Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تسجيل تيار البوتاسيوم المعتمد على الجهد على خلايا عضلة القلب H9c2 عبر تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64805
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3,4, 5, 1,3,4, 4
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

يصف البروتوكول الحالي طريقة فعالة للاكتساب الديناميكي في الوقت الفعلي لتيارات قناة البوتاسيوم ذات الجهد الكهربائي (Kv) في خلايا عضلة القلب H9c2 باستخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة.

Abstract

تلعب قنوات البوتاسيوم على غشاء خلية عضلة القلب دورا مهما في تنظيم الأنشطة الكهربية للخلية. كونها واحدة من القنوات الأيونية الرئيسية ، ترتبط قنوات البوتاسيوم ذات الجهد الكهربائي (Kv) ارتباطا وثيقا ببعض أمراض القلب الخطيرة ، مثل تلف عضلة القلب الناجم عن الأدوية واحتشاء عضلة القلب. في الدراسة الحالية ، تم استخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة لتحديد تأثيرات 1.5 mM 4-aminopyridine (4-AP ، مثبط قناة البوتاسيوم واسع الطيف) والأكونيتين (AC ، 25 μM ، 50 μM ، 100 μM ، و 200 μM) على تيار قناة Kv (IKv) في خلايا عضلة القلب H9c2. وجد أن 4-AP يثبط I Kv بحوالي 54٪ ، بينما أظهر التأثير المثبط للتيار المتردد على IKv اتجاها يعتمد على الجرعة (لا يوجد تأثير ل 25 ميكرومتر ، ومعدل مثبط 30٪ ل 50 ميكرومتر ، ومعدل مثبط 46٪ ل 100 ميكرومتر ومعدل تثبيط 54٪ ل 200 ميكرومتر). نظرا لخصائص الحساسية والدقة العالية ، ستعزز هذه التقنية استكشاف السمية القلبية والتأثيرات الدوائية للطب العرقي الذي يستهدف القنوات الأيونية.

Introduction

القنوات الأيونية هي بروتينات متكاملة خاصة مضمنة في الطبقة المزدوجة الدهنية لغشاء الخلية. في وجود المنشطات ، تشكل مراكز هذه البروتينات المتكاملة الخاصة مسام انتقائية للغاية محبة للماء ، مما يسمح للأيونات ذات الحجم والشحنة المناسبين بالمرور بطريقة نقل سلبية1. القنوات الأيونية هي أساس استثارة الخلية والكهرباء الحيوية وتلعب دورا رئيسيا في مجموعة متنوعة من الأنشطة الخلوية2. يمد القلب الأعضاء الأخرى بالدم من خلال الانقباضات المنتظمة الناتجة عن عملية اقتران الإثارة والانقباض التي بدأتها جهود الفعل3. أكدت الدراسات السابقة أن توليد إمكانات الفعل في خلايا عضلة القلب ناتج عن التغير في تركيز الأيونات داخل الخلايا ، وأن تنشيط وتعطيل قنوات Na + و Ca2 + و K + أيون في خلايا عضلة القلب البشرية يؤدي إلى تكوين إمكانات الفعل في تسلسل معين4،5،6. يمكن لتيارات قناة البوتاسيوم المضطربة ذات الجهد الكهربائي (Kv) أن تغير إيقاع القلب الطبيعي ، مما يؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب ، والذي يعد أحد الأسباب الرئيسية للوفاة. لذلك ، يعد تسجيل IKv أمرا بالغ الأهمية لفهم آليات الأدوية لعلاج عدم انتظام ضربات القلب الذي يهدد الحياة7.

قناة Kv هي عنصر مهم في قناة البوتاسيوم. تلعب وظيفة التنسيق لقناة Kv دورا مهما في النشاط الكهربائي وانقباض عضلة القلب لقلب الثدييات8،9،10. في خلايا عضلة القلب ، تعتمد سعة ومدة إمكانات الفعل على التوصيل المشترك لتيارات K + الخارجية بواسطة أنواع فرعية متعددة من قنوات Kv11. يعد تنظيم وظيفة قناة Kv مهما جدا لإعادة الاستقطاب الطبيعي لإمكانات عمل القلب. حتى أدنى تغيير في توصيل Kv يؤثر بشكل كبير على إعادة استقطاب القلب ويزيد من احتمال عدم انتظام ضربات القلب12,13.

تمثل طريقة أساسية في أبحاث الفيزيولوجيا الكهربية الخلوية ، يمكن إنشاء ختم عالي المقاومة بين منطقة صغيرة من غشاء الخلية وطرف ماصة لتسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة عن طريق تطبيق ضغط سلبي. الضغط السلبي المستمر يجعل غشاء الخلية يتلامس مع طرف الماصة ويلتصق بالجدار الداخلي للماصة. تسمح الدائرة الكهربائية الكاملة الناتجة للمرء بتسجيل أي تيار قناة أيونية واحدة عبر سطح غشاء الخلية14. تتمتع هذه التقنية بحساسية عالية جدا لتيار القناة الأيونية لغشاء الخلية ويمكن استخدامها للكشف عن التيارات في جميع القنوات الأيونية ، والتطبيقات واسعة للغاية15. علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع وضع العلامات الفلورية ووضع العلامات المشعة ، يتمتع مشبك التصحيح بسلطة ودقة أعلى16. في الوقت الحاضر ، تم استخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة للكشف عن مكونات الطب الصيني التقليدي التي تعمل على تيارات قناة Kv17،18،19. على سبيل المثال ، استخدم Wang et al. تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة وأكد أن المكون الفعال لبذور اللوتس قد يحقق تثبيط قناة Kv4.3 عن طريق منع قنوات الحالة المنشطة19. الأكونيتين (AC) هو أحد المكونات الفعالة والنشطة لأنواع الأكونيتوم ، مثل Aconitum carmichaeli Debx و Aconitum pendulum Busch. أظهرت العديد من الدراسات أن الجرعات الزائدة من التيار المتردد يمكن أن تسبب عدم انتظام ضربات القلب وحتى السكتة القلبية20. يؤدي التفاعل بين التيار المتردد والقنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي إلى تعطيل التوازن الأيوني داخل الخلايا ، وهو الآلية الرئيسية للسمية القلبية21. لذلك ، في هذه الدراسة ، يتم استخدام تقنية المشبك التصحيح للخلية الكاملة لتحديد آثار AC على IKv من خلايا عضلة القلب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تحضين خلايا عضلة القلب للفئران H9c2 التي تم الحصول عليها تجاريا (انظر جدول المواد) في DMEM التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS) و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2. ثم تم استخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة للكشف عن التغييرات في IKv في خلايا H9c2 العادية والخلايا المعالجة ب 4-AP أو AC (الشكل 1 والشكل 2).

1. إعداد الحل

  1. تحضير وسط زراعة الخلايا DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (انظر جدول المواد).
  2. قم بإعداد محلول 1.5 M 4-AP بإضافة 14.1165 مجم من 4-AP إلى 100 ميكرولتر من محلول DMSO (انظر جدول المواد). قم بتخفيف 1.5 M 4-AP إلى 1.5 mM عن طريق إضافة المحلول خارج الخلية (الخطوة 1.5).
  3. قم بإعداد 400 مللي متر تيار متردد بإضافة 5 مجم من التيار المتردد إلى 19.36 ميكرولتر من محلول DMSO (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تم تخزين جميع المحاليل المذكورة أعلاه في ثلاجة 4 درجات مئوية ، ويجب ألا يتجاوز التركيز النهائي ل DMSO 0.1٪ (v / v).
  4. تحضير 50 مل من محلول داخل الخلايا عن طريق إضافة 0.4100 جم من KCl (110.0 mM) ، 0.0120 جم من MgCl 2 (1.2 mM) ، 0.1270 جم من Na2 ATP (5.0 mM) ، 0.1190 جم من HEPES (10.0 mM) ، و 0.1900 جم من EGTA (10.0 mM) في 50 مل من الماء المقطر المزدوج (انظر الجدول 1 وجدول المواد).
    ملاحظة: تم تعديل قيمة الأس الهيدروجيني للمحلول داخل الخلايا إلى 7.2 باستخدام 1 M KOH وتم اقتباسها إلى أحجام صغيرة (1.5-2 مل) وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  5. تحضير 50 مل من محلول خارج الخلية بإضافة 0.0185 جم من KCl (5.0 mM) ، 0.3945 g من NaCl (135.0 mM) ، 0.0203 g من MgCl 2 · 6H2O (2.0 mM) ، 0.0595 g من HEPES (5.0 mM) ، و 0.0990 g من D-glucose (10.0 mM) في 50 mL من الماء المقطر المزدوج (انظر الجدول 1 وجدول المواد).
    ملاحظة: يجب تحضير المحلول خارج الخلية للاستخدام الفوري ، ويجب تعديل قيمة الأس الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1 M NaOH.

2. ثقافة الخلية

  1. بمجرد أن يصبح طبق الاستزراع H9c2 متقاربا بنسبة 80٪ ، اهضم الخلايا التي تحتوي على 0.25٪ تربسين لمدة 30 ثانية.
  2. مزرعة 2 × 10 5 خلايا / مل مع وسط عادي أو وسط يحتوي على دواء (25 ميكرومتر ، 50 ميكرومتر ، 100 ميكرومتر ، و 200 ميكرومتر تيار متردد) في طبق 35 مم مغطى بالسجاد بألواح زجاجية لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، مع جو5 ٪ CO2 ورطوبة نسبية 70٪ إلى 80٪ (انظر جدول المواد).

3. تصنيع الماصات الدقيقة

  1. قم بتشغيل مجتذب الماصة الدقيقة (انظر جدول المواد) ، وقم بالتسخين لمدة 30 دقيقة.
  2. ضع شعرية زجاجية من البورسليكات مع خيوط (OD: 1.5 مم ، ID: 1.10 مم ، طول 10 سم) على مجتذب micropipette. حدد البرنامج الذي تم تعيينه في الخطوة 3.3 ، وانقر فوق Enter في لوحة التحكم. انقر فوق برنامج المنحدر في الزاوية العلوية اليمنى لتحديد قيمة "الحرارة" للشعيرات الدموية الزجاجية.
  3. اكتب البرنامج لسحب القطب وفقا للقيمة التي يحددها اختبار "المنحدر" ، واستخدم الخطوات التالية: قيمة "الحرارة" = قيمة "المنحدر" ، السحب = 0 ، Vel = سرعة تحريك قضيب السحب ، الوقت = 200-250. انقر فوق سحب لبدء تصنيع الماصات.
    ملاحظة: لاحظ لون المجففات في الحاوية محكمة الغلق لمجتذب الماصة الدقيقة قبل استخدامها. إذا تغير اللون من الأزرق إلى الوردي ، فيجب استبدال المجففات. لمنع تلوث طرف القطب ، حاول ألا تلمس الجزء الأوسط من الشعيرات الدموية الزجاجية أثناء تحضير الماصة. بعد ذلك ، قم بإزالة الماصات المنتجة بعناية ، وضعها في حاوية مغلقة ومختومة.

4. إعداد الصك

  1. قم بتشغيل الأدوات المقابلة بالترتيب التالي: المحول الرقمي التناظري ، ومضخم الإشارة ، والمعالج الدقيق ، والمجهر ، والكاميرا (انظر جدول المواد).
  2. افتح تطبيق التصوير وبرنامج مضخم الإشارة وبرنامج الحصول على البيانات بالتسلسل (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يجب تشغيل الأداة بالتتابع. خلاف ذلك ، ستظهر حالة "Demo Digitizer" بعد فتح البرنامج.

5. إعداد معلمة IKv

  1. قم بتحرير بروتوكول تسجيل IKv باتباع الخطوات أدناه.
    1. انقر فوق تحرير ، وحدد تحرير البروتوكول في برنامج الحصول على البيانات (انظر جدول المواد).
    2. قم بتحرير البرنامج في واجهة "Waveform": Epoch A (المستوى الأول = -60 mV ، مستوى دلتا = 0 mV ، المدة الأولى = 20 مللي ثانية ، ومدة Delta = 0 مللي ثانية) ؛ الحقبة B (المستوى الأول = -40 مللي فولت ، مستوى دلتا = 10 مللي فولت ، المدة الأولى = 150 مللي ثانية ، ومدة دلتا = 0 مللي ثانية) ، والحقبة C (المستوى الأول = -60 مللي فولت ، مستوى دلتا = 0 مللي فولت ، المدة الأولى = 30 مللي ثانية ، ومدة دلتا = 0 مللي ثانية).
    3. ثم ، انقر فوق واجهة الوضع / المعدل ، وقم بتعيين بيانات "التسلسل الهرمي للمحاكمة": تأخير المحاكمة = 0 ثانية ، والتشغيل = 1 ، وعمليات المسح = 11 ، ومدة الاجتياح = 0.22 ثانية22,23.
      ملاحظة: الحصول على تيارات قناة IKv من خلال تطبيق خطوات إزالة استقطاب 150 مللي ثانية من -40 مللي فولت إلى +60 مللي فولت مع زيادة قدرها 10 مللي فولت عند إمكانية الاحتفاظ بها −60 مللي فولت في ظل ظروف التحكم. يجب أن يكون الوقت الإجمالي للبروتوكول أكبر من الوقت المحدد في برنامج "Waveform".
  2. قم بتحرير برنامج طرح تسرب P / N: انقر فوق تحرير البروتوكول لتحديد زر التحفيز ، وقم بتعيين برنامج طرح التسرب في مربع حوار طرح التسرب P / N : عدد عمليات المسح الفرعية = 2-8 (4 في هذه الدراسة) ، وقت الاستقرار = 100-1000 مللي ثانية (200 في هذه الدراسة) ، "القطبية" = "عكس شكل الموجة" ، مستوى الاحتفاظ = -80 مللي فولت.
    ملاحظة: يجب أن يكون لطرح تسرب P / N مستوى تثبيت أقل من "التثبيت الأول" (-60 مللي فولت).

6. تسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة ل I Kv في وضع مشبك الجهد

  1. إنشاء مسار تخزين البيانات: انقر فوق ملف ، وحدد تعيين أسماء ملفات البيانات في برنامج الحصول على البيانات. افتح بروتوكول IKv الذي تم إنشاؤه (الخطوة 5.1) عن طريق تحديد تحرير والنقر فوق فتح بروتوكول في برنامج الحصول على البيانات. أخيرا ، انقر فوق خيار الأدوات ، وحدد اختبار الغشاء لبدء تشغيل البروتوكول.
  2. أضف المحلول خارج الخلية (الخطوة 1.5) إلى حمام الخلية على جهاز مشبك التصحيح للخلية الكاملة (انظر جدول المواد) ، وضع الغطاء لأعلى مع خلايا H9c2 (المزروعة في الخطوة 2.1) في الحمام.
  3. املأ 30٪ من الماصة (المصنعة في الخطوة 3) بالمحلول خارج الخلية ، وقم بتثبيته على حامل قطب التسجيل المدمج في جهاز مشبك التصحيح. شد الماصة باستخدام حشية مطاطية دائرية وغسالة بلاستيكية. ثم ، قم بإسقاط ماصة في الحمام مع micromanipulator. انقر فوق واجهة إزاحة الماصة لبرنامج مضخم الإشارة (انظر جدول المواد) للحفاظ على خط الأساس الحالي IKv عند 0 pA.
    ملاحظة: يجب أن يكون المحلول داخل الخلايا (الخطوة 1.4) ملامسا لجزء AgCl / Ag من السلك الفضي ، ويجب ألا يكون السلك الفضي قريبا من الجدار الداخلي للماصة. يجب أن تكون مقاومة الماصة 2-6 MΩ. لتجنب انسداد طرف الماصة ، يجب توصيل ضغط إيجابي مستمر إلى الماصة باستخدام حقنة سعة 1.0 مل متصلة بحامل قطب التسجيل عبر أنبوب بلاستيكي24.
  4. قم بتوصيل ضغط إيجابي مناسب يدويا باستخدام محقنة سعة 1.0 مل متصلة بحامل قطب التسجيل من خلال أنبوب بلاستيكي. حرك الماصة قليلا عن طريق معالجة المناور الدقيق في ثلاثة أبعاد للاتصال بالخلية.
  5. بمجرد أن تنخفض الموجة المربعة لاختبار الغشاء بمقدار 1/3 إلى 1/2 بعد أن تلمس الماصة غشاء الخلية ، قم بإزالة الضغط الإيجابي ، وقم بتوصيل ضغط سلبي مناسب يدويا. ثم ، انقر فوق واجهة التصحيح لبرنامج الحصول على البيانات لتشكيل ختم GΩ. استخدم برنامج مضخم الإشارة "C p Fast" و "Cp Slow" أثناء ختم الخلية للتعويض عن السعة السريعة والبطيئة.
    ملاحظة: عندما يكون اختبار الغشاء ≥1 GΩ ، يتم تشكيل تكوين متصل بالخلية بين طرف الماصة والخلية.
  6. ضع نبضات قصيرة من الضغط السلبي لتمزيق رقعة من غشاء الخلية.
    ملاحظة: الانخفاض الحاد في مقاومة الغشاء يميز نمط تسجيل الخلية الكاملة الناجح. إذا كانت مقاومة الوصول (Ra) ≥30 MΩ ، فيجب إعادة تحديد الخلايا للخطوات 6.3-6.6. من أجل ضمان دقة بيانات IKv المسجلة ، يجب إزالة الضغط السلبي بعد كسر غشاء الخلية.
  7. قم بتنفيذ تعويض سعة غشاء الخلية الكاملة بالنقر فوق زر الخلية الكاملة لبرنامج مضخم الإشارة. أخيرا ، احفظ البيانات وسجلها بالنقر فوق زر تسجيل البيانات .
  8. افتح بيانات IKv المحفوظة باستخدام برنامج تحليل البيانات. احفظ علاقات الجهد الحالي (I−V): انقر فوق تحليل لتحديد إحصائيات للقيام بما يلي: حدد النطاق ك Cousors 1,2 لتحليل البيانات ؛ انقر فوق الزرين Peak Amplitude و Mean ، ثم انقر فوق "موافق " لعرض البيانات في صفحة النتائج . أخيرا ، انسخ عمود بيانات IKv mean في برنامج رسم الوظائف (انظر جدول المواد) لمزيد من التحليل.
  9. احفظ آثار IKv الحالية التمثيلية: انقر فوق تحرير لتحديد نقل الآثار ؛ ثم حدد ملف تتبع كامل في المنطقة المراد نقله; بعد ذلك ، انقر فوق تحديد في تحديد التتبع ، وحدد IN 0 (pA) في الإشارات ؛ أخيرا ، انقر فوق "موافق" لعرض البيانات في صفحة "النتائج " ، وانسخ إجمالي البيانات إلى برنامج رسم الوظائف لرسم الآثار الحالية.
  10. احفظ بروتوكول IKv : انقر فوق تحرير لتحديد إنشاء إشارة شكل موجة التحفيز ، وحدد موافق. بعد ذلك ، أعد الخطوة 6.9 باستثناء تحديد A0 # 0 (مللي أمبير) في "الإشارات".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

سمح هذا البروتوكول بتسجيل IKv وفقا للمعايير المحددة في تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة. تم تشغيل IKv بواسطة 150 مللي ثانية من تحفيز النبض غير المستقطب من -40 إلى +60 مللي فولت عند إمكانية الاحتفاظ ب -60 مللي فولت (الشكل 3 أ). ظهر IKv لخلايا عضلة القلب للفئران H9c2 لأول مرة حوالي -20 مللي فولت ، ثم زادت السعة مع مزيد من إزالة الاستقطاب. تم حساب متوسط العلاقة بين IKv وجهد الغشاء من السعات الحالية المقاسة. أظهرت النتائج أنه بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، تم تقليل سعة IKv بشكل ملحوظ بعد العلاج لمدة 5 دقائق مع 1.5 mM 4-AP (الشكل 3B). بالإضافة إلى ذلك ، انخفض IKv بشكل ملحوظ عند إمكانات الغشاء من 10 mV إلى 60 mV بطريقة تعتمد على الجرعة بعد معالجة AC لمدة 24 ساعة (الشكل 3C-F).

Figure 1
الشكل 1: المعدات والأدوات اللازمة لتسجيل IKv. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: مخطط انسيابي للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي ل IKv في خلايا H9c2 باستخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة. أ: زراعة الخلايا. ب: تحضير المحاليل داخل الخلايا وخارجها. (ج) رسم تخطيطي لتسجيل الخلية بأكملها. C1: حرك الماصة بالقرب من الخلية ؛ C2: تشكيل ختم مقاومة عالية بين ماصة والخلية ؛ C3: تمزق غشاء الخلية. (د) سجل IKv. D1: رسم تخطيطي لتشكيل K + الحالي ؛ D2: آثار التيار التمثيلي ل IKv المسجلة في وضع مشبك الجهد للخلية الكاملة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: الممثل IKv في خلايا H9c2. (A) آثار التيار التمثيلي ل IKv المقاسة في خلايا H9c2 دون أي معالجة (مجموعة التحكم) ، مع وسائط تحتوي على AC لمدة 24 ساعة (25 ميكرومتر ، 50 ميكرومتر ، 100 ميكرومتر و 200 ميكرومتر) ، ومع 1.5 مللي متر 4-AP لمدة 5 دقائق. تم تشغيل IKv بواسطة 150 مللي ثانية من نبضة إزالة الاستقطاب من -40 إلى +60 مللي فولت عند إمكانية الاحتفاظ ب -60 مللي فولت. (ب) لتحفيز 1.5 mM 4-AP ، نزل IKv عند جهد الغشاء من 10 mV إلى 60 mV. (ج-و) خفضت معالجة التيار المتردد IKv بطريقة تعتمد على التركيز عند إمكانات الغشاء من 10 مللي فولت إلى 60 مللي فولت. * p < 0.05 مقابل المجموعة الضابطة (n = 6). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

حل خارج الخلية
المواد الكيميائيه جم / 50 مل التركيب (مللي متر)
كلوريد الصوديوم 0.3945 135.0
ككل 0.1865 5.0
هيبس 0.5958 5.0
MgCl 2 · 6H2O 0.2033 2.0
د-الجلوكوز 0.9900 10.0
حل داخل الخلايا
المواد الكيميائيه جم / 50 مل التركيب (مللي متر)
ككل 0.4100 110.0
مغكل2 0.0120 1.2
Na2-ATP 0.1270 5.0
هيبس 0.1190 10.0
ايجتا 0.1900 10.0

الجدول 1: حلول داخل الخلايا وخارجها لتسجيل IKv في وضع مشبك الجهد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تستخدم تقنية الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح بشكل أساسي لتسجيل وعكس النشاط الكهربائي والخصائص الوظيفية للقنوات الأيونية على غشاء الخلية25. في الوقت الحاضر ، تشمل طرق التسجيل الرئيسية لتقنية مشبك التصحيح التسجيل أحادي القناة وتسجيل الخلية بأكملها26. بالنسبة لوضع الخلية الكاملة ، يتم استخدام القطب الزجاجي الدقيق والضغط السلبي لتشكيل ختم عالي المقاومة بين مساحة صغيرة من غشاء الخلية وطرف ماصة27. بمجرد أن يتسبب الضغط السلبي المستمر في تمزق طرف الماصة لغشاء الخلية ويتصل الغشاء بالجدار الداخلي للماصة ، فإن الدائرة الكهربائية الكاملة المتكونة بين الماصة والخلية تسمح بتسجيل الكثافة الحالية للقنوات الأيونية الفردية على سطح غشاء الخلية26,27 . في السنوات الأخيرة ، تم استخدام تقنية المشبك التصحيحي للخلية الكاملة على نطاق واسع لأبحاث الأدوية التي تستهدف الأمراض المرتبطة بالقناة الأيونية. على الرغم من أن لديها متطلبات عالية للمشغلين ، إلا أن هذه التقنية لا تزال "المعيار الذهبي" لأبحاث القنوات الأيونية28. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لتقنية المشبك المثقوب أيضا تسجيل التغيرات الحالية في القنوات الأيونية المستهدفة في البيئات داخل الخلايا المستقرة نسبيا على مدى فترات طويلة باستخدام المضادات الحيوية لتشكيل مسام نفاذية في غشاء الخلية29,30. يمكن للمرء تسجيل وتتبع التغيرات الديناميكية في الجهد أو التيار للقنوات الأيونية باستخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة في وضع المشبك الحالي أو مشبك الجهد ، مما يجعل هذا بلا شك منصة قوية لتقييم النشاط الدوائي أو آليات السمية للأدوية31,32.

AC هو أحد المكونات السامة الرئيسية لأنواع Aconitum ، وينتمي إلى مجموعة قلويدات dister-diterpenoid ، وهو شديد السمية 20,33. أشارت الأدلة إلى أن AC يمكن أن يسبب سمية القلب والأوعية الدموية34,35. كمانع قناة K + غير انتقائي ، تم الإبلاغ عن أن التيار المتردد يمكن أن يمنع تيار K + الخارجي العابر ، والمعدل المتأخر فائق السرعة K + الحالي ، والمعدل المتأخر السريع إلى الخارج K + الحالي ، مما يؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب21،36،37. حتى الآن ، لا يوجد دليل قوي على أن تيارات البوتاسيوم المعتمدة على الجهد تشارك في السمية القلبية للتيار المتردد. لذلك ، في هذه الدراسة ، تم فحص التأثير المثبط للتيار المتردد على IKv في خلايا عضلة القلب H9c2 الفئران باستخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة. تنشيط قنوات Na + هو آلية معترف بها على نطاق واسع يمارس بها AC تأثيرات دوائية أو سمية38. ومن المثير للاهتمام ، أن هناك أدلة على أن التيار المتردد يمكن أن يعمل مباشرة على IKv21،36،37. ومع ذلك ، فإن البيانات المقدمة في هذه الورقة لا تقدم أدلة كافية على أن التيار المتردد يمكن أن يثبط بشكل مباشر IKv. قد يكون التأثير المثبط ل IKv للتيار المتردد ناتجا عن التنشيط المباشر لقنوات Na + ، الأمر الذي يتطلب مزيدا من التحقيق.

منذ نشأتها وتطورها ، أصبحت تقنية المشبك التصحيحي للخلية الكاملة المستخدمة في هذه الدراسة طريقة تقليدية لاستكشاف السمية القلبية للأدوية من حيث القنوات الأيونية. أكدت هذه التجربة أن التيار المتردد يثبط بشكل فعال IKv لخلايا H9c2 بطريقة تعتمد على التركيز في وضع مشبك الجهد. ومع ذلك ، يحتوي كل نوع من أنواع القنوات الأيونية ، بما في ذلك قنوات K + ، على عدة أنواع فرعية ، وتم تسجيل تيار قناة K + المعتمد على الجهد فقط في هذه الدراسة. يمكن للدراسات اللاحقة استكشاف الآليات الدوائية والسمية للتيار المتردد عن طريق خطوط الخلايا النموذجية مع تعبير عال عن أنواع فرعية محددة من القنوات الأيونية37. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء دمج قنوات أيونية محددة موسومة ببروتينات الفلورسنت للتحقيق في سمية عضلة القلب للتيار المتردد بصريا39. الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي الخطوات 6.4-6.6 ؛ يؤدي إكمال هذه الخطوات الثلاث مباشرة إلى تحديد ما إذا كان التسجيل اللاحق ل IKv ناجحا أم لا. بالمقارنة مع التقنيات الأخرى ، فإن تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة هي المعيار الذهبي والطريقة المقبولة لتسجيل التيار في قنوات أيونية مفردة في غشاء الخلية أو غشاء العضيات ، مع خصائص المتطلبات التقنية العالية وتسجيلالإنتاجية المنخفضة 40. باختصار ، هذه التقنية ليست فقط طريقة أساسية لأبحاث الفيزيولوجيا الكهربية للخلايا ولكنها تستخدم أيضا على نطاق واسع في علم الأعصاب وعلوم القلب والأوعية الدموية وغيرها من المجالات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نحن نقدر الدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82130113) وبرنامج البحث والتطوير والتحول الرئيسي التابع لإدارة العلوم والتكنولوجيا بمقاطعة تشينغهاي (2020-SF-C33).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
  3. Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
  4. Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
  5. Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
  6. Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
  8. Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
  9. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  10. Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
  11. Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
  12. Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
  13. Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 6 Suppl 42-46 (2007).
  14. Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
  15. Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
  16. Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
  17. Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
  18. Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
  19. Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
  20. Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
  21. Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
  22. An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
  23. Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
  24. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
  25. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
  26. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  27. Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
  28. Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
  29. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  30. Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
  31. Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
  32. Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
  33. Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  34. Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
  35. Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
  36. Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , Shenyang, China. Master's thesis (2007).
  37. Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
  38. Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
  39. Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
  40. Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).

Tags

الطب ، العدد 189 ،
تسجيل تيار البوتاسيوم المعتمد على الجهد على خلايا عضلة القلب H9c2 <em>عبر</em> تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li,… More

Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter