה של ננו-ביגודים, הובלה אלקטרוגנית נמדדה תחילה בריכוזים מצע שונים כדי לקבוע את EC50 (איור 1B,C). נבחר ריכוז מצע התואם לתנאים רוויים(איור 1C). ריכוז מצע זה נשמר אז קבוע בכל המאגרים המפעילים. עבור דוגמה מסוימת זו, בחרנו 5 mM כולין.

עבור ההקרנה של nanobodies, nanobody חייב להיות נוסף הן לא הפעלה והפעלה מאגרים. כאשר ננו-בודים נוספו רק למאגר ההפעלה, לא ניתן היה להבחין בעיכוב של ההובלה האלקטרוגנית. אנו משערים כי זה נובע עיסוק לא שלם של כל אתרי כריכת nanobody באוכלוסיית המשגר על השבב, ובכך לחשוף את החשיבות של דגירה מראש עם nanobodies בתנאים שאינם מפעילים. כדי להבטיח כי כל האתרים צפויים להיות תפוסים, שלב עיכוב זמן נכלל במהלך היישום של שלב החיץ הראשון שאינו מפעיל כדי לאפשר רוויה של אתרי כריכה nanobody על אוכלוסיית המשגר. זמני דגירה הנעים בין 2-60 דקות נבדקו עם תוצאות לשחזור. זכור כי הזמנים האופטימליים של דגירה תלויים באופי של קלסר nanobody ואת הריכוז שלה במהלך הניסוי (כמו גם את הריכוז של טרנספורטר פרוטאוליפוזומים על השבב). לכן, מומלץ לנסות זמני דגירה שונים. בכל מקרה, ככלל אצבע, ככל שריכוז הננו-גוף נמוך יותר, כך זמן הדגירה נדרש זמן הדגירה. בדקנו זמני דגירה של 2 דקות, 20 דקות, 30 דקות ו -60 דקות עבור ננו-בומניים שונים, אך לא זיהינו עיכוב תחבורה נוסף.

ההשפעה של ננו-בומני מעכבות על הובלה אלקטרוגנית מדמיינת את הירידה של משרעת זרמי שיא(איור 2A,C,D). ננו-בודים לא מעכבים, לעומת זאת, אינם משפיעים על זרמי שיא. לאחר הפעלת פרוטוקול הכביסה כדי לאפשר ננו-בודה unbinding, התאוששות של 80 עד 95% של משרעת זרם השיא הראשוני נצפתה (איור 2A,C, D). ביצענו ניסוי דומה אך בנוכחות ליפוזומים ללא חלבון המשגר. בעת המעבר מאי-הפעלה לתנאים מפעילים, לא הוצגו זרמי חפץ משמעותיים על-ידי ננו-בודיות הנמצאות במאגרים אלה (איור 2B). הפעלת ניסוי בקרה זה מומלצת שכן חשוב לדעת אם שינויים בזרמי שיא נובעים מממצאים או לא.

לאחר בחירת ננו-בודיות עם תכונות מעכבות, קבענו ערכיIC 50 עבור ננו-בודיות בודדות (איור 3A,B). עבור ניסוי מסוים זה, מומלץ להתחיל עם ריכוז נמוך של nanobodies ולאחר מכן לנוע לעבר ריכוז גבוה במהלך ההגשה. חישוב העיכוב עבור כל ריכוז בוצע לאחר מכן על ידי השוואת זרמי שיא שנמדדו לפני ואחרי היישום של ננו גוף. כדי למנוע כריכה לא סימטית של ננו-בודיות למשטחים, אשר יכול להיות בעייתי במיוחד בעת שימוש בריכוזים ננו-גוף נמוך, מומלץ לעקוב אחר פרוטוקול דומה לזה שתואר על ידי Kermani ואח'37, שבו 50 מיקרוגרם / מ"ל של אלבומין סרום שור נוספה למאגרים, מניעת אפקט מזיק זה. הוספת חומרי ניקוי כגון Tween או Triton למטרה זו יש להימנע כמו אלה היה להמיס קרומי השומנים.

Figure 1
איור 1:אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM. (A)פרוטוקול למדידת זרמים ארעיים. פתרון שאינו מפעיל מוחלף בפתרון הפעלה ואחריו זרימת פתרון שאינו מפעיל לשחזור התנאים ההתחלתיים. במהלך השלב הראשון, ננו-ביגודים נקשרים למשגר. בעת המעבר לפתרון ההפעלה, שיפוע המצע מניע את התחבורה האלקטרוגנית (עקומת כתום). בנוכחות ננו-גוף מעכב, זרם השיא מראה משרעת קטנה יותר (עקומה כחולה). לאחר סיום הפרוטוקול ופתרונות ריצה ללא nanobody (לשטוף), unbinding של nanobodies מתרחשת. בסכמטי, פרוטאוליפוזומים עם חלבון מחודש (כחול) משותקים בחיישן SSM. משולשים ועיגולים אדומים מייצגים ננו-בונים ומצעים, בהתאמה. (B)הובלת כולין אלקטרוגנית בהיעדר ננו-בומני. זרמי שיא הנמדדים במהלך תנאי ההפעלה מוצגים עבור ריכוזי מצע שונים. (C)מדידה מייצגת של זרמים במהלך הפעלת תנאים בהיעדר חלבון טרנספורטר בריכוזים מצע שונים. (D)עלילה של ריכוז מצע לעומת משרעת זרמי שיא. EC50 נקבע היה 95 ± 11 μM כולין. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן (n = 3 שכפולים ביולוגיים, n = 3 עותקים משוכפלים טכניים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סינון וסיווג של ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות. (A)הובלת כולין אלקטרוגנית בנוכחות ננו-גוף. זרמי שיא הנמדדים במהלך ההפעלה מוצגים בהיעדר ננו-גוף (כחול), בנוכחות ננו-גוף מעכב (אדום), ולאחר הפעלה של ננו-גוף (ירוק). (B)מדידת זרמים במהלך הפעלת תנאים בהיעדר חלבון טרנספורטר. עקבות להראות הקלטות בהיעדר ננו (כחול), בנוכחות ננו-גוף מעכב (ירוק), ובנוכחות של ננו-גוף לא מעכב (אדום). (C,D). היסטוגרמה המציגה זרמי שיא נמדדים במהלך הפעלת תנאים בנוכחות ננו-בודיות ולאחר נבוז unbinding (התאוששות). לוח C מציג את התוצאות של מדידות באמצעות שבבים בודדים לכל ננו- גוף. לוח D מציג את התוצאות ממדידה טורית באמצעות שבב אחד. Nanobodies מסומנים כ- Nb. סרגלי שגיאה מציינים את סטיית התקן (n = 3 שכפולים ביולוגיים, n = 2 עותקים משוכפלים טכניים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: קביעת IC50 של ננו-גוף מעכב. (A)הובלת כולין אלקטרוגנית ועיכוב על ידי ננו גוף. זרמי שיא נמדדים במהלך ההפעלה תנאים מוצגים עבור ריכוזי ננו שונים. (B)עלילה של זרמי שיא משרעת לעומת ריכוז ננו-גוף ממדידה סדרתית עם ננו מעכב. IC50 נקבע היה 18 ± 2 nM. קווי שגיאה מציינים את סטיית התקן (n = 3 שכפולים ביולוגיים, n = 3 עותקים משוכפלים טכניים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטכניקה המוצגת כאן מסווגת ננו-ביגודיות עם תכונות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרים אלקטרוגניים. הערכת הובלת המצע אפשרית בשל זיהוי תנועת המטענים באמצעות המשגר המוטמע בקרום הפרוטאוליפוזומים. חלק מהצעדים הקריטיים במהלך ההתקנה של ניסוי הם שחזור של חלבון פעיל בליפוזומים, הכנת monolayers יציב על שבבי SSM, ושחזור של תנאים ראשוניים לאחר היישום של פרוטוקול לשטוף כדי להסיר מולקולות nanobody מאוגד. לאחר שחלבון הממברנה משוחזר ביחס מתאים בין שומנים לחלבון, ניתן לקבוע פרוטוקול SSM כללי באמצעות המצע המקומי. חשוב לבצע ניסויי בקרה באמצעות ליפוזומים נטולי חלבונים כדי לחשוף זרמי רעש שיש להפחית מהזרמים הנמדדים באמצעות פרוטאוליפוזומים. עם זאת, אם זרמי הרעש גדולים מדי, אנו ממליצים לנסות שחזור חלבונים באמצעות שומנים שונים, או מסך עבור תנאי חיץ הממזערים אותות מזיקים אלה. לאחר קביעת תנאים בהצלחה לבדיקת SSM, ניתן לבצע סינון של ננו-בודיות. אפשרות שימושית מאוד שעשויה לעזור בהקרנה מהירה יותר של ננו-בודיות היא לבצע בדיקות תפוקה גבוהה באמצעות שבב חיישן SSM יחיד. זה מקטין את זמן המניפולציה של שבבים ומאגרים ומפחית את העלויות. עם זאת, כי במהלך סוג זה של אסייד ננו-בודיות מרובות מוחלים ברצף, חשוב להבטיח כי nanobody מיושם ניתן לשטוף לאחר המדידה. מחזור כביסה מחמיר ייתכן שיהיה צורך ליישם כדי unbind כמה nanobodies במקרה כי משרעת זרם שיא מופחת מזוהים בהיעדר ננו גוף. אנו ממליצים להשתמש, כנקודת המוצא, בתנאי הכביסה המתוארים כאן. אם הגדלת נפח הכביסה או מספר המחזורים לא עוזר, שבבים בודדים היה צריך לשמש כדי לסנן כל nanobody בנפרד. בכל המקרים שנבדקו כאן, כריכת הננו-ביגוד הייתה הפיכה וניתן היה ליישם פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה. במערך הניסויי שלנו, לא הצלחנו לשחזר את המשרעת המלאה של זרם השיא הראשוני לאחר מדידות עם ננו-בונים (איור 1A; איור 2C,ד). עם זאת, ברוב המקרים, גודל זרמי השיא התאושש נע בין 80 ל 95% של משרעת נמדד לפני החלת nanobodies (איור 2C, D). אנו משערים כי זה יכול להיות תוצאה של שטיפת שבריר של proteoliposomes דבק בשבב, או בשל קינטיקה איטית של unbinding של כמה nanobodies מעכב, או שילוב של שניהם. בכל מקרה, עדיין ניתן היה להמשיך למדוד ננו-בומניות נוספות מכיוון שההובלה האלקטרוגנית הייתה מדידה. זה מוצג באיור 2D, שבו הקרננו שישה ננו-ביגודים באמצעות הכנת שבב יחיד.

מאפיין התפוקה הגבוהה הוא אחת ההתקדמות המשמעותית ביותר של השיטה המוצגת. בנוסף, בניגוד לגישות אחרות, שיטה זו מאפשרת בחירה של ננו-בודיות מעכבות המתמקדות במשגרים אלקטרוגניים שעבורם מצעים מסומנים אינם זמינים. זיהוי מהיר של ננו-בומני מעכבות יכול לעזור להאיץ את המחקר שמטרתו לזהות יישומים חדשניים של ננו-בומני תרופות. היתרונות לכאורה שלהם בהשוואה לטיפולים דומים כגון טיפולים בנוגדנים הם רבים, החל בגודל קטן יותר המסייע להם להתפשט עוד יותר לתוך רקמות או תאים, לעלויות הייצור הנמוכות שלהם ויציבות גבוהה.

אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM שימשה בעבר לאפיון של מובילים אלקטרוגניים שלפוחיות ממברנה29,38. סוגים אלה של ניסויים הם יתרון כפי שהם אינם תלויים בפרוטוקולי טיהור חלבון ושיקום. אנו משערים כי ביצוע הבחירה של ננו-בודיות מעכבות באמצעות שלל ממברנה הוא אפשרי. זה יעזור להפחית עלויות ולהימנע מניפולציות של חלבונים מטוהרים.

אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM היא טכניקה חזקה לסנן מעכבי ננו-גוף של חלבונים ממברנה מרובים המציגים הובלה אלקטרוגנית. אנו מדמיינים כי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM תהפוך לכלי חשוב לבחירת ננו-בודים מעכבים ונוגדנים אחרים עם יישומים קליניים פוטנציאליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים סדריק א.ג. הוטר ומרקוס א. סיגר מהמכון למיקרוביולוגיה רפואית באוניברסיטת ציריך, ולגונזלו קברו מ-Biozentrum מאוניברסיטת באזל על שיתוף פעולה בדור הננו-בודיות הסינתטיות (sybodies). אנו מודים למריה ברתמס ואנדרה בזון מ-NANION Technologies על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע (SNSF) (יוזמת מענק המחקר PP00P3_170607 ו-NANION ל- C.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octadecanethiol solution Sigma Aldrich O1858-25ML
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) BioRad #152-3920
PD 10 Desalting Columns GE Healthcare GE17-0851-01
Filter 200 nm membrane Whatman Nucleopore WHA800282
2-Propanol Merck 33539-1L-R
n-Decane Sigma Aldrich 8034051000
n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) Avanti Polar Lipids 850520P-25g
Sodium Chloride AppliChem 131659.1211
(SSM setup) SURFE2R N1 Nanion -----
SURFE2R N1 Single Sensor Chips Nanion # 161001
Trizma Base Sigma Aldrich T1503
E. coli Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids 100600C
Egg PC L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
  2. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  3. Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641 (2017).
  4. Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216 (2020).
  5. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
  6. Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296 (2017).
  7. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  8. Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
  9. Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
  10. Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
  11. Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
  12. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
  13. Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
  14. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317 (2018).
  15. McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
  16. Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
  17. Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228 (2016).
  18. Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343 (2014).
  19. Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
  20. Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
  21. vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
  22. Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
  23. Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273 (2018).
  24. Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
  25. Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
  26. Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187 (2015).
  27. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  28. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  29. Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
  30. Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
  31. Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
  32. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
  33. Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392 (2016).
  34. Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183 (2020).
  35. Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
  36. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
  37. Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064 (2020).
  38. Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).

Tags

ביוכימיה גיליון 171 משגר ממברנה חלבוני ממברנה אלקטרופיזיולוגיה של ממברנות מוצקות ננו-בודיות ננו-בודיות מעכבות בחירת ננו-בודי
מבחר ננו-בודיות מעכבות ממוקדות טרנספורטר על-ידי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bärland, N., Perez, C.… More

Bärland, N., Perez, C. Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (171), e62578, doi:10.3791/62578 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter