Studium synaptischer Vesikel Pools mit Photokonversion Styrylfarbstoffe

Dieses Video zeigt die Vorgehensweise bei der Fotokonvertierung des Styro Dye FM 1 43. Um synaptische Vesikelbecken in Drosophila melanogaster zu untersuchen, werden zunächst Drosophila-Larven präpariert, um die ventralen Muskeln freizulegen, die die neuromuskuläre Verbindung oder NMJ-Präparation bilden. Die Präparate werden in Puffer inkubiert, der FM D enthält, hier in grau markierender Zellmembran.

Sie werden dann elektrisch oder chemisch stimuliert, um eine physikalische Fusion der Vesikelmembran zu induzieren. Die stimulierte Exozytose wird mit FM D gefärbt. Der extrazelluläre FM-Farbstoff wird dann gewaschen, wobei er von der Plasmamembran entfernt wird, und das Gewebe wird unter kontinuierlicher Beleuchtung mit hoher Intensität fixiert. Der Farbstoff ist vollständig gebleicht und die schwarze Farbe erscheint aufgrund des Amino Ben und der Ausfällung.

Dieser Niederschlag kann dann durch Transmission em visualisiert werden. Hallo, ich bin Philippe o Paso aus dem Labor von Sylvia Olli am European Neuroscience Institute in Gaon, Deutschland. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für die FM-Photoumwandlung in der neuromuskulären Verbindung.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um das synaptische vesikale Recycling zu untersuchen. Okay, fangen wir an: Arbeiten unter einem Präpariermikroskop. Beginnen Sie damit, eine Drosophila-Larve mit der Rückenseite nach oben in eine mit So-Guard beschichtete Schale zu stecken.

Bedecken Sie es mit einer Spritzennadel mit Drosophila-Kochsalzlösung und finden Sie eine Dissektionsschere, die die dorsale Seite in Längsrichtung durchschneidet. Entfernen Sie dann die inneren Organe. Dehnen Sie dann die Zubereitung und stecken Sie sie erneut an die Sigarschale.

Mehrere Bauchmuskeln können dann verwendet werden, um die bei diesem Verfahren verwendeten FM-Farbstoffe vor dem Ausbleichen zu schützen. Dieser Vorgang sollte bei schlechten Lichtverhältnissen durchgeführt werden. Bedecken Sie das eingeklemmte Drosophila-Präparat mit Drosophila-Kochsalzlösung, die 90 millimolares Kaliumchlorid und 10 mikromolare FM enthält.1 43 Matrize, um die Nerven chemisch zu stimulieren.

Nach der Stimulation eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die stimulierende Lösung und tauchen Sie die Schale mit der festgesteckten Drosophila ein. Zubereitung in einem mit 100 Millilitern Drosophila-Kochsalzlösung gefüllten Becherglas zweimal, um die extrazelluläre Matrize FM 1 43 unter einer chemischen Sicherheitshaube zu entfernen.

Fixieren Sie das Präparat der neuromuskulären Verbindung in 2,5 % Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Präparat einmal mit PBS, nehmen Sie es dann aus der Zigarrenschale und tauchen Sie es 15 Minuten lang in 100 Millimolar Ammoniumchlorid. Zum Abschrecken der freien Aldehydgruppen des restlichen Gesäßaldehyd-Fixiermittels.

Waschen Sie die Ammoniumchloridlösung mit normalem PBS, geben Sie das Präparat für den neuromuskulären Übergang in eine neue Zigarrenschale und tauchen Sie es in gefilterte 1,5 Milligramm pro Milliliter. Diaminbenzin oder DAB in PBS und 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Positionieren Sie die Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Quecksilberlampen-Lichtquelle ausgestattet ist, wobei ein Lampengehäuse mit einem Rückspiegel unter Verwendung eines Trockenobjektivs mit relativ geringer Vergrößerung

Suchen Sie die Probe. Bringen Sie dann mit einem normalen grünen Fluoreszenzfilterwürfel mit blauer Anregung das Fluoreszenzsignal in den Fokus. Die neuromuskulären Verbindungen erscheinen als helle Flecken auf den Muskeln.

Beleuchten Sie anschließend die Probe mit demselben Fluoreszenzfilterset mit maximaler Intensität, bis der FM D vollständig gebleicht ist. Bei Verwendung eines 20-fach-Objektivs sollten 30 bis 45 Minuten ausreichen. Die Zeit für die Fotokonvertierung hängt jedoch von der Intensität der Beleuchtung, der Stärke des Eindringeinkommens von DAB in die Vorbereitung und dem verwendeten Objektiv ab.

Untersuchen Sie die Probe nach der Beleuchtung unter Durchlicht. Wenn eine Fotokonvertierung stattgefunden hat, sollte ein dunkelbrauner Niederschlag zu sehen sein. Kehren Sie zum Sezierbereich zurück und schneiden Sie dann mit einer Schere den fotokonvertierten Fleck aus der Larve ab.

Kehren Sie zum Sezierbereich zurück. Schneiden Sie dann mit einer Schere den fotokonvertierten Fleck aus den Larven ab. Legen Sie nun die Probe in ein Mikrofugeröhrchen, das PBS enthält, arbeiten Sie unter einer chemischen Sicherheitshaube und tragen Sie geeignete Sicherheitsausrüstung, einschließlich Handschuhe und Augenschutz.

Bereiten Sie 300 Mikroliter 1%Osmiumtetroxid pro Probe vor. Geben Sie nun die Probe in einen Glaskolben mit Plastikdeckel und fügen Sie die vorbereitete Osmiumtetroxidlösung hinzu, um das Präparat nachzufixieren. Während der Inkubation der Probe getrennte Lösungen mit 30, 50, 70, 90, 95 und 100 % Ethanol herstellen.

Waschen Sie die Probe vier- bis fünfmal jeweils fünf Minuten lang mit PBS. Verwenden Sie nach jedem Waschen ein Kunststoff-PE für Ihre Pipette, um die Probe in einen neuen Kolben zu übertragen. Nach dem letzten Waschen wird die Probe in einen sauberen Glaskolben umgefüllt.

Als nächstes dehydrieren Sie die Probe, indem Sie sie in die Reihe der Ethanollösungen geben. Beginnen Sie mit der Inkubation in einem Milliliter 30%igem Ethanol. Entfernen Sie dann nach fünf Minuten das Ethanol mit einer Weidepipette und ersetzen Sie es durch einen Milliliter 50%Ethanol.

Fahren Sie mit der Dehydrierung fort und inkubieren Sie das Präparat der neuromuskulären Verbindung in den Lösungen 70, 90 und dann 95%. Die Probe wird dann nach der Dehydrierung mehr Mal in 95%iger Ethanollösung inkubiert als dreimal in 100%iger Ethanol. Fügen Sie dem Ethanol zwei Milliliter Eins-zu-Eins-EIN-Harz hinzu und geben Sie die Probe auf einen Rotator-Inkubat.

Zwei bis vier Stunden bei Raumtemperatur nach Rotation bei 100 %ein und geben Sie die Probe in einen offenen Kolben, damit das restliche Ethanol vier bis sechs Stunden lang verdampfen kann. Gießen Sie frisches EIN in eine Form. Die Präparate dazugeben und 36 Stunden bei 60 Grad Celsius inkubieren.

Wenn die EIN-eingebetteten Präparate fertig sind, werden mit einem Ultramikrotom 50 bis 80 Nanometer dünne Schnitte I mit einem Diamantmesser hergestellt. Die Proben werden in Dünnschliffen geschnitten. Die Abschnitte fließen auf dem Wasserbad des Messers und können anschließend auf normalen EM-Gittern aufgenommen werden.

Die Präparate sind nun bereit, mit herkömmlichen EM-Verfahren abgebildet zu werden. Isolierte neuromuskuläre Verbindungen aus Drosophila Melan gaster wurden mit hohem Kaliumgehalt und internalisierten Membranen stimuliert. Wurden mit FM 1 43 gefärbt, wie hier gezeigt.

Die Fluoreszenz einer Nervenendigung kann mit einem herkömmlichen Epi-Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden. Bei kontinuierlicher Beleuchtung wird der Farbstoff vollständig gebleicht und wenn die Beleuchtung fortgesetzt wird, erscheint eine schwarze Farbe aufgrund der Dinobenzinfällung. Diese Nervenendigung enthält synaptische Vesikel, aber keines von ihnen ist photokonvertiert.

Dies kann durch eine unzureichende Beleuchtung oder eine schlechte DIA-Aminobenzin-Penetration im Gewebe verursacht werden. Im Gegensatz dazu führt zu viel Beleuchtung zu einem insgesamt dunklen Terminal, an dem keine Vesikel oder Organellen unterscheidbar sind, wobei die Fotokonvertierung bei entsprechender Beleuchtungsstärke zu sehen ist. Diese Mikroaufnahme zeigt ein synaptisches Bhuton, in dem ein Pool dunkler Vesikel zu sehen ist, der auf eine FM-Photokonversion hinweist.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie synaptische Vesikel, die mit fem die gekennzeichnet sind, in Fotos konvertieren können. Bei diesem Vorgang ist es wichtig, daran zu denken, die Beleuchtungszeiten für den Konvertierungsschritt immer sorgfältig zu kalibrieren. Das war's also.

Danke fürs Zuschauen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.