Summary
Het huidige protocol beschrijft een efficiënte methode voor de real-time en dynamische acquisitie van voltage-gated kalium (Kv) kanaalstromen in H9c2 cardiomyocyten met behulp van de whole-cell patch-clamp techniek.
Abstract
Kaliumkanalen op het myocardiale celmembraan spelen een belangrijke rol bij de regulatie van celelektrofysiologische activiteiten. Omdat het een van de belangrijkste ionkanalen is, zijn voltage-gated kalium (Kv) -kanalen nauw verbonden met sommige ernstige hartaandoeningen, zoals door geneesmiddelen geïnduceerde myocardiale schade en een hartinfarct. In deze studie werd de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om de effecten van 1,5 mM 4-aminopyridine (4-AP, een breedspectrum kaliumkanaalremmer) en aconitine (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM en 200 μM) op de Kv-kanaalstroom (IKv) in H9c2-cardiomyocyten te bepalen. Het bleek dat 4-AP de IKv met ongeveer 54% remde, terwijl het remmende effect van AC op de IKv een dosisafhankelijke trend vertoonde (geen effect voor 25 μM, 30% remmend tarief voor 50 μM, 46% remmend tarief voor 100 μM en 54% remmend tarief voor 200 μM). Vanwege de kenmerken van hogere gevoeligheid en precisie, zal deze techniek de verkenning van cardiotoxiciteit en de farmacologische effecten van etnomedicine gericht op ionkanalen bevorderen.
Introduction
Ionkanalen zijn speciale geïntegreerde eiwitten ingebed in de lipide bilayer van het celmembraan. In aanwezigheid van activatoren vormen de centra van dergelijke speciale geïntegreerde eiwitten zeer selectieve hydrofiele poriën, waardoor ionen van de juiste grootte en lading op een passieve transportmanier kunnen passeren1. Ionkanalen vormen de basis van celexcitabiliteit en bio-elektriciteit en spelen een sleutelrol in een verscheidenheid aan cellulaire activiteiten2. Het hart levert bloed aan andere organen door regelmatige samentrekkingen als gevolg van een excitatie-contractie-gekoppeld proces geïnitieerd door actiepotentialen3. Eerdere studies hebben bevestigd dat het genereren van actiepotentialen in cardiomyocyten wordt veroorzaakt door de verandering in intracellulaire ionenconcentratie, en de activering en inactivatie van Na+, Ca2+ en K+ ionkanalen in menselijke cardiomyocyten leiden tot de vorming van actiepotentialen in een bepaaldevolgorde 4,5,6. Verstoorde spanningsafhankelijke kalium (Kv) kanaalstromen (IKv) kunnen het normale hartritme veranderen, wat leidt tot aritmieën, die een van de belangrijkste doodsoorzaken zijn. Daarom is het opnemen van de IKv van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen van geneesmiddelen voor de behandeling van levensbedreigende aritmieën7.
Het Kv-kanaal is een belangrijk onderdeel van het kaliumkanaal. De coördinatiefunctie van het Kv-kanaal speelt een belangrijke rol in de elektrische activiteit en myocardiale contractiliteit van het zoogdierhart 8,9,10. Bij cardiomyocyten zijn de amplitude en de duur van de actiepotentialen afhankelijk van de cogeleiding van uitgaande K+-stromen door meerdere Kv-kanaalsubtypen11. De regulatie van de Kv-kanaalfunctie is erg belangrijk voor de normale repolarisatie van het cardiale actiepotentiaal. Zelfs de kleinste verandering in Kv-geleiding heeft een grote invloed op cardiale repolarisatie en verhoogt de kans op aritmie12,13.
Vertegenwoordigend een fundamentele methode in cellulair elektrofysiologisch onderzoek, kan een hoge weerstandsafdichting tussen een klein deel van het celmembraan en een pipetpunt voor de registratie van de hele cel patchklem worden vastgesteld door een negatieve druk toe te passen. De continue onderdruk zorgt ervoor dat het celmembraan in contact komt met de pipetpunt en op de binnenwand van de pipet blijft plakken. Het resulterende volledige elektrische circuit maakt het mogelijk om elke enkele ionkanaalstroom over het oppervlak van het celmembraan te registreren14. Deze techniek heeft een zeer hoge gevoeligheid voor de ionkanaalstroom van het celmembraan en kan worden gebruikt om stromen in alle ionkanalen te detecteren, en de toepassingen zijn extreem breed15. Bovendien heeft patch-clamp, in vergelijking met fluorescerende etikettering en radioactieve etikettering, een hogere autoriteit en nauwkeurigheid16. Op dit moment is de whole-cell patch-clamp-techniek gebruikt om de traditionele Chinese medicijncomponenten te detecteren die werken op Kv-kanaalstromen 17,18,19. Wang et al. gebruikten bijvoorbeeld de whole-cell patch-clamp-techniek en bevestigden dat de effectieve component van het lotuszaad de remming van het Kv4.3-kanaal zou kunnen bereiken door de geactiveerde toestandskanalen19 te blokkeren. Aconitine (AC) is een van de effectieve en actieve ingrediënten van Aconitum-soorten, zoals Aconitum carmichaeli Debx en Aconitum pendelbusch. Talrijke studies hebben aangetoond dat overdoses van AC aritmieën en zelfs hartstilstand kunnen veroorzaken20. De interactie tussen AC- en spanningsafhankelijke ionkanalen leidt tot de verstoring van intracellulaire ionhomeostase, het belangrijkste mechanisme van cardiotoxiciteit21. Daarom wordt in deze studie de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om de effecten van AC op de IKv van cardiomyocyten te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De commercieel verkregen H9c2 rat cardiomyocyten (zie de tabel van materialen) werden geïncubeerd in DMEM met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer. De whole-cell patch-clamp techniek werd vervolgens gebruikt om de veranderingen in IKv in normale H9c2 cellen en 4-AP- of AC-behandelde cellen te detecteren (figuur 1 en figuur 2).
1. Oplossingsvoorbereiding
- Bereid het DMEM-celkweekmedium met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine (zie materiaaltabel).
- Bereid 1,5 M 4-AP-oplossing door 14,1165 mg 4-AP toe te voegen aan 100 μL DMSO-oplossing (zie materiaaltabel). Verdun 1,5 M 4-AP tot 1,5 mM door toevoeging van de extracellulaire oplossing (stap 1.5).
- Bereid 400 mM AC door 5 mg AC toe te voegen aan 19,36 μL DMSO-oplossing (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Alle bovenstaande oplossingen zijn bewaard in een koelkast van 4 °C en de eindconcentratie van de DMSO mag niet hoger zijn dan 0,1% (v/v). - Bereid 50 ml intracellulaire oplossing door toevoeging van 0,4100 g KCl (110,0 mM), 0,0120 g MgCl2 (1,2 mM), 0,1270 g Na2 ATP (5,0 mM), 0,1190 g HEPES (10,0 mM) en 0,1900 g EGTA (10,0 mM) in 50 ml dubbel gedestilleerd water (zie tabel 1 en tabel met materialen).
OPMERKING: De pH-waarde van de intracellulaire oplossing werd aangepast tot 7,2 met behulp van 1 M KOH en werd gealiquoteerd in kleine volumes (1,5-2 ml) en bewaard bij −20 °C. - Bereid 50 ml extracellulaire oplossing door toevoeging van 0,0185 g KCl (5,0 mM), 0,3945 g NaCl (135,0 mM), 0,0203 g MgCl2·6H2O (2,0 mM), 0,0595 g HEPES (5,0 mM) en 0,0990 g D-glucose (10,0 mM) tot 50 ml dubbel gedestilleerd water (zie tabel 1 en materiaaltabel).
OPMERKING: De extracellulaire oplossing moet worden bereid voor onmiddellijk gebruik en de pH-waarde moet worden aangepast naar 7,4 met behulp van 1 M NaOH.
2. Celkweek
- Zodra het H9c2-kweekgerecht 80% confluent wordt, verteer je de cellen met 0,25% trypsine gedurende 30 s.
- Kweek 2 x 105 cellen/ml met normaal medium of geneesmiddelbevattend medium (25 μM, 50 μM, 100 μM en 200 μM AC) in een schaal van 35 mm die gedurende 24 uur is bekleed met glasplaten bij 37 °C, met een CO2-atmosfeer van 5% en een relatieve vochtigheid van 70% tot 80% (zie materiaaltabel).
3. Fabricage van micropipettes
- Zet de micropipettetrekker aan (zie Materiaaltabel) en verwarm 30 minuten voor.
- Leg een capillair borosilicaatglas met een gloeidraad (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm lengte) op de micropipettetrekker. Selecteer het programma dat is ingesteld in stap 3.3 en klik op Enter op het configuratiescherm. Klik op het Ramp-programma in de rechterbovenhoek om de "Heat" -waarde van het glazen capillair te bepalen.
- Schrijf het programma voor het trekken van de elektrode volgens de waarde bepaald door de "Ramp" -test en gebruik de volgende stappen: "Heat" -waarde = "Ramp" -waarde, Pull = 0, Vel = trekstangbewegingssnelheid, Tijd = 200-250. Klik op Pull om te beginnen met het fabriceren van de pipetten.
OPMERKING: Observeer de kleur van de droogmiddelen in de verzegelde container van de micropipettetrekker voordat u deze gebruikt. Als de kleur verandert van blauw naar roze, moeten de droogmiddelen worden vervangen. Om verontreiniging van de elektrodepunt te voorkomen, probeert u het middelste deel van het glazen capillair niet aan te raken tijdens de pipetvoorbereiding. Verwijder vervolgens voorzichtig de geproduceerde pipetten en plaats ze in een gesloten en verzegelde container.
4. Instrument instellen
- Schakel de overeenkomstige instrumenten in de volgende volgorde in: de digitaal-analoge converter, de signaalversterker, de micromanipulator, de microscoop en de camera (zie Materiaaltabel).
- Open de beeldbewerkingstoepassing, de signaalversterkersoftware en de data-acquisitiesoftware achtereenvolgens (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Het instrument moet sequentieel worden ingeschakeld; anders verschijnt de status "Demo Digitizer" na het openen van de software.
5. IKv parameter instelling
- Bewerk het protocol voor het opnemen van de IKv volgens de onderstaande stappen.
- Klik op Bewerken en selecteer Protocol bewerken in de software voor gegevensverzameling (zie Materiaaltabel).
- Bewerk het programma in de interface "Waveform": Epoch A (Eerste niveau = −60 mV, Deltaniveau = 0 mV, Eerste duur = 20 ms en Deltaduur = 0 ms); Tijdvak B (eerste niveau = −40 mV, deltaniveau = 10 mV, eerste duur = 150 ms en deltaduur = 0 ms) en tijdperk C (eerste niveau = −60 mV, deltaniveau = 0 mV, eerste duur = 30 ms en deltaduur = 0 ms).
- Klik vervolgens op de interface Modus/Snelheid en stel de gegevens "Trial Hierarchy" in: Trial delay = 0 s, Runs = 1, Sweeps = 11 en Sweep duration = 0.22 s22,23.
OPMERKING: Verkrijg de IKv-kanaalstromen door 150 ms depolariserende stappen toe te passen van −40 mV tot +60 mV met een toename van 10 mV bij een holdingpotentiaal van −60 mV onder controleomstandigheden. De totale tijd van het protocol moet groter zijn dan de tijd die is ingesteld in het programma "Waveform".
- Bewerk het P/N Leak Subtracction programma: klik op Edit Protocol om de Stimulus knop te selecteren, en stel het leak subtracction programma in het P/N Leak Subtracction dialoogvenster: aantal Subsweeps = 2-8 (4 in deze studie), Settle time = 100-1.000 ms (200 in deze studie), "Polarity" = "Opposite to waveform", holding level = −80 mV.
OPMERKING: De P/N Leak-aftrekking moet een holdingniveau hebben dat lager is dan het "Eerste bedrijf" (−60 mV).
6. Whole-cell patch-clamp opname van de I Kv in spanning-klem modus
- Stel het pad voor gegevensopslag in: klik op Bestand en selecteer Namen van gegevensbestanden instellen in de software voor gegevensverzameling. Open het vastgestelde IKv-protocol (stap 5.1) door Bewerken te selecteren en op Open Protocol te klikken in de software voor gegevensverzameling. Klik ten slotte op de optie Extra en selecteer Membraantest om het protocol uit te voeren.
- Voeg de extracellulaire oplossing (stap 1.5) toe aan het celbad op het patchklemapparaat voor de hele cel (zie Materiaaltabel) en plaats de afdeksel omhoog met de H9c2-cellen (gekweekt in stap 2.1) in het bad.
- Vul 30% van de pipet (vervaardigd in stap 3) met de extracellulaire oplossing en installeer deze op de opname-elektrodehouder die in het patchklemapparaat is geïntegreerd. Draai de pipet aan met de o-ring rubberen pakking en plastic ring. Laat vervolgens de pipet in het bad vallen met de micromanipulator. Klik op de pipetverschuivingsinterface van de signaalversterkersoftware (zie Materiaaltabel) om de huidige basislijn van IKv op 0 pA te houden.
OPMERKING: De intracellulaire oplossing (stap 1.4) moet in contact komen met het AgCl/Ag-gedeelte van de zilverdraad en de zilverdraad mag zich niet dicht bij de binnenwand van de pipet bevinden. De weerstand van de pipet moet 2-6 MΩ zijn. Om occlusie van de pipetpunt te voorkomen, moet een continue positieve druk op de pipet worden uitgeoefend met behulp van een spuit van 1,0 ml die via plastic buis24 op de opname-elektrodehouder is aangesloten. - Lever handmatig een geschikte overdruk met een spuit van 1,0 ml die via een plastic buis op de opname-elektrodehouder is aangesloten. Beweeg de pipet iets door de micromanipulator in drie dimensies te manipuleren om contact te maken met de cel.
- Zodra de blokgolf van de membraantest met 1/3 tot 1/2 daalt nadat de pipet het celmembraan heeft geraakt, verwijdert u de overdruk en levert u handmatig een geschikte negatieve druk. Klik vervolgens op de Patch-interface van de data-acquisitiesoftware om het GΩ-zegel te vormen. Gebruik de signaalversterkersoftware "Cp Fast" en "Cp Slow" tijdens het afdichten van cellen om de snelle en langzame capaciteit te compenseren.
OPMERKING: Wanneer de membraantest wordt ≥1 GΩ, wordt een celgebonden configuratie gevormd tussen de pipetpunt en de cel. - Pas korte pulsen van negatieve druk toe om een stukje van het celmembraan te scheuren.
OPMERKING: Een snelle vermindering van de membraanweerstand kenmerkt een succesvol opnamepatroon voor de hele cel. Als de toegangsweerstand (Ra) ≥30 MΩ, moeten de cellen opnieuw worden gekozen voor stap 6.3-6.6. Om de nauwkeurigheid van de geregistreerde IKv-gegevens te garanderen, moet de negatieve druk worden verwijderd nadat het celmembraan is verbroken. - Voer compensatie van de hele celmembraancapaciteit uit door op de knop Hele cel van de signaalversterkersoftware te klikken. Sla ten slotte de gegevens op en neem deze op door op de knop Gegevensopname te klikken.
- Open de opgeslagen IKv-gegevens met de data-analysesoftware. Sla de stroomspanningsrelaties (I−V) op: klik op Analyseren om Statistieken te selecteren om het volgende te doen: selecteer het bereik als Cousors 1,2 voor gegevensanalyse; klik op de knoppen Piekamplitude en Gemiddelde en klik vervolgens op OK om de gegevens op de pagina Resultaten te bekijken. Kopieer ten slotte de kolom van IKv-gemiddeldegegevens naar de functietekensoftware (zie Materiaaltabel) voor verdere analyse.
- Sla de representatieve IKv huidige sporen op: klik op Bewerken om Traces overzetten te selecteren; selecteer vervolgens de volledige tracering in de regio die u wilt overbrengen; klik vervolgens op Selecteren in Trace selectie en selecteer IN 0 (pA) in Signalen; klik ten slotte op OK om de gegevens op de pagina "Resultaten" te bekijken en kopieer de totale gegevens naar de functietekensoftware om de huidige sporen te tekenen.
- Sla het IKv-protocol op: klik op Bewerken om Stimulus Waveform Signal maken te selecteren en selecteer OK. Voer vervolgens stap 6.9 opnieuw uit, behalve voor het selecteren van A0 # 0 (mA) in "Signalen".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol maakte de opname van de IKv mogelijk volgens de parameters die zijn ingesteld in de hele-cel patch-clamp techniek. De IKv werd geactiveerd door 150 ms depolariserende pulsstimulus van −40 tot +60 mV bij een houdpotentiaal van −60 mV (figuur 3A). De IKv van de H9c2 rat cardiomyocyten verscheen eerst rond -20 mV, en daarna nam de amplitude toe met verdere depolarisatie. De gemiddelde relatie tussen de IKv en de membraanpotentiaal werd berekend op basis van de gemeten stroomamplitudes. De resultaten toonden aan dat in vergelijking met de controlegroep de I Kv-amplitude waarneembaar verminderd was na de behandeling van 5 minuten met 1,5 mM 4-AP (figuur 3B). Bovendien daalde de IKv significant bij membraanpotentialen van 10 mV tot 60 mV op een dosisafhankelijke manier na de 24 h AC-behandeling (figuur 3C-F).
Figuur 1: Apparatuur en instrumenten die nodig zijn om de IKv. Op te nemen klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stroomdiagram van de elektrofysiologische opname van IKv in H9c2 cellen met behulp van een hele-cel patch-clamp techniek. (A) Celcultuur. (B) Bereiding van de intracellulaire en extracellulaire oplossingen. (C) Schematische illustratie van de opname van de hele cel. C1: Plaats de pipet dicht bij de cel; C2: Vorm een afdichting met hoge weerstand tussen de pipet en de cel; C3: Scheur het celmembraan. (D) Neem de IKv. op. D1: Schematisch diagram van K+ stroomvorming; D2: Representatieve stroomsporen voor de IKv opgenomen in hele-cel spanning-klemmodus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vertegenwoordiger IKv in H9c2 cellen. (A) Representatieve stroomsporen voor de IKv gemeten in H9c2-cellen zonder enige behandeling (controlegroep), met AC-bevattende media gedurende 24 uur (25 μM, 50 μM, 100 μM en 200 μM), en met 1,5 mM 4-AP gedurende 5 min. De IKv werd geactiveerd door 150 ms depolariserende puls van −40 tot +60 mV bij een houdpotentiaal van −60 mV. (B) Voor 1,5 mM 4-AP stimulatie daalde de IKv af bij membraanpotentialen van 10 mV naar 60 mV. (C-F) AC-behandeling verlaagde de IKv op een concentratieafhankelijke manier bij membraanpotentialen van 10 mV naar 60 mV. *p < 0,05 versus de controlegroep (n = 6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Extracellulaire oplossing | ||
| Chemicaliën | g/50 ml | Samenstelling (mM) |
| NaCl | 0.3945 | 135.0 |
| Kcl | 0.1865 | 5.0 |
| Hepes | 0.5958 | 5.0 |
| MgCl2·6H2O | 0.2033 | 2.0 |
| D-glucose | 0.9900 | 10.0 |
| Intracellulaire oplossing | ||
| Chemicaliën | g/50 ml | Samenstelling (mM) |
| Kcl | 0.4100 | 110.0 |
| MgCl2 | 0.0120 | 1.2 |
| Na2-ATP | 0.1270 | 5.0 |
| Hepes | 0.1190 | 10.0 |
| EGTA | 0.1900 | 10.0 |
Tabel 1: Intracellulaire en extracellulaire oplossingen voor het registreren van de IKv in spanningsklemmodus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De patch-clamp elektrofysiologische techniek wordt voornamelijk gebruikt om de elektrische activiteit en functionele kenmerken van ionkanalen op het celmembraan te registreren en weer te geven25. Op dit moment omvatten de belangrijkste opnamemethoden van de patch-clamp-techniek eenkanaalsopname en hele celopname26. Voor de hele celmodus worden de glasmicro-elektrode en negatieve druk gebruikt om een zeer resistente afdichting te vormen tussen een klein deel van het celmembraan en een pipetpunt27. Zodra de aanhoudende negatieve druk ervoor zorgt dat de punt van de pipet het celmembraan scheurt en het membraan zich hecht aan de binnenwand van de pipet, maakt het volledige elektrische circuit gevormd tussen de pipet en de cel het mogelijk om de stroomdichtheid van individuele ionkanalen op het celmembraanoppervlak te registreren26,27 . In de afgelopen jaren is de whole-cell patch-clamp-techniek op grote schaal gebruikt voor geneesmiddelenonderzoek gericht op ionkanaalgerelateerde ziekten. Hoewel het hoge eisen stelt aan operators, blijft deze techniek nog steeds de "gouden standaard" voor ionkanaalonderzoek28. Bovendien kan de geperforeerde patchklemtechniek ook de huidige veranderingen in doelionkanalen in relatief stabiele intracellulaire omgevingen gedurende langere duur registreren door antibiotica te gebruiken om permeabiliteitsporiën in het celmembraan te vormen29,30. Men kan de dynamische veranderingen in de spanning of stroom van ionkanalen registreren en traceren met behulp van de hele-cel patch-clamp-techniek in de stroom-klem- of spanningsklemmodus, waardoor dit ongetwijfeld een krachtig platform is om de farmacologische activiteit of toxiciteitsmechanismen van geneesmiddelen te evalueren31,32.
AC is een van de belangrijkste toxische componenten van Aconitum-soorten, behoort tot de groep van diester-diterpenoïde alkaloïden en is zeer giftig20,33. Er zijn aanwijzingen dat AC cardiovasculaire toxiciteit kan veroorzaken34,35. Als een niet-selectieve K + kanaalblokker, is gemeld dat AC de voorbijgaande uitgaande K + stroom, ultrasnelle vertraagde gelijkrichter K + stroom en snelle vertraagde gelijkrichter naar buiten K + stroom kan blokkeren, waardoor aritmieën 21,36,37 worden opgewekt. Tot op heden is er geen sterk bewijs dat spanningsafhankelijke kaliumstromen betrokken zijn bij de cardiotoxiciteit van AC. Daarom werd in deze studie het remmende effect van AC op de IKv bij ratten H9c2 cardiomyocyten onderzocht met behulp van de whole-cell patch-clamp techniek. De activering van Na+ kanalen is een algemeen erkend mechanisme waarmee AC farmacologische of toxicologische effecten uitoefent38. Interessant is dat er bewijs is dat AC direct kan handelen op de IKv 21,36,37. De gegevens in dit artikel leveren echter onvoldoende bewijs dat AC de IKv direct kan remmen. Het IKv-remmende effect van AC kan te wijten zijn aan de directe activering van Na + -kanalen, die verder onderzoek vereist.
Sinds de oprichting en ontwikkeling is de hele cel patch-clamp-techniek die in deze studie wordt gebruikt een conventionele methode geworden om de cardiotoxiciteit van geneesmiddelen in termen van ionkanalen te onderzoeken. Dit experiment bevestigde dat AC de IKv van H9c2-cellen effectief remde op een concentratieafhankelijke manier in de spanningsklemmodus. Elk type ionkanaal, inclusief K + -kanalen, bevat echter verschillende subtypen en alleen de totale spanningsafhankelijke K + kanaalstroom werd in deze studie geregistreerd. Latere studies kunnen de farmacologische en toxicologische mechanismen van AC onderzoeken door middel van modelcellijnen met een hoge expressie van specifieke ionkanaalsubtypen37. Als alternatief kan men specifieke ionkanalen opnemen die zijn gelabeld met fluorescerende eiwitten om de myocardiale toxiciteit van AC visueel te onderzoeken39. De kritieke stappen in dit protocol zijn stappen 6.4-6.6; het voltooien van deze drie stappen bepaalt direct of de daaropvolgende opname van IKv succesvol is. In vergelijking met andere technologieën is de patchklemtechniek voor hele cellen de gouden standaard en geaccepteerde methode voor het registreren van de stroom in enkele ionkanalen in het celmembraan of organelmembraan, met de kenmerken van hoge technische vereisten en lage doorvoerregistratie40. Kortom, deze techniek is niet alleen een basismethode voor celelektrofysiologisch onderzoek, maar wordt ook veel gebruikt in de neurowetenschappen, cardiovasculaire wetenschap en andere gebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We waarderen de financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (82130113) en het Key R &D and Transformation Program van de afdeling Wetenschap & Technologie van de provincie Qinghai (2020-SF-C33).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
| Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
| Amplifier | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
| Analytical Balance | Sartorius | 124S-CW | |
| ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
| Cell culture dish (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cell culture dish (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
| Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 5 | |
| Clampfit software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 6. 0. 13 | data acqusition software |
| D-(+)-glucose | Rhawn | RH289133 | |
| Digital camera | Hamamatsu | C11440 | |
| Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 | |
| H9c2 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
| HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
| HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
| HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
| KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
| KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
| MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
| MgCl2·6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285A | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Microscope cover glass (20 × 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
| Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
| MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | signal-amplifier software |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| PH meter | Mettler Toledo | S201K | |
| Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
References
- Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
- Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
- Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
- Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
- Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L.
- Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
- Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
- Grant, A. O.
- Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
- Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
- Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
- Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 6 Suppl 42-46 (2007).
- Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
- Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
- Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
- Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
- Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
- Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
- Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
- Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
- An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
- Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
- Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
- Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
- Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
- Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
- Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
- Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
- Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
- Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
- Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
- Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
- Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
- Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , Shenyang, China. Master's thesis (2007).
- Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
- Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
- Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
- Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).
