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Biochemistry

Seleção de nanomá corpos inibitórios direcionados ao transporte por eletrofisiologia baseada em membrana sólida (SSM)

Published: May 3, 2021 doi: 10.3791/62578
Automatic Translation
1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

Os nano corpos são importantes ferramentas na biologia estrutural e representam um grande potencial para o desenvolvimento de terapias. No entanto, a seleção de nano corpos com propriedades inibitórias pode ser desafiadora. Aqui demonstramos o uso de eletrofisiologia baseada em membrana sólida (SSM) para a classificação de nano corpos inibitórios e não inibitórios visando transportadores de membrana eletrogênica.

Abstract

Anticorpos de domínio único (nano corpos) têm sido amplamente utilizados em estudos mecanicistas e estruturais de proteínas e representam um enorme potencial como ferramentas para o desenvolvimento de terapias clínicas, muitas das quais dependem da inibição de proteínas de membrana, como transportadores. No entanto, a maioria dos métodos utilizados para determinar a inibição da atividade de transporte são difíceis de executar em rotinas de alto rendimento e dependem da disponibilidade de substratos rotulados, complicando assim a triagem de grandes bibliotecas de nanocorpos. A eletrofisiologia da membrana de suporte sólido (SSM) é um método de alta produtividade, usado para caracterizar transportadores eletrogênicos e medir sua cinética de transporte e inibição. Aqui mostramos a implementação da eletrofisiologia baseada em SSM para selecionar nano corpos inibitórios e não inibitórios visando um transporte secundário eletrogênico e calcular constantes inibitórias de nano corpos. Esta técnica pode ser especialmente útil para selecionar nano corpos inibitórios direcionados aos transportadores para os quais substratos rotulados não estão disponíveis.

Introduction

Os anticorpos são compostos de duas correntes pesadas idênticas e duas correntes leves que são responsáveis pela ligação de antígeno. Os camelados possuem anticorpos de cadeia pesada que exibem afinidade semelhante ao seu antígeno cognato em comparação com os anticorpos convencionais1,2. O domínio variável único (VHH) de anticorpos de cadeia pesada apenas retém o potencial total de ligação de antígeno e mostrou-se muito estável1,2. Essas moléculas isoladas de VHH ou "nano corpos" foram implementadas em estudos relacionados à bioquímica de proteínas de membrana como ferramentas para estabilizar as conformações3,4, como inibidores5,6, como agentes de estabilização7, e como dispositivos para determinação da estrutura8,9,10 . Os nanocorpos podem ser gerados pela imunização de camelds para o pré-enriquecimento de células B que codificam nanocorpos específicos do alvo e posterior isolamento de células B, seguidos pela clonagem da biblioteca de nanocorpos e seleção por exibição phage11,12,13. Uma forma alternativa de gerar nano corpos baseia-se em métodos de seleção in vitro que dependem da construção de bibliotecas e seleção por exibição de phage, display de ribossomo ou display de levedura14,15,16,17,18,19,20. Esses métodos in vitro exigem grandes tamanhos de biblioteca, mas se beneficiam de evitar a imunização animal e favorecem a seleção de nano corpos direcionados a proteínas com estabilidade relativamente baixa.

O pequeno tamanho dos nano corpos, sua alta estabilidade e solubilidade, forte afinidade de antígeno, baixa imunogenicidade e produção relativamente fácil, fazem deles fortes candidatos ao desenvolvimento da terapêutica21,22,23. Em particular, os nanocomas que inibem a atividade de múltiplas proteínas de membrana são ativos potenciais para aplicações clínicas5,24,25,26. No caso dos transportadores de membrana, para avaliar se um nanocorpo tem atividade inibitória, é necessário desenvolver um ensaio que permita a detecção de substratos transportados e/ou co-substratos. Tais ensaios geralmente envolvem moléculas rotuladas ou o desenho de métodos de detecção específicos de substrato, que podem não ter uma aplicação universal. Além disso, a identificação de nano corpos inibitórios geralmente requer a triagem de um grande número de aglutinantes. Assim, um método que pode ser usado em um modo de alta produtividade e que não conta com substratos rotulados é essencial para esta seleção.

A eletrofisiologia baseada em SSM é uma técnica extremamente sensível e altamente resolvida pelo tempo que permite a detecção de movimento de cargas através de membranas (por exemplo, ligação/transporte de íons)27,28. Esta técnica tem sido aplicada para caracterizar transportadores eletrogênicos, que são difíceis de estudar utilizando outras técnicas de eletrofisiologia devido à relativa baixa rotatividade dessas proteínas29,30,31,32,33,34,35. A eletrofisiologia SSM não requer o uso de substratos rotulados, é adequado para triagem de alto rendimento, e ou proteoliposomes ou vesículas de membrana que contenham o transportador de interesse podem ser usados. Aqui, demonstramos que a eletrofisiologia baseada em SSM pode ser usada para classificar os nanomutos direcionados ao transportador com propriedades inibitórias e não inibitórias. Como prova de princípio, descrevemos a reconstituição de um transportador de colina bacteriana em lipossomos, seguido de passos detalhados para a imobilização de proteoliposomes nos sensores SSM. Em seguida, descrevemos como realizar medições de eletrofisiologia baseadas em SSM no transporte de colina e como determinar a concentração efetiva semi-máxima (EC50). Em seguida, mostramos como usar a eletrofisiologia baseada em SSM para rastrear vários nanomá corpos e identificar inibidores do transporte de colina. Finalmente, descrevemos como determinar as concentrações inibitórias semi-máximas (IC50) de nano corpos inibitórios selecionados.

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Protocol

1. Reconstituição da proteína da membrana

  1. Misture 3 mL de lipídios polares E. coli com 1 mL de fosfatididylcholina em um frasco fundo redondo sob um capô ventilado.
  2. Seque a mistura lipídica por 20 minutos sob vácuo usando um evaporador rotativo e um banho de água a 37 °C para remover o clorofórmio. Se necessário, seque ainda mais sob nitrogênio ou gás argônio.
  3. Utilizando tampão TS (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) contendo 2 mM β-mercaptoethanol, lipídios resuspend a 25 mg/mL.
  4. Lipídios de aliquot em 500 alíquotas μL, congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenamento a -80 °C.
  5. Descongele uma alíquota de 500 μL de lipídios e dilua 1:1 usando tampão TS contendo 2 mM β-mercaptoethanol.
  6. Extrude a suspensão lipídica 15 vezes usando uma membrana de 400 nm.
  7. Diluir a suspensão lipídica para ter uma concentração lipídica final de 4,4 mg/mL.
  8. Adicione n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) para ter uma concentração final de 0,2% e deixe-o girando por 1h a 200 rpm em temperatura ambiente (RT).
  9. Adicione a proteína purificada aos lipídios usando uma relação lipídio-proteína entre 1:10 e 1:100 (w:w).
    NOTA: A razão precisa ser ajustada dependendo da força do sinal detectado nas medições de eletrofisiologia SSM do transporte de substrato (veja abaixo). Para obter sinais maiores, use menores relações lipídio-proteína.
  10. Incubar a mistura girando a 200 rpm por 1h no RT.
  11. Adicione 30 mg/mL de contas adsorbentes de poliestireno, pré-lavadas em tampão TS.
    NOTA: Adicione contas de poliestireno em sentido passo a passo.
  12. Incubar a mistura de lipídios por 30 minutos em RT sob agitação lenta.
  13. Para remover as contas, deixe a mistura de contas-lipídios para que as contas se acalmem. Transfira a solução para um novo tubo e deixe as contas para trás. Adicione 30 mg/mL de contas frescas de adsorbent de poliestireno à mistura lipídica separada.
  14. Incubar a mistura por 1h a 4 °C em agitação lenta.
  15. Separe as contas da mistura conforme descrito na etapa 1.13 e adicione 30 mg/mL de contas frescas de adsorde de poliestireno fresco.
  16. Incubar a mistura por 16 h a 4 °C.
  17. Separe as contas da mistura conforme descrito na etapa 13 e adicione 30 mg/mL de contas frescas de adsorente de poliestireno fresco.
  18. Incubar a mistura por 2h a 4 °C para uma quarta e última lavagem.
  19. Centrifugar a 110.000 x g por 30 min a 4 °C.
  20. Lave a pelota com 500 μL de tampão TS contendo 2 mM β-mercaptoetanol.
  21. Centrifugar novamente a 110.000 x g para 30 min a 4 °C.
  22. Resuspenque a pelota para uma concentração lipídica final de 25 mg/mL em tampão TS com 2 mM β-mercaptoetanol.
  23. Estime a concentração de proteínas usando um ensaio in-gel ou amido preto36.
  24. Alíquotar os proteoliposomes, congelar em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C.

2. Preparação do chip

  1. Encha um único chip de sensor com solução de 0,5 mM 1 octadecanethiol (resuspended em isopropanol).
  2. Incubar o chip com a solução por 30 min na RT.
  3. Remova a solução de tiol tocando o chip em um tecido.
  4. Enxágüe o sensor 3 vezes com 5 mL de isopropanol puro.
  5. Enxágüe o sensor 3 vezes com 5 mL de água dupla destilada.
  6. Seque o sensor tocando em um papel de tecido.
  7. Aplique 1,5 μL de 7,5 μg/μL 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholina (lipídios secos em um evaporador rotativo e resuspended em n-decana).
  8. Imediatamente depois, encha o sensor com 50 μL de buffer SSM não ativado, que não contém o substrato. Isso levará a uma formação espontânea da camada SSM.
    NOTA: O buffer SSM deve ser otimizado antecipadamente para determinar as condições ideais que têm baixo ruído de fundo. Um buffer geral contendo 30 mM HEPES pH 7.4, 5 mM MgCl2, 140 mM NaCl, pode ser usado como ponto de partida. O buffer SSM sem o substrato é usado para lavar antes e depois da medição (tampão não ativador). Para evitar a incompatibilidade do buffer, use o buffer não ativador para preparar o buffer contendo o substrato (ativando o buffer). O substrato pode ser adicionado diretamente como pó ou em um pequeno volume de um estoque de alta concentração para evitar diluições.
  9. Descongelar proteoliposomes da etapa 1.24 na RT.
  10. Proteolipósmas diluídos entre 1:5 e 1:100 (proteoliposomes:buffer, (v:v)) no buffer SSM não ativador (aqui 1:20).
  11. Sonicate proteoliposomes para 20-30 s ou 3 vezes para 10 s, colocando no gelo entre a sônica, se necessário. Aqui foi utilizado um sonicator de banho de água a 45 kHz.
  12. Aplique 5-10 μL da amostra de proteoliposomes sonicados diluídos na superfície do sensor sem tocá-lo.
  13. Centrifugar os chips com a solução em RT por 30 minutos usando uma velocidade entre 2.000 e 3.000 x g.
    NOTA: Use tubos de 50 mL com fundo plano. Coloque cuidadosamente os chips do sensor na vertical usando pinças. Também podem ser utilizadas placas de 6 poços e uma centrífuga com porta-placas.
  14. Use os chips do sensor no mesmo dia.

3. Medição do transporte soluto: determinação das condições de saturação

NOTA: Como prova de princípio, esses experimentos foram realizados utilizando-se um transportador de colina bacteriana reconstituído em lipossomos seguindo o protocolo descrito acima. O processo passo a passo de determinar condições saturadas da colina substrato antes da medição da inibição por nano corpos é mostrado aqui.

  1. Prepare 1-2 L do buffer SSM não ativado.
    NOTA: Prepare e use o mesmo estoque de buffer SSM para todos os buffers de ativação e não ativação em todas as medições.
  2. Pegue 10 tubos limpos e transfira 10 mL do buffer SSM não ativado para cada um.
  3. Adicione o substrato nos tubos a partir da etapa 3.2 usando uma série de concentrações em torno da meia concentração máxima esperada (aqui 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 mM de colina) para preparar os buffers SSM ativados. Use um estoque de alta concentração para evitar diluições.
  4. Ligue a máquina SSM.
  5. Inicie o software SSM e deixe a máquina inicializar automaticamente. Defina o caminho de salvamento para dados e confirme apertando o botão OK. Selecione o protocolo inicial de limpeza padrão nas opções de fluxo de trabalho e clique em Executar.
  6. Monte o chip revestido de proteoliposome na tomada, mova o braço para travar o chip e feche o chip montado com a tampa.
  7. Selecione o CapCom do programa no fluxo de trabalho e deixe-o executar para determinar a condutividade e a capacitância. Confirme que a condutividade está abaixo de 5 nS e que a capacitância está entre 15 e 35 nF antes de usá-la para a medição.
    NOTA: Um valor de capacitância de 15-35 nF e condução abaixo de 5 nS são recomendados pelo fabricante ao usar um chip de 3 mm.
  8. Transfira as soluções de ativação em frascos e posicione os buffers no sampler do teste.
  9. Transfira o buffer não ativador para um reservatório e posicione-o ao lado do suporte do chip na posição do reservatório à direita.
  10. Crie um protocolo para o fluxo de trabalho usando uma sequência de soluções não ativantes (B), ativação (A) e não ativação (B) e um loop que executa três medidas e se move para o próximo buffer de ativação para todos os 10 buffers preparados na etapa 3.3. Use a taxa de fluxo padrão em 200 μL/s usando 1 s - 1 s - 1 s para a sequência B-A-B. Clique em Reproduzir para iniciar a medição.
    NOTA: Um experimento típico consiste no fluxo sequencial de soluções não ativantes (B), ativação (A) e não ativação (B) (escritas como B-A-B; ver Figura 1A). Os proteoliposomes imobilizados no sensor serão lavados com as soluções. Portanto, a troca de soluções B-A gera um gradiente de concentração de substrato, que impulsiona a reação de transporte eletrogênico.
  11. Salve o protocolo e deixe o fluxo de trabalho ser executado clicando no botão Reproduzir. Realize o mesmo tipo de experimento, mas usando lipossomos livres de proteínas. Isso é altamente importante, pois mostraria a intensidade das correntes de fundo. Isso deve ser considerado ao analisar dados de transporte eletrogênico medidos com proteoliposomes(Figura 1C).
  12. Use qualquer software preferencial para análise de dados para traçar a corrente medida versus o tempo. Leia o pico de corrente manualmente, ou se estiver usando o software, use a função para estimativa de altura máxima na faixa de adição do buffer de ativação.
  13. Plote a corrente máxima contra a concentração do substrato para determinar a EC50 do substrato através da regressão não linear(Figura 1B,C). Leia a menor concentração em que a corrente máxima atinge um valor máximo, essa concentração corresponde a condições de saturação.
    NOTA: É importante considerar que o número de proteolipósos que permanecem imobilizados varia de chip para chip. Essa variação é evidente, pois as correntes de pico em condições de medição idênticas mostrarão diferentes amplitudes. Portanto, é necessário normalizar as amplitudes atuais das medições realizadas em cada chip separadamente antes de comparar as medições entre diferentes preparações de chips.

4. Classificação serial de nanomutos inibitórios e não inibitórios

NOTA: Esta seção mostra como medir o transporte de colina na presença de nano corpos que se ligam especificamente ao transportador de colina bacteriana. Correntes de pico menores na presença de nano corpos indicam inibição do transporte. Os nanomácos não inibitórios não afetarão o transporte de substratos, ou seja, nenhuma diminuição do sinal de corrente de pico.

  1. Prepare 1-2 L de buffer SSM não ativado.
  2. Transfira 50 mL do buffer SSM não ativador para um tubo limpo. Adicione a colina do substrato a uma concentração final de 5 mM (condições saturais). Use isso para uma medição de controle positiva.
  3. Transfira 10 mL do buffer SSM não ativador para um tubo limpo. Adicione a colina do substrato a uma concentração final de 5 mM (condições saturais) e adicione nanocorpo a uma concentração final de 500 nM.
  4. Repita o passo 4.3 para cada nanocorpo preparar as soluções de ativação.
    NOTA: Se os nanomá corpos purificados forem resuspendidos em um buffer diferente do buffer SSM, sua adição aos buffers de ativação e não ativação levará a uma incompatibilidade tampão. Uma incompatibilidade de buffer deve ser evitada, pois pode levar a ruídos altos. Trocar o buffer dos nanomá corpos purificados com o buffer SSM pode ajudar a evitar esse problema. Além disso, recomenda-se o uso de concentrações de nanocorpo que permitam atingir condições saturadas. Considerando que as constantes de ligação de nanocorpos geralmente estão abaixo de 100 nM, uma concentração de nanocorpo de 500 nM é recomendada para este experimento. No entanto, é importante pré-tela para concentrações ideais.
  5. Inicie a máquina SSM e meça a capacitância e condutividade do chip revestido proteoliposome, conforme descrito nas etapas 3.4-3.7.
  6. Transfira a solução de ativação sem um nanocorpo em um frasco e coloque o buffer no sampler da sonda. Transfira o buffer não ativador sem um nanocorpo para um reservatório e posicione-o no sampler da sonda.
  7. Transfira as soluções de ativação contendo nano corpos em frascos e posicione os buffers no sampler da sonda. Transfira os buffers não ativadores contendo nano corpos em frascos e posicione os buffers no sampler da sonda.
  8. Crie um protocolo para o fluxo de trabalho usando uma sequência de soluções não ativantes (B), ativação (A) e não ativação (B).
  9. Crie um loop que executa o seguinte: três medidas da sequência B-A-B usando buffers sem nanocorpo, duas medidas da sequência B-A-B com buffers contendo um nanocorpo, 120 s tempo de atraso para incubação com o nanocorpo, depois 3 medidas da sequência B-A-B com buffers contendo o nanocorpo.
  10. Salve o fluxo de trabalho e deixe-o executado clicando no botão Reproduzir.
    NOTA: Este fluxo de trabalho medirá as condições iniciais do transporte sem inibição executando o protocolo B-A-B 3 vezes usando buffers não ativadores (B) e ativando buffers (A) sem o nanocorpo (Figura 1B,C),seguido pela medição do efeito nanocorpo no transporte, executando o protocolo B-A-B 5 vezes com os buffers não ativadores e ativadores contendo nanocorpos (Figura 2A ). A cinética de ligação de segunda ordem dita a interação de nano corpos e suas proteínas alvo. Portanto, é importante usar um atraso de tempo na etapa B-A, a fim de dar tempo suficiente para nano corpos se ligarem aos transportadores em proteoliposomes no chip. Os tempos ideais dependem da concentração de nanocorpos, ou seja, em concentrações mais baixas são necessárias. As duas primeiras medidas são necessárias para adaptar o sistema às novas condições e a segunda execução deve ser realizada após um tempo de atraso de 120 s. Apenas as três medidas a seguir devem ser utilizadas para análise de dados.
  11. Crie um novo protocolo para o fluxo de trabalho usando uma sequência de soluções não ativantes (B), ativação (A) e não ativação (B) e um loop de 5 medidas para lavar o nanocorpo reversivelmente ligado.
    NOTA: Opcionalmente, inclua uma etapa de incubação para permitir a dissociação de nano corpos com cinética lenta.
  12. Salve o fluxo de trabalho e deixe-o executado clicando no botão Reproduzir.
  13. Compare a última corrente de pico das medições com a medição inicial somente do substrato na etapa 4.10. O nanocorpo foi lavado com sucesso e as condições iniciais foram restabelecidas se a corrente de pico atingir o valor inicial, caso contrário, repita as etapas 4.12-4.13 ou mude para um novo chip.
  14. Repita as etapas 4.6-4.13 e use chips individuais para cada tela de nanocorpo(Figura 2C) ou repita com vários nanocorpos usando o mesmo chip(Figura 2D).
  15. Use qualquer software preferencial para análise de dados para traçar a corrente medida versus o tempo. Leia o pico de corrente manualmente ou, se disponível, no software usado, selecione automaticamente a função para estimativa de altura máxima na faixa de adição do buffer de ativação.
  16. Normalize a corrente máxima na presença do nanocorpo, com base na medição anterior do substrato. Plote as correntes máximas em um histograma e compare as correntes máximas do substrato apenas medições com as correntes de pico medidas na presença de nano corpos (Figura 2C,D) para identificar nano corpos inibitórios.
    NOTA: A normalização das correntes de pico determinadas de cada indivíduo executa com um nanocorpo deve ser realizada considerando o pico de corrente na ausência do nanocorpo da medição anterior. Além disso, uma vez que o número de proteoliposomes que permanecem imobilizados varia de chip para chip, é importante normalizar as amplitudes atuais das medições realizadas em cada chip separadamente antes de comparar as medidas entre diferentes preparações de chip.

5. Medição ic50 com nano corpos inibitórios

NOTA: Após a identificação de nano corpos inibitórios, é possível determinar sua concentração inibitória meia maximal (IC50). Isso é feito medindo o transporte de colina em constante concentração, enquanto concentrações variadas do nanocorpo inibidor.

  1. Prepare 1-2 L do buffer SSM não ativado.
  2. Transfira 50 mL do buffer SSM não ativador para um tubo limpo. Adicione a colina do substrato a uma concentração final de 5 mM (condições saturais). Use isso como solução de ativação para controle positivo.
  3. Pegue 8 tubos limpos e adicione 5 mL da solução não ativante em cada um. Adicione a colina do substrato a uma concentração final de 5 mM (condições saturais). Adicione o nanocorpo inibidor aos tubos em concentrações na faixa prevista ic50 (aqui 500 nM - 1 nM).
  4. Pegue 8 tubos limpos e adicione 10 mL da solução não ativante em cada um. Adicione nanocorpo inibitório a cada tubo individualmente na mesma concentração da etapa 5.3. Isso corresponde ao buffer não ativador.
    NOTA: Isso gerará uma série de pares tampão ativados e não ativadores em diferentes concentrações do mesmo nanocorpo inibidor.
  5. Inicie a configuração SSM e meça a capacitância e condutividade do chip revestido proteoliposome conforme descrito nas etapas 3.4-3.7.
  6. Transfira a solução de ativação sem nanocorpo para um frasco e coloque-a no sampler da sonda. Transfira o tampão não ativado sem nanocorpo para um reservatório e posicione-o na posição do reservatório ao lado do suporte do chip à direita.
  7. Transfira as soluções de ativação contendo nano corpos em frascos e posicione os buffers no sampler da sonda. Transfira os buffers não ativadores contendo nano corpos em frascos e posicione os buffers no sampler da sonda.
  8. Crie um protocolo para o fluxo de trabalho usando uma sequência de soluções não ativantes (B), ativação (A) e não ativação (B). Inclua um loop para medir cada concentração 2 vezes, incubar por 120 s e medir mais 3 vezes. O fluxo de trabalho começará com o controle positivo do substrato somente seguido pela menor concentração do nanocorpo. Cada medição de nanocorpo será seguida por uma medição subsequente do controle positivo com substrato apenas para restaurar a amplitude inicial de pico, antes de passar para a próxima maior concentração de nanocorpos.
    NOTA: A cinética de segunda ordem dita a ligação de nano corpos. Portanto, é importante usar um atraso de tempo na etapa B-A. Os tempos ideais dependem da concentração de nanocorpo, ou seja, em concentrações mais baixas são necessárias maiores tempos; aqui 120 s foi utilizado com resultados satisfatórios.
  9. Use qualquer software preferencial para análise de dados para traçar a corrente medida versus o tempo. Leia o pico de corrente manualmente, ou se estiver usando software, selecione a função para a estimativa de altura máxima na faixa de adição do buffer de ativação(Figura 3A). Plote as correntes de pico contra a concentração de nanocorpo para determinar o IC50 via regressão não linear(Figura 3B).
    NOTA: Normalizar as amplitudes atuais das medições realizadas para cada chip individual antes de comparar as medições entre diferentes preparações de chip.

6. Limpeza de sensores

  1. Enxágüe os chips de sensor único após o uso com 10 mL de água destilada.
  2. Seque o chip tocando-o em um papel de tecido.
  3. Encha a cavidade do sensor do chip com 100 μL de isopropanol puro e incubar por 10 min no RT.
  4. Coloque um cotonete em isopropanol puro e incubar por 1-3 min.
  5. Use os cotonetes de algodão presos e gire suavemente na superfície do sensor sem pressão para remover resíduos.
  6. Enxágüe o sensor com 5 mL de isopropanol puro.
  7. Enxágüe o sensor com 10 mL de água destilada.
  8. Seque o sensor tocando o chip em um tecido.
  9. Deixe o sensor secar durante a noite no RT, e armazene no RT em condições secas.
    NOTA: Os sensores podem ser reutilizados até 4-5 vezes quando limpos e armazenados corretamente.

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Representative Results

A eletrofisiologia baseada em SSM tem sido amplamente utilizada para a caracterização de transportadores eletrogênicos. No protocolo aqui apresentado, mostramos como usar a eletrofisiologia baseada em SSM para classificar os nanomá corpos direcionados a um transportador secundário (aqui um simportador de colina bacteriana) com base em suas propriedades inibitórias e não inibitórias. Uma das características mais úteis desta técnica é que ela permite a triagem de alto rendimento de múltiplas condições de buffer. Esta característica particular é benéfica para a análise de bibliotecas de nanocorpos, que após a seleção de aglutinantes podem ser constituídas de algumas a dezenas de nanocorpos. Em um experimento padrão, uma monocamada lipídica estável é montada em um chip de sensor. Após a aplicação da preparação de proteoliposomes contendo o transportador de colina, é realizada uma verificação de boa condutividade e capacitância, pois isso é essencial para o sucesso do experimento. Caso a integridade da membrana seja comprometida durante um experimento, o que é facilmente observado devido às altas correntes de fundo de ruído, a mudança para um novo chip é recomendada, pois a recuperação de condições de baixo ruído é bastante difícil. Em geral, temos observado uma reprodutibilidade muito boa entre as medidas de transporte e inibição por nano corpos ao usar diferentes chips.

Para decidir sobre a concentração de substrato a ser utilizada durante uma triagem de nano corpos, o transporte eletrogênico foi medido pela primeira vez sob diferentes concentrações de substrato para determinar a EC50 (Figura 1B,C). Foi selecionada uma concentração de substrato que corresponde às condições saturais(Figura 1C). Esta concentração de substrato foi então mantida constante em todos os buffers de ativação. Para este exemplo em particular, selecionamos colina de 5 mM.

Para a triagem de nanocorpos, o nanocorpo deve ser adicionado tanto aos buffers não ativados quanto à ativação. Quando os nano corpos foram adicionados apenas ao tampão ativador, não foi possível observar a inibição do transporte eletrogênico. Especulamos que isso se deve a uma ocupação incompleta de todos os locais de ligação de nanocorpos na população de transporte no chip, revelando assim a importância da pré-incubação com nanocorpos em condições não ativantes. Para garantir que todos os locais sejam provavelmente ocupados, uma etapa de atraso de tempo foi incluída durante a aplicação da primeira etapa tampão não ativada para permitir a saturação de locais de ligação de nanocorpos na população do transportador. Tempos de incubação que variam de 2 a 60 min foram testados com resultados reprodutíveis. Tenha em mente que os melhores tempos de incubação dependem da natureza do aglutinante de nanocorpo e sua concentração durante o experimento (bem como a concentração de transportador em proteoliposomes no chip). Portanto, recomenda-se experimentar diferentes tempos de incubação. De qualquer forma, como regra geral, quanto menor a concentração de nanocorpo, maior o tempo de incubação necessário. Testamos tempos de incubação de 2 min, 20 min, 30 min e 60 min para diferentes nano corpos, mas não detectamos mais inibição de transporte.

O efeito dos nano corpos inibitórios no transporte eletrogênico é visualizado a partir da diminuição das amplitudes das correntes de pico(Figura 2A,C,D). Os nanomá corpos não inibitórios, por outro lado, não afetam as correntes de pico. Após a execução do protocolo de lavagem para permitir a desvinculação de nano corpos, observou-se uma recuperação de 80 a 95% da amplitude inicial de corrente de pico(Figura 2A,C,D). Realizamos um experimento semelhante, mas na presença de lipossomos sem a proteína do transportador. Ao mudar de não ativação para condições de ativação, nenhuma corrente significativa de artefato foi introduzida por nano corpos presentes nestes buffers(Figura 2B). A execução deste experimento de controle é recomendada, pois é importante saber se as mudanças nas correntes de pico surgem ou não de artefatos.

Após a seleção de nano corpos com propriedades inibitórias, determinamos os valores ic50 para nanocas individuais(Figura 3A, B). Para este experimento em particular, recomenda-se começar com uma baixa concentração de nano corpos e, em seguida, mover-se para alta concentração durante o ensaio. O cálculo da inibição para cada concentração foi então realizado comparando correntes de pico medidas antes e depois da aplicação do nanocorpo. Para evitar a ligação inespecífica de nanocorpos às superfícies, o que pode ser particularmente problemático ao usar baixas concentrações de nanocorpos, é aconselhável seguir um protocolo semelhante ao descrito por Kermani et al.37, onde 50 μg/mL de albumina de soro bovino foram adicionados aos buffers, impedindo este efeito deletério. A adição de detergentes como Tween ou Triton para este fim deve ser evitada, pois estas dissolveriam membranas lipídicas.

Figure 1
Figura 1: Eletrofisiologia baseada em SSM. (A) Protocolo para medição de correntes transitórias. Uma solução não ativante é substituída por uma solução de ativação seguida pelo fluxo de solução não ativante para restaurar as condições iniciais. Durante o primeiro passo, nanomutos se ligam ao transportador. Ao mudar para a solução de ativação, o gradiente do substrato impulsiona o transporte eletrogênico (curva laranja). Na presença de um nanocorpo inibidor, a corrente de pico mostra uma amplitude menor (curva azul). Após o término do protocolo e as soluções de execução sem nanocorpo (lavagem), ocorre a desvinculação de nanocorpos. No esquema, os proteolipóssos com proteína reconstituída (azul) são imobilizados no sensor SSM. Triângulos e círculos vermelhos representam nano corpos e substrato, respectivamente. (B) Transporte de colina eletrogênica na ausência de nano corpos. As correntes de pico medidas durante as condições de ativação são mostradas para diferentes concentrações de substratos. (C) Medição representativa das correntes durante as condições de ativação na ausência de proteína transportadora em diferentes concentrações de substrato. (D) Parcela da concentração de substrato versus amplitude de correntes de pico. A EC50 determinada foi de 95 ± colina de 11 μM. As barras de erro indicam desvio padrão (n=3 réplicas biológicas, n=3 réplicas técnicas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Triagem e classificação de nanocorpos inibitórios e não inibitórios. (A) Transporte de colina eletrogênica na presença de um nanocorpo. As correntes máximas medidas durante as condições de ativação são mostradas na ausência de nanocorpo (azul), na presença de um nanocorpo inibidor (vermelho) e após a desvinculação de nanocorpo (verde). (B) Medição das correntes durante as condições de ativação na ausência de proteína de transporte. Traços mostram gravações na ausência de nanocorpo (azul), na presença de um nanocorpo inibidor (verde), e na presença de um nanocorpo não inibitório (vermelho). (C,D). Histogramas mostrando correntes máximas medidas durante as condições de ativação na presença de nanocorpos e após desvinculação de nanocorpos (recuperação). O painel C mostra os resultados das medições usando chips individuais por nanocorpo. O painel D mostra os resultados de uma medição serial usando um chip. Os nano corpos são indicados como Nb. As barras de erro indicam o desvio padrão (n=3 réplicas biológicas, n=2 réplicas técnicas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Determinação de IC50 de um nanocorpo inibidor. (A) Transporte de colina eletrogênica e inibição por um nanocorpo. As correntes de pico medidas durante as condições de ativação são mostradas para diferentes concentrações de nanocorpos. (B) Parcela de correntes de pico amplitude vs concentração de nanocorpo de uma medição serial com um nanocorpo inibidor. O IC50 determinado foi de 18 ± 2 nM. As barras de erro indicam o desvio padrão (n=3 réplicas biológicas, n=3 réplicas técnicas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A técnica aqui apresentada classifica os nano corpos com propriedades inibitórias e não inibitórias voltadas aos transportadores eletrogênicos. A avaliação do transporte de substratos é possível devido à detecção do movimento de cargas através do transportador embutido na membrana de proteoliposomes. Algumas das etapas críticas durante a configuração de um experimento são a reconstituição de proteína ativa em lipossomos, a preparação de monocamadas estáveis em chips SSM e a recuperação das condições iniciais após a aplicação do protocolo de lavagem para remover moléculas de nanocorpogramas ligadas. Uma vez que a proteína da membrana é reconstituída em uma proporção lipídica-proteína apropriada, um protocolo geral de SSM pode ser estabelecido usando o substrato nativo. É crucial realizar experimentos de controle usando lipossomos livres de proteínas para revelar correntes de ruído que precisariam ser subtraídas das correntes medidas usando proteoliposomes. No entanto, se as correntes de ruído forem muito grandes, recomendamos tentar a reconstituição de proteínas usando lipídios diferentes, ou tela para condições tampão que minimizem esses sinais deletérios. Depois de estabelecer com sucesso condições para um ensaio SSM, a triagem de nano corpos pode ser realizada. Uma opção muito útil que pode ajudar na triagem mais rápida de nano corpos é realizar ensaios de alto rendimento usando um único chip de sensor SSM. Isso reduz o tempo de manipulação de chips e buffers e reduz os custos. No entanto, como durante este tipo de ensaio vários nanocorpos são aplicados sequencialmente, é importante garantir que o nanocorpo aplicado possa ser lavado após a medição. Um rigoroso ciclo de lavagem pode precisar ser implementado para desvincular alguns nanocorpos no caso de que amplitudes de corrente de pico reduzidas sejam detectadas na ausência de nanocorpo. Recomendamos usar, como ponto de partida, as condições de lavagem descritas aqui. Se aumentar o volume de lavagem ou o número de ciclos não ajudar, chips individuais precisariam ser usados para rastrear cada nanocorpo separadamente. Em todos os casos aqui examinados, a ligação de nano corpos era reversível e um protocolo de alto rendimento poderia ser aplicado. Em nossa configuração experimental, não conseguimos recuperar toda a amplitude da corrente inicial após medições com nano corpos (Figura 1A; Figura 2C,D). No entanto, na maioria dos casos, a magnitude das correntes máximas recuperadas variou entre 80 e 95% da amplitude medida antes da aplicação de nano corpos(Fig. 2C,D). Especulamos que isso pode ser uma consequência de lavar uma fração dos proteolipóssos aderidos ao chip, ou devido à cinética lenta de desvincular alguns nano corpos inibitórios, ou uma combinação de ambos. Em ambos os casos, ainda era possível continuar a avaliar outros nanomás e os nanomás e os transportes eletrogênicos eram mensuráveis. Isso é mostrado na Figura 2D,onde examinamos seis nanomá corpos usando uma única preparação de chip.

A característica de alto rendimento é um dos avanços mais significativos do método apresentado. Além disso, em contraste com outras abordagens, este método permite a seleção de nano corpos inibitórios direcionados aos transportadores eletrogênicos para os quais não estão disponíveis substratos rotulados. Uma identificação rápida de nano corpos inibitórios pode ajudar a acelerar a pesquisa com o objetivo de identificar novas aplicações de nano corpos como drogas. Suas vantagens aparentes em comparação com terapias similares, como tratamentos de anticorpos, são numerosas, começando com um tamanho menor que os ajuda a se propagar ainda mais em tecidos ou células, para seus baixos custos de produção e alta estabilidade.

A eletrofisiologia baseada em SSM foi usada no passado para a caracterização de transportadores eletrogênicos em vesículas de membrana29,38. Esses tipos de experimentos são vantajosos, pois não dependem dos protocolos de purificação e reconstituição de proteínas. Especulamos que a realização da seleção de nano corpos inibitórios usando vesículas de membrana é viável. Isso ajudaria a reduzir custos e evitar manipulações de proteínas purificadas.

A eletrofisiologia baseada em SSM é uma técnica forte para testar inibidores de nanocorpos de múltiplas proteínas de membrana que exibem transporte eletrogênico. Prevemos que a eletrofisiologia baseada em SSM se tornará uma ferramenta importante para a seleção de nano corpos inibitórios e outros anticorpos com aplicações clínicas potenciais.

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Disclosures

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos a Cedric A. J. Hutter e Markus A. Seeger do Instituto de Microbiologia Médica da Universidade de Zurique, e Gonzalo Cebrero, da Biozentrum, da Universidade de Basileia, pela colaboração na geração de nanomá corpos sintéticos (sybodies). Agradecemos a Maria Barthmes e Andre Bazzone da NANION Technologies pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça (SNSF) (PP00P3_170607 e naNION Research Grant Initiative to C.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octadecanethiol solution Sigma Aldrich O1858-25ML
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorbent (Polystyrene adsorbent beads) BioRad #152-3920
PD 10 Desalting Columns GE Healthcare GE17-0851-01
Filter 200 nm membrane Whatman Nucleopore WHA800282
2-Propanol Merck 33539-1L-R
n-Decane Sigma Aldrich 8034051000
n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) Avanti Polar Lipids 850520P-25g
Sodium Chloride AppliChem 131659.1211
(SSM setup) SURFE2R N1 Nanion -----
SURFE2R N1 Single Sensor Chips Nanion # 161001
Trizma Base Sigma Aldrich T1503
E. coli Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids 100600C
Egg PC L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C

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References

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Seleção de nanomá corpos inibitórios direcionados ao transporte por eletrofisiologia baseada em membrana sólida (SSM)
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Bärland, N., Perez, C. Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (171), e62578, doi:10.3791/62578 (2021).

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