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Biochemistry

Déchiffrer le mécanisme moléculaire de l’assemblage des histones par la technique du rideau d’ADN

Published: March 9, 2022 doi: 10.3791/63501
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Biological Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology, 2Center for Genomic Integrity, Institute for Basic Science (IBS)

Summary

Le rideau d’ADN, une technique d’imagerie à haut débit d’une seule molécule, fournit une plate-forme pour la visualisation en temps réel de diverses interactions protéine-ADN. Le présent protocole utilise la technique du rideau d’ADN pour étudier le rôle biologique et le mécanisme moléculaire d’Abo1, une ATPase AAA+ contenant du bromodomaine de Schizosaccharomyces pombe .

Abstract

La chromatine est une structure d’ordre supérieur qui emballe l’ADN eucaryote. La chromatine subit des altérations dynamiques en fonction de la phase du cycle cellulaire et en réponse à des stimuli environnementaux. Ces changements sont essentiels à l’intégrité génomique, à la régulation épigénétique et aux réactions métaboliques de l’ADN telles que la réplication, la transcription et la réparation. L’assemblage de la chromatine est crucial pour la dynamique de la chromatine et est catalysé par les chaperons des histones. Malgré des études approfondies, les mécanismes par lesquels les chaperons histones permettent l’assemblage de la chromatine restent insaisissables. De plus, les caractéristiques globales des nucléosomes organisés par des chaperons d’histones sont mal comprises. Pour résoudre ces problèmes, ce travail décrit une technique unique d’imagerie à molécule unique appelée rideau d’ADN, qui facilite l’étude des détails moléculaires de l’assemblage des nucléosomes par les chaperons d’histones. Le rideau d’ADN est une technique hybride qui combine la fluidité des lipides, la microfluidique et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM) pour fournir une plate-forme universelle pour l’imagerie en temps réel de diverses interactions protéine-ADN. À l’aide d’un rideau d’ADN, la fonction chaperon des histones d’Abo1, l’ATPase AAA+ contenant des bromodomaines contenant des pombes de Schizosaccharomyces , est étudiée, et le mécanisme moléculaire sous-jacent à l’assemblage des histones d’Abo1 est révélé. Le rideau d’ADN offre une approche unique pour l’étude de la dynamique de la chromatine.

Introduction

L’ADN eucaryote est emballé dans une structure d’ordre supérieur connue sous le nom de chromatine 1,2. Le nucléosome est l’unité fondamentale de la chromatine, qui se compose d’environ 147 pb d’ADN enroulé autour des histones octamères 3,4. La chromatine joue un rôle essentiel dans les cellules eucaryotes ; par exemple, la structure compacte protège l’ADN des facteurs endogènes et des menaces exogènes5. La structure de la chromatine change dynamiquement en fonction de la phase du cycle cellulaire et des stimuli environnementaux, et ces changements contrôlent l’accès aux protéines lors des transactions de l’ADN telles que la réplication, la transcription et la réparation6. La dynamique de la chromatine est également importante pour la stabilité génomique et l’information épigénétique.

La chromatine est régulée dynamiquement par divers facteurs, y compris les modifications de la queue des histones et les organisateurs de la chromatine tels que les remodeleurs de chromatine, les protéines du groupe polycomb et les chaperons d’histones7. Les chaperons histones coordonnent l’assemblage et le désassemblage des nucléosomes par dépôt ou détachement des histones centrales 8,9. Les défauts dans les chaperons d’histones induisent une instabilité du génome et provoquent des troubles du développement et des cancers 9,10. Divers chaperons d’histones n’ont pas besoin de consommation d’énergie chimique comme l’hydrolyse de l’ATP pour assembler ou désassembler les nucléosomes 9,11,12,13. Récemment, des chercheurs ont rapporté que les ATPases AAA+ (ATPase associées à diverses activités cellulaires) contenant des bromodomaines jouent un rôle dans la dynamique de la chromatine en tant que chaperons d’histones 14,15,16,17. L’ATAD2 humain (protéine 2 contenant le domaine AAA de la famille des ATPase) favorise l’accessibilité de la chromatine pour améliorer l’expression des gènes18. En tant que co-régulateur transcriptionnel, l’ATAD2 régule la chromatine des facteurs transcriptionnels oncogènes14, et la surexpression d’ATAD2 est liée à un mauvais pronostic dans de nombreux types de cancer19. Yta7, l’homologue de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) d’ATAD2, diminue la densité des nucléosomes dans la chromatine15. En revanche, Abo1, l’homologue Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) d’ATAD2, augmente la densité des nucléosomes16. À l’aide d’une technique unique d’imagerie à molécule unique, le rideau d’ADN, la question de savoir si Abo1 contribue à l’assemblage ou au désassemblage des nucléosomes est abordée17,20.

Traditionnellement, les propriétés biochimiques des biomolécules ont été examinées par des expériences en masse telles que le test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) ou la co-immunoprécipitation (co-IP), dans lesquelles un grand nombre de molécules sont sondées, et leurs propriétés moyennes sont caractérisées21,22. Dans les expériences en vrac, les sous-états moléculaires sont voilés par l’effet d’ensemble-moyenne, et l’exploration des interactions biomoléculaires est limitée. En revanche, les techniques à molécule unique contournent les limites des expériences en vrac et permettent la caractérisation détaillée des interactions biomoléculaires. En particulier, les techniques d’imagerie à molécule unique ont été largement utilisées pour étudier les interactions ADN-protéine et protéine-protéine23. L’une de ces techniques est le rideau d’ADN, une technique unique d’imagerie à molécule unique basée sur la microfluidique et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM)24,25. Dans un rideau d’ADN, des centaines de molécules d’ADN individuelles sont ancrées à la bicouche lipidique, ce qui permet le mouvement bidimensionnel des molécules d’ADN en raison de la fluidité lipidique. Lorsque l’écoulement hydrodynamique est appliqué, les molécules d’ADN se déplacent le long de l’écoulement sur la bicouche et restent coincées à une barrière de diffusion, où elles sont alignées et étirées. Alors que l’ADN est coloré avec des agents intercalants, des protéines marquées par fluorescence sont injectées, et TIRFM est utilisé pour visualiser les interactions protéine-ADN en temps réel au niveau d’une seule molécule23. La plate-forme de rideau d’ADN facilite l’observation des mouvements des protéines tels que la diffusion, la translocation et la collision 26,27,28. De plus, le rideau d’ADN peut être utilisé pour la cartographie des protéines sur l’ADN avec des positions, des orientations et des topologies définies ou appliqué à l’étude de la séparation de phase des protéines et des acides nucléiques 29,30,31.

Dans ce travail, la technique du rideau d’ADN est utilisée pour fournir des preuves de la fonction des chaperons grâce à la visualisation directe de protéines spécifiques. De plus, comme DNA curtain est une plate-forme à haut débit, elle facilite une collecte de données suffisante pour assurer la fiabilité statistique. Ici, il est décrit comment effectuer le test de rideau d’ADN en détail pour étudier le rôle moléculaire de l’AAA+ ATPase Abo1 contenant du bromodomaine de S. pombe .

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Protocol

1. Préparation de la cellule d’écoulement

  1. Préparer une lame de silice fondue nettoyée contenant des motifs de nano-tranchées à la suite du rapport25 publié précédemment.
    1. Percez deux trous de 1 mm de diamètre dans une lame de silice fondue nettoyée (figure 1A) à l’aide d’un foret diamanté (voir tableau des matériaux).
    2. Déposer 250 nm d’aluminium épais (Al) sur la lame à l’aide d’une pulvérisation cathodique CC32 (voir tableau des matériaux) avec 10 mTorr de gaz argon.
    3. Appliquer une couche de 310 nm d’épaisseur de poly(méthacrylate de méthyle) (méthacrylate de méthyle) (PMMA) 950K à 4 % (voir tableau des matériaux) à 4 000 tr/min pendant 1 min et cuire sur une plaque chauffante à 180 °C pendant 3 min.
    4. Dessinez les motifs de nano-tranchées sur la couche de PMMA entre les deux trous à l’aide de la lithographie par faisceau d’électrons (ebeam)33 avec un courant de 0,724 nA à 80 kV.
      NOTE : L’architecture et les dimensions des motifs de nano-tranchées sont illustrées à la figure 1A.
    5. Retirez le PMMA exposé par faisceau d’ébrèches en trempant les lames dans la solution de développement (rapport 1 :3 de méthylisobutylcétone et d’isopropanol, voir le tableau des matériaux) pendant 2 min.
    6. Graver des couches d’Al avec une gravure ionique réactive au plasma à couplage inductif (ICP-RIE) à l’aide de gaz chlore (Cl2) et trichlorure de bore (BCl3).
      REMARQUE : Ces deux gaz peuvent éliminer l’Al des zones exposées aux faisceaux électriques.
    7. Creuser des nano-tranchées sur les lames à l’aide de gaz de tétrafluorure de soufre (SF4), de tétrafluorométhane (CF4) et d’oxygène (O2) (voir le tableau des matériaux).
    8. Retirez la couche d’Al restante en trempant les lames dans de l’Al etchant (révélateur AZ 300 MIF, voir Tableau des matériaux) pendant 10 min.
    9. Après la fabrication, rincez les lames avec de l’eau déminéralisée et sonicez dans de l’acétone pendant 30 min à l’aide d’un sonicateur de type bain.
    10. Nettoyez les lames dans une solution Hellmanex III à 2 % (voir tableau des matériaux) pendant au moins 1 jour avec un brassage magnétique.
    11. Ponctionner successivement les lames dans de l’acétone et 1 M de NaOH pendant 30 min.
    12. Rincez les lames avec de l’eau déminéralisée et séchez-les avec un gaz azoté (N2).
  2. Placez un papier propre (5 mm x 35 mm) au centre du ruban adhésif double face. Fixez le ruban adhésif sur la lame pour couvrir les deux trous et les nano-motifs avec le papier.
  3. Retirez le papier à l’aide d’une lame propre (Figure 1A).
  4. Placez une lamelle de verre sur le ruban adhésif double face et frottez la lamelle à l’aide d’une pointe de pipette pour former une chambre microfluidique (Figure 1A).
  5. Placez la cellule d’écoulement assemblée entre deux lames de microscope et clipsez-les.
  6. Faites cuire la cellule d’écoulement dans un four sous vide à 120 °C pendant 45 min.
  7. Fixez le connecteur de fluide (Nanoport) pour les analyses à base de puce (voir tableau des matériaux) à chaque trou ouvert à l’aide d’un pistolet à colle chaude et connectez les deux lignes de tubes Luer Lock.
  8. Branchez une seringue Luer lock contenant 3 mL d’eau déminéralisée et lavez la chambre.
  9. Lavez la chambre avec 3 mL de tampon lipidique (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 et 100 mM de NaCl) via le raccord goutte à goutte.
    REMARQUE : La connexion goutte à goutte relie toutes les seringues à la cellule d’écoulement pour éviter d’injecter des bulles d’air dans la chambre.
  10. Injecter 1 mL de lipides biotinylés 0,04x dans un tampon lipidique dans la chambre en deux injections avec une incubation de 5 minutes par injection.
    NOTE : La préparation d’une souche lipidique biotinylée 1x est décrite dans un rapport publié précédemment34.
  11. Lavez la chambre avec 3 mL de tampon lipidique et incubez pendant 20 min pour que la bicouche lipidique mûrisse sur la surface de la lame.
  12. Ajouter 1 mL de tampon BSA (40 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2 et 0,2 mg/mL de BSA) et incuber pendant 5 min pour passiver la surface de la lame.
    REMARQUE : Cette étape peut réduire la liaison non spécifique des protéines à la surface de la lame.
  13. Injecter 0,025 mg/mL de streptavidine dans 1 mL de tampon BSA avec deux injections et 10 minutes d’incubation par injection.
  14. Éliminer la streptavidine résiduelle avec 3 mL de tampon BSA.
  15. Injecter ~300 pM (30 μL) d’ADN de phage lambda biotinylé dans 1 mL de tampon BSA dans la chambre avec deux injections et 10 minutes d’incubation par injection.
    NOTE : La préparation de l’ADN lambda biotinylé est décrite dans un rapport publié précédemment34.

2. Connexion de la cellule d’écoulement au système microfluidique et chargement de celle-ci sur le microscope

  1. Préparer le tampon d’imagerie Abo1 (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 1 mM d’ATP, 2 mM de MgCl2, 1,6 % de glucose et 0,1x de gloxy, voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Gloxy est un système de piégeage de l’oxygène qui réduit le photoblanchiment des colorants fluorescents. La préparation d’une souche 100x gloxy avec de la glucose oxydase et de la catalase est décrite dans la référence35.
  2. Connectez une seringue contenant 10 mL de tampon d’imagerie à un pousse-seringue et éliminez les bulles dans toutes les conduites de tubulure du système microfluidique.
  3. Couplez la cellule d’écoulement préparée avec le système microfluidique via une connexion goutte à goutte pour éviter l’injection de bulles dans la cellule d’écoulement (Figure 1B).
  4. Assemblez la cellule d’écoulement et les supports de cellule d’écoulement et montez l’ensemble sur un microscope TIRF construit sur mesure (Figure 1C).
    ATTENTION : Lorsque la cellule d’écoulement est placée sous le microscope, réglez soigneusement la hauteur de la lentille de l’objectif. La cellule d’écoulement ne doit pas toucher la lentille de l’objectif. Cela peut endommager l’objectif.
  5. Déposez l’huile correspondante à l’indice au centre de la cellule d’écoulement et placez un prisme en forme de colombe sur mesure (voir le tableau des matériaux) sur la goutte d’huile.

3. Assemblage d’histones par Abo1 à l’aide d’un rideau d’ADN

  1. Mélanger 5 nM d’Abo1 et 12,5 nM de dimère d’histone H3-H4 marqué au Cy5 (Cy5-H3-H4) (voir le tableau des matériaux) dans 150 μL de tampon d’imagerie. Toutes les protéines ont été préparées conformément au rapport17 publié précédemment.
  2. Incuber le mélange sur de la glace pendant 15 min.
    REMARQUE : Pour éviter le photoblanchiment de Cy5, l’incubation doit se faire dans l’obscurité.
  3. Injecter ~20 pM (2 μL) de colorant YOYO-1 dans un tampon d’imagerie à travers une boucle d’échantillon de 100 μL pour colorer les molécules d’ADN lambda.
  4. Exécutez un logiciel d’imagerie (voir le tableau des matériaux) et allumez le laser 488 nm pour vérifier si les rideaux d’ADN sont bien formés.
    REMARQUE : Si les rideaux d’ADN sont bien formés, les molécules d’ADN, qui sont colorées avec YOYO-1, sont représentées sous forme de lignes alignées sur une barrière en présence d’écoulement. Les lignes tendues reculent et diffusent loin de la barrière lorsque le flux est coupé.
  5. Injecter 2 mL de tampon à haute teneur en sel (200 mM de NaCl et 40 mM de MgCl2) pour éliminer le colorant YOYO-1 de l’ADN.
  6. Une fois que le colorant YOYO-1 a été retiré, injectez l’échantillon de protéine pré-incubé.
  7. Lorsque les protéines atteignent le rideau d’ADN, éteignez le pousse-seringue, fermez la vanne d’arrêt et incubez 15 minutes pour la charge d’histones par Abo1.
  8. Lavez les protéines Abo1 et histones non liées pendant 5 min.
  9. Allumez la vanne d’arrêt et reprenez l’injection de débit.
  10. Allumez le laser 637 nm et imagez les protéines fluorescentes pendant que le flux tampon est activé.
  11. Arrêtez temporairement le flux tampon pour vérifier si les protéines histones sont chargées sur l’ADN (Figure 2C).
  12. Recueillir des images de rideaux d’ADN à l’aide d’un programme d’acquisition d’images (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Lorsque le flux tampon s’arrête transitoirement, l’ADN recule hors du champ évanescent de la réflexion interne totale, et les protéines marquées par fluorescence liées à l’ADN disparaissent.

4. Analyse des données

  1. Transformez les images prises par le programme d’acquisition d’images au format TIFF sous forme de séquences d’images.
    NOTA : Toutes les données ont été analysées à l’aide de l’image J (NIH) telle qu’elle est décrite dans la référence20.
  2. Choisissez une seule molécule d’ADN parmi les séquences d’images et dessinez un kymographe.
    REMARQUE : Le kymographe peut montrer le changement d’intensité de fluorescence de chaque protéine histones liée à une seule molécule d’ADN en fonction du temps.
  3. Créez le profil d’intensité de fluorescence à partir du kymographe et adaptez-le à plusieurs fonctions gaussiennes.
  4. Collectez les coordonnées centrales des pics à partir du profil d’intensité de fluorescence. Dans cette étape, l’intensité minimale de la fluorescence des histones peut être obtenue.
  5. Divisez toutes les intensités maximales recueillies à partir des profils par l’intensité minimale. Le nombre de dimères H3-H4 liés à l’ADN est estimé dans cette étape.
  6. Effectuez les étapes 4.2 à 4.5 pour les autres molécules d’ADN.
  7. Créez un histogramme pour la distribution de liaison des dimères H3-H4 avec une taille de groupe de 1 kbp. Le nombre de molécules analysées est d’au moins 300.

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Representative Results

Ce travail décrit la procédure de préparation des cellules en flux pour le test de rideau d’ADN (Figure 1A). Le test de rideau d’ADN a facilité l’étude de l’assemblage des dimères d’histones H3-H4 sur l’ADN par Abo1. Tout d’abord, la formation d’un rideau d’ADN a été vérifiée en colorant les molécules d’ADN avec YOYO-1, un colorant intercalant. Des lignes vertes ont été montrées dans des réseaux parallèles, indiquant que YOYO-1 s’intercalait en molécules d’ADN, qui étaient bien alignées et étirées au niveau d’une barrière de diffusion sous écoulement hydrodynamique (Figure 2A). Pour exclure la possibilité que YOYO-1 entrave l’interaction de l’ADN et des protéines histones, YOYO-1 a été retiré de l’ADN avec un tampon à haute teneur en sel avant d’ajouter des protéines histones. Lorsque des dimères Cy5-H3-H4 ont été injectés dans le rideau d’ADN en l’absence d’Abo1, Cy5-H3-H4 ne s’est pas lié à l’ADN, ce qui indique une absence de liaison spontanée des dimères H3-H4 à l’ADN (Figure 2B). Lorsque Cy5-H3-H4 a été injecté avec Abo1, des particules fluorescentes rouges ont été observées sur les molécules d’ADN, ce qui suggère qu’Abo1 charge les dimères H3-H4 sur l’ADN (Figure 2C). L’écoulement tampon a été temporairement désactivé pour s’assurer que les dimères Cy5-H3-H4 ne se lient pas à la surface de la lame tout en se liant à l’ADN. Lorsque le flux a été coupé, les protéines marquées par fluorescence liées à l’ADN ont disparu parce que les molécules d’ADN ont reculé hors du champ évanescent. En revanche, les protéines adsorbées à la surface sont restées les mêmes. Les signaux fluorescents ont disparu en l’absence d’écoulement et sont réapparus lorsque l’écoulement a été repris, ce qui suggère que les dimères H3-H4 se lient à l’ADN (Figure 2C). La liaison des dimères H3-H4 à l’ADN a également été confirmée par le kymographe, dans lequel les signaux de fluorescence disparaissaient chaque fois que le flux était coupé (Figure 2D). Étant donné qu’Abo1 est une ATPase AAA+, l’effet de l’hydrolyse de l’ATP sur l’activité de charge en histones d’Abo1 a été examiné16. Peu de puncta fluorescents sont apparus dans le rideau d’ADN, soit en l’absence de nucléotide (Apo), soit en présence d’ADP (Figure 2E), ce qui indique que les dimères H3-H4 se lient rarement à l’ADN, que ce soit à l’état Apo ou en présence d’ADP. La figure 2F présente des analyses quantitatives de la figure 2B, de la figure C et de la figure 2E, montrant que le nombre de dimères H3-H4 liés à l’ADN augmente en présence d’ATP. Les résultats suggèrent que l’hydrolyse de l’ATP est essentielle pour la charge H3-H4 sur l’ADN par Abo1 (Figure 2E,F).

Ensuite, il a été testé si Abo1 charge préférentiellement les histones à la séquence Widom 601, qui a une affinité de liaison dix fois plus élevée aux histones que les séquences aléatoires in vitro, même si les nucléosomes n’ont pas de spécificité pour la séquence Widom 601 in vivo 36,37,38,39,40. Le rideau d’ADN a été formé avec de l’ADN lambda qui contient des répétitions de Widom 601 à une extrémité ou à l’intérieur (Figure 3A,B). Le paysage de liaison des dimères H3-H4 sur chaque construction d’ADN a été obtenu (Figure 3C,D). L’emplacement de liaison de Cy5-H3-H4 a été estimé à partir de la position centrale de l’ajustement gaussien 2D pour chaque punctum fluorescent17,41. Si l’activité de chargement H3-H4 d’Abo1 dépend de la séquence d’ADN, alors la distribution de liaison serait biaisée vers la séquence Widom 601. La figure 3C,D montre les histogrammes de distribution de liaison des dimères H3-H4 par Abo1 sur l’ADN lambda contenant des répétitions Widom 601 à la fin (dix répétitions) et en interne (cinq répétitions), respectivement. Il n’y avait pas de liaison préférentielle aux multiples répétitions de Widom 601, et la distribution de liaison était aléatoire, ce qui suggère qu’Abo1 n’a aucune préférence pour la séquence de Widom 601 mais charge plutôt H3-H4 sur l’ADN d’une manière indépendante de la séquence (Figure 3C,D).

Figure 1
Figure 1 : Préparation de la cellule d’écoulement. (A) Schémas de l’assemblage de la cellule d’écoulement et du système de rideau d’ADN. La chambre microfluidique peut être formée entre une lame de silice fondue et une lamelle de verre collée ensemble avec du ruban adhésif double face. Sous l’écoulement hydrodynamique dans la chambre, une grande quantité de molécules d’ADN lambda sont alignées au niveau d’une barrière de diffusion (une nano-tranchée ici) en raison de la fluidité de la bicouche lipidique et tendues comme un rideau. Dans la vue agrandie de la barrière de diffusion, la nano-tranchée présente des motifs en dents de scie avec un pas de 1,5 μm, une largeur de 350 nm et une profondeur de 1,4 μm. (B) Photographie du système microfluidique composé d’un pousse-seringue, d’une vanne d’arrêt et d’une vanne d’injection d’échantillon à 6 voies avec une boucle d’échantillonnage. (C) Photos des composants du porte-lames (à gauche), de l’assemblage des supports et de la cellule d’écoulement (au milieu) et de la cellule d’écoulement entièrement assemblée montée sur un microscope TIRF sur mesure (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Visualisation de la charge en histones par Abo1 à l’aide d’un rideau d’ADN à molécule unique. (A) Image d’un rideau d’ADN, où les molécules d’ADN colorées avec YOYO-1 (en vert) sont bien alignées au niveau d’une barrière de diffusion. (B) Images de Cy5-H3-H4 (rouge) sans Abo1. (C) Images de Cy5-H3-H4 (rouge) chargées par Abo1 en présence (en haut) et en absence (en bas) d’écoulement tampon. (D) Kymographe extrait d’une seule molécule d’ADN de (C). Lorsque le flux est temporairement interrompu, les signaux de fluorescence Cy5 disparaissent, ce qui indique que Cy5-H3-H4 se lie à l’ADN mais pas à la surface de la lame. (E) Image de Cy5-H3-H4 chargée par Abo1 sans nucléotide (Apo) (en haut). Image de Cy5-H3-H4 chargée par Abo1 en présence d’ADP (en bas). (F) Quantification de Cy5-H3-H4 chargé par Abo1 en fonction des nucléotides. Les barres d’erreur représentent l’écart-type en trois exemplaires. Chaque expérience impliquait l’analyse de 100 à 200 molécules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Chargement indépendant de la séquence de H3-H4 par Abo1. (A) Une extrémité de l’ADN lambda est ancrée au lipide biotinylé par la streptavidine, et l’autre extrémité contient dix répétitions de la séquence Widom 601 (en haut). L’autre ADN lambda contient cinq répétitions de la séquence Widom 601 à l’intérieur de l’ADN lambda (en bas). (B) Schéma d’un test d’ADN avec de l’ADN lambda contenant des répétitions Widom 601. (C,D) Les histogrammes de distribution de liaison de Cy5-H3-H4 sur l’ADN lambda contenant Widom 601 se répètent à la fin (C) et en interne (D). Il n’y a pas de spécificité de séquence pour l’ADN lorsque H3-H4 est assemblé par Abo1. Les barres d’erreur sont obtenues en amorçant42 avec un intervalle de confiance de 70 %. Le nombre total d’événements est de 312 et 252 pour (C) et (D), respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

En tant que technique d’imagerie à molécule unique, le rideau d’ADN a été largement utilisé pour sonder les réactions métaboliques de l’ADN43. Le rideau d’ADN est un système hybride qui concatène la fluidité lipidique, la microfluidique et le TIRFM. Contrairement à d’autres techniques à molécule unique, le rideau d’ADN permet une visualisation en temps réel à haut débit des interactions protéine-ADN. Par conséquent, la technique du rideau d’ADN est adaptée pour sonder le mécanisme à l’origine des interactions moléculaires, y compris l’association spécifique à la séquence, le mouvement des protéines avec l’ADN et la collision protéine-protéine sur l’ADN 17,20,26. De plus, la nature à haut débit du rideau d’ADN permet de collecter suffisamment de données pour assurer la fiabilité statistique. Le rideau d’ADN facilite l’étude des propriétés biophysico-chimiques des protéines, y compris les paramètres cinétiques, le coefficient de diffusion, la vitesse et la processivité 17,26,27,30. Il est important de noter que le rideau d’ADN peut être utilisé pour déterminer le paysage de liaison du dépôt de nucléosomes, ce qui indique la préférence intrinsèque des nucléosomes30.

Plusieurs points doivent être pris en compte pour obtenir des données de haute qualité à partir du test de rideau d’ADN. Tout d’abord, la bicouche lipidique doit être formée de manière appropriée sur la surface de la lame. La fluidité de la bicouche lipidique permet aux molécules d’ADN de se déplacer sur la lame et d’être alignées au niveau d’une barrière de diffusion en présence d’un écoulement hydrodynamique. La bicouche lipidique passive également la surface de la chambre microfluidique pour empêcher l’adsorption non spécifique des protéines à la surface. Étant donné que la passivation par la bicouche lipidique n’est pas complète, les protéines marquées par fluorescence sont adsorbées de manière non spécifique à la surface, ce qui conduit à une interprétation incorrecte des résultats. Cependant, les protéines coincées en surface peuvent être distinguées de celles liées à l’ADN en activant et en désactivant le flux transitoire, car les protéines liées à l’ADN disparaissent lorsque le flux s’arrête. Deuxièmement, le photoblanchiment des fluorophores doit être supprimé. De nombreuses méthodes d’imagerie par fluorescence à molécule unique adoptent un système de piégeage de l’oxygène pour réduire le photoblanchiment. Plusieurs systèmes de piégeage de l’oxygène ont été développés, dont le plus populaire est le gloxy. Gloxy, composé de glucose oxydase et de catalase, réduit enzymatiquement les oxygènes moléculaires en solution mais abaisse le pH 44,45,46. Un pH bas n’est pas compatible avec les conditions physiologiques et réduit la fluidité des lipides. Pour retarder la diminution du pH, (1) le tampon d’imagerie doit être préparé avec de l’eau déminéralisée dégazée, (2) le tampon doit être utilisé immédiatement et (3) le tampon doit être scellé et stocké sur de la glace jusqu’à son utilisation.

Une plate-forme unique a été développée pour améliorer le système de rideaux d’ADN dans lequel des nano-tranchées sculptées servent de barrières de diffusion au lieu de nano-motifs de chrome25. Étant donné que ces nano-tranchées sont plus robustes dans des conditions de nettoyage difficiles avec des solvants puissants, elles permettent une imagerie reproductible et plus claire. Cependant, la technique du rideau d’ADN présente plusieurs limites. Sous un éclairage laser continu, les fluorophores qui marquent les protéines sont photoblanchis, ce qui rend difficiles les mesures à long terme. Le rideau d’ADN ne fonctionne pas à un pH bas (inférieur à ~6) car la bicouche lipidique n’est pas fluidique. De plus, le bruit de fond de fluorescence et la liaison non spécifique des protéines à la surface de la lame perturbent l’imagerie d’une seule molécule lorsque la concentration en protéines est élevée. Un autre inconvénient du rideau d’ADN est que la résolution spatiale du rideau d’ADN est de ~1 kbp/pixel, de sorte que le mouvement des protéines à moins de 1 kbp ne peut pas être observé. De plus, le rideau d’ADN applique en permanence une force hydrodynamique aux protéines de l’ADN. Mais la force par écoulement est faible (moins de 1 pN), et il est donc difficile que les histones ou les nucléosomes se déplacent le long de l’ADN dans le rideau. Il a également été rapporté que les nucléosomes glissent rarement le long de l’ADN sans remodeleurs de chromatine47. Si les histones ou les nucléosomes glissent le long de l’ADN, la plupart d’entre eux resteront dans la région terminale de l’ADN dans le rideau. Cependant, nous n’avons pas vu de répartition biaisée. D’autre part, si les histones ou les nucléosomes s’écoulent de l’extrémité de l’ADN, ils seraient épuisés à la fin de l’ADN. Nous ne l’avons pas observé non plus.

Ce travail démontre que le test de rideau d’ADN est une plateforme d’imagerie à molécule unique idéale pour étudier la dynamique de la chromatine. Le rideau d’ADN peut être appliqué pour étudier le processus par lequel les chaperons histones tels que les ATPases AAA+ contenant du bromodomaine assemblent la chromatine. La fonction biologique des ATPases AAA+ contenant des bromodomaines est controversée. L’absence d’ATAD2 humain ou de S. cerevisiae Yta7 régule à la baisse l’expression des gènes via la condensation de la chromatine18. En revanche, S. pombe Abo1 augmente la densité des nucléosomes16. Les études sur une seule molécule montrent qu’Abo1 catalyse la charge de l’histone H3-H4 sur l’ADN. Il est montré que l’activité de charge des histones d’Abo1 est dépendante de l’hydrolyse de l’ATP (Figure 2C,E,F). De plus, la distribution de liaison des dimères H3-H4 montre que les dimères H3-H4 sont chargés sur l’ADN par Abo1 d’une manière indépendante de la séquence (Figure 3). En conclusion, le rideau d’ADN peut être utilisé pour démêler le rôle biologique d’Abo1 en tant que chaperon des histones dans l’assemblage des histones. À l’aide de la technique du rideau d’ADN, la formation de nucléosomes par Abo1 et d’autres chaperons d’histones tels que CAF-1 et FACT sera étudiée à l’avenir.

Sur la base de ce protocole, le test de rideau d’ADN peut être utilisé pour observer la réorganisation de la chromatine en remodelant des complexes qui transloquent et réarrangent les nucléosomes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs apprécient l’aimable soutien apporté à Abo1 et Cy5-H3-H4 par le professeur Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., et Juwon Jang, Ph.D., à KAIST, en Corée du Sud. Ce travail est soutenu par la subvention de la Fondation nationale de recherche (NRF-2020R1A2B5B01001792), le fonds de recherche intra-muros (1.210115.01) de l’Institut national des sciences et technologies d’Ulsan et l’Institut des sciences fondamentales (IBS-R022-D1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 301321
1' x 3' fused-silca slide glass G. Finkenbeiner 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness
10 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 302149
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) Avanti 850375 This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 Biotinyl cap PE Avanti 870273 This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 PEG2000 PE Avanti 880130 This is a component of biotinylated lipid stock
3 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 302832
6-way sample injection valve IDEX MX series II
950K PMMA All-resist 671.04
Acetone SAMCHUN A1759
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A2383
Aluminum (Al) TASCO, South Korea LT50AI414 Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa Millipore Z648027
Ampicillin Mbcell MB-A4128 Antibiotics
AZ 300 MIF developer Merck 10454110521 Used for removing aluminum
Blade DORCO DN52 12 mm x 6 m
Boron trichloride (BCl3) UNIONGAS Purity: >99.99%
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Catalase Sigma C40-1g This is a component of 100x gloxy stock
Chlorine (Cl2) UNIONGAS Purity: >99.99%
Clear double-sided tape 3M 313770
D-(+)-glucose Sigma G7528
DC sputter Sorona SRM-120 Used for deposition aluminum on a slide
Diamond-coated drill bit Eurotool DIB-211.00 Used for making holes in a fusced silica slide
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
Dove-prism Korea Electro-Optics Co. Ltd. 1906-106 Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating
Drill Dremel Dremel 3000 Used for making holes in a fusced silica slide
Electron Bean Lithography Nanobeam Ltd. NB3
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-1KG
Fingertight fittings IDEX F-300 It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Flangeless male nut IDEX P-235 It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Freeze Dryer, HyperCOOL Labogene HC3110 Used for lyophilizing liquid proteins
Glucose oxidase Sigma G2133-50KU This is a component of 100x gloxy stock
Guanidinium hydrochloride Acros Organics 364790025
Hamilton syringe Hamilton Company 80065 This syringe is used for sample injection
Hellmanex III Sigma Z805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg Cytiva 28-9893-36 Used for FPLC (size exclusion)
Hot plate stirrer Corning PC-420D
Hydrochloric acid Sigma H1759 Used for Tris-HCl
Index matching oil ZEISS 444970-9000-000
Inductively coupled plasma-reactive ion etching Top Technology Ltd. FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Glentham Life Sciences GC6586-100g Used for induction of β-galactosidase activity
Lambda phage DNA NEB N0311
LB broth BD difco 244610 Media for E.coli cell growth
Luer adapter 10-32 IDEX P-659 This connects luer-lock syringe and tubing
Magnesium chloride hexahydrate fisher bioreagents BP214
Methyl isobutyl ketone (MIBK) KAYAKU ADVANCED MATERIALS Used for developing solution
Microscope (Eclipse Ti2) Nikon Eclipse Ti2 Inverted fluorescence microscope
Microscope glass coverslip MARIENFELD 101142 22 x 50 mm (No. 1)
Microscope slide DURAN GROUP DU.2355013 Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm
Nanoport IDEX N-333-01
Objective lens Nikon CFI Plan Apochromat VC 60XC WI Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli Thermo Fisher Scientific C6060-03 Competent cell for overexpressing proteins
Oxygen (O2) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
PFA tubing natural IDEX 1512L It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche 11359061001 Protease inhibitor
Sephacryl S-200 High Resolution Cytiva 17-0584-01 Used for FPLC (size exclusion)
Shut-off valve IDEX P-732
Sodium acetate Sigma 791741
Sodium chloride (NaCl) Sigma S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma s5881
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa Spectrum laboratories 132660
Streptavidin Thermo Fisher Scientific S888
Sulfur tetralfluoride (SF4) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
Syringe pump KD Scientific 78-8210
Tetrafluoromethane (CF4) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
TritonX-100 Sigma T9284
Trizma base Sigma T1503 Used for Tris-HCl
TSKgel SP-5PW TOSOH 14715 Used for FPLC (ion exchange)
Union assembly IDEX P-760 This connects tubings
Urea Sigma U5378
Vacuum oven Jeio Tech OV-11
YOYO-1 Thermo Fisher Scientific Y3601 This intercalation dye is diluted in DMSO
β-mercaptoethanol (BME) Sigma M6250

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