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Biochemistry

सॉलिड-सपोर्टेड-झिल्ली (एसएसएम) आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वारा ट्रांसपोर्टर-लक्षित अवरोधक नैनोबॉडी का चयन

Published: May 3, 2021 doi: 10.3791/62578
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

नैनोबॉडी संरचनात्मक जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण उपकरण हैं और उपचारों के विकास के लिए एक महान क्षमता पैदा करते हैं। हालांकि, निरोधात्मक गुणों के साथ नैनोबॉडी का चयन चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यहां हम इलेक्ट्रोजेनिक झिल्ली ट्रांसपोर्टरों को लक्षित करने वाले अवरोधक और गैर-निरोधात्मक नैनोबॉडी के वर्गीकरण के लिए ठोस समर्थित झिल्ली (एसएसएम) आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं।

Abstract

एकल डोमेन एंटीबॉडी (नैनोबॉडी) का बड़े पैमाने पर प्रोटीन के मशीनी और संरचनात्मक अध्ययनों में उपयोग किया गया है और वे नैदानिक चिकित्सा विकसित करने के लिए उपकरण के रूप में एक विशाल क्षमता पैदा करते हैं, जिनमें से कई ट्रांसपोर्टरों जैसे झिल्ली प्रोटीन के अवरोध पर निर्भर करते हैं। हालांकि, परिवहन गतिविधि के अवरोध को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश तरीकों को उच्च-थ्रूपुट दिनचर्या में प्रदर्शन करना मुश्किल होता है और लेबल किए गए सब्सट्रेट्स उपलब्धता पर निर्भर करता है जिससे बड़े न कोई पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग जटिल हो जाती है। ठोस समर्थित झिल्ली (एसएसएम) इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एक उच्च-थ्रूपुट विधि है, जो इलेक्ट्रोजेनिक ट्रांसपोर्टरों की विशेषता और उनके परिवहन गतिज और अवरोध को मापने के लिए उपयोग की जाती है। यहां हम एक इलेक्ट्रोजेनिक माध्यमिक ट्रांसपोर्टर को लक्षित करने और नैनोबॉडी निरोधात्मक स्थिरांश की गणना करने के लिए अवरोधक और गैर-निरोधात्मक नैनोबॉडी का चयन करने के लिए एसएसएम-आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के कार्यान्वयन को दिखाते हैं। यह तकनीक ट्रांसपोर्टरों को लक्षित करने वाले निरोधात्मक नैनोबॉडी का चयन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकती है जिसके लिए लेबल किए गए सब्सट्रेट्स उपलब्ध नहीं हैं।

Introduction

एंटीबॉडी दो समान भारी श्रृंखलाओं और दो हल्की श्रृंखलाओं से बना होते हैं जो एंटीजन बाइंडिंग के लिए जिम्मेदार होते हैं। कैमलिड्स में भारी-श्रृंखला केवल एंटीबॉडी होती है जो पारंपरिक एंटीबॉडी1,2की तुलना में अपने कॉग्नेट एंटीजन के लिए समान आत्मीयता प्रदर्शित करती है। भारी-श्रृंखला का एकल चर डोमेन (वीएचएच) केवल एंटीबॉडी पूर्ण एंटीजन-बाइंडिंग क्षमता को बनाए रखता है और इसे बहुत स्थिर1,2दिखाया गया है। इन अलग-थलग वीएचएच अणुओं या "नैनोबॉडी" को झिल्ली प्रोटीन बायोकेमिस्ट्री से संबंधित अध्ययनों में लागू किया गया है, जो संरचना को स्थिर करने के लिए उपकरण के रूप में3,4,अवरोधक5,6,स्थिरीकरण एजेंट 7 के रूप में, और संरचना निर्धारण के लिए गैजेट के रूप में8,9,10 . नैनोबॉडी बी-कोशिकाओं के पूर्व-संवर्धन के लिए कैमलिड्स के प्रतिरक्षण द्वारा उत्पन्न की जा सकती है जो लक्ष्य-विशिष्ट नैनोबॉडी और बी कोशिकाओं के बाद अलगाव को एन्कोड करती है, इसके बाद ननओ लाइब्रेरी की क्लोनिंग और फेज डिस्प्ले11,12, 13द्वारा चयन कियाजाताहै। नैनोबॉडी उत्पन्न करने का एक वैकल्पिक तरीका इन विट्रो चयन विधियों पर आधारित है जो पुस्तकालयों के निर्माण और फेज डिस्प्ले, राइबोसोम डिस्प्ले, या खमीरप्रदर्शन14,15, 16, 17,18,19,20द्वारा चयन पर निर्भर करते हैं। इन इन इन विट्रो विधियों को बड़े पुस्तकालय आकारों की आवश्यकता होती है लेकिन पशु प्रतिरक्षण से बचने से लाभ होता है और अपेक्षाकृत कम स्थिरता वाले प्रोटीन को लक्षित करने वाले नैनोबॉडी के चयन का पक्ष लेते हैं।

नैनोबॉडी का छोटा आकार, उनकी उच्च स्थिरता और घुलनशीलता, मजबूत एंटीजन आत्मीयता, कम इम्यूनोजेनिसिटी, और अपेक्षाकृत आसान उत्पादन, उन्हें चिकित्सीय21, 22,23के विकास के लिए मजबूत उम्मीदवार बनाते हैं। विशेष रूप से, कई झिल्ली प्रोटीन की गतिविधि को बाधित करने वाले नैनोबॉडी नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए संभावित संपत्ति हैं5,24,25, 26। झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के मामले में, यह मूल्यांकन करने के लिए कि क्या किसी के पास निरोधात्मक गतिविधि नहीं है, एक परख विकसित करना आवश्यक है जो ले जाए गए सब्सट्रेट्स और/या सह-सब्सट्रेट्स का पता लगाने की अनुमति देता है । इस तरह के परखों में आमतौर पर लेबल किए गए अणु या सब्सट्रेट-विशिष्ट पता लगाने के तरीकों का डिजाइन शामिल होता है, जिसमें सार्वभौमिक अनुप्रयोग की कमी हो सकती है। इसके अलावा, निरोधात्मक नैनोबॉडी की पहचान के लिए आम तौर पर बड़ी संख्या में बाइंडर्स की स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, एक विधि जिसका उपयोग उच्च-थ्रूपुट मोड में किया जा सकता है और जो लेबल किए गए सब्सट्रेट्स पर भरोसा नहीं करता है, इस चयन के लिए आवश्यक है।

एसएसएम-आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एक अत्यंत संवेदनशील, अत्यधिक समय-हल तकनीक है जो झिल्ली (जैसे, आयन बाध्यकारी/परिवहन)27, 28में आरोपों के आंदोलन का पता लगाने की अनुमति देती है। यह तकनीक इलेक्ट्रोजेनिक ट्रांसपोर्टरों की विशेषता के लिए लागू की गई है, जो इन प्रोटीनोंके सापेक्ष कम कारोबार29,30, 31, 33, 34,34,35के कारण अन्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीकों का उपयोग करके अध्ययन करना मुश्किल है। एसएसएम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को लेबल किए गए सब्सट्रेट्स के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है, यह उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है, और या तो प्रोटेओलिपोसोम या ब्याज के ट्रांसपोर्टर युक्त झिल्ली वेसिकल्स का उपयोग किया जा सकता है। यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि एसएसएम-आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग ट्रांसपोर्टर-लक्षित नैनोबॉडी को निरोधात्मक और गैर-निरोधात्मक गुणों के साथ वर्गीकृत करने के लिए किया जा सकता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, हम एक बैक्टीरियल कोलीन ट्रांसपोर्टर के लाइपोसोम्स में पुनर्गठन का वर्णन करते हैं, जिसके बाद एसएसएम सेंसर पर प्रोटियोलिपोसोम्स के स्थिरीकरण के लिए विस्तृत कदम उठाए जाते हैं। हम अगले वर्णन कैसे कोलीन परिवहन के एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माप प्रदर्शन करने के लिए और कैसे आधा अधिकतम प्रभावी एकाग्रता (ईसी५०)निर्धारित करने के लिए । फिर हम दिखाते हैं कि कई नैनोबॉडी को स्क्रीन करने और कोलीन परिवहन के अवरोधकों की पहचान करने के लिए एसएसएम-आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग कैसे करें। अंत में, हम वर्णन करते हैं कि चयनित निरोधात्मक नैनोबॉडी के आधे अधिकतम निरोधात्मक सांद्रता(आईसी 50)का निर्धारण कैसे किया जाए।

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Protocol

1. झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन

  1. एक हवादार हुड के नीचे एक गोल नीचे फ्लास्क में फॉस्फेटिडिलकोलिन के 1 मिलीलीटर के साथ ई कोलाई ध्रुवीय लिपिड के 3 एमएल मिलाएं।
  2. क्लोरोफॉर्म को हटाने के लिए रोटरी वाष्पीकरण और 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान का उपयोग करके वैक्यूम के तहत लिपिड मिश्रण को 20 मिनट तक सुखाएं। यदि आवश्यक हो, तो नाइट्रोजन या आर्गन गैस के नीचे आगे सूखें।
  3. टीएस बफर (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 150 एमएमएम एनएसीएल) का उपयोग करना जिसमें 2 एमएमएम β-मर्केप्टोथेनॉल, 25 मिलीग्राम/एमएल के लिए रिसिपेंड लिपिड शामिल हैं।
  4. 500 माइक्रोल एलिकोट में एलिकोट लिपिड, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 2 एमएम β-मर्केप्टोथेन युक्त टीएस बफर का उपयोग करके लिपिड और पतला 1:1 के एक 500 μL aliquot गल।
  6. लिपिड निलंबन को 400 एनएम झिल्ली का उपयोग करके 15 बार बाहर निकालें।
  7. लिपिड निलंबन को पतला करने के लिए 4.4 मिलीग्राम/
  8. 0.2% की अंतिम एकाग्रता रखने के लिए एन-डोडेसिल-β-डी-माल्टोसाइड (डीडीएम) जोड़ें और इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर 200 आरपीएम पर 1 घंटे के लिए घुमाना छोड़ दें।
  9. 1:10 और 1:100 (w:w) के बीच लिपिड-टू-प्रोटीन अनुपात का उपयोग करके लिपिड में शुद्ध प्रोटीन जोड़ें।
    नोट: सब्सट्रेट परिवहन के एसएसएम-इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माप में पाए गए संकेत की ताकत के आधार पर अनुपात को समायोजित करने की आवश्यकता है (नीचे देखें)। बड़े संकेतों को प्राप्त करने के लिए, छोटे लिपिड-टू-प्रोटीन अनुपात का उपयोग करें।
  10. आरटी में 1 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर घूर्णन मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
  11. पॉलीस्टीरिन एसोरबेंट मोतियों की 30 मिलीग्राम/एमएल जोड़ें, टीएस बफर में पूर्व-धोया जाता है।
    नोट: पॉलीस्टीरिन मोती स्टेपवाइज जोड़ें।
  12. धीमी गति से सरगर्मी के तहत आरटी में 30 मिनट के लिए मोती-लिपिड मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
  13. मोतियों को हटाने के लिए मोतियों-लिपिड मिश्रण को खड़ा होने दें ताकि मोतियों का बसा हो। समाधान को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और मोतियों को पीछे छोड़ दें। अलग लिपिड मिश्रण में ताजा पॉलीस्टीरिन एसोर्बेंट मोतियों की 30 मिलीग्राम/एमएल जोड़ें।
  14. धीमी गति से सरगर्मी के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मिश्रण इनक्यूबेट।
  15. मिश्रण से मोतियों को अलग करें जैसा कि चरण 1.13 में वर्णित है और ताजा पॉलीस्टीरिन एसोरबेंट मोतियों के 30 मिलीग्राम/एमएल जोड़ें।
  16. मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  17. मिश्रण से मोतियों को अलग करें जैसा कि चरण 13 में वर्णित है और ताजा पॉलीस्टीरिन एसोरबेंट मोतियों के 30 मिलीग्राम/एमएल जोड़ें।
  18. एक चौथे और अंतिम धोने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मिश्रण इनक्यूबेट।
  19. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 110,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  20. 2 एमएमएम β-मर्केप्टोथेन युक्त टीएस बफर के 500 माइक्रोन के साथ गोली धोएं।
  21. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 110,000 x g पर फिर से सेंट्रलाइज।
  22. 2 एमएमएम β-मर्केप्टोथेन के साथ टीएस बफर में 25 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम लिपिड एकाग्रता के लिए गोली को फिर से खर्च करें ।
  23. इन-जेल या एमो ब्लैक परख36का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान लगाएं।
  24. एलिकोट प्रोटियोलिपोसोम, लिक्विड नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. चिप की तैयारी

  1. 0.5 m 1-octadecanethiol समाधान (आइसोप्रोपैनॉल में फिर से निलंबित) के 50-100 माइक्रोन के साथ एक सेंसर चिप भरें।
  2. आरटी में 30 मिनट के लिए समाधान के साथ चिप इनक्यूबेट ।
  3. एक टिश्यू पर चिप को टैप करके थिओल सॉल्यूशन निकालें।
  4. प्योर आइसोप्रोपेनॉल के 5 एमएल के साथ सेंसर को 3 बार कुल्ला करें।
  5. सेंसर को 3 बार डबल डिस्टिल्ड पानी के 5 एमएल से कुल्ला करें।
  6. एक टिश्यू पेपर पर टैप करके सेंसर को सुखा लें।
  7. 7.5 μg/μL 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-फॉस्फोकोलिन (लिपिड एक रोटोरी वाष्पीकरण में सूख गया और एन-डेकेन में पुनः निलंबित) के 1.5 माइक्रोन लागू करें।
  8. इसके तुरंत बाद सेंसर को 50 माइक्रोन से नॉन एक्टिवेट एसएसएम बफर भरें, जिसमें सब्सट्रेट नहीं होता है। इससे एसएसएम लेयर का सहज गठन हो जाएगा।
    नोट: कम पृष्ठभूमि शोर वाले इष्टतम स्थितियों को निर्धारित करने के लिए एसएसएम बफर को पहले से अनुकूलित किया जाना चाहिए। 30 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.4, 5 एमएम एमजीसीएल2,140 एमएम एनएसीएल युक्त एक सामान्य बफर का उपयोग शुरुआती बिंदु के रूप में किया जा सकता है। सब्सट्रेट के बिना एसएसएम बफर का उपयोग माप (गैर-सक्रिय बफर) से पहले और बाद में धोने के लिए किया जाता है। बफर बेमेल से बचने के लिए, सब्सट्रेट (बफर को सक्रिय करने) युक्त बफर तैयार करने के लिए गैर-सक्रिय बफर का उपयोग करें। सब्सट्रेट को सीधे पाउडर के रूप में या उच्च एकाग्रता स्टॉक से थोड़ी मात्रा में जोड़ा जा सकता है ताकि कमजोर पड़ने से बचा जा सके।
  9. आरटी में कदम १.२४ से गल प्रोटियोलिपोसोम्स ।
  10. 1:5 और 1:100 के बीच पतला प्रोटेलिपोम (प्रोटियोलिपोसोम: बफर, (v:v)) गैर-सक्रिय एसएसएम बफर (यहां 1:20) में।
  11. यदि आवश्यक हो तो 10 एस के लिए 20-30 एस या 3 बार के लिए सोनिकेट प्रोटेपोलिपोम्स, यदि आवश्यक हो तो सोनीसेन के बीच में बर्फ पर रखें। यहां 45 किलोहर्ट्ज पर वाटर बाथ सोनिकेटर का इस्तेमाल किया गया।
  12. सेंसर की सतह पर पतला सोनिकेटेड प्रोटेओलिपोम्स सैंपल का 5-10 माइक्रोन लगाएं, बिना इसे छुए।
  13. 2,000 और 3,000 x ग्रामके बीच की गति का उपयोग करके 30 मिनट के लिए आरटी में समाधान के साथ चिप्स को सेंट्रलाइज करें।
    नोट: एक फ्लैट नीचे के साथ 50 एमएल ट्यूब का उपयोग करें। चिमटी का उपयोग करके सेंसर चिप्स को ध्यान से सीधा रखें। 6- वेल प्लेट्स और प्लेट होल्डर के साथ सेंट्रलाइज का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  14. उसी दिन सेंसर चिप्स का इस्तेमाल करें।

3. सोल्यूट परिवहन को मापने: संतृप्ति की स्थिति का निर्धारण

नोट: सिद्धांत के सबूत के रूप में, इन प्रयोगों के ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद लिपोसोम में पुनर्गठित एक जीवाणु कोलीन ट्रांसपोर्टर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । नैनोबॉडी द्वारा अवरोध के माप से पहले सब्सट्रेट कोलिन की संतृप्त स्थितियों का निर्धारण करने की चरण-दर-चरण प्रक्रिया यहां दिखाई जाती है।

  1. नॉन-एक्टिवेट एसएसएम बफर के 1-2 एल तैयार करें।
    नोट: सभी मापों में सभी सक्रिय और गैर-सक्रिय बफ़र्स के लिए एक ही एसएसएम बफर स्टॉक तैयार करें और उपयोग करें।
  2. 10 साफ ट्यूब लें और प्रत्येक में गैर-सक्रिय एसएसएम बफर के 10 एमएल स्थानांतरित करें।
  3. सक्रिय एस एस एसएम बफर तैयार करने के लिए अपेक्षित आधा अधिकतम एकाग्रता (यहां 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.5, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 मीटर चोलिन) के आसपास सांद्रता की एक श्रृंखला का उपयोग करके चरण 3.2 से ट्यूबों में सब्सट्रेट जोड़ें। कमजोर पड़ने से बचने के लिए उच्च एकाग्रता स्टॉक का उपयोग करें।
  4. एसएसएम मशीन पर स्विच करें।
  5. एसएसएम सॉफ्टवेयर शुरू करें और मशीन को स्वचालित रूप से शुरू करने दें। डेटा के लिए बचत पथ सेट करें और ओके बटन से टकराकर पुष्टि करें। वर्कफ़्लो विकल्पों में मानक प्रारंभिक सफाई प्रोटोकॉल का चयन करें और रनपर क्लिक करें।
  6. सॉकेट पर प्रोटियोलिपोसोम लेपित चिप माउंट करें, चिप को लॉक करने के लिए हाथ को स्थानांतरित करें, और कैप के साथ घुड़सवार चिप को बंद करें।
  7. वर्कफ़्लो में प्रोग्राम कैपकॉम का चयन करें और इसे चालकता और क्षमता निर्धारित करने के लिए चलाने दें। पुष्टि करें कि चालकता 5 एनएस से नीचे है और माप के लिए इसका उपयोग करने से पहले क्षमता 15 और 35 एनएसएफ के बीच है।
    नोट: 3 मिमी चिप का उपयोग करते समय निर्माता द्वारा 15-35 एनएसएन और 5 एनएस से नीचे चालन का क्षमता मूल्य की सिफारिश की जाती है।
  8. सक्रिय समाधानों को शीशियों में स्थानांतरित करें और जांच पारखी में बफ़र्स की स्थिति रखें।
  9. गैर-सक्रिय बफर को जलाशय में स्थानांतरित करें और इसे दाईं ओर जलाशय की स्थिति में चिप धारक के बगल में रखें।
  10. नॉन-एक्टिवेशनिंग (बी), एक्टिवेटिंग (ए), और नॉन-एक्टिविंग (बी) सॉल्यूशंस (बी-बी सीक्वेंस) और एक लूप के सीक्वेंस का इस्तेमाल करते हुए वर्कफ्लो के लिए एक प्रोटोकॉल बनाएं जो तीन माप करता है और स्टेप ३.३ में तैयार सभी 10 बफर्स के लिए अगले एक्टिविंग बफर पर जाता है । बी-ए-बी अनुक्रम के लिए 1 एस -1 एस - 1 एस प्रवाह समय का उपयोग करके 200 माइक्रोन/एस पर डिफ़ॉल्ट प्रवाह दर का उपयोग करें। माप शुरू करने के लिए प्ले पर क्लिक करें।
    नोट: एक विशिष्ट प्रयोग में गैर-सक्रिय (बी), सक्रिय (ए), और गैर-सक्रिय (बी) समाधान (बी-ए-बी के रूप में लिखित; चित्र 1 एदेखें) के अनुक्रमिक प्रवाह शामिल हैं। सेंसर पर स्थिर प्रोटेपोलिपोम्स को समाधानों के साथ धोया जाएगा। इसलिए, बी-ए समाधान एक्सचेंज एक सब्सट्रेट एकाग्रता ढाल उत्पन्न करता है, जो इलेक्ट्रोजेनिक परिवहन प्रतिक्रिया को चलाता है।
  11. प्रोटोकॉल को सेव करें और प्ले बटन पर क्लिक करके वर्कफ्लो को चलने दें। एक ही प्रकार का प्रयोग करें लेकिन प्रोटीन मुक्त लिपोसोम का उपयोग करें। यह अत्यधिक महत्वपूर्ण है क्योंकि यह पृष्ठभूमि धाराओं की तीव्रता दिखाएगा। प्रोटियोलिपोसोम(चित्रा 1C)के साथ मापा गया इलेक्ट्रोजेनिक परिवहन के डेटा का विश्लेषण करते समय इस पर विचार किया जाना चाहिए।
  12. मापा वर्तमान बनाम समय प्लॉट करने के लिए डेटा विश्लेषण के लिए किसी भी पसंदीदा सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। पीक वर्तमान मैन्युअल रूप से पढ़ें, या यदि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रहे हैं, तो सक्रिय बफर के अलावा की सीमा में पीक ऊंचाई अनुमान के लिए फ़ंक्शन का उपयोग करें।
  13. सब्सट्रेट एकाग्रता के खिलाफ चोटी की धारा को गैर-लिनर प्रतिगमन(चित्रा 1B,सी)के माध्यम से सब्सट्रेट के ईसी50 निर्धारित करने के लिए प्लॉट करें। सबसे कम एकाग्रता पढ़ें जिस पर चोटी वर्तमान अधिकतम मूल्य तक पहुंचता है, यह एकाग्रता संतृप्त स्थितियों से मेल खाती है।
    नोट: यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि स्थिर रहने वाले प्रोटियोलिपोमों की संख्या चिप-टू-चिप से भिन्न होती है। यह भिन्नता स्पष्ट है क्योंकि समान माप स्थितियों पर चोटी की धाराएं विभिन्न आयामों को दिखाएगी। इसलिए, विभिन्न चिप तैयारियों के बीच माप की तुलना करने से पहले प्रत्येक चिप पर अलग-अलग किए गए मापों के वर्तमान आयाम को सामान्य करना आवश्यक है।

4. निरोधात्मक और गैर-निरोधात्मक नैनोबॉडी का धारावाहिक वर्गीकरण

नोट: यह अनुभाग नैनोबॉडी की उपस्थिति में कोलीन परिवहन को मापने के तरीके दिखाता है जो विशेष रूप से बैक्टीरियल कोलीन ट्रांसपोर्टर को बांधते हैं। नैनोबॉडी की उपस्थिति में छोटी चोटी की धाराएं परिवहन अवरोध का संकेत देती हैं। गैर-निरोधात्मक नैनोबॉडी सब्सट्रेट परिवहन को प्रभावित नहीं करेगा, यानी, पीक करंट सिग्नल की कोई कमी नहीं होगी।

  1. नॉन-एक्टिवेट एसएसएम बफर के 1-2 एल तैयार करें।
  2. एक साफ ट्यूब में गैर सक्रिय एसएसएम बफर के 50 एमएल स्थानांतरित करें। सब्सट्रेट कोलीन को 5 mm (संतृप्त स्थितियों) की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। एक सकारात्मक नियंत्रण माप के लिए इसका उपयोग करें।
  3. एक साफ ट्यूब में गैर सक्रिय एसएसएम बफर के 10 एमएल हस्तांतरण। सब्सट्रेट कोलीन को 5 m (संतृप्त स्थितियों) की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और 500 एनएम की अंतिम एकाग्रता में कोई नहीं जोड़ें।
  4. सक्रिय समाधान तैयार करने के लिए प्रत्येक न कोई के लिए चरण 4.3 दोहराएं।
    नोट: यदि शुद्ध नैनोबॉडी एसएसएम बफर की तुलना में एक अलग बफर में फिर से निलंबित कर रहे हैं, सक्रिय और गैर सक्रिय बफ़र्स के लिए उनके अलावा एक बफर बेमेल करने के लिए नेतृत्व करेंगे । एक बफर बेमेल से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह उच्च शोर का कारण बन सकता है। एसएसएम बफर के साथ शुद्ध नैनोबॉडी के बफर का आदान-प्रदान इस मुद्दे से बचने में मदद कर सकता है। इसके अलावा, संतृप्त स्थितियों तक पहुंचने की अनुमति देने वाली ना कोई सांद्रता का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यह देखते हुए कि नैनोबॉडी के बाध्यकारी स्थिरांक आम तौर पर 100 एनएम से नीचे होते हैं, इस प्रयोग के लिए 500 एनएम की कोई भी एकाग्रता की सिफारिश की जाती है। हालांकि, इष्टतम सांद्रता के लिए प्री-स्क्रीन करना महत्वपूर्ण है।
  5. एसएसएम मशीन शुरू करें और कदम 3.4-3.7 में वर्णित प्रोटेओलिपोसोम कोटेड चिप की क्षमता और चालकता को मापें।
  6. एक शीशी में एक na कोई नहीं के बिना सक्रिय समाधान हस्तांतरण और जांच पारखी में बफर जगह है। एक जलाशय में एक na कोई नहीं के बिना गैर सक्रिय बफर हस्तांतरण और यह जांच पारखी में स्थिति ।
  7. नैनोबॉडी युक्त सक्रिय समाधानों को शीशियों में स्थानांतरित करें और जांच पारखी में बफ़र्स की स्थिति रखें। नैनोबॉडी युक्त गैर-सक्रिय बफ़र्स को शीशियों में स्थानांतरित करें और जांच पारखी में बफ़र्स की स्थिति रखें।
  8. नॉन-एक्टिवेशनिंग (बी), एक्टिवेटिंग (ए), और नॉन-एक्टिवेशनिंग (बी) सॉल्यूशंस (बी-ए-बी सीक्वेंस) के सीक्वेंस का इस्तेमाल करते हुए वर्कफ्लो के लिए प्रोटोकॉल बनाएं ।
  9. एक पाश बनाएं जो निम्नलिखित करता है: बी-ए-बी अनुक्रम के तीन माप ना कोई नहीं के बिना बफ़र्स का उपयोग करते हैं, बफ़र्स के साथ बी-ए-बी अनुक्रम के दो माप, जिसमें कोई नहीं होता है, न कोई के साथ इनक्यूबेशन के लिए 120 एस विलंब समय, फिर बी-ए-बी अनुक्रम के 3 माप न कोई होता है।
  10. वर्कफ्लो को सेव करें और प्ले बटन पर क्लिक करके इसे चलने दें।
    नोट: यह कार्यप्रवाह बी-ए-बी प्रोटोकॉल को चलाने के बिना परिवहन की प्रारंभिक स्थितियों को मापने के लिए 3 बार गैर-सक्रिय (बी) का उपयोग करके और नन(चित्रा 1 बी,सी)के बिना बफ़र्स (ए) को सक्रियकरेगा, जिसके बाद बी-ए-बी प्रोटोकॉल को चलाकर परिवहन पर कोई भी प्रभाव नहीं होगा। ). दूसरा आदेश बाध्यकारी काइनेटिक्स नैनोबॉडी और उनके लक्षित प्रोटीन की बातचीत को निर्देशित करता है। इसलिए, बी-ए चरण में समय की देरी का उपयोग करना महत्वपूर्ण है ताकि नैनोबॉडी को चिप पर प्रोटेओलिपोम में ट्रांसपोर्टरों को बांधने के लिए पर्याप्त समय दिया जा सके। इष्टतम समय ना कोई एकाग्रता पर निर्भर यानी, कम सांद्रता पर अब समय की आवश्यकता होती है। सिस्टम को नई परिस्थितियों में अनुकूलित करने के लिए पहले दो मापों की आवश्यकता होती है और दूसरा रन 120 एस के विलंब समय के बाद किया जाना चाहिए। केवल निम्नलिखित तीन माप डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  11. नॉन-एक्टिवेशनिंग (बी), एक्टिवेटिंग (ए), और नॉन-एक्टिवेशनिंग (बी) सॉल्यूशंस (बी-ए-बी सीक्वेंस) और रिवर्सिबली बाउंड ने कोई भी को धोने के लिए 5 मापों का लूप का उपयोग करके वर्कफ्लो के लिए एक नया प्रोटोकॉल बनाएं ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, धीमी गतिज के साथ नैनोबॉडी के वियोजन की अनुमति देने के लिए एक इनक्यूबेशन कदम शामिल करें।
  12. वर्कफ्लो को सेव करें और प्ले बटन पर क्लिक करके इसे चलने दें।
  13. चरण 4.10 में प्रारंभिक सब्सट्रेट-केवल माप के साथ माप के अंतिम शिखर वर्तमान की तुलना करें। ना कोई भी सफलतापूर्वक बाहर धोया गया है और प्रारंभिक शर्तों को फिर से स्थापित किया गया है अगर चोटी वर्तमान प्रारंभिक मूल्य तक पहुंचता है, अंयथा दोहराने कदम 4.12-4.13 या एक नई चिप में बदल जाते हैं ।
  14. चरण 4.6-4.13 दोहराएं और प्रत्येक ना कोई स्क्रीन(चित्रा 2 सी)के लिए व्यक्तिगत चिप्स का उपयोग करें या एक ही चिप(चित्रा 2D)का उपयोग करके कई नैनोबॉडी के साथ दोहराएं।
  15. मापा वर्तमान बनाम समय प्लॉट करने के लिए डेटा विश्लेषण के लिए किसी भी पसंदीदा सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर में पीक वर्तमान को मैन्युअल रूप से पढ़ें, या यदि उपलब्ध हो, तो स्वचालित रूप से सक्रियण बफर के अलावा की सीमा में पीक ऊंचाई अनुमान के लिए फ़ंक्शन का चयन करें।
  16. पिछले सब्सट्रेट-केवल माप के आधार पर, ना कोई नहीं की उपस्थिति में चोटी की धारा को सामान्य करें। एक हिस्टोग्राम में चोटी की धाराओं को प्लॉट करें और अवरोधक नैनोबॉडी की पहचान करने के लिए नैनोबॉडी(चित्रा 2C,D)की उपस्थिति में मापी गई चोटी की धाराओं के लिए केवल माप की चोटी की धाराओं की तुलना करें।
    नोट: प्रत्येक व्यक्ति की निर्धारित चोटी की धाराओं को सामान्य बनाने के साथ एक नाह के साथ चलाने के लिए कोई भी पूर्ववर्ती माप से na कोई नहीं की अनुपस्थिति में चोटी वर्तमान पर विचार किया जाना चाहिए । इसके अलावा, चूंकि स्थिर रहने वाले प्रोटियोलोपसोम्स की संख्या चिप-टू-चिप से भिन्न होती है, इसलिए विभिन्न चिप तैयारियों के बीच माप की तुलना करने से पहले प्रत्येक चिप पर अलग-अलग किए गए मापों के वर्तमान आयाम को सामान्य करना महत्वपूर्ण है।

5. निरोधात्मक नैनोबॉडी के साथआईसी 50 माप

नोट: निरोधात्मक नैनोबॉडी की पहचान करने के बाद, उनकी आधी अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी50)निर्धारित करना संभव है। यह लगातार एकाग्रता पर कोलीन के परिवहन को मापने के द्वारा किया जाता है, जबकि निरोधात्मक न कोई की सांद्रता बदलती है।

  1. नॉन-एक्टिवेट एसएसएम बफर के 1-2 एल तैयार करें।
  2. एक साफ ट्यूब में गैर सक्रिय एसएसएम बफर के 50 एमएल स्थानांतरित करें। सब्सट्रेट कोलीन को 5 mm (संतृप्त स्थितियों) की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। सकारात्मक नियंत्रण के लिए सक्रिय समाधान के रूप में इसका उपयोग करें।
  3. 8 साफ ट्यूब लें और प्रत्येक में गैर-सक्रिय समाधान के 5 एमएल जोड़ें। सब्सट्रेट कोलीन को 5 mm (संतृप्त स्थितियों) की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। अपेक्षित आईसी 50 रेंज (यहां500 एनएम - 1 एनएम) में सांद्रता पर ट्यूबों में निरोधात्मक न कोई जोड़ें।
  4. 8 साफ ट्यूब लें और प्रत्येक में गैर-सक्रिय समाधान के 10 एमएल जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब में प्रत्येक ट्यूब में प्रत्येक व्यक्ति को एक ही एकाग्रता पर अवरोधक न कोई जोड़ें जैसा कि चरण 5.3 में है। यह गैर-सक्रिय बफर से मेल खाती है।
    नोट: यह एक ही निरोधात्मक नाद कोई के विभिन्न सांद्रता पर सक्रिय और गैर सक्रिय बफर जोड़े की एक श्रृंखला उत्पन्न करेगा।
  5. एसएसएम सेटअप शुरू करें और कदम 3.4-3.7 में वर्णित प्रोटियोलपोसोम कोटेड चिप की क्षमता और चालकता को मापें।
  6. किसी को भी शीशी में नछेसर के बिना सक्रिय समाधान स्थानांतरित करें और इसे जांच पारखी में रखें। एक जलाशय में किसी के बिना गैर सक्रिय बफर हस्तांतरण और यह सही पर चिप धारक के बगल में जलाशय की स्थिति में स्थिति ।
  7. नैनोबॉडी युक्त सक्रिय समाधानों को शीशियों में स्थानांतरित करें और जांच पारखी में बफ़र्स की स्थिति रखें। नैनोबॉडी युक्त गैर-सक्रिय बफ़र्स को शीशियों में स्थानांतरित करें और जांच पारखी में बफ़र्स की स्थिति रखें।
  8. नॉन-एक्टिवेशनिंग (बी), एक्टिवेटिंग (ए), और नॉन-एक्टिवेशनिंग (बी) सॉल्यूशंस (बी-ए-बी सीक्वेंस) के सीक्वेंस का इस्तेमाल करते हुए वर्कफ्लो के लिए प्रोटोकॉल बनाएं । प्रत्येक एकाग्रता को 2 बार मापने के लिए एक लूप शामिल करें, 120 एस के लिए इनक्यूबेट करें और 3 बार मापें। वर्कफ्लो सब्सट्रेट के सकारात्मक नियंत्रण के साथ शुरू होगा-केवल इसके बाद नन कोई की सबसे कम एकाग्रता होगी। प्रत्येक na कोई भी माप सब्सट्रेट के साथ सकारात्मक नियंत्रण के बाद माप के बाद किया जाएगा-केवल प्रारंभिक शिखर आयाम बहाल करने के लिए, अगले उच्च na कोई एकाग्रता में जाने से पहले ।
    नोट: दूसरा आदेश काइनेटिक्स नैनोबॉडी के बंधन को निर्देशित करता है। इसलिए जरूरी है कि बी-ए स्टेप में समय देरी का इस्तेमाल किया जाए। इष्टतम समय ना कोई एकाग्रता पर निर्भर करता है यानी, कम सांद्रता पर अब समय की आवश्यकता होती है; यहां 120 एस संतोषजनक परिणामों के साथ इस्तेमाल किया गया था।
  9. मापा वर्तमान बनाम समय प्लॉट करने के लिए डेटा विश्लेषण के लिए किसी भी पसंदीदा सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। पीक वर्तमान मैन्युअल रूप से पढ़ें, या यदि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रहे हैं, तो सक्रियण बफर(चित्रा 3 ए)के अतिरिक्त की सीमा में पीक ऊंचाई अनुमान के लिए फ़ंक्शन का चयन करें। गैर-रैखिक प्रतिगमन(चित्रा 3B)के माध्यम सेआईसी 50 निर्धारित करने के लिए ना कोई एकाग्रता के खिलाफ चोटी की धाराओं को प्लॉट करें।
    नोट: विभिन्न चिप तैयारियों के बीच माप की तुलना करने से पहले प्रत्येक व्यक्तिगत चिप के लिए किए गए मापों के वर्तमान आयाम को सामान्य करें।

6. सेंसर की सफाई

  1. आसुत पानी के 10 एमएल के साथ उपयोग के बाद एकल सेंसर चिप्स कुल्ला।
  2. चिप को टिश्यू पेपर पर टैप करके सुखा लें।
  3. चिप के सेंसर गुहा को शुद्ध आइसोप्रोपैनॉल के 100 माइक्रोन के साथ भरें और आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. शुद्ध आइसोप्रोपेनॉल में एक कपास झाड़ू रखें और 1-3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. पूर्वसोकित कपास झाड़ू का उपयोग करें और अवशेषों को हटाने के लिए दबाव के बिना सेंसर की सतह पर धीरे से घुमाएं।
  6. प्योर आइसोप्रोपेनॉल के 5 एमएल के साथ सेंसर कुल्ला।
  7. 10 एमएल डिस्टिल्ड वाटर से सेंसर को खंगाल लें।
  8. एक ऊतक पर चिप दोहन करके सेंसर सूखी।
  9. सेंसर आरटी में रात भर सूखी चलो, और सूखी परिस्थितियों में आरटी पर स्टोर ।
    नोट: सेंसर को साफ करने और ठीक से संग्रहीत किए जाने पर 4-5 बार तक फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Representative Results

इलेक्ट्रोजेनिक ट्रांसपोर्टरों के लक्षण वर्णन के लिए एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम दिखाते हैं कि एक माध्यमिक ट्रांसपोर्टर (यहां एक जीवाणु कोलीन सिंपोर्टर) को लक्षित करने वाले नैनोबॉडी को वर्गीकृत करने के लिए एसएसएम-आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग कैसे किया जाए, उनके निरोधात्मक और गैर-निरोधात्मक गुणों के आधार पर। इस तकनीक की सबसे उपयोगी विशेषताओं में से एक यह है कि यह कई बफर स्थितियों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है। यह विशेष विशेषता नन्हा पुस्तकालयों के विश्लेषण के लिए फायदेमंद है, जो बाइंडर्स के चयन के बाद कुछ से दर्जनों नैनोबॉडी तक गठित की जा सकती है। एक मानक प्रयोग में, एक स्थिर लिपिड मोनोलेयर एक सेंसर चिप पर इकट्ठा किया जाता है। कोलीन ट्रांसपोर्टर युक्त प्रोटियोलिपोम तैयारी को लागू करने के बाद, अच्छी चालकता और क्षमता की जांच की जाती है क्योंकि यह प्रयोग की सफलता के लिए आवश्यक है। यदि झिल्ली की अखंडता को एक प्रयोग के दौरान समझौता किया जाता है, जिसे उच्च शोर पृष्ठभूमि धाराओं के कारण आसानी से मनाया जाता है, एक नई चिप में बदलने की सिफारिश की जाती है क्योंकि कम शोर की स्थिति ठीक होना मुश्किल है। सामान्य तौर पर, हमने विभिन्न चिप्स का उपयोग करते समय परिवहन के माप और नैनोबॉडी द्वारा अवरोध के बीच बहुत अच्छी प्रजनन क्षमता देखी है।

नैनोबॉडी की स्क्रीनिंग के दौरान इस्तेमाल की जाने वाली सब्सट्रेट एकाग्रता के बारे में निर्णय लेने के लिए, इलेक्ट्रोजेनिक परिवहन को सबसे पहले ईसी50 (चित्रा 1 बी,सी)निर्धारित करने के लिए विभिन्न सब्सट्रेट सांद्रता के तहत मापा गया था। एक सब्सट्रेट एकाग्रता जो संतृप्त स्थितियों से मेल खाती है(चित्रा 1C)का चयन किया गया था। इस सब्सट्रेट एकाग्रता को तब सभी सक्रिय बफ़र्स में स्थिर रखा गया था। इस विशेष उदाहरण के लिए, हमने 5 एमएमएम कोलीन का चयन किया।

नैनोबॉडी की स्क्रीनिंग के लिए, नन किसी को भी गैर-सक्रिय और सक्रिय बफ़र्स दोनों में नहीं जोड़ा जाना चाहिए। जब नैनोबॉडी को केवल सक्रिय बफर में जोड़ा गया था, तो इलेक्ट्रोजेनिक परिवहन के अवरोध का पालन करना संभव नहीं था। हम अटकलें लगाते हैं कि यह चिप पर ट्रांसपोर्टर आबादी में सभी ना कोई बाध्यकारी साइटों के अधूरे व्यवसाय के कारण है, जिससे गैर-सक्रिय परिस्थितियों में नैनोबॉडी के साथ पूर्व-इनक्यूबेशन के महत्व का खुलासा होता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी साइटों पर कब्जा होने की संभावना है, ट्रांसपोर्टर आबादी पर ना कोई बाध्यकारी साइटों के संतृप्ति की अनुमति देने के लिए पहले गैर-सक्रिय बफर कदम के आवेदन के दौरान एक समय देरी कदम शामिल किया गया था। 2-60 मिनट से लेकर इनक्यूबेशन बार प्रजनन योग्य परिणामों के साथ परीक्षण किया गया है। ध्यान रखें कि इनक्यूबेशन का इष्टतम समय प्रयोग के दौरान ने कोई भी बांधने की मशीन और इसकी एकाग्रता की प्रकृति पर निर्भर करता है (साथ ही चिप पर प्रोटियोलिपोम में ट्रांसपोर्टर की एकाग्रता)। इसलिए, इनक्यूबेशन बार अलग-अलग प्रयास करने की सिफारिश की जाती है। किसी भी मामले में, अंगूठे के नियम के रूप में, नन कोई एकाग्रता कम, इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता उतनी ही लंबी होगी। हमने विभिन्न नैनोबोडीज के लिए 2 मिनट, 20 मिनट, 30 मिनट और 60 मिनट के इनक्यूबेशन बार परीक्षण किया लेकिन आगे परिवहन अवरोध का पता नहीं लगाया।

इलेक्ट्रोजेनिक परिवहन पर निरोधात्मक नैनोबॉडी के प्रभाव को पीक धाराओं के आयामों(चित्रा 2 ए,सी, डी)की कमी से कल्पना की जाती है। दूसरी ओर, गैर-निरोधात्मक नैनोबॉडी, चोटी की धाराओं को प्रभावित नहीं करते हैं। नैनोबॉडी को अनबाइंडिंग की अनुमति देने के लिए वाशिंग प्रोटोकॉल चलाने के बाद, प्रारंभिक पीक वर्तमान आयाम का 80 से 95% की वसूली देखी गई(चित्रा 2 ए,सी, डी)। हमने इसी तरह का प्रयोग किया है लेकिन ट्रांसपोर्टर प्रोटीन के बिना लिपोसोम्स की मौजूदगी में । गैर-सक्रिय से सक्रिय करने की स्थिति में बदलते समय, इन बफ़र्स(चित्रा 2B)में मौजूद नैनोबॉडी द्वारा कोई महत्वपूर्ण विरूपण साक्ष्य धाराएं पेश नहीं की गई थीं। इस नियंत्रण प्रयोग को चलाने की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह जानना महत्वपूर्ण है कि पीक धाराओं में परिवर्तन कलाकृतियों से उत्पन्न होते हैं या नहीं।

निरोधात्मक गुणों के साथ नैनोबॉडी के चयन के बाद, हमने व्यक्तिगत नैनोबॉडी(चित्र 3 ए,बी)के लिए आईसी50 मूल्य निर्धारित किए हैं। इस विशेष प्रयोग के लिए, नैनोबॉडी की कम एकाग्रता के साथ शुरू करने और फिर परख के दौरान उच्च एकाग्रता की ओर बढ़ने की सिफारिश की जाती है। प्रत्येक एकाग्रता के लिए निषेध की गणना तब किसी के आवेदन से पहले और बाद में मापी गई चोटी की धाराओं की तुलना करके की गई थी। सतहों के लिए नैनोबॉडी के अविशिष्ट बाध्यकारी से बचने के लिए, जो विशेष रूप से समस्याग्रस्त हो सकता है जब कम na कोई सांद्रता का उपयोग कर, यह की सलाह दी जाती है कि केरमानी एट अल द्वारा वर्णित एक समान प्रोटोकॉल का पालन करें ।३७,जहां ५० μg/ml गोजातीय सीरम एल्बुमिन बफ़र्स में जोड़ा गया था, इस हानिकारक प्रभाव को रोकने । इस उद्देश्य के लिए ट्वीन या ट्राइटन जैसे डिटर्जेंट को जोड़ने से बचा जाना चाहिए क्योंकि ये लिपिड झिल्ली को भंग कर देंगे।

Figure 1
चित्र 1:एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी। (A)क्षणिक धाराओं के माप के लिए प्रोटोकॉल। एक गैर-सक्रिय समाधान को सक्रिय समाधान द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है जिसके बाद प्रारंभिक स्थितियों को बहाल करने के लिए गैर-सक्रिय समाधान का प्रवाह होता है। पहले चरण के दौरान, नैनोबॉडी ट्रांसपोर्टर को बांधती है। सक्रिय समाधान पर स्विच करते समय, सब्सट्रेट ग्रेडिएंट इलेक्ट्रोजेनिक परिवहन (नारंगी वक्र) को चलाता है। एक निरोधात्मक न कोई की उपस्थिति में, चोटी की धारा एक छोटे आयाम (नीली वक्र) को दिखाती है। प्रोटोकॉल खत्म करने और ना कोई नहीं (धोने) के बिना समाधान चलाने के बाद, नैनोबॉडी की अनबाइंडिंग होती है। योजनाबद्ध में, पुनर्गठित प्रोटीन (नीला) के साथ प्रोटियोलिपोसोम एसएसएम सेंसर पर स्थिर होते हैं। त्रिकोण और लाल हलकों क्रमशः नैनोबॉडी और सब्सट्रेट का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी)नैनोबॉडी के अभाव में इलेक्ट्रोजेनिक कोलीन परिवहन। सक्रिय करने की स्थितियों के दौरान मापा गया पीक धाराओं को विभिन्न सब्सट्रेट सांद्रता के लिए दिखाया जाता है। (ग)विभिन्न सब्सट्रेट सांद्रता पर ट्रांसपोर्टर प्रोटीन के अभाव में सक्रिय करने की स्थिति के दौरान धाराओं का प्रतिनिधि माप। (घ)सब्सट्रेट एकाग्रता बनाम पीक धाराओं आयाम की साजिश । चुनाव आयोग५० निर्धारित ९५ ± 11 μM कोलीन था । त्रुटि सलाखों मानक विचलन (n = 3 जैविक प्रतिकृति, n = 3 तकनीकी प्रतिकृति) का संकेत मिलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:निरोधात्मक और गैर-निरोधात्मक नैनोबॉडी की स्क्रीनिंग और वर्गीकरण। (ए)नन कोई की उपस्थिति में इलेक्ट्रोजेनिक कोलीन परिवहन। सक्रिय परिस्थितियों के दौरान मापा गया पीक धाराएं न कोई (नीला) की अनुपस्थिति में दिखाई जाती हैं, एक निरोधात्मक ना कोई नहीं (लाल) की उपस्थिति में, और ना कोई भी बिनाबाइंडिंग (हरे रंग) के बाद। (ख)ट्रांसपोर्टर प्रोटीन के अभाव में सक्रिय करने की स्थिति के दौरान धाराओं का मापन। निशान एक निरोधात्मक नाद (हरे) की उपस्थिति में, और एक गैर-निरोधात्मक न कोई (लाल) की उपस्थिति में ना कोई नहीं (नीला) की अनुपस्थिति में रिकॉर्डिंग दिखाते हैं। (C,D)। हिस्टोग्राम नैनोबॉडी की उपस्थिति में सक्रिय परिस्थितियों के दौरान मापा चरम धाराओं दिखा रहा है और न कोई भी unbinding (वसूली) के बाद । पैनल सी कोई नहीं प्रति व्यक्तिगत चिप्स का उपयोग कर माप के परिणामों से पता चलता है । पैनल डी एक चिप का उपयोग कर एक धारावाहिक माप से परिणाम दिखाता है । नैनोबॉडी को एनबी के रूप में इंगित किया जाता है। त्रुटि सलाखों मानक विचलन (एन = 3 जैविक प्रतिकृति, n = 2 तकनीकी प्रतिकृति) का संकेत देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:एक निरोधात्मक na कोई नहीं केआईसी ५० का निर्धारण । (A)इलेक्ट्रोजेनिक कोलीन परिवहन और एक na कोई द्वारा निषेध । सक्रिय करने की स्थिति के दौरान मापा गया पीक धाराएं अलग-अलग ननकों की सांद्रता के लिए दिखाई जाती हैं। (ख)पीक धाराओं की साजिश आयाम बनाम एक निरोधात्मक na कोई नहीं के साथ एक धारावाहिक माप से एकाग्रता । आईसी50 निर्धारित 18 ± 2 एनएम था। त्रुटि सलाखों मानक विचलन (n = 3 जैविक प्रतिकृति, n = 3 तकनीकी प्रतिकृति) का संकेत मिलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां प्रस्तुत तकनीक इलेक्ट्रोजेनिक ट्रांसपोर्टरों को लक्षित करने वाले निरोधात्मक और गैर-निरोधात्मक गुणों के साथ नैनोबॉडी का वर्गीकरण करती है। प्रोटियोलिपोसोम की झिल्ली में एम्बेडेड ट्रांसपोर्टर के माध्यम से शुल्कों की आवाजाही का पता लगाने के कारण सब्सट्रेट परिवहन का आकलन संभव है। एक प्रयोग के सेटअप के दौरान महत्वपूर्ण चरणों में से कुछ लिपोसोम्स में सक्रिय प्रोटीन का पुनर्गठन, एसएसएम चिप्स पर स्थिर मोनोलेयर की तैयारी, और बंधे ना कोई भी अणुओं को हटाने के लिए वॉश प्रोटोकॉल के आवेदन के बाद प्रारंभिक शर्तों की वसूली कर रहे हैं । एक बार झिल्ली प्रोटीन एक उपयुक्त लिपिड-टू-प्रोटीन अनुपात में पुनर्गठित किया जाता है, एक सामान्य एसएसएम प्रोटोकॉल देशी सब्सट्रेट का उपयोग करके स्थापित किया जा सकता है। शोर धाराओं को प्रकट करने के लिए प्रोटीन-मुक्त लिपोसोम का उपयोग करके नियंत्रण प्रयोग करना महत्वपूर्ण है जिन्हें प्रोटेओलिपोम का उपयोग करके मापा जाने वाली धाराओं से घटाया जाना चाहिए। हालांकि, यदि शोर धाराएं बहुत बड़ी हैं, तो हम विभिन्न लिपिड का उपयोग करके प्रोटीन पुनर्गठन की कोशिश करने की सलाह देते हैं, या बफर स्थितियों के लिए स्क्रीन करते हैं जो इन हानिकारक संकेतों को कम करते हैं। एक एसएसएम परख के लिए सफलतापूर्वक स्थापित करने के बाद, नैनोबॉडी की स्क्रीनिंग की जा सकती है। एक बहुत ही उपयोगी विकल्प है कि नैनोबॉडी की तेजी से स्क्रीनिंग में मदद कर सकते है एक एसएसएम सेंसर चिप का उपयोग कर उच्च थ्रूपुट परख प्रदर्शन करने के लिए है । इससे चिप्स और बफर में हेरफेर का समय कम हो जाता है और लागत कम हो आती है। हालांकि, क्योंकि इस प्रकार के परख के दौरान कई नैनोबॉडी क्रमिक रूप से लागू होते हैं, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि माप के बाद लागू नफीस को धोया जा सकता है। एक कठोर वाशिंग चक्र को कुछ नैनोबॉडी को बिना चालन करने के लिए लागू करने की आवश्यकता हो सकती है, यदि कम पीक वर्तमान आयाम ना कोई नहीं के अभाव में पाए जाते हैं। हम शुरुआती बिंदु के रूप में, यहां वर्णित धोने की स्थिति का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यदि धोने की मात्रा में वृद्धि या चक्र की संख्या में मदद नहीं करता है, व्यक्तिगत चिप्स के लिए प्रत्येक na कोई अलग से स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यहां जांच किए गए सभी मामलों में, नैनोबॉडी की बाध्यकारी प्रतिवर्ती थी और एक उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता था। हमारे प्रायोगिक सेटअप में, हम नैनोबॉडी(चित्रा 1A)के साथ माप के बाद प्रारंभिक शिखर वर्तमान के पूर्ण आयाम को ठीक नहीं करसके। चित्रा 2C,D)। हालांकि, ज्यादातर मामलों में, बरामद की गई चोटी की धाराओं की भयावहता नैनोबॉडी(अंजीर 2C, D)लागू करने से पहले मापा गया आयाम के 80 और 95% के बीच था। हम अनुमान लगाते हैं कि यह चिप का पालन करने वाले प्रोटेओलिपोम के एक अंश को धोने का परिणाम हो सकता है, या कुछ निरोधात्मक नैनोबॉडी, या दोनों के संयोजन के अनबाइंडिंग की धीमी गति के कारण। या तो मामले में, यह अभी भी विद्युत परिवहन के रूप में आगे नैनोबॉडी परख जारी रखना संभव था औसत दर्जे का था । यह चित्रा 2Dमें दिखाया गया है, जहां हमने एक ही चिप तैयार करने का उपयोग करके छह नैनोबॉडी की जांच की।

उच्च-थ्रूपुट विशेषता प्रस्तुत विधि की सबसे महत्वपूर्ण प्रगति में से एक है। इसके अलावा, अन्य दृष्टिकोणों के विपरीत, यह विधि इलेक्ट्रोजेनिक ट्रांसपोर्टरों को लक्षित करने वाले निरोधात्मक नैनोबॉडी के चयन के लिए अनुमति देती है जिसके लिए लेबल किए गए सब्सट्रेट्स उपलब्ध नहीं हैं। निरोधात्मक नैनोबॉडी की तेजी से पहचान करने से नैनोबॉडी के नवीन अनुप्रयोगों को दवाओं के रूप में पहचानने के उद्देश्य से अनुसंधान में तेजी लाने में मदद मिल सकती है । एंटीबॉडी उपचार जैसे समान उपचारों की तुलना में उनके स्पष्ट लाभ कई हैं, जो एक छोटे आकार से शुरू होते हैं जो उन्हें ऊतकों या कोशिकाओं में आगे प्रचार करने में मदद करता है, उनके कम उत्पादन लागत और उच्च स्थिरता के लिए।

एसएसएम आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग अतीत में झिल्ली वेसिकल्स29,38में इलेक्ट्रोजेनिक ट्रांसपोर्टरों के लक्षण वर्णन के लिए किया जाता रहा है। इस प्रकार के प्रयोग लाभप्रद हैं क्योंकि वे प्रोटीन शुद्धि और पुनर्गठन प्रोटोकॉल पर निर्भर नहीं हैं। हम अनुमान लगाते हैं कि झिल्ली वेसिकल्स का उपयोग करके निरोधात्मक नैनोबॉडी का चयन करना संभव है। यह लागत को कम करने और शुद्ध प्रोटीन के जोड़तोड़ से बचने में मदद करेगा ।

एसएसएम-आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी इलेक्ट्रोजेनिक परिवहन का प्रदर्शन करने वाले कई झिल्ली प्रोटीन के ना कोई अवरोधक के लिए स्क्रीन करने के लिए एक मजबूत तकनीक है। हम कल्पना करते हैं कि एसएसएम-आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों के साथ निरोधात्मक नैनोबॉडी और अन्य एंटीबॉडी के चयन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन जाएगा।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम ज्यूरिख विश्वविद्यालय में इंस्टीट्यूट ऑफ मेडिकल माइक्रोबायोलॉजी से सिडरिक ए जे हुटर और मारकस ए सीगर और सिंथेटिक नैनोबॉडी (सियबॉडी) के उत्पादन में सहयोग के लिए बेसल विश्वविद्यालय के बायोज़ेंप्रम से गोंजालो सेबरेरो का शुक्रिया अदा करते हैं । हम तकनीकी सहायता के लिए नानियन टेक्नोलॉजीज से मारिया बार्थम्स और आंद्रे बाजजोन को धन्यवाद देते हैं । इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (एसएनएसएफ) (PP00P3_170607 और नानियन रिसर्च ग्रांट इनिशिएटिव टू सीपी) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octadecanethiol solution Sigma Aldrich O1858-25ML
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) BioRad #152-3920
PD 10 Desalting Columns GE Healthcare GE17-0851-01
Filter 200 nm membrane Whatman Nucleopore WHA800282
2-Propanol Merck 33539-1L-R
n-Decane Sigma Aldrich 8034051000
n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) Avanti Polar Lipids 850520P-25g
Sodium Chloride AppliChem 131659.1211
(SSM setup) SURFE2R N1 Nanion -----
SURFE2R N1 Single Sensor Chips Nanion # 161001
Trizma Base Sigma Aldrich T1503
E. coli Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids 100600C
Egg PC L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 171 झिल्ली ट्रांसपोर्टर झिल्ली प्रोटीन ठोस समर्थित-झिल्ली इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी नैनोबॉडी निरोधात्मक नैनोबॉडी नैनोबॉडी चयन
सॉलिड-सपोर्टेड-झिल्ली (एसएसएम) आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वारा ट्रांसपोर्टर-लक्षित अवरोधक नैनोबॉडी का चयन
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Bärland, N., Perez, C.… More

Bärland, N., Perez, C. Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (171), e62578, doi:10.3791/62578 (2021).

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