Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Spenningsavhengig kaliumstrømregistrering på H9c2-kardiomyocytter via helcelleplaster-klemmeteknikken

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64805
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3,4, 5, 1,3,4, 4
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver en effektiv metode for sanntids og dynamisk oppkjøp av spenningsstyrte kalium (Kv) kanalstrømmer i H9c2 kardiomyocytter ved bruk av helcellepatch-klemmeteknikken.

Abstract

Kaliumkanaler på myokardcellemembranen spiller en viktig rolle i reguleringen av celleelektrofysiologiske aktiviteter. Å være en av de viktigste ionkanalene, er spenningsstyrte kaliumkanaler (Kv) nært forbundet med noen alvorlige hjertesykdommer, for eksempel legemiddelindusert myokardskade og hjerteinfarkt. I denne studien ble helcellepatchklemmeteknikken brukt for å bestemme effekten av 1,5 mM 4-aminopyridin (4-AP, en bredspektret kaliumkanalhemmer) og akonitin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM og 200 μM) på Kv-kanalstrømmen (IKv) i H9c2 kardiomyocytter. Det ble funnet at 4-AP hemmet I Kv med ca. 54%, mens den hemmende effekten av AC på IKv viste en doseavhengig trend (ingen effekt for 25 μM, 30% hemmende rate for 50 μM, 46% hemmende rate for 100 μM og 54% hemmende rate for 200 μM). På grunn av egenskapene til høyere følsomhet og presisjon, vil denne teknikken fremme utforskningen av kardiotoksisitet og de farmakologiske effektene av etnomedisinmålrettede ionkanaler.

Introduction

Ionkanaler er spesielle integrerte proteiner innebygd i lipid dobbeltlaget av cellemembranen. I nærvær av aktivatorer danner sentrene til slike spesielle integrerte proteiner svært selektive hydrofile porer, slik at ioner av passende størrelse og ladning kan passere gjennom på en passiv transportmåte1. Ionekanaler er grunnlaget for celle excitability og bioelektrisitet og spiller en nøkkelrolle i en rekke cellulære aktiviteter2. Hjertet leverer blod til andre organer gjennom regelmessige sammentrekninger som følge av en eksitasjonskontraksjonskoblet prosess initiert av handlingspotensialer3. Tidligere studier har bekreftet at genereringen av aksjonspotensialer i kardiomyocytter er forårsaket av endringen i intracellulær ionkonsentrasjon, og aktivering og inaktivering av Na+, Ca2+ og K+ ionkanaler i humane kardiomyocytter fører til dannelse av aksjonspotensialer i en bestemt sekvens 4,5,6. Forstyrret spenningsstyrt kalium (Kv) kanalstrømmer (IKv) kan endre normal hjerterytme, noe som fører til arytmier, som er en av de viktigste dødsårsakene. Derfor er registrering av IKv avgjørende for å forstå mekanismene til legemidler for behandling av livstruende arytmier7.

Kv-kanalen er en viktig komponent i kaliumkanalen. Koordinasjonsfunksjonen til Kv-kanalen spiller en viktig rolle i den elektriske aktiviteten og myokardial kontraktiliteten til pattedyrhjertet 8,9,10. I kardiomyocytter avhenger amplituden og varigheten av aksjonspotensialer av samledning av utgående K+-strømmer av flere Kv-kanalundertyper11. Reguleringen av Kv-kanalfunksjonen er svært viktig for normal repolarisering av hjertets aksjonspotensial. Selv den minste endringen i Kv-konduktans påvirker i stor grad hjerterepolarisering og øker muligheten for arytmi12,13.

Representerer en grunnleggende metode i cellulær elektrofysiologisk forskning, kan en høybestandig tetning mellom et lite område av cellemembranen og en pipettespiss for helcelle patch-klemmeopptak etableres ved å påføre et negativt trykk. Det kontinuerlige negative trykket gjør at cellemembranen kommer i kontakt med pipettespissen og fester seg på pipettens indre vegg. Den resulterende komplette elektriske kretsen gjør det mulig å registrere en hvilken som helst enkelt ionkanalstrøm over overflaten av cellemembranen14. Denne teknikken har en meget høy følsomhet for cellemembranionekanalstrømmen og kan brukes til å oppdage strømmer i alle ionkanaler, og applikasjonene er ekstremt brede15. Videre, sammenlignet med fluorescerende merking og radioaktiv merking, har patch-klemme høyere autoritet og nøyaktighet16. For tiden har helcellepatch-klemmeteknikken blitt brukt til å oppdage de tradisjonelle kinesiske medisinkomponentene som virker på Kv-kanalstrømmer17,18,19. For eksempel brukte Wang og medarbeidere helcellepatch-klemmeteknikken og bekreftet at den effektive komponenten av lotusfrøet kunne oppnå hemming av Kv4.3-kanalen ved å blokkere de aktiverte tilstandskanalene19. Akonitin (AC) er en av de effektive og aktive ingrediensene i Aconitum arter, som Aconitum carmichaeli Debx og Aconitum pendel Busch. Tallrike studier har vist at overdoser av AC kan forårsake arytmier og til og med hjertestans20. Samspillet mellom vekselstrøm og spenningsstyrte ionkanaler fører til forstyrrelse av intracellulær ionhomeostase, som er nøkkelmekanismen for kardiotoksisitet21. Derfor, i denne studien, brukes helcellepatch-klemmeteknikken til å bestemme effekten av AC på IKv av kardiomyocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De kommersielt oppnådde H9c2-rottekardiomyocytter (se materialtabellen) ble inkubert i DMEM som inneholdt 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet atmosfære. Helcellepatchklemmeteknikken ble deretter brukt for å oppdage endringene iI Kv i normale H9c2-celler og 4-AP- eller AC-behandlede celler (figur 1 og figur 2).

1. Oppløsning forberedelse

  1. Forbered DMEM-cellekulturmediet som inneholder 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (se materialtabell).
  2. Klargjør 1,5 M 4-AP oppløsning ved å tilsette 14,1165 mg 4-AP til 100 μL DMSO oppløsning (se tabell over materialer). Fortynn 1,5 M 4-AP til 1,5 mM ved å tilsette den ekstracellulære løsningen (trinn 1,5).
  3. Tilbered 400 mM AC ved å tilsette 5 mg AC til 19,36 μL DMSO-oppløsning (se materialtabell).
    MERK: Alle de ovennevnte oppløsningene ble oppbevart i et kjøleskap på 4 °C, og den endelige konsentrasjonen av DMSO må ikke overstige 0,1 % (v/v).
  4. Klargjør 50 ml intracellulær oppløsning ved å tilsette 0,4100 g KCl (110,0 mM), 0,0120 g MgCl 2 (1,2 mM), 0,1270 g Na2 ATP (5,0 mM), 0,1190 g HEPES (10,0 mM) og 0,1900 g EGTA (10,0 mM) i 50 ml dobbeltdestillert vann (se tabell 1 og materialtabell).
    MERK: pH-verdien til den intracellulære oppløsningen ble justert til 7,2 ved bruk av 1 M KOH og ble aliquoted i små volumer (1,5-2 ml) og lagret ved -20 ° C.
  5. Tilbered 50 ml ekstracellulær oppløsning ved å tilsette 0,0185 g KCl (5,0 mM), 0,3945 g NaCl (135,0 mM), 0,0203 g MgCl 2·6H2O (2,0 mM), 0,0595 g HEPES (5,0 mM) og 0,0990 g D-glukose (10,0 mM) i 50 ml dobbeltdestillert vann (se tabell 1 og materialtabell).
    MERK: Den ekstracellulære oppløsningen må klargjøres for umiddelbar bruk, og pH-verdien må justeres til 7,4 ved bruk av 1 M NaOH.

2. Cellekultur

  1. Når H9c2-kulturskålen blir 80% sammenflytende, fordøyer cellene med 0,25% trypsin i 30 s.
  2. Kultur 2 x 105 celler/ml med normalt medium eller legemiddelholdig medium (25 μM, 50 μM, 100 μM og 200 μM AC) i en 35 mm tallerken teppebelagt med glassplater i 24 timer ved 37 °C, med 5 % CO2 atmosfære og 70 % til 80 % relativ fuktighet (se tabell over materialer).

3. Fremstilling av mikropipetter

  1. Slå på mikropipettetrekkeren (se Materialtabell), og forvarm i 30 min.
  2. Sett en borosilikatglasskapillær med filament (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm lengde) på mikropipettetrekkeren. Velg programsettet i trinn 3.3, og klikk på Enter på kontrollpanelet. Klikk på rampeprogrammet øverst til høyre for å bestemme "Varme" -verdien til glasskapillæren.
  3. Skriv programmet for å trekke elektroden i henhold til verdien bestemt av "Ramp" -testen, og bruk følgende trinn: "Varme" -verdi = "Ramp" -verdi, Trekk = 0, Vel = trekkstangbevegelseshastighet, Tid = 200-250. Klikk på Trekk for å begynne å produsere pipettene.
    MERK: Vær oppmerksom på fargen på tørkemidlene i den forseglede beholderen til mikropipettetrekkeren før du bruker den. Hvis fargen endres fra blå til rosa, må tørkemidlene byttes ut. For å forhindre forurensning av elektrodespissen, prøv å ikke berøre den midterste delen av glasskapillæren under pipettpreparasjonen. Deretter fjerner du forsiktig de produserte pipettene, og plasserer dem i en lukket og forseglet beholder.

4. Oppsett av instrument

  1. Slå på de tilsvarende instrumentene i følgende rekkefølge: den digital-analoge omformeren, signalforsterkeren, mikromanipulatoren, mikroskopet og kameraet (se materialtabell).
  2. Åpne bildebehandlingsprogrammet, signalforsterkerprogramvaren og datainnsamlingsprogramvaren i rekkefølge (se Materialtabell).
    MERK: Instrumentet må slås på sekvensielt; Ellers vises tilstanden "Demo Digitizer" etter at du har åpnet programvaren.

5.I Kv parameterinnstilling

  1. Rediger protokollen for opptak av IKv ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Klikk på Rediger, og velg Rediger protokoll i datainnsamlingsprogramvaren (se Materialtabell).
    2. Rediger programmet i "Waveform" -grensesnittet: Epoch A (Første nivå = −60 mV, Delta-nivå = 0 mV, Første varighet = 20 ms og Delta-varighet = 0 ms); Epoch B (Første nivå = −40 mV, Delta-nivå = 10 mV, Første varighet = 150 ms og Delta-varighet = 0 ms) og Epoch C (Første nivå = −60 mV, Delta-nivå = 0 mV, Første varighet = 30 ms og Delta-varighet = 0 ms).
    3. Klikk deretter på Mode / Rate-grensesnittet, og angi "Trial Hierarchy" -dataene: Trial delay = 0 s, Runs = 1, Sweeps = 11 og Sweep duration = 0.22 s22,23.
      MERK: Oppnå I Kv-kanalstrømmene ved å bruke 150 ms depolariserende trinn fra -40 mV til +60 mV med en økning på 10 mV ved et holdepotensial på -60 mV under kontrollforhold. Den totale tiden for protokollen må være større enn tiden som er angitt i "Waveform" -programmet.
  2. Rediger P/N Leak Subtraction-programmet: klikk på Rediger protokoll for å velge Stimulus-knappen , og still inn lekkasjesubtraksjonsprogrammet i dialogboksen P/N Leak Subtraksjon : antall Subsweeps = 2-8 (4 i denne studien), Sedimenteringstid = 100-1,000 ms (200 i denne studien), "Polaritet" = "Motsatt bølgeform", holdenivå = −80 mV.
    MERK: P/N-lekkasje-subtraksjonen må ha et holdenivå som er lavere enn "First holding" (−60 mV).

6. Helcelle patch-klemme opptak av I Kv i spenningsklemmemodus

  1. Etabler datalagringsbanen: Klikk på Fil, og velg Angi datafilnavn i datainnsamlingsprogramvaren. Åpne den etablerte IKv-protokollen (trinn 5.1) ved å velge Rediger og klikke på Åpne protokoll i datainnsamlingsprogramvaren. Til slutt klikker du på Verktøy-alternativet , og velger Membrantest for å begynne å kjøre protokollen.
  2. Tilsett den ekstracellulære løsningen (trinn 1.5) i cellebadet på helcelleplastklemmeapparatet (se materialtabell), og plasser dekselet oppover med H9c2-cellene (dyrket i trinn 2.1) i badekaret.
  3. Fyll 30 % av pipetten (produsert i trinn 3) med den ekstracellulære løsningen, og installer den på opptakselektrodeholderen som er integrert i patchklemmeapparatet. Stram pipetten med o-ring gummipakningen og plastvaskemaskinen. Slipp deretter pipetten i badekaret med mikromanipulatoren. Klikk på pipetteforskjøvningsgrensesnittet til signalforsterkerprogramvaren (se materialtabell) for å opprettholde I Kv-strømlinjen ved 0 pA.
    MERK: Den intracellulære oppløsningen (trinn 1.4) må være i kontakt med AgCl/Ag-delen av sølvtråden, og sølvtråden må ikke være nær pipettens indre vegg. Pipettens motstand må være 2-6 MΩ. For å unngå okklusjon av pipettespissen, må et kontinuerlig positivt trykk tilføres pipetten ved hjelp av en 1,0 ml sprøyte koblet til opptakselektrodeholderen via plastrør24.
  4. Lever et passende overtrykk manuelt med en 1,0 ml sprøyte koblet til opptakselektrodeholderen gjennom et plastrør. Beveg pipetten litt ved å manipulere mikromanipulatoren i tre dimensjoner for å komme i kontakt med cellen.
  5. Når membrantesten firkantbølge faller med 1/3 til 1/2 etter at pipetten berører cellemembranen, fjern positivt trykk og lever manuelt et passende undertrykk. Klikk deretter på Patch-grensesnittet til datainnsamlingsprogramvaren for å danne GΩ-seglet. Bruk signalforsterkerprogramvaren "C p Fast" og "Cp Slow" under celletetning for å kompensere for den raske og langsomme kapasitansen.
    MERK: Når membrantesten er ≥1 GΩ, dannes en cellefestet konfigurasjon mellom pipettespissen og cellen.
  6. Påfør korte pulser av negativt trykk for å briste en av cellemembranen.
    MERK: En kraftig reduksjon i membranmotstanden karakteriserer et vellykket helcelleopptaksmønster. Hvis tilgangsmotstanden (Ra) ≥30 MΩ, må cellene velges på nytt for trinn 6.3-6.6. For å sikre nøyaktigheten av de registrerte IKv-dataene , må undertrykket fjernes etter at cellemembranen er ødelagt.
  7. Utfør helcellemembrankapasitanskompensasjon ved å klikke på Helcelle-knappen i signalforsterkerprogramvaren. Til slutt, lagre og registrer dataene ved å klikke på Dataregistrering knapp.
  8. Åpne de lagrede IKv-dataene med dataanalyseprogramvaren. Lagre strømspenningsrelasjonene (I−V): klikk på Analyser for å velge Statistikk for å gjøre følgende: velg Område som Cousors 1,2 for dataanalyse; klikk på knappene Peak Amplitude og Mean, og klikk deretter på OK for å se dataene på resultatsiden. Til slutt kopierer du kolonnen med I Kv-middeldata inn i funksjonstegningsprogramvaren (se Materialtabell) for videre analyse.
  9. Lagre representanten IKv gjeldende spor: klikk på Rediger for å velge Overfør spor; velg deretter Full sporing i regionen som skal overføres; klikk deretter på Velg i Sporvalg, og velg IN 0 (pA) i Signaler; til slutt klikker du på OK for å se dataene på "Resultater" -siden, og kopierer de totale dataene inn i funksjonstegningsprogramvaren for å tegne gjeldende spor.
  10. Lagre IKv-protokollen : klikk på Rediger for å velge Opprett stimulusbølgeformsignal, og velg OK. Gjør deretter om trinn 6.9 bortsett fra å velge A0 # 0 (mA) i "Signaler".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen tillot opptak av IKv i henhold til parametrene som er angitt i helcellepatch-klemmeteknikken. IKv ble utløst av 150 ms depolariserende pulsstimulus fra −40 til +60 mV ved et holdepotensial på −60 mV (figur 3A). IKv av H9c2 rottekardiomyocytter dukket først opp rundt -20 mV, og deretter økte amplituden med ytterligere depolarisering. Det gjennomsnittlige forholdet mellom IKv og membranpotensialet ble beregnet ut fra de målte strømamplitudene. Resultatene viste at sammenlignet med kontrollgruppen ble I Kv-amplituden observert redusert etter 5 minutters behandling med 1,5 mM 4-AP (figur 3B). I tillegg reduserte IKv signifikant ved membranpotensialer fra 10 mV til 60 mV på en doseavhengig måte etter 24 timers AC-behandling (figur 3C-F).

Figure 1
Figur 1: Utstyr og instrumenter som kreves for å registrere IKv. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Flytskjema for elektrofysiologisk registrering av IKv i H9c2 celler ved hjelp av en helcelle patch-klemmeteknikk. (A) Cellekultur. (B) Fremstilling av intracellulære og ekstracellulære løsninger. (C) Skjematisk illustrasjon av helcelleopptak. C1: Flytt pipetten nær cellen; C2: Lag en høy motstandsforsegling mellom pipetten og cellen; C3: Briste cellemembranen. (d) Registrer Ikv. D1: Skjematisk diagram over K + strømdannelse; D2: Representative strømspor for IKv registrert i helcellespenningsklemmemodus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representant IKv i H9c2 celler. (A) Representative strømspor for IKv målt i H9c2-celler uten behandling (kontrollgruppe), med AC-holdige medier i 24 timer (25 μM, 50 μM, 100 μM og 200 μM), og med 1,5 mM 4-AP i 5 min. IKv ble utløst av 150 ms depolariserende puls fra −40 til +60 mV ved et holdepotensial på −60 mV. (B) For 1,5 mM 4-AP-stimulering falt IKv ned ved membranpotensialer fra 10 mV til 60 mV. (C-F) AC-behandling reduserte IKv på en konsentrasjonsavhengig måte ved membranpotensialer fra 10 mV til 60 mV. *p < 0,05 versus kontrollgruppen (n = 6). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ekstracellulær løsning
Kjemikalier g/50 ml Sammensetning (mM)
NaCl 0.3945 135.0
KCl 0.1865 5.0
HEPES 0.5958 5.0
MgCl 2·6T2O 0.2033 2.0
D-glukose 0.9900 10.0
Intracellulær løsning
Kjemikalier g/50 ml Sammensetning (mM)
KCl 0.4100 110.0
MgCl2 0.0120 1.2
Na2-ATP 0.1270 5.0
HEPES 0.1190 10.0
EGTA 0.1900 10.0

Tabell 1: Intracellulære og ekstracellulære løsninger for registrering av IKv i spenningsklemmemodus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den patch-clamp elektrofysiologiske teknikken brukes hovedsakelig til å registrere og reflektere den elektriske aktiviteten og funksjonelle egenskapene til ionkanaler på cellemembranen25. For tiden inkluderer de viktigste opptaksmetodene for patch-klemmeteknikken enkeltkanalsopptak og helcelleopptak26. For helcellemodus brukes glassmikroelektroden og undertrykket til å danne en høymotstandsforsegling mellom et lite område av cellemembranen og en pipettespiss27. Når det vedvarende negative trykket får pipettens spiss til å briste cellemembranen og membranen festes til pipettens indre vegg, gjør den komplette elektriske kretsen dannet mellom pipetten og cellen det mulig å registrere den nåværende tettheten av individuelle ionkanaler på cellemembranoverflaten26,27 . I de senere år har helcellepatch-klemmeteknikken blitt mye brukt til narkotikaforskning rettet mot ionkanalrelaterte sykdommer. Selv om den har høye krav til operatører, er denne teknikken fortsatt "gullstandarden" for ionkanalforskning28. I tillegg kan den perforerte patch-clamp-teknikken også registrere de nåværende endringene i målionkanaler i relativt stabile intracellulære miljøer over lengre varighet ved å bruke antibiotika til å danne permeabilitetsporer i cellemembranen29,30. Man kan registrere og spore de dynamiske endringene i spenningen eller strømmen til ionkanaler ved hjelp av helcellepatch-klemmeteknikken i strømklemme- eller spenningsklemmemodus, noe som gjør dette utvilsomt til en kraftig plattform for å evaluere farmakologisk aktivitet eller toksisitetsmekanismer for legemidler31,32.

AC er en av de viktigste giftige komponentene i Aconitum-arter, tilhører gruppen diester-diterpenoidalkaloider, og er svært giftig20,33. Bevis har indikert at AC kan forårsake kardiovaskulær toksisitet34,35. Som en ikke-selektiv K + kanalblokker har det blitt rapportert at AC kan blokkere den forbigående utover K + -strømmen, ultrarask forsinket likeretter K + -strøm og rask forsinket likeretter utover K + -strøm, noe som induserer arytmier 21,36,37. Til dags dato er det ingen sterke bevis for at spenningsavhengige kaliumstrømmer er involvert i kardiotoksisiteten til AC. Derfor ble den hemmende effekten av AC på IKv i rotte H9c2 kardiomyocytter undersøkt ved hjelp av helcelle patch-klemmeteknikken. Aktiveringen av Na+-kanaler er en allment anerkjent mekanisme der AC utøver farmakologiske eller toksikologiske effekter38. Interessant nok er det bevis for at AC kan handle direkte på IKv 21,36,37. Dataene som presenteres i denne artikkelen gir imidlertid ikke tilstrekkelig bevis for at AC direkte kan hemme IKv. Den IKv-hemmende effekten av AC kan skyldes direkte aktivering av Na + -kanaler, noe som krever ytterligere undersøkelser.

Siden starten og utviklingen har helcellepatch-klemmeteknikken som brukes i denne studien blitt en konvensjonell metode for å utforske kardiotoksisiteten til legemidler når det gjelder ionkanaler. Dette eksperimentet bekreftet at AC effektivt hemmet IKv av H9c2-celler på en konsentrasjonsavhengig måte i spenningsklemmemodus. Imidlertid inneholder hver type ionkanal, inkludert K + -kanaler, flere undertyper, og bare den totale spenningsavhengige K + kanalstrømmen ble registrert i denne studien. Senere studier kan utforske de farmakologiske og toksikologiske mekanismene til AC ved hjelp av modellcellelinjer med høyt uttrykk for spesifikke ionekanal-subtyper37. Alternativt kan man inkorporere spesifikke ionekanaler merket med fluorescerende proteiner for å undersøke myokardtoksisiteten til AC visuelt39. De kritiske trinnene i denne protokollen er trinn 6.4-6.6; å fullføre disse tre trinnene direkte avgjør om den påfølgende innspillingen av IKv er vellykket. Sammenlignet med andre teknologier er helcellepatch-klemmeteknikken gullstandarden og akseptert metode for registrering av strømmen i enkeltionkanaler i cellemembranen eller organellemembranen, med egenskapene til høye tekniske krav og opptak med lav gjennomstrømning40. Oppsummert er denne teknikken ikke bare en grunnleggende metode for celleelektrofysiologiforskning, men er også mye brukt i nevrovitenskap, kardiovaskulær vitenskap og andre felt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi setter pris på den økonomiske støtten fra National Natural Science Foundation of China (82130113) og Key R&D and Transformation Program fra Science & Technology Department of Qinghai Province (2020-SF-C33).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
  3. Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
  4. Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
  5. Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
  6. Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
  8. Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
  9. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  10. Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
  11. Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
  12. Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
  13. Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 6 Suppl 42-46 (2007).
  14. Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
  15. Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
  16. Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
  17. Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
  18. Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
  19. Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
  20. Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
  21. Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
  22. An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
  23. Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
  24. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
  25. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
  26. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  27. Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
  28. Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
  29. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  30. Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
  31. Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
  32. Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
  33. Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  34. Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
  35. Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
  36. Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , Shenyang, China. Master's thesis (2007).
  37. Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
  38. Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
  39. Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
  40. Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).

Tags

Medisin utgave 189
Spenningsavhengig kaliumstrømregistrering på H9c2-kardiomyocytter <em>via</em> helcelleplaster-klemmeteknikken
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li,… More

Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter