Summary
Præsenteret her er sgRNA / CAS9 endonuklease og næste generations sekventeringsprotokol, der kan bruges til at identificere mutationerne forbundet med dobbeltstrengbrudsreparation nær CD4-promotoren.
Abstract
Dobbeltstrengsbrud (DSB'er) i DNA er den mest cytotoksiske type DNA-skade. Fordi et utal af fornærmelser kan resultere i disse læsioner (f.eks. Replikationsstress, ioniserende stråling, urepareret UV-skade), forekommer DSB'er i de fleste celler hver dag. Ud over celledød reducerer ureparerede DSB'er genomintegriteten, og de resulterende mutationer kan drive tumorgenese. Disse risici og forekomsten af DSB'er motiverer undersøgelser af de mekanismer, hvormed celler reparerer disse læsioner. Næste generations sekventering kan parres med induktion af DSB'er ved ioniserende stråling for at give et kraftfuldt værktøj til præcist at definere de mutationer, der er forbundet med DSB-reparationsfejl. Denne tilgang kræver imidlertid beregningsmæssigt udfordrende og omkostningsmæssigt uoverkommelig helgenomsekventering for at detektere reparationen af de tilfældigt forekommende DSB'er forbundet med ioniserende stråling. Sjældne skæreendonukleaser, såsom I-Sce1, giver mulighed for at generere en enkelt DSB, men deres genkendelsessteder skal indsættes i det genom, der er af interesse. Som følge heraf er reparationsstedet i sagens natur kunstigt. Nylige fremskridt gør det muligt for guide RNA (sgRNA) at lede en Cas9-endonuklease til ethvert genom-locus af interesse. Dette kan anvendes i studiet af DSB-reparation, der gør næste generations sekventering mere omkostningseffektiv ved at lade den fokusere på DNA'et, der flankerer den Cas9-inducerede DSB. Målet med manuskriptet er at demonstrere gennemførligheden af denne tilgang ved at præsentere en protokol, der kan definere mutationer, der stammer fra reparation af en DSB opstrøms for CD4-genet. Protokollen kan tilpasses for at bestemme ændringer i DSB's mutagene potentiale forbundet med eksogene faktorer, såsom reparationshæmmere, viral proteinekspression, mutationer og miljøeksponeringer med relativt begrænsede beregningskrav. Når en organismes genom er blevet sekventeret, kan denne metode teoretisk anvendes på ethvert genomisk locus og i enhver cellekulturmodel af den organisme, der kan transfekteres. Lignende tilpasninger af tilgangen kan gøre det muligt at sammenligne reparationstroskab mellem forskellige loci i samme genetiske baggrund.
Introduction
Opretholdelse af genomisk stabilitet er afgørende for alle levende organismer. Nøjagtig DNA-replikation og et robust DNA-skaderespons (DDR) er nødvendige for trofast at udbrede det genetiske materiale 1,2. DNA-skader forekommer regelmæssigt i de fleste celler 2,3. Når disse skader mærkes, standses cellecyklusprogressionen, og DNA-reparationsmekanismer aktiveres. Dobbeltstrengsbrud i DNA eller DSB'er er den mest giftige og mutagene type DNA-skade 3,4.
Mens flere DDR-signalveje kan reparere disse læsioner, er de mest grundigt undersøgte DSB-reparationsveje homolog rekombination (HR) og ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ). HR er en stort set fejlfri vej, der reparerer en DSB ved hjælp af et søsterkromatid som en homolog skabelon. Dette har tendens til at ske i S-fasen og G2-fasen af en cellecyklus 5,6,7. NHEJ er mere fejlbehæftet, men det kan ske i hele cellecyklussen 8,9. Forskellige reporteranalyser er blevet udviklet til at måle effektiviteten af specifikke reparationsmekanismer 10,11,12. Disse assays har tendens til at stole på flowcytometri til en høj gennemstrømningsmåling af DSB-reparationsvejsaktivitet ved hjælp af GFP eller mCherry som en udlæsning11,13. Selvom de er meget effektive, er de afhængige af kanonisk reparation, der finder sted på et kunstigt introduceret DSB.
Der er en række andre metoder, der anvendes til at studere DSB-reparation. Mange af disse er afhængige af immunofluorescens (IF) mikroskopi 1,14. IF mikroskopi detekterer diskrete nukleare fokusområder, der er repræsentative for reparationskomplekser, efter at DSB'er er induceret ved eksponering for genotoksiske kemikalier eller ioniserende stråling15,16. Sporing af dannelsen og opløsningen af disse foci giver en indikation af reparationsinitiering og færdiggørelse, henholdsvis14,17. Disse metoder til DSB-induktion (dvs. kemikalier eller ioniserende stråling) forårsager imidlertid ikke DSB'er på definerede steder i genomet. Det er også funktionelt umuligt at bruge dem til konsekvent kun at fremkalde et lille antal (f.eks. 2-4) DSB'er. Som følge heraf forårsager de mest almindeligt anvendte metoder til at inducere DSB'er en lang række læsioner tilfældigt fordelt over hele genomet18. Et lille antal DSB'er kan introduceres ved at indsætte genkendelsesstedet for en sjælden skærende endonuklease og udtrykke den relevante endonuklease, såsom I-Sce119. Desværre forhindrer den nødvendige integration af et målsted undersøgelsen af DSB på endogene genomiske loci.
Dette manuskript beskriver en metode til at påvise mutationer i forbindelse med reparation af en DSB genereret på et brugerdefineret locus. Vi giver et repræsentativt eksempel på den tilgang, der anvendes til at vurdere et viralt proteins evne til at øge antallet af mutationer forbundet med en DSB. Specifikt beskriver dette manuskript brugen af et enkelt guide-RNA (sgRNA) til at lede en CAS9-endonuklease til at inducere en DSB ved human CD4 åben læseramme i humane forhudskekeratinocytter, der udtrykker vektorkontrol (HFK LXSN) og HFK, der udtrykker E6-proteinet af humant papillomavirus type 8 (HFK 8E6). Målrettet næste generations sekventering (NGS) af regionen omkring pausen gør det muligt at definere mutationer forbundet med reparation af læsionen strengt. Disse data viser, at virusproteinet forårsager en ca. 20 gange stigning i mutationer under DSB-reparation. Det giver også en upartisk karakterisering af de mutagene konsekvenser af DSB'er på et enkelt sted uden behov for helgenomsekventering. I princippet kunne protokollen let tilpasses til at sammenligne den relative risiko for mutationer mellem genomlodi eller cellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellebelægning
- Dyrk HFK LXSN- og HFK 8E6-celler i 10 cm plader i keratinocytkulturmedier (10 ml / plade) med humant keratinocytvæksttilskud (HKGS) og 1% penicillin / streptomycin. Dyrk celler til ca. 80% sammenløb ved 37 °C i en jakkeinkubator med 5% CO2.
- Udskift kulturmedier med 3 ml trypsin-EDTA (0,05%, ethylendiamintetraeddikesyre). Inkuber ved 37 °C i 3 min. Neutraliser trypsin med lige stor mængde føtalt kvægserum (FBS) suppleret med medier og overfør celler til et 15 ml centrifugerør. Centrifuge ved 300 x g i 5 min.
- Resuspend celler med 10 ml keratinocytkulturmedier med HKGS. Bestem koncentrationen af celler med et hæmocytometer.
- Plade 4 x 105 celler/6 cm plader (frø to plader til HFK LXSN og to plader til HFK 8E6) i 4 ml keratinocytkulturmedier med HKGS og 1% penicillin og streptomycin. Dyrk ved 37 °C i en jakkeinkubator med 5 % CO2.
BEMÆRK: Analyse af HFK-celler blev valgt til denne protokol af to grunde. For det første er HFK en vanskelig at transfektere cellelinje. Ved at påvise, at protokollen fungerer i denne cellelinje, er der således bevis for, at den sandsynligvis vil fungere i mere almindeligt anvendte og lettere transfekterede celler. For det andet viser tidligere offentliggjorte data, at et viralt protein (8E6) forhindrer reparation af dobbeltstrengsbrud i DNA 20,21,22. Sammenligning af HFK LXSN og HFK 8E6 giver os således mulighed for at demonstrere assayets evne til at detektere stigninger i mutationer forbundet med en reduktion i cellulær reparationskapacitet.
2. Transfektion
- På transfektionsdagen (24 timer efter plettering) skal du udskifte medier med 3 ml antibiotikafrit suppleret medie. Inkuber i 2 timer ved 37 °C i en jakkeinkubator.
- Transfektceller med passende lipidbaserede transfektionsreagenser i henhold til producentens anvisninger.
- Varm transfektionsreagenser til stuetemperatur og pipette forsigtigt inden brug.
- For hver cellelinje (HFK LXSN og HFK 8E6) anbringes en passende mængde transfektionsbuffer (som anvist af producenten) i et sterilt 1,5 ml centrifugerør (rør 1). Inkluder et andet rør med samme mængde transfektionsbuffer (mock transfektion eller rør 2).
- Tilsæt 2 μg plasmid-DNA, der udtrykker CAS9/sgRNA rettet mod human CD4 (px330-CD4, 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT) til rør 1 fra trin 2.2.2. Pipette forsigtigt for at blande helt. Tilsæt lige så meget sterilt vand til rør 2.
- Inkluder en kontrolplade med transfektionsreagenser alene (intet plasmid) for hver cellelinje.
BEMÆRK: Den anden plade tjener som en negativ kontrol i eksperimentet, så brugeren kan bekræfte, at transfektion med CAS9 / sgRNA ikke er ansvarlig for nogen mutationer. - Der tilsættes en passende mængde transfektionsreagens (som anvist af fabrikanten) til røret med DNA-blanding (rør 1) fra trin 2.2.3 og mock-transfektionen (rør 2) fra trin 2.2.2. Pipette forsigtigt for at blande helt. Inkuber ved stuetemperatur i 15-30 minutter for at give tilstrækkelig tid til, at komplekser dannes.
- Tilsæt transfektionsblandingen dråbevis til pladen. Rock forsigtigt kulturen i 1 minut for jævnt at fordele transfektionsblandingen.
- Inkuber i 48 timer efter transfektionen for at tillade CAS9-ekspression.
- Høstceller ved trypsinisering.
- Udskift kulturmedier med 1 ml trypsin-EDTA (0,05%, ethylendiamintetraeddikesyre). Inkuber ved 37 °C i 3 min. Neutraliser trypsin med lige store mængder FBS suppleret medie.
- For hver plade af celler overføres cellesuspensionen til to mikrocentrifugerør med lige store alikvoter. Centrifuge ved 300 x g i 5 min.
- Resuspend cellepillen fra et rør i trin 2.4.2 i 1 ml fosfatbufret saltvand (PBS) til sekventering. Resuspend det andet rør fra trin 2.4.2 med iskold PBS til immunoblot.
- Høst hele cellen lysater for immunoblot.
- Centrifugering af røret ved 300 x g i 5 min. Kassér supernatanten.
- Tilsæt 100 μL radioimmunoprecipitationsanalysebuffer (RIPA lysisbuffer) blandet med 1 % proteasehæmmer og 1% fosfatasehæmmer i røret, bland grundigt med en pipette og inkuber i 10 minutter på is.
BEMÆRK: RIPA lysis buffer indeholder 10 mM Tris-HCI, pH 8,0; 1 mM EDTA; 0,5 mM EGTA; 1% Triton X-100; 0,1% natriumdeoxycholat; 0,1% SDS; 140 mM NaCl og deioniseret vand. - Centrifuge lyserer ved 13.000 x g i 10 min. Saml supernatanter til immunoblot.
3. Måling af CAS9-ekspression via immunoblot
- Bestem proteinkoncentrationen med et bicinchoninsyre (BCA) assay i henhold til producentens anvisninger.
- Der køres 20 μg protein fra hver prøve i brøndene i en 3%-8% Tris-acetatgel i 150 minutter og halvdry overførsel (10 V i 30 min og derefter 25 V i 12 min) til polyvinylidendifluoridmembran.
- Efter blokering af membranen i 5% fedtfri tørmælk i PBS med 0,1% tween (PBST) i 1 time ved stuetemperatur tilsættes anti-CAS9 (1:1000) og anti-GAPDH (1:1000) antistoffer. Inkuber ved 4 °C natten over.
- Efter vask af membranen med PBST inkuberes membranen med sekundært antistof i 5% fedtfri tørmælk i PBST i 1 time ved stuetemperatur.
- Forestil dig bloten og bestem CAS9-niveauet ved hjælp af densitometri23. Se figur 1 for en repræsentativ blot.
BEMÆRK: Påvisning af fosforyleret H2AX (S139) focidannelse ved immunofluorescensmikroskopi kan anvendes til at validere CAS9-aktivitet14. Der forventes et lavt antal forskellige foci (typisk 1-4 foci) afhængigt af cellecykluspositionen, om mutationer på CAS9-målstedet forhindrer yderligere skæring, og hvor mange kopier af CAS9-skærestedet der findes i det genom, der er af interesse. Et repræsentativt billede er vist i figur 2.
4. Nukleinsyreekstraktion og amplicongenerering
- Uddrag DNA fra celleprøver fra trin 2.4.3 ved hjælp af et DNA-ekstraktionssæt med høj molekylvægt, som specificeret af producenten.
- Resuspend primere med angivet opløsningsmiddel i henhold til databladet. Fortynd med det samme reagens til 20 μM og pool 20 μM primere i de angivne puljer.
BEMÆRK: Primerpulje er angivet i supplerende tabel 1. - Opret en PCR Master-blanding ved hjælp af en Taq-polymerase med lang amplifikation for hver 20 μM primerpulje som specificeret i tabel 1.
- Tilsæt 21 μL af mastermixene til separate PCR-rør.
- Tilsæt 4 μL af målprøven (100 ng/μL) fra trin 4.1 til PCR-assayrør, der indeholder mastermix- og cap-assayrør. Sørg for separate reaktioner for hver primerpool.
- Vortex til at blande PCR-assayrør og centrifuge (hurtig spin) for at fjerne dråber fra rørlågene.
- Anbring PCR-rørene på en konventionel termisk cykturmaskine.
- Program PCR-maskine som angivet i tabel 2.
- Kør programmet på en termisk cyktur.
5. PCR-oprydning
- Fjern primere fra PCR-reaktioner ved hjælp af et perlebaseret PCR-oprydningssystem.
- Fjern oprydningsperler fra køleskabet 30 min før brug.
- Vortex perler i god tid inden brug og sørg for, at alle perler er resuspended.
- Tilsæt 30 μL (1,2x) resuspenderede perler til hver brønd af en dyb brønd 96-brønds plade.
- Der tilsættes 25 μL PCR-reaktion til brønde, der indeholder perler.
- Læg pladen på en pladeryster ved 2000 o / min i 2 minutter.
- Lad pladen forblive ved stuetemperatur i 5 minutter efter omrystning.
- Anbring den dybe brøndplade på en plademagnet med 96 brønde og inkuber i 2 minutter.
- Fjern og kassér supernatanten uden de forstyrrende perler.
- Mens pladen forbliver på magneten, tilsættes 180 μL 80% ethanol og inkuberes i 30 s. Fjern og kassér supernatanten.
- Gentag trin 5.1.9.
- Brug en 10 μL pipette til at fjerne og kassere eventuel resterende væske fra brøndene.
- Lad perlerne tørre ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Tilsæt 20 μL nukleasefrit vand til brøndene, der indeholder perler, og fjern pladen fra magneten.
- Ryst pladen ved 2000 o / min i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber pladen ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Placer pladen på et magnetstativ og inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten i en anden, mærket PCR-plade. Dette indeholder det rensede DNA.
- Mål koncentrationen af hver reaktion med et fluorometer.
- Sørg for, at dsDNA-fluormålerreagenser er ved stuetemperatur.
- Opsæt fluorometriske assayrør plus to ekstra rør til standarder.
- Tilsæt 199 μL 1x dsDNA-arbejdsløsning til alle undtagen to rør. Tilsæt 190 μL af arbejdsløsningen til de sidste to rør.
- Tilsæt 10 μL af de to standarder (inkluderet i materialetabellen) for at adskille assayrørene.
- Der tilsættes 1 μL af hver PCR-reaktion til fluormålermastermixrør.
- Hvirvelrør til blanding og inkubering ved stuetemperatur i 2 minutter.
- På fluorometerets startskærm skal du vælge knappen med assay kitin use (1x dsDNA) og derefter vælge Læs standarder og Kør prøver.
- Indsæt standard 1-rør, vælg knappen Læs , og gentag derefter for standard 2.
- Efter trin 5.2.6 gentages for en prøve, der udtages et prøvevolumen på 1 μL, og den resulterende koncentration tilvejebringes.
- Gentag trin 5.2.7 for de resterende prøver.
- Den forventede molaritet af alle reaktioner beregnes, og der oppuljes lige store koncentrationer af reaktioner fra hver enkelt prøve separat (en endelig pulje pr. prøve) ved hjælp af nedenstående ligning.
- Gentag trin 5.2.1 til 5.2.7 for at opnå den endelige poolkoncentration.
- Kontroller ampliconpoolen på en kapillær elektroforesemaskine / agarosegel som specificeret af producenten.
- Forbered kapillærelektroforeserør til det passende antal prøver. Der tilsættes 7 μL af DNA-bufferen som specificeret af producenten.
- Tilsæt 4 μL af ampliconpuljen til røret, der indeholder DNA-buffer.
- Anbring rør på elektroforesemaskinen, og kør maskinen som specificeret af producenten for dsDNA.
- Se elektroforesegelbillederne, der sikrer, at båndene lokaliseres til ~ 5 kb (amplicons størrelse).
- Den forventede molaritet af alle reaktioner beregnes, og der oppuljes lige store koncentrationer af reaktioner fra hver enkelt prøve separat (en endelig pulje pr. prøve) ved hjælp af nedenstående ligning.
6. Forberedelse af biblioteket
- Fortynd prøvepuljer fra trin 5.3.1 til 0,2 ng/μL til biblioteksforberedelse.
- Brug et biblioteksforberedelsessæt med lavt input, der er kompatibelt med korte sekvenser (300bp), til at forberede biblioteker ved hjælp af unikke indekskombinationer for hver prøvepulje, der er oprettet i trin 5.3 efter producentens anvisninger.
BEMÆRK: Følg producentens anvisninger for at vælge indekssekvenser. Alle indekser, der er tilgængelige for bibliotekets forberedelsessæt, fungerer for prøverne. - Efter bibliotekets forberedelse skal du samle alle prøver i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Før du opretter bibliotekspuljen, skal du beregne antallet af læsninger, der er nødvendige for 250x dækning af din målsekvens, og sikre, at den valgte sekventeringspatron kan give tilstrækkelig dækning for hver inkluderet prøve. For 0.5Mb i alt svarer dette til 1M læsninger.
- Brug et biblioteksforberedelsessæt med lavt input, der er kompatibelt med korte sekvenser (300bp), til at forberede biblioteker ved hjælp af unikke indekskombinationer for hver prøvepulje, der er oprettet i trin 5.3 efter producentens anvisninger.
- Forbered bibliotekets pool til sekventering.
- Tø op og forbered en 300-cyklus patron og sekventeringsreagenser.
- Denaturere og fortynde sekventeringspuljen, der er oprettet i trin 5.1.1, i henhold til sequencerens producentens anvisninger.
- Føj denatureret og fortyndet bibliotekspulje til sekventeringsreagenser , og kør sekventeringsmaskinen som angivet af producenten.
BEMÆRK: Se vedlagte tabel 3 for fejlfinding.
7. Analyse af data
BEMÆRK: Alle datatrin udføres i den genomiske dataanalysesoftware. Parenteser angiver brugerinput. Større end tegn angiver rækkefølgen af museklik for et givet trin (f.eks. 1. museklik>2. museklik)
- Importer læsningerne ved at klikke på Åbn software > Importer > Illumina > Vælg filer > Næste > Vælg placering for at gemme > Finish. Læsningerne vises nu i softwaren.
- Trim og filtrer læsningerne.
- I softwaren til analyse af dybe sekvensdata skal du trimme standardparametrene for rå læsninger.
- Fremhæv læsningerne, og klik på Værktøjskasse > Forbered sekventeringsdata > Trim Læser > Næste > Næste > Næste > Næste > Gem > Næste > (Vælg placering, der skal gemmes) > Afslut
- Kortlæg de trimmede læsninger til reference.
- Korttrimmede læsninger til den referencesekvens, der blev brugt i trin 4.1 ved hjælp af en matchscore på 2, uoverensstemmelsesomkostninger på 3 og indsættelses-/sletningsomkostninger på 2. Sørg for, at længdefraktionen er over 0,7, og lighedsfraktionen er på eller over 0,8.
- Fremhæv den trimmede læsefil, og klik på Værktøjskasse > Gensekventeringsanalyse > Kort læser til reference > Næste > (Vælg referencesekvens) > Næste > (Sørg for, at parametre er angivet som ovenfor) > Næste > Gem > (Vælg placering, der skal gemmes) > Udfør.
- Uddrag varianter og indels.
- Brug en passende indel caller til at udtrække indels ved hjælp af en p-værditærskel på 0,005 eller lavere og et maksimalt antal uoverensstemmelser på 3.
- Fremhæv den kortlagte læsefil, og klik på Værktøjskasse > Gensekventeringsanalyse > Registrering af varianter > Indels og strukturelle varianter > Næste > (Sørg for, at den nødvendige betydning er input > Næste > Gem > (Vælg placering, der skal gemmes) > Udfør.
- Brug en passende variant, der ringer, til at kalde varianter fra læsetilknytningen ved hjælp af en signifikans på 5 %.
- Fremhæv den kortlagte læsefil, og klik på Værktøjskasse > Gensekventeringsanalyse > Variantregistrering > Registrering af lavfrekvente varianter > Næste > (Sørg for, at den påkrævede betydning er input > Næste > Næste > Gem > (Vælg placering, der skal gemmes) > Udfør.
BEMÆRK: Sørg for at tage højde for værtsgenomets ploidi i indel- og variantopkalderne. Ekstraher ikke mutanter under 5%. Denne tærskel tager højde for PCR- og sekventeringsfejl i forbindelse med analysen. Normalisering (baseret på immunoblotdetektion af CAS9) skal ske ved at justere sekventeringsdækningen. Hvis prøve A f.eks. har dobbelt så stor transfektionseffektivitet som prøve B, skal 50 % af læsningerne fra prøve A anvendes til analyse. Dette bør ske ved stikprøveudtagning og ikke reducere dækningen for en prøve under 100x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der fremlægges tre repræsentative resultater for denne protokol. Figur 1 er en immunoblot, der bekræfter ekspression af CAS9 i HFK-kontrol (LXSN) og HFK, der udtrykker beta-HPV 8E6 (8E6). 48 timer efter transfektion blev helcellelysater høstet og efterfølgende undersøgt med et anti-CAS9-antistof (eller GAPDH som belastningskontrol). Resultatet viser, at HFK LXSN og HFK 8E6 udtrykker en tilsvarende mængde CAS9, hvilket indikerer, at transfektionseffektiviteten er ens mellem to cellelinjer. Figur 2 er et immunfluorescensmikroskopibillede, der viser CAS9-inducerede DSB'er ved hjælp af pH2AX-foci, en standardmarkør for DSB'er24. Dette indikerer, at to DSB'er induceres af CAS9/sgRNA og bekræfter dermed, at DSB-induktion sker som forventet. Figur 3 viser, at 8E6 øger genomiske variationer inden for 200 Kb omkring den CAS9-inducerede DSB22. Dette stemmer overens med hypotesen om, at HPV8 E6 deregulerer DSB-reparation og øger genomisk ustabilitet. Denne figur viser en måde, hvorpå data opnået ved denne tilgang kan vises.
Figur 1: Repræsentativt billede af immunoblot, der sammenligner CAS9-ekspression i utransfekterede og transfekterede HFK-celler. sgRNA/CAS9-plasmider blev anvendt til at transfektere HFK-celler. Anti-CAS9-antistof blev brugt til at detektere CAS9-proteinet. GAPDH bruges som belastningskontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativt immunfluorescensbillede af phosphoryleret histon H2AX (S139) i sgRNA/CAS9 transfekteret celle og utransfekt kontrol. DAPI blev brugt til at plette DNA (Blå). pH2AX (Rød) er en markør for CAS9-induceret DSB. Dette viser, at optimal CAS9-ekspression er opnået ved fravær af spaltning uden for målet. Afhængigt af antallet af målrettede genomloti (ændret ved ændringer i cellens ploidi, variationer i målstedets kopinummer eller cellecyklusposition) kan antallet af foci være højere. Enhver stigning skal dog være forudsigelig baseret på celletypen og målstedet, der analyseres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Beta-HPV 8E6 øger den genomiske ustabilitet under DSB-reparation. A) Skematisk placering af CAS9-induceret DSB langs den sekventerede del af genomet. B) Genomiske variationer grupperet efter typer af mutationshændelser i HFK LXSN og HFK 8E6. Hver gruppe af genomiske variationer og det samlede antal variationer blev sammenlignet mellem HFK LXSN og HFK 8E6. (C) Circos plot af DNA-mutationer i HFK LXSN (højre side) og HFK 8E6 celler (venstre side). Sorte pile angiver CAS9-skæresteder. Den inderste cirkel viser forbindelser mellem identiske genomiske omlejringer. Placeringen af genomiske omlejringer farvet efter typer af genomiske variationer vises i fem koncentriske cirkler (blå repræsenterer SNP, grøn repræsenterer indsættelse, rød repræsenterer sletning, lilla repræsenterer MNV og sort repræsenterer udskiftning). Punktplot i den yderste cirkel viser brudpunkter (sort), tandemdubletter (rød) og punktindels (grå), hvor nærheden til den ydre kant repræsenterer et højt variantforhold. SNP, enkeltnukleotidpolymorfisme. MNV, multi-nukleotid variation. Statistiske forskelle mellem cellelinjer blev målt ved hjælp af en studerendes t-test. angiver p < 0,001". Dette er tilpasset fra en tidligere offentliggjort reference med tilladelse22. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: PCR Master mix komponenter. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: PCR-programindstillinger. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Fejlfinding. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 1: Liste over grundpulje til PCR. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ud over dybden af de oplysninger, der gives, er der flere fordele ved denne metode. For det første kan DSB-reparation i teorien vurderes på ethvert genomisk loci uden at ændre genomet af den celle, der er af interesse. For det andet øges adgangen til NGS-analyse af reparation af de reducerede omkostninger og beregningsmæssige bestræbelser, der ydes ved at foretage og analysere en enkelt DSB målrettet mod et defineret område. Endelig, når genomerne fra yderligere organismer rutinemæssigt bliver tilgængelige, og flere publikationer, der viser vellykket transfektion af forskellige pattedyrs og ikke-pattedyrs cellelinjer, forventes nytten af denne tilgang at være bred 10,23,24.
Dette manuskript analyserede DSB-reparation i humane forhudskeatinocytter som et illustrativt eksempel. Transfektionseffektiviteten har tendens til at være lavere i keratinocytter end andre vævstyper. Derfor anvendte denne protokol en transfektionsmetode, der var optimeret til disse svære at transfektere celler. Transfektionsmetoden skal optimeres til den analyserede celletype. Evnen af CAS9-induceret DSB anvendt i denne protokol er blevet bekræftet i osteosarkom, tyktarmskræft, lungekræft, fibroblast, embryonal nyre og humane keratinocytceller 10,23. Før du udfører næste generations sekventering, anbefales det dog, at CAS9-ekspression og -aktivitet bekræftes.
Et kritisk trin i denne protokol er, når man sammenligner mellem eller blandt forskellige prøver for at normalisere analysen for at tage højde for forskelle i CAS9-transfektionseffektivitet. For at gøre dette skal det relative CAS9-proteinniveau måles ved immunoblotting og densitometri (figur 1). Det er også vigtigt at sikre specificiteten af CAS9-spaltning som angivet ved tydelig pH2AX (S139) focidannelse, der kan påvises ved IF-mikroskopi14 (figur 3). Alternativt kan T7-endonukleaseassayet bruges til at undersøge CRISPR/Cas9-aktivitet og sgRNA-effektivitet.
En bemærkelsesværdig begrænsning ved denne tilgang er, at CAS9-induceret DSB har tendens til at være "renere" end DSB forårsaget af stråling eller lignende fysiologisk skade. Derfor kan den metode, der er beskrevet her, undervurdere antallet eller sværhedsgraden af mutationerne forbundet med reparation af naturligt forekommende læsioner. Anvendelsen af andre sekvensspecifikke nukleaser, der inducerer DSB med længere udhæng, kan hjælpe med at overvinde denne begrænsning26. Desuden er det ikke fuldt ud forstået, om kromatinområdet (f.eks. heterochromatin og euchromatin) påvirker CAS9-aktiviteten. Således skal brugeren være forsigtig med at bekræfte ækvivalent CAS9-aktivitet, når han sammenligner mutationer på forskellige steder.
Metoden beskrevet her kan bruges til at definere de relative mutagene konsekvenser af reparation af DSB'er i en række sammenhænge. For eksempel kan det lette undersøgelsen af nye små molekyle DNA-reparationshæmmere. Dette ville gøre det muligt for hæmmere, der er mere mutagene i transformerede (sammenlignet med utransformerede) celler, at blive prioriteret til udvikling som kemoterapeutiske midler. Denne tilgang kan også være nyttig at sammenligne inden for samme genomiske baggrund for at bestemme hyppigheden af mutationer forbundet med DSB-reparation i forskellige genkontekster (f.eks. nær en promotor, forstærker eller repressor), mellem celler med forskellige mutationer (f.eks. signalgener, der er konstitutivt aktive eller missense-mutationer) eller andre lignende permutationer. Tilgangens fleksibilitet og prisoverkommelighed er et effektivt redskab til fremtidige analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i dette manuskript blev støttet af National Institute of General Medical Sciences fra National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW og RP); National Cancer Institute of the National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center i Kansas State University; og det amerikanske forsvarsministerium (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Vi sætter pris på KSU-CVM Confocal Core og Joel Sanneman for vores immunofluorescensmikroskopi. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis disse finansieringsorganers officielle synspunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W.
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 53B. P. 1 BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (0), 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327 (0), 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -X. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
