Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Spændingsafhængig kaliumstrømsoptagelse på H9c2-kardiomyocytter via helcelle-patch-klemme-teknikken

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64805
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3,4, 5, 1,3,4, 4
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Den nuværende protokol beskriver en effektiv metode til realtid og dynamisk erhvervelse af spændingsstyrede kalium (Kv) kanalstrømme i H9c2 kardiomyocytter ved hjælp af helcelle patch-clamp-teknikken.

Abstract

Kaliumkanaler på myokardiecellemembranen spiller en vigtig rolle i reguleringen af celleelektrofysiologiske aktiviteter. At være en af de vigtigste ionkanaler, spændingsstyrede kaliumkanaler (Kv) er tæt forbundet med nogle alvorlige hjertesygdomme, såsom lægemiddelinduceret myokardieskade og myokardieinfarkt. I denne undersøgelse blev helcelle-patch-clamp-teknikken anvendt til at bestemme virkningerne af 1,5 mM 4-aminopyridin (4-AP, en bredspektret kaliumkanalhæmmer) og aconitin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM og 200 μM) på Kv-kanalstrømmen (IKv) i H9c2-kardiomyocytter. Det blev konstateret, at 4-AP hæmmede I Kv med ca. 54%, mens den hæmmende virkning af AC på IKv viste en dosisafhængig tendens (ingen effekt for 25 μM, 30% hæmningshastighed for 50 μM, 46% hæmmende sats for 100 μM og 54% hæmmende sats for 200 μM). På grund af egenskaberne ved højere følsomhed og præcision vil denne teknik fremme udforskningen af kardiotoksicitet og de farmakologiske virkninger af etnomedicin rettet mod ionkanaler.

Introduction

Ionkanaler er specielle integrerede proteiner indlejret i lipiddobbeltlaget i cellemembranen. I nærværelse af aktivatorer danner centrene for sådanne specielle integrerede proteiner meget selektive hydrofile porer, hvilket tillader ioner af en passende størrelse og ladning at passere igennem på en passiv transportmåde1. Ionkanaler er grundlaget for celle excitabilitet og bioelektricitet og spiller en nøglerolle i en række cellulære aktiviteter2. Hjertet leverer blod til andre organer gennem regelmæssige sammentrækninger som følge af en excitation-kontraktion-koblet proces initieret af handlingspotentialer3. Tidligere undersøgelser har bekræftet, at dannelsen af handlingspotentialer i kardiomyocytter er forårsaget af ændringen i intracellulær ionkoncentration, og aktivering og inaktivering af Na +, Ca2+ og K + ionkanaler i humane kardiomyocytter fører til dannelse af handlingspotentialer i en bestemt sekvens 4,5,6. Forstyrrede spændingsstyrede kaliumkanalstrømme (Kv) (IKv) kan ændre den normale hjerterytme, hvilket fører til arytmier, som er en af de førende dødsårsager. Derfor er optagelse af IKv afgørende for at forstå mekanismerne i lægemidler til behandling af livstruende arytmier7.

Kv-kanalen er en vigtig bestanddel af kaliumkanalen. Kv-kanalens koordinationsfunktion spiller en vigtig rolle i pattedyrshjertets elektriske aktivitet og myokardiekontraktilitet 8,9,10. I kardiomyocytter afhænger amplituden og varigheden af handlingspotentialer af co-ledningen af udadgående K + strømme af flere Kv-kanalundertyper11. Reguleringen af Kv-kanalfunktionen er meget vigtig for den normale repolarisering af hjertehandlingspotentialet. Selv den mindste ændring i Kv-konduktans påvirker i høj grad hjerterepolarisering og øger muligheden for arytmi12,13.

Som en grundlæggende metode i cellulær elektrofysiologisk forskning kan en tætning med høj modstand mellem et lille område af cellemembranen og en pipettespids til optagelse af helcelleplaster etableres ved at anvende et undertryk. Det kontinuerlige undertryk får cellemembranen til at komme i kontakt med pipettespidsen og klæbe fast på pipettens indre væg. Det resulterende komplette elektriske kredsløb gør det muligt at registrere en hvilken som helst enkelt ionkanalstrøm over overfladen af cellemembranen14. Denne teknik har en meget høj følsomhed for cellemembranens ionkanalstrøm og kan bruges til at detektere strømme i alle ionkanaler, og applikationerne er ekstremt brede15. Desuden har patch-clamp højere autoritet og nøjagtighed16 sammenlignet med fluorescerende mærkning og radioaktiv mærkning. På nuværende tidspunkt er helcelle-patch-clamp-teknikken blevet brugt til at detektere de traditionelle kinesiske medicinkomponenter, der virker på Kv-kanalstrømme17,18,19. For eksempel brugte Wang et al. helcelle-patch-klemme-teknikken og bekræftede, at den effektive komponent i lotusfrøet kunne opnå hæmning af Kv4.3-kanalen ved at blokere de aktiverede tilstandskanaler19. Aconitin (AC) er en af de effektive og aktive ingredienser i Aconitum arter, såsom Aconitum carmichaeli Debx og Aconitum pendul Busch. Talrige undersøgelser har vist, at overdoser af AC kan forårsage arytmier og endda hjertestop20. Samspillet mellem AC og spændingsstyrede ionkanaler fører til forstyrrelse af intracellulær ionhomeostase, som er nøglemekanismen for kardiotoksicitet21. Derfor anvendes helcelleplaster-klemme-teknikken i denne undersøgelse til at bestemme virkningerne af AC på IKv af kardiomyocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De kommercielt opnåede H9c2 rotte kardiomyocytter (se materialetabellen) blev inkuberet i DMEM indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovin serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet atmosfære. Helcelle-patch-clamp-teknikken blev derefter anvendt til at detektere ændringerne i IKv i normale H9c2-celler og 4-AP- eller AC-behandlede celler (figur 1 og figur 2).

1. Forberedelse af opløsning

  1. Forbered DMEM-cellekulturmediet indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (se Materialetabel).
  2. Der fremstilles 1,5 M 4-AP-opløsning ved tilsætning af 14,1165 mg 4-AP til 100 μL DMSO-opløsning (se Materialetabel). Fortynd 1,5 M 4-AP til 1,5 mM ved at tilføje den ekstracellulære opløsning (trin 1.5).
  3. Der fremstilles 400 mM AC ved tilsætning af 5 mg AC til 19,36 μL DMSO-opløsning (se Materialetabel).
    BEMÆRK: Alle ovennævnte opløsninger blev opbevaret i et 4 °C køleskab, og den endelige koncentration af DMSO må ikke overstige 0,1% (v/v).
  4. Der fremstilles 50 ml intracellulær opløsning ved tilsætning af 0,4100 g KCl (110,0 mM), 0,0120 g MgCl 2 (1,2 mM), 0,1270 g Na2ATP (5,0 mM), 0,1190 g HEPES (10,0 mM) og 0,1900 g EGTA (10,0 mM) i 50 ml dobbeltdestilleret vand (se tabel 1 og materialetabel).
    BEMÆRK: pH-værdien af den intracellulære opløsning blev justeret til 7,2 ved anvendelse af 1 M KOH og blev aliciteret i små mængder (1,5-2 ml) og opbevaret ved -20 °C.
  5. Der fremstilles 50 ml ekstracellulær opløsning ved tilsætning af 0,0185 g KCl (5,0 mM), 0,3945 g NaCl (135,0 mM), 0,0203 g MgCl 2·6H2O (2,0 mM), 0,0595 g HEPES (5,0 mM) og 0,0990 g D-glucose (10,0 mM) til 50 ml dobbeltdestilleret vand (se tabel 1 og materialetabel).
    BEMÆRK: Den ekstracellulære opløsning skal fremstilles til øjeblikkelig brug, og dens pH-værdi skal justeres til 7,4 ved hjælp af 1 M NaOH.

2. Cellekultur

  1. Når H9c2-kulturskålen bliver 80% sammenflydende, fordøjes cellerne med 0,25% trypsin i 30 s.
  2. Kultur 2 x 10 5 celler/ml med normalt medium eller lægemiddelholdigt medium (25 μM, 50 μM, 100 μM og 200 μM AC) i et 35 mm fad tæppebelagt med glasplader i 24 timer ved 37 °C, med en atmosfære på5 % CO2 og en relativ luftfugtighed på 70 % til 80 % (se Materialetabel).

3. Fremstilling af mikropipetter

  1. Tænd for mikropipettetrækkeren (se Materialeoversigt), og forvarm i 30 min.
  2. Sæt en borosilikatglaskapillær med et filament (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm længde) på mikropipettettrækkeren. Vælg det program, der er indstillet i trin 3.3, og klik på Enter på kontrolpanelet. Klik på rampeprogrammet i øverste højre hjørne for at bestemme værdien "Varme" for glaskapillæren.
  3. Skriv programmet til at trække elektroden i henhold til den værdi, der bestemmes af "Ramp" -testen, og brug følgende trin: "Heat" -værdi = "Ramp" -værdi, Pull = 0, Vel = trækstangens bevægelseshastighed, Time = 200-250. Klik på Træk for at begynde at fremstille pipetterne.
    BEMÆRK: Overhold farven på tørremidlerne i den forseglede beholder på mikropipettetrækkeren, før du bruger den. Hvis farven skifter fra blå til lyserød, skal tørremidlerne udskiftes. For at forhindre forurening af elektrodespidsen skal du prøve ikke at røre ved den midterste del af glaskapillæren under pipetteforberedelsen. Fjern derefter forsigtigt de producerede pipetter, og læg dem i en lukket og forseglet beholder.

4. Opsætning af instrumenter

  1. Tænd for de tilsvarende instrumenter i følgende rækkefølge: den digital-analoge konverter, signalforstærkeren, mikromanipulatoren, mikroskopet og kameraet (se Materialetabel).
  2. Åbn billedbehandlingsprogrammet, signalforstærkersoftwaren og dataindsamlingssoftwaren i rækkefølge (se Materialetabel).
    BEMÆRK: Instrumentet skal tændes sekventielt; Ellers vises tilstanden "Demo Digitizer" efter åbning af softwaren.

5. IKv parameter indstilling

  1. Rediger protokollen til optagelse af IKv ved at følge nedenstående trin.
    1. Klik på Rediger, og vælg Rediger protokol i dataindsamlingssoftwaren (se Materialetabel).
    2. Rediger programmet i grænsefladen "Waveform": Epoke A (Første niveau = -60 mV, Delta-niveau = 0 mV, Første varighed = 20 ms og Delta-varighed = 0 ms); Epoke B (Første niveau = -40 mV, Deltaniveau = 10 mV, Første varighed = 150 ms og Delta varighed = 0 ms) og Epoke C (Første niveau = -60 mV, Delta niveau = 0 mV, Første varighed = 30 ms og Delta varighed = 0 ms).
    3. Klik derefter på grænsefladen Tilstand / hastighed, og indstil dataene "Prøvehierarki": Prøveforsinkelse = 0 s, Kører = 1, Sweeps = 11 og Sweep duration = 0.22 s22,23.
      BEMÆRK: Anskaf I Kv-kanalstrømmene ved at anvende 150 ms depolariserende trin fra -40 mV til +60 mV med en stigning på 10 mV ved et holdepotentiale på -60 mV under kontrolforhold. Den samlede tid for protokollen skal være større end den tid, der er indstillet i "Waveform" -programmet.
  2. Rediger P/N Leak Subtraktionsprogrammet: Klik på Rediger protokol for at vælge stimulusknappen , og indstil lækage-subtraktionsprogrammet i dialogboksen P/N Leak Subtraktion : antal Subsweeps = 2-8 (4 i denne undersøgelse), Afregningstid = 100-1.000 ms (200 i denne undersøgelse), "Polaritet" = "Modsat bølgeform", holdeniveau = -80 mV.
    BEMÆRK: P/N-lækagesubtraktionen skal have et holdeniveau, der er lavere end "Første bedrift" (-60 mV).

6. Helcelle patch-clamp optagelse af I Kv i spænding-klemme tilstand

  1. Opret datalagringsstien: Klik på Filer, og vælg Indstil datafilnavne i dataindsamlingssoftwaren . Åbn den etablerede IKv-protokol (trin 5.1) ved at vælge Rediger og klikke på Åbn protokol i dataindsamlingssoftwaren. Til sidst skal du klikke på værktøjsindstillingen og vælge Membrantest for at begynde at køre protokollen.
  2. Den ekstracellulære opløsning (trin 1.5) tilsættes cellebadet på helcelleplaster-klemmeapparatet (se Materialetabel), og dækslet placeres opad med H9c2-cellerne (dyrket i trin 2.1) i badet.
  3. Fyld 30 % af pipetten (fremstillet i trin 3) med den ekstracellulære løsning, og installer den på optageelektrodeholderen, der er integreret i plaster-klemmeapparatet. Spænd pipetten med o-ring gummipakningen og plastskiven. Slip derefter pipetten i badet med mikromanipulatoren. Klik på signalforstærkersoftwarens pipetteforskydningsgrænseflade (se Materialetabel) for at opretholde I Kv-strømbasen ved 0 pA.
    BEMÆRK: Den intracellulære opløsning (trin 1.4) skal være i kontakt med AgCl/Ag-delen af sølvtråden, og sølvtråden må ikke være tæt på pipettens indre væg. Pipettens modstand skal være 2-6 MΩ. For at undgå okklusion af pipettespidsen skal der tilføres et kontinuerligt positivt tryk til pipetten ved hjælp af en 1,0 ml sprøjte, der er forbundet til optageelektrodeholderen via plastrør24.
  4. Lever et passende positivt tryk manuelt med en 1,0 ml sprøjte tilsluttet optageelektrodeholderen gennem et plastrør. Flyt pipetten lidt ved at manipulere mikromanipulatoren i tre dimensioner for at komme i kontakt med cellen.
  5. Når membrantestens kvadratiske bølge falder med 1/3 til 1/2, efter at pipetten har rørt cellemembranen, skal du fjerne det positive tryk og manuelt levere et passende undertryk. Klik derefter på Patch-grænsefladen til dataindsamlingssoftwaren for at danne GΩ-seglet. Brug signalforstærkersoftwaren "C p Fast" og "Cp Slow" under celleforsegling for at kompensere for den hurtige og langsomme kapacitans.
    BEMÆRK: Når membrantesten er ≥1 GΩ, dannes en cellefastgjort konfiguration mellem pipettespidsen og cellen.
  6. Påfør korte impulser af undertryk for at sprænge et plaster af cellemembranen.
    BEMÆRK: En brat reduktion i membranmodstand karakteriserer et vellykket helcelleoptagelsesmønster. Hvis adgangsmodstanden (Ra) ≥30 MΩ, skal cellerne vælges igen i trin 6.3-6.6. For at sikre nøjagtigheden af de registrerede IKv-data skal det negative tryk fjernes, efter at cellemembranen er brudt.
  7. Udfør helcellemembrankapacitanskompensation ved at klikke på knappen Helcelle i signalforstærkersoftwaren. Til sidst skal du gemme og registrere dataene ved at klikke på knappen Dataoptagelse .
  8. Åbn de gemte IKv-data med dataanalysesoftwaren. Gem strømspændingsrelationerne (I-V): Klik på Analyser for at vælge Statistik for at gøre følgende: Vælg Rækkevidde som cousors 1,2 til dataanalyse; klik på knapperne Peak Amplitude og Mean, og klik derefter på OK for at se dataene på siden Resultater. Endelig skal du kopiere kolonnen med IKv middeldata ind i funktionstegningssoftwaren (se Materialetabel) for yderligere analyse.
  9. Gem repræsentanten IKv aktuelle spor: Klik på Rediger for at vælge Overfør sporinger; vælg derefter Fuld sporing i regionen for at overføre; Klik derefter på Vælg i Spor valg, og vælg IN 0 (pA) i Signaler; til sidst skal du klikke på OK for at se dataene på siden "Resultater" og kopiere de samlede data til funktionstegningssoftwaren for at tegne de aktuelle spor.
  10. Gem IKv-protokollen : Klik på Rediger for at vælge Opret stimulusbølgeformsignal, og vælg OK. Gentag derefter trin 6.9 bortset fra at vælge A0 # 0 (mA) i "Signaler".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol tillod optagelse af IKv i henhold til parametrene i helcelle patch-clamp-teknikken. IKv blev udløst af 150 ms depolariserende pulsstimulering fra -40 til +60 mV ved et holdepotentiale på -60 mV (figur 3A). IKv af H9c2 rotte kardiomyocytter dukkede først op omkring -20 mV, og derefter steg amplituden med yderligere depolarisering. Det gennemsnitlige forhold mellem IKv og membranpotentialet blev beregnet ud fra de målte strømamplituder. Resultaterne viste, at I Kv-amplituden i sammenligning med kontrolgruppen blev observeret reduceret efter 5 minutters behandling med 1,5 mM 4-AP (figur 3B). Derudover faldt IKv signifikant ved membranpotentialer fra 10 mV til 60 mV på en dosisafhængig måde efter 24 timers AC-behandling (figur 3C-F).

Figure 1
Figur 1: Udstyr og instrumenter, der kræves for at optage IKv. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Rutediagram over den elektrofysiologiske registrering af IKv i H9c2 celler ved hjælp af en helcelle patch-clamp teknik. (A) Cellekultur. (B) Fremstilling af intracellulære og ekstracellulære opløsninger. (C) Skematisk illustration af helcelleoptagelse. C1: Flyt pipetten tæt på cellen; C2: Form en tætning med høj modstand mellem pipetten og cellen; C3: Spræng cellemembranen. (d) Optag Ikv. D1: Skematisk diagram over K + strømdannelse; D2: Repræsentative strømspor for IKv registreret i helcellespændings-klemmetilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentativ IKv i H9c2 celler. (A) Repræsentative strømspor for IKv målt i H9c2-celler uden behandling (kontrolgruppe), med AC-holdige medier i 24 timer (25 μM, 50 μM, 100 μM og 200 μM) og med 1,5 mM 4-AP i 5 min. IKv blev udløst af 150 ms depolariserende puls fra -40 til +60 mV ved et holdepotentiale på -60 mV. (B) Ved 1,5 mM 4-AP-stimulering faldt IKv ned ved membranpotentialer fra 10 mV til 60 mV. (C-F) AC-behandling reducerede IKv på en koncentrationsafhængig måde ved membranpotentialer fra 10 mV til 60 mV. *p < 0,05 versus kontrolgruppen (n = 6). Klik her for at se en større version af denne figur.

Ekstracellulær løsning
Kemikalier g/50 ml Sammensætning (mM)
NaCl 0.3945 135.0
KCl 0.1865 5.0
HEPES 0.5958 5.0
MgCl 2·6H2O 0.2033 2.0
D-glukose 0.9900 10.0
Intracellulær opløsning
Kemikalier g/50 ml Sammensætning (mM)
KCl 0.4100 110.0
MgCl2 0.0120 1.2
Na2-ATP 0.1270 5.0
HEPES 0.1190 10.0
EGTA 0.1900 10.0

Tabel 1: Intracellulære og ekstracellulære løsninger til optagelse af IKv i spændingsklemmetilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den elektrofysiologiske teknik med patch-clamp bruges hovedsageligt til at registrere og reflektere den elektriske aktivitet og funktionelle egenskaber ved ionkanaler på cellemembranen25. På nuværende tidspunkt inkluderer de vigtigste optagelsesmetoder for patch-clamp-teknikken enkeltkanalsoptagelse og helcelleoptagelse26. Til helcelletilstand bruges glasmikroelektroden og undertrykket til at danne en højmodstandsforsegling mellem et lille område af cellemembranen og en pipettespids27. Når det vedvarende undertryk får pipettens spids til at sprænge cellemembranen, og membranen fastgøres til pipettens indre væg, giver det komplette elektriske kredsløb, der dannes mellem pipetten og cellen, mulighed for at registrere strømtætheden af individuelle ionkanaler på cellemembranoverfladen26,27 . I de senere år er helcelle-patch-clamp-teknikken blevet brugt i vid udstrækning til lægemiddelforskning rettet mod ionkanalrelaterede sygdomme. Selvom den har høje krav til operatører, er denne teknik stadig "guldstandarden" for ionkanalforskning28. Derudover kan den perforerede patch-clamp-teknik også registrere de aktuelle ændringer i målionkanaler i relativt stabile intracellulære miljøer over længere varighed ved at bruge antibiotika til at danne permeabilitetsporer i cellemembranen29,30. Man kan registrere og spore de dynamiske ændringer i spændingen eller strømmen af ionkanaler ved hjælp af helcelle-patch-klemme-teknikken i strømklemme- eller spændingsklemmetilstand, hvilket utvivlsomt gør dette til en kraftfuld platform til evaluering af den farmakologiske aktivitet eller toksicitetsmekanismer for lægemidler31,32.

AC er en af de vigtigste toksiske komponenter i Aconitum-arter, tilhører gruppen af diester-diterpenoidalkaloider og er meget giftig20,33. Beviser har indikeret, at AC kan forårsage kardiovaskulær toksicitet34,35. Som en ikke-selektiv K + kanalblokker er det blevet rapporteret, at AC kan blokere den forbigående udadgående K + -strøm, ultrahurtig forsinket ensretter K + -strøm og hurtig forsinket ensretter udad K + -strøm, hvilket inducerer arytmier21,36,37. Til dato er der ingen stærke beviser for, at spændingsafhængige kaliumstrømme er involveret i hjertetoksiciteten af AC. Derfor blev den hæmmende virkning af AC på IKv i rotte H9c2 kardiomyocytter undersøgt ved hjælp af helcelleplaster-klemme-teknikken i denne undersøgelse. Aktiveringen af Na+ kanaler er en almindeligt anerkendt mekanisme, hvormed AC udøver farmakologiske eller toksikologiske virkninger38. Interessant nok er der tegn på, at AC kan handle direkte på IKv 21,36,37. De data, der præsenteres i dette papir, giver imidlertid ikke tilstrækkeligt bevis for, at AC direkte kan hæmme IKv. I Kv-hæmmende virkning af AC kan skyldes den direkte aktivering af Na+ kanaler, hvilket kræver yderligere undersøgelse.

Siden starten og udviklingen er helcelle-patch-clamp-teknikken, der anvendes i denne undersøgelse, blevet en konventionel metode til at undersøge lægemidlers kardiotoksicitet med hensyn til ionkanaler. Dette eksperiment bekræftede, at AC effektivt hæmmede IKv af H9c2-celler på en koncentrationsafhængig måde i spændingsklemmetilstand. Imidlertid indeholder hver type ionkanal, inklusive K + -kanaler, flere undertyper, og kun den samlede spændingsafhængige K + -kanalstrøm blev registreret i denne undersøgelse. Efterfølgende undersøgelser kan undersøge de farmakologiske og toksikologiske mekanismer i AC ved hjælp af modelcellelinjer med en høj ekspression af specifikke ionkanalundertyper37. Alternativt kan man inkorporere specifikke ionkanaler mærket med fluorescerende proteiner for at undersøge myokardietoksiciteten af AC visuelt39. De kritiske trin i denne protokol er trin 6.4-6.6; Gennemførelse af disse tre trin bestemmer direkte, om den efterfølgende optagelse af IKv er vellykket. Sammenlignet med andre teknologier er helcelleplaster-klemme-teknikken guldstandarden og den accepterede metode til registrering af strømmen i enkeltionkanaler i cellemembranen eller organellemembranen med karakteristika for høje tekniske krav og optagelse med lav kapacitet40. Sammenfattende er denne teknik ikke kun en grundlæggende metode til celleelektrofysiologisk forskning, men er også meget udbredt inden for neurovidenskab, kardiovaskulær videnskab og andre områder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi sætter pris på den økonomiske støtte fra National Natural Science Foundation of China (82130113) og Key F &D and Transformation Program fra Science & Technology Department of Qinghai Province (2020-SF-C33).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
  3. Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
  4. Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
  5. Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
  6. Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
  8. Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
  9. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  10. Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
  11. Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
  12. Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
  13. Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 6 Suppl 42-46 (2007).
  14. Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
  15. Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
  16. Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
  17. Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
  18. Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
  19. Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
  20. Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
  21. Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
  22. An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
  23. Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
  24. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
  25. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
  26. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  27. Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
  28. Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
  29. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  30. Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
  31. Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
  32. Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
  33. Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  34. Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
  35. Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
  36. Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , Shenyang, China. Master's thesis (2007).
  37. Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
  38. Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
  39. Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
  40. Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).

Tags

Medicin udgave 189
Spændingsafhængig kaliumstrømsoptagelse på H9c2-kardiomyocytter <em>via</em> helcelle-patch-klemme-teknikken
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li,… More

Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter