Summary
يصف البروتوكول الحالي طرق تقييم بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض. يتضمن هنا طرق الطلاء والتلوين الشاملة ، بالإضافة إلى إجراءات القياس الكمي التفصيلية والموضوعية.
Abstract
يعد التألق المناعي أحد أكثر التقنيات استخداما لتصور المستضدات المستهدفة ذات الحساسية العالية والنوعية ، مما يسمح بالتحديد الدقيق وتوطين البروتينات والجليكان والجزيئات الصغيرة. في حين أن هذه التقنية راسخة في ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن استخدامها في نماذج الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D). عضويات سرطان المبيض هي نماذج ورم 3D تلخص عدم تجانس الخلايا السرطانية النسيلي ، والبيئة المكروية للورم ، وتفاعلات الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا. وبالتالي ، فهي متفوقة على خطوط الخلايا لتقييم حساسية الدواء والمؤشرات الحيوية الوظيفية. لذلك ، فإن القدرة على استخدام التألق المناعي على عضويات سرطان المبيض الأولية مفيدة للغاية في فهم بيولوجيا هذا السرطان. تصف الدراسة الحالية تقنية التألق المناعي للكشف عن بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المصلية عالية الجودة المشتقة من المريض (PDOs). بعد تعريض PDOs للإشعاع المؤين ، يتم إجراء التألق المناعي على المواد العضوية السليمة لتقييم البروتينات النووية كبؤر. يتم جمع الصور باستخدام تصوير z-stack على الفحص المجهري متحد البؤر وتحليلها باستخدام برنامج حساب البؤر الآلي. تسمح الطرق الموصوفة بتحليل التوظيف الزمني والخاص لبروتينات إصلاح تلف الحمض النووي وتوطين هذه البروتينات مع علامات دورة الخلية.
Introduction
سرطان المبيض هو السبب الرئيسي للوفاة بسبب الأورام الخبيثة النسائية. يتم علاج غالبية المرضى بالأدوية الضارة بالحمض النووي مثل كاربوبلاتين ، ويمكن إعطاء أولئك الذين يعانون من نقص في إصلاح إعادة التركيب المتماثل (HRR) مثبطات بوليميراز بولي (ADP-ribose) (PARP) 1,2. ومع ذلك ، فإن معظم المرضى يطورون مقاومة لهذه العلاجات ويموتون في غضون 5 سنوات من التشخيص. ارتبط عدم تنظيم استجابة تلف الحمض النووي (DDR) بتطور سرطان المبيض ومقاومة كل من العلاج الكيميائي ومثبطات PARP3. وبالتالي ، فإن دراسة نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج أمر حتمي في فهم الفيزيولوجيا المرضية لسرطان المبيض ، والمؤشرات الحيوية المحتملة ، والعلاجات المستهدفة الجديدة.
تستخدم الطرق الحالية لتقييم نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج التألق المناعي (IF) ، حيث يسمح ذلك بالتحديد الدقيق وتوطين بروتينات تلف الحمض النووي ونظائر النوكليوتيدات. بمجرد حدوث كسر مزدوج تقطعت به السبل (DSB) في الحمض النووي ، يتم فسفرة بروتين هيستون H2AX بسرعة ، مما يشكل تركيزا حيث تتجمع بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي4. يمكن تحديد هذه الفسفرة بسهولة باستخدام IF. في الواقع ، تم استخدام اختبار ɣ-H2AX بشكل شائع لتأكيد تحريض DSB5،6،7،8،9. ارتبط تلف الحمض النووي المتزايد بحساسية البلاتين وفعالية العوامل الضارة بالحمض النووي10،11،12 ، وقد تم اقتراح ɣ-H2AX كعلامة حيوية مرتبطة باستجابة العلاج الكيميائي في علاجات السرطان الأخرى 13. عند DSB ، تقوم الخلية التي تتقن HRR بإجراء سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى تجنيد BRCA1 و BRCA2 RAD51 ليحل محل بروتين النسخ المتماثل A (RPA) ويرتبط بالحمض النووي. يستخدم إصلاح HRR قالب الحمض النووي لإصلاح DSB بأمانة. ومع ذلك ، عندما تكون الأورام ناقصة في HRR ، فإنها تعتمد على مسارات إصلاح بديلة مثل الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ). من المعروف أن NHEJ عرضة للخطأ ويخلق عبئا طفريا كبيرا على الخلية ، والتي تستخدم 53BP1 كمنظم إيجابي14. يمكن تحديد جميع بروتينات تلف الحمض النووي هذه بدقة على أنها بؤر باستخدام IF. بالإضافة إلى تلطيخ البروتينات ، يمكن استخدام IF لدراسة حماية الشوكة وتشكيل فجوة الحمض النووي التي تقطعت بها السبل. ارتبطت القدرة على الحصول على شوكات مستقرة باستجابة البلاتين ، ومؤخرا ، أظهرت فحوصات الفجوة إمكانية التنبؤ بالاستجابة لمثبطات PARP6،15،16،17. لذلك ، فإن تلطيخ نظائر النوكليوتيدات بعد إدخالها في الجينوم هو طريقة أخرى لدراسة DDR.
حتى الآن ، اقتصر تقييم DDR في سرطان المبيض إلى حد كبير على خطوط خلايا 2D المتجانسة التي لا تلخص عدم التجانس النسيلي أو البيئة المكروية أو بنية الأورام في الجسم الحي 18,19. تشير الأبحاث الحديثة إلى أن الكائنات العضوية تتفوق على خطوط خلايا 2D في دراسة العمليات البيولوجية المعقدة مثل آليات DDR6. تقيم المنهجية الحالية RAD51 و ɣ-H2AX و 53BP1 و RPA و geminin في PDOs. تقوم هذه الطرق بتقييم العضو العضوي السليم وتسمح بدراسة آليات نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج في بيئة أكثر تشابها مع البيئة المكروية للورم في الجسم الحي. جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر والعد الآلي للبؤر ، يمكن أن تساعد هذه المنهجية في فهم مسار نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج في سرطان المبيض وتخصيص خطط العلاج للمرضى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على أنسجة الورم والاستسقاء بعد الحصول على موافقة المريض كجزء من المستودع الحيوي لأورام النساء الذي تمت الموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة واشنطن في سانت لويس (IRB). تم تضمين المرضى إذا كان لديهم مرحلة متقدمة من سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC). تم تنفيذ جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء ما لم ينص على خلاف ذلك. تم تحضير جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة (ما لم يذكر خلاف ذلك) وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
1. توليد العضوية
- قم بإنشاء المواد العضوية بعد التقرير المنشورمسبقا 20.
2. تصفيح وتشعيع المواد العضوية
- باستخدام المواد العضوية في الثقافة ، قم بإزاحة علامات تبويب المواد العضوية من طبق الاستزراع من خلال التلاعب اليدوي بطرف ماصة. اجمع المواد العضوية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
- جهاز طرد مركزي الأنبوب المخروطي عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. باستخدام ماصة ، نضح من طافها بعناية.
- أضف 1000 ميكرولتر من إنزيم مؤتلف خال من أصل حيواني إلى الحبيبات (انظر جدول المواد). اخلطي المحلول واحتضانه لمدة 15 دقيقة على حرارة 37 درجة مئوية.
- جهاز طرد مركزي المحلول عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. باستخدام ماصة ، استنشق بعناية من طاف.
- بعد الطرد المركزي والشفط ، أعد تعليق الحبيبات في 1000 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات.
- انقل 10 ميكرولتر من المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل واخلطه مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق.
- خذ 10 ميكرولتر من محلول الخلية الزرقاء trypan في شريحة غرفة عد الخلايا وأدخلها في آلة عد الخلايا (انظر جدول المواد).
- لوحة 40000 خلية لكل 20 ميكرولتر من مستخلص الغشاء القاعدي (BME) في شريحة غرفة زجاجية ذات 8 آبار (انظر جدول المواد). هذا يحافظ على المواد العضوية لمدة 3-5 أيام للسماح للخلايا بتكوين عضويات وتنمو إلى حجم مناسب.
- للحث على فواصل الحمض النووي مزدوجة الخيوط ، قم بإشعاع المواد العضوية المطلية ب 10 رمادي (Gy) من الإشعاع ɣ (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل التشعيع).
ملاحظة: قد يستغرق هذا ما يصل إلى 5-10 دقائق. - احتضان الكائنات العضوية في وسائط الاستزراع الخاصة بها في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 4 ساعات.
3. تلطيخ المناعي
ملاحظة: تشير الأحجام إلى الكمية لكل بئر من شريحة الغرفة المكونة من 8 آبار (~ 300 ميكرولتر).
- بعد تشعيع وحضانة المواد العضوية ، استنشاق الوسائط باستخدام ماصة ، بعناية حتى لا تعطل مصفوفة 3D. يغسل مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- ثبت المواد العضوية في 300 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 10 دقائق.
ملاحظات: لا تترك لفترة طويلة ، لأن BME سوف يتبلمر ويمكن استنشاقه. - اغسل المواد العضوية ب 300 ميكرولتر من محلول التلوين (انظر جدول المواد). ضعيها على شاكر لمدة 5 دقائق.
- للنفاذية ، أضف برفق 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية (انظر جدول المواد) واحتضانها لمدة 20 دقيقة. يغسل مع 300 ميكرولتر من العازلة تلطيخ. ضعيها على شاكر لمدة 5 دقائق.
- أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ لمنع خطوة النفاذية. ضعيها على شاكر لمدة 30 دقيقة. نضح من المخزن المؤقت تلطيخ باستخدام ماصة.
- أضف 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (أرنب مضاد RAD51 ، مضاد للفأر Geminin ، أرنب مضاد RPA ، مضاد للفأر H2AX ، أرنب مضاد للجيمينين ، مضاد للفأر 53BP1 ؛ انظر جدول المواد) مخفف في مخزن تلطيخ. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
ملاحظة: تجنب التلوين المشترك مع نفس الحيوان المضيف. اترك الغطاء مفتوحا لتجنب اختلاط الأجسام المضادة في الآبار المجاورة. - قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي. قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام 300 ميكرولتر من محلول التلوين لمدة 5 دقائق لكل منها على الخفق.
- أضف 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضادة للفأر Alexa fluor 488 والماعز المضاد للأرانب Alexa fluor 647 ؛ انظر جدول المواد) محلول مخفف في محلول تلطيخ واحتضان لمدة 1 ساعة في الظلام.
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في الظلام. - نضح محلول الأجسام المضادة الثانوي. أضف 300 ميكرولتر من DAPI المخفف. ضعيها على شاكر لمدة 5 دقائق.
- قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام 300 ميكرولتر من محلول التلوين لمدة 5 دقائق لكل منها على الخفق. قم بإزالة المخزن المؤقت للتلطيخ وافصل الحجرات باستخدام مجموعة الإزالة المرفقة مع شرائح الحجرة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تأكد من عدم الدفع بعيدا جدا للأمام لتعطيل مصفوفة 3D. - باستخدام طرف ماصة p200 مع قطع الطرف ، أضف وسيط التثبيت (انظر جدول المواد) لتغطية كل بئر بعلامة تبويب عضوية (على سبيل المثال ، 20-30 ميكرولتر لكل علامة تبويب عضوية).
- ضع غطاء على العينة ، وتجنب الفقاعات.
- خذ طلاء الأظافر الشفاف وقم بطلائه على جوانب زجاج الغطاء لإغلاق الشريحة. اتركه يتصلب لمدة 1 ساعة وضعه عند -20 درجة مئوية.
ملاحظة: بعد التصوير ، يمكن تخزين الشريحة لمدة 6 أشهر على الأقل مع الحد الأدنى من فقدان التألق.
4. التصوير
- التقط صورا باستخدام مجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد) بمعدل 63x باستخدام زيت الغمر.
ملاحظة: إذا كان تصوير البروتينات النووية ، فإن 63x مفيد ، لكن 40x مقبول أيضا. - استخدم DAPI لتحديد موقع المواد العضوية من خلال العدسة. حدد المرشحات المناسبة للفحص المجهري بناء على الفلوروفورات المستخدمة. قم بتعيين المعلمات لالتقاط صور z-stack.
ملاحظة: كانت الفلوروفورات المستخدمة في الدراسة هي DAPI و 488 و 647. تم تشغيل الليزر 405 و 488 و 638 لتصور التلطيخ.
ملاحظة: يعتمد مكدس z الموصى به على قوة حل الهدف. - اضبط الصورة الحية: اضبط التركيز ، وشدة الليزر ، وما إلى ذلك.
ملاحظة: كلما زادت شدة الليزر ، زاد احتمال تبييض العينة. لذلك ، حدد كثافة الليزر المثلى. - الحصول على مكدس z.
ملاحظة: قد يستغرق هذا ما يصل إلى 5-10 دقائق. - من الصور التي تم جمعها في z-stack ، التقط لقطة شاشة لثلاث صور على الأقل لكل مكدس.
ملاحظة: تأكد من الحصول على لقطات شاشة في جميع أنحاء المكدس حتى لا تكرر النوى عند القياس الكمي. - احفظ كل ملف بتنسيق TIFF وانتقل إلى التحليل (الخطوة 5).
5. التحليل
ملاحظة: استخدم JCountPro لكافة تحليلات الصور بعد التقريرالمنشور مسبقا 21. للحصول على هذا البرنامج، راجع المنشور المقترن.
- ضمن لوحة تحليل الكائن (أعلى البرنامج) في علامة تبويب تحديد الملف (أسفل البرنامج) ، حدد ملفات TIFF .
- انقر فوق إضافة لنقل الملفات المحددة إلى مجموعة الملفات المحددة. حدد العرض.
- ضمن علامة تبويب التجزئة ، حدد الأزرق كلون النوى. حدد تجزئة آلية لتحسين عتبة النوى.
ملاحظة: إذا لم يحدد التقسيم التلقائي الكائنات بدقة ، فيمكن للمستخدم ضبط الضبط الدقيق والضبط الخام للصورة أو الاطلاع على دليل المستخدم لتحسين التجزئة بشكل أكبر. - تحت لوحة الكائنات، حدد تقسيم آلي للكائنات الكبيرة وتحسين حجم النوى.
ملاحظة: عادة ما يكون حجم النوى غير المشروط 5000 بكسل ، بينما الحجم الشرطي هو 1500 بكسل. راجع دليل المستخدم لتحسين حجم الكائنات بشكل أكبر. - حدد تحديد الكائنات لاختبار المعلمات.
ملاحظة: إذا لم تكن هذه المعلمات دقيقة ، فيمكن ضبط الحجم والضبط مع الإعدادات الأخرى. راجع دليل المستخدم للحصول على إرشادات حول المزيد من التحسين. - بعد ضبط المعلمات على الصورة، حدد تعريف الكائنات في كل الصور لتعريف النوى في كل الصور المحددة.
- حدد لوحة تحليل البؤر (أعلى البرنامج).
- ضمن علامة التبويب تحديد الملفات (أسفل البرنامج) ، حدد ملفات TIFF التي تم استخدامها لتحليل الكائنات وحدد أزرار الأسهم (>>) لنقل الصور إلى مجموعة ملفات الصور.
- في مجموعة الدليل أسفل ملفات الصور التي تم نقلها، انقر نقرا مزدوجا فوق المجلد تحرير يدوي وحدد لنقل ملفات ioc إلى مجموعة ملفات مجموعة الكائنات.
ملاحظة: يجب أن تكون جميع TIFFs المحددة مطابقة لملفات IOC. - اضغط على تحديد لنقل الملفات إلى مجموعة الملفات المحددة. حدد علامة التبويب عد البؤر في الجزء السفلي من البرنامج.
- قم بتحسين المعلمات باتباع الخطوات أدناه.
- فهرس إعدادات القبعة العلوية: 12.
- قناة التركيز البؤري: حدد لون البؤر (أخضر: ɣ-H2AX؛ أحمر: RAD51).
- إعدادات قبة H: ارتفاع القبة٪: 30 ؛ العتبة٪: 28 و 28.
- إعداد الشكل / الحجم: الحد الأدنى لحجم التركيز ، بكسل: 5. حدد تطبيق الشكل / الحجم. الحد الأقصى لحجم التركيز البؤري (مشروط): 32. الحد الأدنى للاستدارة ، x100: 96. الحد الأقصى للتركيز ، بكسل: 60.
- مرشح الضوضاء: الحجم 1.
ملاحظة: في حالة تحديد ما إذا كانت النواة موجبة لتلطيخ الجيمينين ، حدد اللون الأخضر تحت القناة الثانية ، وتحت التحليل حدد الشدة.
- لاختبار مجموعة المعلمات ، حدد الأزرار أدناه بالترتيب: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
ملاحظة: إذا لم تعمل هذه المعلمات ، فيمكن ضبط الحجم والضبط مع الإعدادات الأخرى. راجع دليل المستخدم لمعرفة المزيد حول كيفية تحسين الصورة بشكل أكبر. - بمجرد تحسين المعلمات للصور المحددة، حدد العد التلقائي لحساب البؤر في كل صورة لكل نوى. إذا كانت القناة الثانية مطلوبة ، فسيحدد البرنامج الكثافة التي يمكن استخدامها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن للبروتوكول المقدم أن يلطخ بنجاح بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في المواد العضوية ويتصورها ويحددها كميا. تم استخدام هذه التقنية لتلطيخ وتقييم PDOs قبل وبعد التشعيع. تعرضت PDOs إلى 10 Gy من الإشعاع وتم تقييمها للمؤشرات الحيوية التالية: ɣ-H2AX (الشكل 1) ، علامة على تلف الحمض النووي. RAD51 (الشكل 2) ، علامة لمعدل الموارد البشرية ؛ 53BP1 ، علامة على NHEJ ؛ RPA ، علامة على إجهاد النسخ المتماثل (الشكل 3) ؛ و geminin ، علامة دورة خلية الطور G2 / S14. تم اختيار جرعة 10 Gy بناء على بحث منشور سابقا يدرس تلف الحمض النووي في سرطان المبيض 6,22. تم استخدام برنامج JCountPro لتحديد النواة وتحديد عدد البؤر داخل النواة باستخدام المعلمات الموضحة13 (الشكل 4). يحدد البرنامج النواة (الشكل 4 أ ، ب) ، ثم البؤر النووية (الشكل 4 ج) ، ويقوم بتصفية البؤر من الخلايا الإيجابية للجيمينين (الشكل 4 د).
الشكل 1: بؤر ɣ-H2AX في PDOs قبل وبعد التشعيع. صور تمثيلية لبؤر DAPI و ɣ-H2AX في PDOs قبل وبعد التشعيع عند 10x مع إدخالات 63x. قضبان المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: بؤر RAD51 و geminin في PDOs قبل وبعد التشعيع. صور تمثيلية ل DAPI و geminin و RAD51 والتلوين المشترك لبؤر geminin / RAD51 PDOs قبل وبعد التشعيع عند 10x مع إدخالات 63x. قضبان المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: RPA و 53BP1 في PDOs قبل وبعد التشعيع. صور تمثيلية ل (A) DAPI و RPA ؛ (ب) جيمينين ، 53BP1 ، والتلوين المشترك لبؤر geminin / 53BP1 عند 10x مع إدخالات 63x. قضبان المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: سير عمل القياس الكمي لبرنامج JCountPro. (أ) تحت تحليل الكائن ، يتم تحديد القناة الزرقاء لتحديد الأجسام الزرقاء ، النوى ، ثم يتم تحسينها تلقائيا عن طريق تحديد التجزئة التلقائية (السهم الأحمر). (ب) في حالة الانقسام التلقائي، يتكيف حجم الجسم (النوى) مع حجم الصورة والتكبير. يتم تحديد زر تعريف الكائن لاختبار المعلمات (1)، ويتم تحديد زر تعريف الكائنات في كل الصور (السهم الأحمر) لتعريف الكائنات (النوى) لكل صورة. (ج) تحت علامة تبويب تحليل البؤر ، يتم إدخال الصور وتعيين معلمات عد البؤر: أولا ، يتم تحديد لون البؤر تحت قناة التركيز ، أخضر ؛ تم تعيين مؤشر Top Hat على 12 ؛ تم ضبط إعدادات القبة H بحيث يكون لها نسبة ارتفاع قبة 30 ونسبة عتبة 28 ؛ تم تحسين شكل وحجم البؤر لحجم الصورة باستخدام المعلمات اليدوية لأقصى حجم تركيز بكسل عند 60 والحد الأدنى للاستدارة × 100 عند 96 ؛ أخيرا ، يتم تطبيق مرشح الضوضاء. يتم اختبار الإعدادات من خلال تطبيق القبعة العلوية والقبة H وعدد البؤر (1-3). لتحديد بؤر ɣ-H2AX لكل خلية ، اضغط على start (سهم أحمر). (د) بالنسبة لبؤر RAD51 ، يتم تطبيق الإعدادات كما هو موضح لبؤر ɣ-H2AX ، باستثناء قناة التركيز التي تم تغييرها إلى اللون الأحمر ؛ ومع ذلك ، لتحديد النوى الملطخة بالجيمينين ، يتم اختيار القناة الثانية للأخضر ، ويتم تغيير التحليل إلى شدة. يتم اختبار المعلمات من خلال تطبيق القبعة العلوية ، والقبة H ، وعدد البؤر (1-3) ، ثم الضغط على start (السهم الأحمر) لتحديد جميع بؤر RAD51 وتقييم شدة اللون الأخضر لكل خلية في كل صورة. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تلعب استجابة تلف الحمض النووي دورا أساسيا في كل من تطور سرطان المبيض ومقاومة العلاج الكيميائي. لذلك ، فإن الفهم الشامل لآليات إصلاح الحمض النووي أمر حتمي. هنا ، يتم تقديم منهجية لدراسة بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في 3D ، عضويات سليمة. تم تطوير بروتوكول موثوق وقابل للتكرار باستخدام الأجسام المضادة المميزة لتقييم تلف الحمض النووي ، وإعادة التركيب المتماثل ، والانضمام النهائي غير المتماثل ، وإجهاد التكاثر. الأهم من ذلك ، يتم التحقق من صحة هذه الطرق باستخدام ضوابط معدلة وراثيا توضح خصوصية وحساسية هذه الطرق.
الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي طلاء وتثبيت المواد العضوية. يحتضن هذا البروتوكول على وجه التحديد المواد العضوية في 2٪ PFA لمدة 10 دقائق مع مراقبة دقيقة لمستخلص الغشاء القاعدي (BME) أثناء عملية التثبيت. هذا يختلف عن بروتوكولات التألق المناعي الأخرى في المواد العضوية التي تقترح استخدام 4٪ PFA لمدة 10-60 دقيقة23،24،25. لقد وجد أنه إذا كانت علامات تبويب BME في كمية مركزة من PFA لفترة طويلة جدا ، فإن علامات التبويب تتبلمر وتخضع للشفط. وتجدر الإشارة إلى أن الشركات المصنعة ل BMEs المحددة غالبا ما تقدم اقتراحات بشأن التثبيت. نقطة أخرى مهمة للمناقشة هي طلاء المواد العضوية. يمكن أن تؤدي عملية التلوين إلى فقدان جزء أو كل المواد العضوية. لذلك ، كلما كانت علامة التبويب أكثر تقاربا في وقت الطلاء ، زاد احتمال أن تتحمل العينة خطوات التلوين بنجاح.
تشمل نقاط القوة في هذا البروتوكول التحقق من صحة تلطيخ الأجسام المضادة النووية ، والقدرة على إجراء التألق المناعي وتصوير عضويات 3D السليمة ، وقدرة البروتوكول على التكيف مع أي علاج أو جزيء مهم.
تم التحقق من صحة الأجسام المضادة المستخدمة في هذه التجارب بشكل صارم للتأكد من خصوصيتها باستخدام خلايا سرطان المبيض المعدلة وراثيا. تم التحقق من صحة الطرق لمزيد من الحساسية من خلال تعريض PDOs لجرعات متزايدة من الإشعاع. أدى ذلك إلى زيادة بؤر ɣ-H2AX و RAD51 و RPA في PDOs التي تتقن HRR. أخيرا ، تسهل طرق القياس الكمي الموضوعية استنساخ هذا الفحص وتجنب التحيز الذاتي للقياس الكمي اليدوي.
الطرق التقليدية لاستكشاف DDR هي من خلال ظروف زراعة 2D المعروفة باسم خطوط الخلايا ، ولكن ليس لديهم القدرة على الحفاظ على عدم التجانس الجيني للورم الأصلي. تعتبر البيئة المكروية للورم أمرا حيويا في تكوين الورم ومقاومة العلاج الكيميائي في سرطان المبيض26،27،28 ، وبالتالي ، فإن هذه النماذج توفر ميزة لثقافات الخلايا المتجانسة ثنائية الأبعاد عند دراسة DDR. عند دراسة DDR ، من الضروري التحكم في دورة الخلية لتجنب سوء تصنيف عدم القدرة على إجراء أنواع معينة من إصلاح الحمض النووي التي تكون خاصة بدورة الخلية (أي HRR). يركز العمل المستقبلي على دراسة أنواع معينة من آفات الحمض النووي التي يسببها العلاج الكيميائي البلاتيني أو مثبطات بوليميراز بولي (ADP-ribose) أو هيدروكسي يوريا.
أخيرا ، هذا البروتوكول قابل للتكيف لدراسة أي مستضد قابل للتعديل إلى التألق المناعي التقليدي ويمكن أن يستوعب دراسة العلاجات الدوائية الجديدة. يركز البروتوكول المقدم على بروتينات DDR ، ولكن مع تغيير بسيط في الأجسام المضادة ، يمكن تعديل هذا البروتوكول لدراسة البروتينات الأخرى والجليكان والجزيئات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن الكائنات العضوية عبارة عن نماذج ثلاثية الأبعاد غير متجانسة يتم زراعتها في المختبر ، فإن أي علاج للعضويات ممكن ، بما في ذلك العلاج المناعي والعلاج المضاد لتولد الأوعية والعلاج الأيضي والعلاجات الجديدة الأخرى التي يصعب تقييمها في خطوط الخلايا المتجانسة29،30،31.
تشمل قيود هذه الطريقة استخدام BME بتكوين غير متسق وتلطيخ غير محدد. نظرا لأن BMEs التجارية يتم إنتاجها من خطوط الخلايا ، يمكن أن يختلف تكوين كل وحدة بشكل كبير. يمكن أن تؤثر هذه الاختلافات على التثبيت والتلوين ، وكذلك توليد المواد العضوية. بالإضافة إلى ذلك ، اعتمادا على العينة ، يمكن أن يكون هناك تلطيخ غير محدد ل BME ، والذي يمكن أن يعيق البروتين محل الاهتمام. ومع ذلك ، فإن التلوين النووي محدد للغاية ويوضح بؤرا نووية واضحة يمكن قياسها بسهولة.
في الختام ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتقييم بروتينات DDR في المواد العضوية. مع تقدم التكنولوجيا ، من المتوقع أن تكون المواد العضوية قادرة على استخدامها لتقييم إصلاح تلف الحمض النووي للخلايا الحية في نماذج 3D هذه. بالإضافة إلى ذلك ، باعتبارها الطريقة الأكثر فعالية للاستزراع ، سيتم إنشاء المواد العضوية ، وسيكون من الممكن إجراء فحوصات أكثر تطورا مثل ألياف الحمض النووي ومقايسات فجوة النسخالمتماثل 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نحن ممتنون لتوجيهات بافل لوباتشيفسكي ، دكتوراه في إنشاء هذا البروتوكول. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لكلية الطب بجامعة واشنطن في قسم أمراض النساء والتوليد في سانت لويس وقسم الأورام النسائية ، وبرنامج العميد للباحثين بجامعة واشنطن ، ومؤسسة مجموعة الأورام النسائية ، وبرنامج تطوير علماء الإنجاب لدعمهم لهذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M.
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
