Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الكشف عن Published: January 20, 2015 doi: 10.3791/52139
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University, 2Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

Summary

يوضح هذا البروتوكول كيف القرب ربط الفحص يمكن استخدامها للكشف في الموقع تفاعلات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة العصبي العضلي اليرقات تقاطع. مع هذه التقنية، وترد أقراص كبيرة وهو جين تاو لى شاو تاي لتشكيل مجمع في المنطقة بعد المشبكي، وهي جمعية التي سبق تحديدها من خلال المشاركة في مناعي.

Introduction

ذبابة الفاكهة أقراص كبيرة (DLG) هو عضو الحفظ من guanylate كيناز الأسرة المرتبطة غشاء السقالات البروتينات التي تساعد في تنظيم جمعية مجمعات البروتين كبيرة في مواقع محددة من غشاء البلازما. حددت أصلا باعتبارها البروتين القامع الورم، ويخدم DLG كمقياس مهم من الظهارية apicobasal قطبية 1،2،3. يخدم أجهزة ... كذلك وحدة نمطية السقالات الرئيسية في الوصل العصبي العضلي (NMJ) من الخلايا العصبية الحركية glutamatergic خلال نمو اليرقات 4. أجهزة ... تلعب أدوارا متنوعة في NMJ اليرقات، ويعتمد تعدد النمط الظاهري على قدرته على ربط مع بروتينات متعددة 5،6. واحدة من هذه البروتين هو هو جين تاو لى شاو تاي (HTS)، ونديد إلى adducins الثدييات التي أساسا وصفت في ما يخص دورهم في تنظيم الأكتين-إسبكترن الهيكل الخلوي 7. وقد سبق يتبين أن DLG وHTS يمكن أن تشكل مجمع مع بعضها البعض على أساس في المختبر 8. عيب واحد من هذه النتائج، ومع ذلك، هو أنها لا تشير إلى هذا حيث أشكال معقدة. مع استخدام المناعية، ويلاحظ توزيعات DLG وHTS إلى التداخل في الغشاء بعد المشبكي من لل NMJs اليرقات، ولكن هل هم في مجمع في هذه المنطقة 8؟ كما هو مبين في الآونة الأخيرة وأكبر من التفصيل هنا، ويستخدم القرب ربط الفحص (PLA) للبحث عن وجود ارتباط بين الوضع الطبيعي DLG وHTS في خصيصا في اليرقات NMJ 27.

جيش التحرير الشعبى الصينى هو تقنية جديدة نسبيا تستخدم في الغالب في الخلايا والأنسجة الثقافة التي يمكن الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات في الموقع 9. في هذا الاختبار، يتم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية ضد اثنين من البروتينات في المصالح مع زوج من الأجسام المضادة الثانوية أنواع محددة، ووصف تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى، والتي يتم تصريفها إلى أليغنوكليوتيد] (الشكل 1A، B). إذا كان البروتين اثنينالصورة هي على مقربة من بعضها البعض (أي في غضون بضع عشرات من نانومتر)، والمسافة بين تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى المرفقة يمكن سد من خلال التهجين اثنين من [أليغنوكليوتيد موصل إضافية (الشكل 1C). في هذا التشكل، وينتهي خالية من أليغنوكليوتيد] موصل قريبة بما فيه الكفاية لاجراء اتصالات مع بعضها البعض، وجزيء DNA دائرية مغلقة يمكن تشكيلها على ربط في الموضع (1D الشكل). يخدم جزيء DNA دائري كنموذج لفي الموقع التضخيم دائرة المتداول، والذي وتستعد قبل واحدة من [أليغنوكليوتيد مترافق إلى تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى (الشكل 1E). تسلسل داخل تضخيمها، والمنتج DNA concatemeric الناتجة عندئذ يمكن تصور مع fluorescently المسمى، تحقيقات قليل النوكليوتيد التكميلية (الشكل 1F). منذ يبقى تضخيم الحمض النووي تعلق على واحدة من تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى، وتوطين التحت خلوية من البروتين البروتين التفاعل داخلهاالأنسجة غ يمكن التأكد بسهولة.

ويشيع استخدام عدة أساليب للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات بما في ذلك تقنيات المختبر مثل شارك في مناعي، وسحب إلى أسفل المقايسات والخميرة فحص يومين الهجين، وتقنيات الجسم الحي مثل نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) وثنائي الجزيء الإسفار التكملة ( BiFC). وشرك من التقنيات في المختبر هو أنها لا تعرف أين التفاعل يحدث التطور الطبيعي، في حين تشمل المذكورة آنفا في الجسم الحي تقنيات التعبير الاصطناعي من البروتينات الانصهار التي قد لا تعكس السلوك الأصلي من نظرائهم الذاتية. واحد الميزة الرئيسية لجيش التحرير الشعبى الصينى هو أنه قادر على تحديد داخل الأنسجة توطين التحت خلوية من interactors البروتين الذاتية التي هي على مقربة من بعضها البعض، ومن المرجح تشكيل المعقدة، مع درجة من التقارب المطلوب لتوليد إشارة يجري مقارنة لFRET وBiFC. PLA يمكن الكشف عن التفاعلات مع خصوصية عالية وحساسية نظرا لاقتران الاعتراف الأجسام المضادة والتضخيم DNA. وهكذا، يمكن فحص توليد منفصلة، ​​وإشارات مضيئة في شكل نقاط والتي تكشف عن الموضع الدقيق للتفاعل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتم الكشف عن المستضدات مرئية بالكاد. وأخيرا، جيش التحرير الشعبى الصينى هو تقنية بسيطة نسبيا على القيام بها، ويستغرق مدة لا تزيد على إجراء المناعى القياسية لإكمال. ولذلك، يوفر PLA ميزة الفنية اكثر من غيرها من المقايسات التفاعل البروتين البروتين التي غالبا ما تعاني من الأوقات إعداد طويلة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها واسعة النطاق.

يوضح هذا البروتوكول كيف PLA يمكن تطبيقها على ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ لغرض الكشف عن الذاتية البروتين البروتين التفاعلات في الموقع. هنا، يتم تنفيذ جيش التحرير الشعبى الصينى على اليرقات الاستعدادات العضلات جدار الجسم حيث يتم عرض DLG وHTS في الوجود الواقع في مجمع في المنطقة بعد المشبكي من لل NMJs. جيش التحرير الشعبى الصينى لم تستخدم سابقا لدراسة NMJ اليرقات، وهناك في الوقت الحاضر سوى عدد قليل من الأبحاث المنشورة التي استخدمت هذا الاختبار في الأنسجة ذبابة الفاكهة. ومن المؤمل أن مزيدا من التعرض لجيش التحرير الشعبى الصينى للمجتمع ذبابة الفاكهة سوف يؤدي إلى زيادة استخدامه كأداة إضافية لتكمل الأخرى، أكثر شيوعا البروتين البروتين المقايسات التفاعل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الجسم إعداد ستريت

تم تنفيذ إعداد الطور الثالث الجدران الجسم اليرقات (لدراسة لل NMJs التي يعصب عضلات جدار الجسم) كما هو موضح سابقا في برنت 10 آخرون، أو راماشاندران وBudnik 11،12، ولكن مع بعض التعديلات: ملاحظة.

  1. تشريح
    1. رفع مخزون الطاير والصلبان عند 25 درجة مئوية لمدة 5-6 أيام باستخدام الإجراءات القياسية 13.
    2. اختيار الزحف يرقات العمر الثالثة من قوارير أو زجاجات باستخدام ملقط غرامة.
    3. غسل اليرقات في طبق بتري صغيرة تحتوي على الفوسفات عازلة المالحة (PBS) لإزالة أي جزيئات الطعام.
    4. وضع يرقة واحدة على قرص sylgard وتزج به في بضع قطرات من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. باستخدام PBS الجليد الباردة سيساعد الصاعقة اليرقة مما يجعل من الاسهل للتلاعب. في جميع أنحاء تشريح، وضمان أن إعداد الغارقة دائما في برنامج تلفزيوني لمنعها من الجفاف.
    5. ضع لاوكالة الخطوط الجوية مع الجانب الظهري لها تواجه حتى أن اثنين من مساحات القصبة الهوائية مرئية تحت المجهر تشريح (الشكل 2A). باستخدام ملقط لفهم دبوس minutien، دبوس اليرقة إلى أسفل في نهاية الخلفي بالقرب من الفتحات التنفسية (الشكل 2B). مع دبوس آخر، يخترق من خلال بشرة في نهاية الأمامية بالقرب من السنانير الفم. تمتد برفق اليرقة خارج بالطول، ثم يعلقون عليه (الشكل 2B).
    6. باستخدام مقص تسليخ مجهري، قرصة نهاية الخلفي بالقرب من دبوس لخلق فتحة صغيرة. يجب أن يكون شق سطحي يكفي لتمرير فقط من خلال بشرة.
    7. وضع غيض من شفرة الجزء السفلي من مقص في شق، وقطع على طول على طول خط الوسط الظهرية بين اثنين من مساحات القصبة الهوائية (الشكل 2C). يشير ريش مقص صعودا طفيفا عند قطع لتجنب إتلاف بطني عضلات جدار الجسم.
    8. إجراء شق صغير الأفقي الأمامي قليلا لمنصبدبوس وضعت eriorly (الشكل 2C). جعل شق آخر مماثل الخلفي قليلا إلى دبوس وضعت الأمامية (الشكل 2C). يجب أن الشقوق يمر من خلال بشرة.
      ملاحظة: شقوق ثلاثة من خطوات 1.1.7 و 1.1.8 مجتمعة يجب اشبه " "عند اكتماله، أي يجب أن تنتج رفرف اليسارية واليد اليمنى على الجانب الظهري من الجسم اليرقات.
    9. تنظيف بعناية الأعضاء الداخلية مع ملقط. وإضافة بضع قطرات قوية من برنامج تلفزيوني مساعدة تهجير أجهزة خارج الجسم اليرقات، مما يجعل من الاسهل لإزالتها. تجنب بدس الجسم اليرقات لأنها سوف تسبب ضررا على عضلات جدار الجسم.
    10. فض الجسم اليرقات مفتوحة ويعلقون الزوايا أسفل (الشكل 2D). عندما تعلق، وتمتد جدار الجسم أفقيا ورأسيا لتشكيل المستطيل المتأزم بالتساوي (SEالبريد الشكل 2G للشكل)، مع الحرص على عدم المسيل للدموع عضلات جدار الجسم في هذه العملية.
    11. الانتهاء من إزالة أي الأعضاء الداخلية المتبقية (الشكل 2E).
  2. تثبيت وPermeabilization
    1. تزج الجدران الجسم معلقة في عدة قطرات من الحل بوان. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد. بدلا من ذلك، استخدم بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) باعتبارها تثبيتي بديل. احتضان لمدة 30 دقيقة.
    2. شطف ثلاث مرات مع الفوسفات عازلة المالحة مع تريتون (PBT).
    3. باستخدام ملقط غرامة، وإزالة بعناية دبابيس ونقل الجدران الجسم عن طريق أركانها إلى siliconized و0.65 مل أنبوب microcentrifuge.
    4. تخزين الجدران الجسم في PBT في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة لجيش التحرير الشعبى الصينى. لأفضل النتائج، وبدء المناعية الجدران الجسم في خلال يوم أو يومين من تشريح.
      ملاحظة: لانقاذ على الكواشف وضمان أن يتم التعامل مع جميع الجدران الجسم بالتساوي أثناء الفحص، يمكن وضعها الأنماط الجينية المختلفة في واحدأنبوب. الأنماط الجينية يمكن تمييزها عن طريق خفض زوايا الجدران الجسم بطريقة مختلفة (انظر الشكل 2F للحصول على أمثلة).

2. المناعية

تم تنفيذ المناعية من الطور الثالث الجدران جسم اليرقات كما هو موضح سابقا في برنت وآخرون 14 و راماشاندران وBudnik 11، ولكن مع بعض التعديلات 11،14: ملاحظة.
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ومع الإثارة لطيف ما لم ينص على خلاف ذلك.

  1. حجب
    1. غسل الجدران الجسم مع PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    2. منع مع 1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) لمدة 1 ساعة.
  2. المناعية
    1. احتضان الجدران الجسم مع الماوس والأرنب الابتدائي أجسام مضادة ضد اثنين من البروتينات ذات الاهتمام (المخفف في 1٪ BSA) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في هذه الحالة، استخدم 1:10 الماوس مكافحة DLG و 1: 250 أرنب لالمعهد القومي للاتصالات-HtsM 15،16. ويمكن أيضا أن يدرج الأجسام المضادة ضد علامات التي لا تتم في الماوس أو أرنب - على سبيل المثال، استخدم 1: 200 الماعز المضادة للبرنامج الصحة الإنجابية لتحديد أغشية الخلايا العصبية.
    2. يغسل مع PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    3. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية fluorophore مترافق للكشف عن علامات (المخفف في 1٪ BSA) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. وكما هو تصور إشارة PLA في وقت لاحق مع fluorophore أحمر، يجب استخدام fluorophore آخر للكشف عن علامة - على سبيل المثال، استخدم 1: 200 FITC مترافق مكافحة الماعز للكشف عن الماعز المضادة للHRP الأضداد. نظرا لاستخدام الكواشف الحساسة للضوء، والحفاظ على أنابيب في الظلام من هذه النقطة فصاعدا.
      ملاحظة: هذه المجموعة التي تستخدم تسمح لجيش التحرير الشعبى الصينى التي يتعين القيام بها بين الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في الماوس والأرانب، مع الإشارة تصور على القناة الحمراء تحت المجهر متحد البؤر. إذا رغبت في ذلك، هي مجموعات الأخرى المتاحة التي تسمح للفحص الذي يتعين القيام به مع الوجاهةالأجسام المضادة راي أثيرت في الأنواع الأخرى، وإشارة تصور على القنوات الأخرى.

3. القرب ربط الفحص

ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ومع الإثارة لطيف ما لم ينص على خلاف ذلك.

  1. جيش التحرير الشعبى الصينى المسابر
    1. غسل الجدران الجسم مع PBT ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    2. احتضان مع تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى (1: 5 تمييع كل في 1٪ BSA) لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. في هذه الحالة، استخدم 40 ميكرولتر من جيش التحرير الشعبى الصينى التحقيق المضادة للماوس MINUS، 40 ميكرولتر من جيش التحرير الشعبى الصينى التحقيق المضادة للأرنب PLUS و 120 ميكرولتر من 1٪ BSA لضمان غمر السليم واختلاط 5-10 الجدران الجسم. حتى 1:25 التخفيف من تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى لا يزال يؤدي إلى وجود نسبة كافية إشارة إلى الضوضاء (أي لهذه التجربة).
  2. رباط
    1. غسل الجدران الجسم مع الاحتياطي اغسل A مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    2. احتضان مع الحل ربط (01:40 التخفيف من يغاز العازلة في ربط) لمدة 1 ساعة لر 37 ° C. في هذه الحالة، استخدم 5 ميكرولتر من يغاز، 40 ميكرولتر من العازلة 5 ربط و 155 ميكرولتر من المياه عالية النقاء لضمان غمر السليم واختلاط 5-10 الجدران الجسم.
  3. توسيع
    1. غسل الجدران الجسم مع الاحتياطي اغسل A مرتين لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
    2. احتضان مع التضخيم الحل (1:80 التخفيف من البلمرة في المخزن التضخيم) لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. في هذه الحالة، استخدم 2.5 ميكرولتر من البلمرة، 40 ميكرولتر من 5 التضخيم العازلة و157.5 ميكرولتر من المياه عالية النقاء لضمان غمر السليم واختلاط 5-10 الجدران الجسم.
  4. إعداد للتصوير
    1. غسل الجدران الجسم مع الاحتياطي اغسل B مرتين لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    2. يغسل مع 0.01x الاحتياطي اغسل B مرة واحدة لمدة 1 دقيقة.
    3. تتوازن في بضع قطرات من تصاعد الحل لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التركيب، أو تخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    4. باستخدام ملقط غرامة، ونقل بعناية الجدران الجسم على شريحة منصة ثإيث البشرة من أسفل. ضع الجدران الجسم في الصفوف وفي نفس الاتجاه داخل قطرة أو اثنتين من مرس. وضع 22 مم × 40 مم ساترة على إعداد مع الحرص على عدم توليد فقاعات الهواء، ثم ختم الشريحة مع طلاء الأظافر واضحة.
    5. تخزين الشرائح في الظلام في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للتصوير متحد البؤر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في البرية من نوع الطور الثالث لل NMJs اليرقات، وجدت DLG الغالب في الغشاء بعد المشبكي من نوع I حبات glutamatergic، مع مستويات مناعية DLG يجري أكثر وضوحا في نوع حبات إيب من نوع هل حبات (الشكل 3A) 4. HTS موجودة في جميع أنحاء العضلات ولكن يركز على المنطقة بعد المشبكي مع مستويات مناعية HTS التي تظهر متساوية في كل نوع I حبات، ويوجد أيضا presynaptically (الشكل 3A ') 8،17. لاحظ أن توزيع DLG وHTS تتداخل إلى حد كبير في المنطقة بعد المشبكي (الشكل 3A '') 8.

لتحديد ما إذا كان وجود أجهزة ... وHTS في مجمع في NMJ، جيش التحرير الشعبى الصينى بين البروتينات اثنين أجريت على جسم اليرقات الاستعدادات العضلات الجدار. لهذا الاختبار، ماوس لمكافحة DLG الأجسام المضادة التي يكشف المجال PDZ الثاني في N-محطة وأرنب مكافحة HtsM الأجسام المضادةأن يكتشف استخدمت المجال MARCKS-التماثل في C-محطة 15،16. في البرية من نوع، لوحظ إشارة PLA بين أجهزة ... وHTS تحديدا في NMJ (الشكل 3C-C ''). إشارة المترجمة معظمهم محيطي إلى غشاء قبل المشبكي من نوع I حبات الذي demarked من قبل برنامج الصحة الإنجابية، مما يشير إلى أن أجهزة ... وHTS هي على مقربة من بعضها البعض، وتشكيل مجمع في المنطقة بعد المشبكي احتمالا. تم تحديد النتيجة أن تكون محددة كما سيطرة سلبية لدينا، والتي تنطوي HTS 01103 لل NMJs متحولة التي تفتقر HTS مناعية (الشكل 3B-B '')، لم تظهر أي إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى ملاحظتها (الشكل 3D) 8،17،18. وبالإضافة إلى ذلك، قام جيش التحرير الشعبى الصينى دون إضافة الجسم المضاد أرنب مكافحة HtsM تنتج أي إشارة (لا تظهر البيانات). كشفت جهات النظر التكبير عالية من حبات أن DLG وHTS مناعية تتداخل بشكل صارخ في المنطقة بعد المشبكي (الشكل 3E)، في حين PLA بين البروتينات اثنين أدى إلى نقاط وسرية تشير إلى أن مجموعة فرعية فقط من إجمالي DLG وHTS البروتينات في معقد (الشكل 3F).

لمزيد من اختبار موثوقية جيش التحرير الشعبى الصينى كأداة لدراسة NMJ اليرقات، قمنا بتقييم أيضا التفاعلات بين سيرين / ثريونين تنشيط P21 كيناز، باك، والبروتينات متشابك أخرى 19. وقد أظهرت التجارب السابقة شارك في مناعي أن باك هو عضو في مجمع خربشة، منها DLG هو أيضا عضو 20. في البرية من نوع لل NMJs، باك يموضع لكثافة بعد المشبكي (الشكل 4A، C)، حيث كان مطلوبا لأجهزة ... التعريب 15،21. التوزيعات مناعيا من باك وDLG تتداخل في المنطقة بعد المشبكي (الشكل 4A '')، وجيش التحرير الشعبي بين اثنين من البروتينات أسفرت إشارة إيجابية على وجه التحديد في NMJ (الشكل 4B). هذه النتائج تشير إلى أن البروتينات هما في ج تفقد قربها من بعضها البعض، وعلى الأرجح تشكيل المعقدة في هذه المنطقة. كان آخر متشابك بروتين اختبرنا لمجمع باك ملزمة مجنح (مجموعة العمل)، ويجند ذبابة الفاكهة WNT، والتي تلعب العديد من الأدوار في NMJ 22. في البرية من نوع، غير المخصب مجموعة العمل في الجانبين قبل المشبكي وبعد المشبكي من نوع I حبات، ولكن أيضا بوصفها نقاط وجميع أنحاء السيتوبلازم العضلات (الشكل 4C ') 23. ومن المثير للاهتمام، على الرغم من التوزيعات مناعيا من باك ومجموعة العمل تتداخل جزئيا في المنطقة بعد المشبكي (الشكل 4C '')، جيش التحرير الشعبى الصينى بين البروتينات اثنين تنتج أي إشارة يمكن ملاحظتها (الشكل 4D). ولذلك، باك ومجموعة العمل ليسوا على مقربة من بعضها البعض في NMJ. هذه النتيجة تثبت أن ليس كل البروتينات التي تظهر immunoreactivities التداخل من خلال التجارب المشارك توطين التقليدية سوف تولد إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى، وبمثابة عنصر تحكم سلبية إضافية.

والأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل (1)
الشكل 1: رسم تخطيطي من القرب ربط الفحص. (A) الأجسام المضادة الأولية ربط لاثنين من البروتينات ذات الاهتمام باستخدام إجراءات المناعى القياسية. (B) ثم يتم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية مع زوج من الأجسام المضادة الثانوية أنواع محددة، ووصف تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى، والتي يتم تصريفها إلى أليغنوكليوتيد]. (C) إذا البروتينات هما على مقربة من بعضها البعض، والمسافة بين تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى المرفقة يمكن سد من خلال التهجين اثنين من [أليغنوكليوتيد موصل إضافية. (D) في هذا التشكل، لا يمكن للأليغنوكليوتيد] موصل تشكيل جزيء DNA دائرية مغلقة على ربط في الموقع . (E) يقدم جزيء DNA دائري كنموذج لفي الموقع المتداول التضخيم دائرة، والتي وتستعد قبل واحدة من اولىثم يتم الكشف عن gonucleotides مترافق إلى تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى. (F) تسلسل داخل المنتج تضخيم الحمض النووي مع fluorescently المسمى، تحقيقات قليل النوكليوتيد التكميلية. لاحظ أن الرقم استند Weibrecht وآخرون. 24. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: إعداد الطور الثالث الجدران جسم اليرقات. (AF) رسومات تخطيطية تمثل تشريح جدار الجسم. (A) ضع يرقة واحدة على قرص sylgard مع الجانب الظهري لها تواجه حتى أن اثنين من مساحات القصبة الهوائية مرئية. (B) دبوس اليرقة أسفل في نهايات الأمامي والخلفي مع دبابيس minutien، وتمتد اليرقة خارج بالطول في هذه العملية. (C) ز> جعل ثلاثة شقوق في الجانب الظهري للجسم اليرقات مع مقص تسليخ مجهري. يجب على شقوق تشبه إلى '' أنا '' عند اكتماله. (D) إنشر الجسم اليرقات مفتوحة ويعلقون الزوايا أسفل، وتمتد جدار الجسم أفقيا ورأسيا في عملية لتشكيل المستطيل المتأزم بالتساوي. (E) كلين من أي أجهزة المتبقية الداخلية. (F) المعروضة هي أمثلة على طرق مختلفة لخفض ركن من أركان الجدران الجسم من أجل تمييز الأنماط الجينية المختلفة. (G) عرض من الضغوط من إعداد جدار الجسم عند اكتماله. تم التقاط هذه الصورة مع كاميرا رقمية مثبتة على مجهر تشريح. شريط النطاق في لوحة F يمثل 1 ملم. لاحظ أن الرقم استند راماشاندران وBudnik، 2010 12. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ف together.within صفحة = "دائما"> الشكل (3)
الشكل 3: DLG وHTS موجودة في مجمع في المنطقة بعد المشبكي من لل NMJs اليرقات (AB '') التوزيعات من أجهزة ... (أحمر) وHTS (الأخضر) في البرية من نوع وHTS لل NMJs متحولة (AA '.') في البرية. من نوع لل NMJs، وجدت DLG الغالب في الغشاء بعد المشبكي من نوع I حبات، مع مستويات DLG يجري أكثر وضوحا في نوع من إيب هل حبات. HTS موجودة في جميع أنحاء العضلات ولكن تركز أيضا في جميع أنحاء المنطقة بعد المشبكي، مع مستويات HTS يجري مماثلة في كل من نوع I حبات. توزيعات DLG وHTS تتداخل في المنطقة بعد المشبكي. (BB '') متحولة لل NMJs لHTS تفتقر HTS مناعية. لاحظ أن HTS 01103 آثار الطفرة NMJ المتفرعة 8. (CD '') PLA بين أجهزة ... وHTS (أحمر) التي أجريت على النوع البري وHTS لل NMJs متحولة. يستخدم برنامج الصحة الإنجابية للاحتفال غشاء الخلايا العصبية (الخضراء). أظهرت وجهات نظر عالية التكبير من بضع حبات. (CC '') في البرية من نوع، لوحظ إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى تحديدا في NMJ. في الغالب مترجمة إشارة محيطي إلى غشاء قبل المشبكي من نوع I حبات، مشيرا إلى أن أجهزة ... وHTS هي على مقربة من بعضها البعض، وتوجد في مجمع في المنطقة بعد المشبكي. أظهر (D) لل NMJs متحولة لHTS أي إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى ملاحظتها. (EF) يظهر وجهات نظر عالية التكبير من حبات واحدة. (E) HTS وDLG مناعية التداخل بشكل صارخ في المنطقة بعد المشبكي. (F) PLA بين أجهزة ... وHTS النتائج في نقاط واضحة تشير إلى أنه ليس هناك سوى مجموعة فرعية من البروتينات في مجمع . شريط النطاق في لوحة ب '' يمثل 40 ميكرون (AB '')؛ شريط النطاق في لوحة D '' يمثل 10 ميكرون (CD '')؛ SCALشريط الإلكترونية في لوحة F يمثل 5 ميكرون (EF). جميع لل NMJs المعروضة هي من العضلات 6/7 في الجزء البطن اتخذت 4. الصور كما هو أكوام اندمجت باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر نيكون A1R مع برنامج شيكل، عناصر، ومعالجتها مع أدوبي فوتوشوب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: باك موجود في مجمع مع DLG، ولكن ليس مجموعة العمل في المنطقة بعد المشبكي من لل NMJs اليرقات (AD) يظهر وجهات نظر عالية التكبير من بضع حبات (AA '') توزيعات باك (الخضراء) وأجهزة ... (.. أحمر) في البرية من نوع لل NMJs. باك يموضع لكثافة بعد المشبكي. لاحظ أن التوزيعات مناعيا من باك وDLG تتداخل في المنطقة بعد المشبكي. (B) PLA بإلى صف باك وأجهزة ... (الحمراء) التي أجريت على النوع البري لل NMJs. ويلاحظ إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى تحديدا في NMJ، مشيرا إلى أن البروتينات هما على مقربة من بعضها البعض في هذه المنطقة. (CC '') توزيعات باك (الخضراء) ومجموعة العمل (الحمراء) في البرية من نوع لل NMJs. غير المخصب مجموعة العمل في كلا الجانبين قبل المشبكي وبعد المشبكي من NMJ، ولكن أيضا بوصفها نقاط وجميع أنحاء العضلات. لاحظ أن توزيع متفاعل مناعيا من باك لوحظ أيضا أن تتداخل جزئيا مع مجموعة العمل في المنطقة بعد المشبكي. (D) PLA بين باك ومجموعة العمل (الحمراء) التي أجريت على النوع البري لل NMJs. لوحظ عدم وجود إشارة محددة جيش التحرير الشعبى الصينى، مشيرا إلى أن البروتينات هما لا على مقربة من بعضها البعض في NMJ على الرغم من التوزيعات متداخلة بهم. شريط النطاق في لوحة D يمثل 5 ميكرون (AD). جميع لل NMJs يعصب العضلات 6/7 في الجزء البطن اتخذت 4. الصور كما هو أكوام اندمجت باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر نيكون A1R مع برنامج شيكل، عناصر، والمؤيدcessed مع أدوبي فوتوشوب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوضح هذا التقرير كيف PLA يمكن تطبيقها على ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ. يتم تنفيذ الفحص على اليرقات جدار الجسم الاستعدادات العضلات لغرض الكشف عن الذاتية البروتين البروتين التفاعلات الحاضرة في NMJ. مع هذه التقنية، وتظهر DLG وHTS ليكون على مقربة من بعضها البعض، وبالتالي وجود لها في مجمع، وتحديدا في المنطقة بعد المشبكي 27. ودعما لهذه النتيجة، قدمت دراسة سابقة دليل على ارتباطهم مع البيانات التالية: 1) التوزيعات مناعيا من DLG وHTS تتداخل في المنطقة بعد المشبكي من لل NMJs اليرقات، 2) DLG وHTS تشكيل مجمع على أساس المشارك تجارب مناعي التي تنطوي على الكبار كله يطير لست]، و3) DLG وHTS تتفاعل في كل الظهارية وتقاطعات متشابك 8. وقد لوحظ إشارة PLA في المنطقة بعد المشبكي أيضا بين أجهزة ... وباك، والتفاعل التي سبق تحديدها في دراسات أخرى، وبالتالي توفير المزيد من credeالامتحانات التنافسية الوطنية لاستخدام هذا الاختبار في NMJ 15،20،21. ومن المثير للاهتمام، أدى PLA بين باك ومجموعة العمل في أي إشارة يمكن ملاحظتها، على الرغم من توزيعاتها مناعيا تتداخل في NMJ. هذه النتيجة تثبت أن ليس كل البروتينات التي تظهر متداخلة توزيعات مناعيا سوف تولد إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى، لذلك مشيرا إلى أن جيش التحرير الشعبى الصينى يوفر دقة أعلى في الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين من الدراسات شارك في توطين التقليدية.

تم إجراء تغييرات متعددة إلى بروتوكول جيش التحرير الشعبى الصينى الأصلي من أجل تحسين فحص لNMJ اليرقات (لا تظهر البيانات) 9،25. أولا، تقرر أن 1٪ BSA هو عامل حجب أفضل للجدران الجسم بدلا من عرقلة الحل المقدمة. ثانيا، لإنتاج نسبة قوية إشارة إلى الضوضاء، غمر السليم واختلاط الجدران الجسم في الحلول رد فعل أمر بالغ الأهمية. واعتبر ما لا يقل عن 200 ميكرولتر مدة خمس إلى عشر الجدران الجسم في أنبوب 0.65 مل ميكروسنتريفوج suitabلو عندما تفرخ مع جيش التحرير الشعبى الصينى تحقيقات، يغاز أو البلمرة، على الرغم من أن حجم يمكن زيادة وفقا لذلك عند تجهيز المزيد من الجدران الجسم. تم تعزيز قوة الإشارة أيضا عن طريق زيادة أوقات رد الفعل من قبل 30 دقيقة على مدى الأوقات الموصى بها. ثالثا، تم إجراء اختبار تخفيف التسلسلي للتحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى لتحسين التوازن بين الحفظ كاشف وقوة الإشارة. لتجارب أجريت في هذا التقرير، حتى 1:25 التخفيف - من المستحسن 1: 5 التخفيف - لا تزال تنتج نسبة معقولة إشارة إلى الضوضاء. لاحظ أن تعظيم الاستفادة من ردود الفعل ربط والتضخيم لم يؤديها. أخيرا، وكما PLA يمكن أن تكون حساسة للتغيرات دقيقة، فمن المستحسن أن يتم وضع الأنماط الجينية المختلفة للتجربة واحدة في أنبوب واحد بحيث يتم التعامل مع الضوابط والتجارب على قدم المساواة أثناء الفحص. الأنماط الجينية يمكن تمييزها عن طريق خفض زوايا الجدران الجسم بشكل مختلف.

سيفيراوتستخدم أساليب لتر للكشف عن ذبابة الفاكهة البروتين البروتين التفاعلات بما في ذلك الخميرة فحص هجين اثنين، وشارك في مناعي والحنق. ولكن كيف يمكن لهذه الطرق مقارنة ضد جيش التحرير الشعبى الصينى وقدرته على تصور تفاعلات البروتين البروتين في الموقع؟ الخميرة اثنين الهجين يمكن الكشف المباشر ملزمة بين البروتينات ذبابة الفاكهة أعرب في الخميرة، وكان قد تم استخدامها في شاشات الجينوم على نطاق عالية الإنتاجية. على الرغم من العديد من التفاعلات التي تم تحديدها هي ذات الصلة بيولوجيا، وفحص كثير من الأحيان تنتج-ايجابيات كاذبة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحدث السلبيات كاذبة لأسباب متعددة: وتنصهر البروتينات إلى مجالات عامل النسخ التي قد تتداخل مع ملزمة، كثير من التفاعلات تتطلب التعديلات بعد متعدية التي لا تحدث في الخميرة، والنواة (حيث يأخذ فحص مكان) يجوز لا يمكن أن يكون بيئة مناسبة لبعض التفاعلات لتشكيل صحيح. لا واجهت مثل هذه القضايا مع جيش التحرير الشعبى الصينى لأنه يتعامل مع البروتينات الذاتية في عضو هيئة الجائزة مدير وطنهمonment. ومن بين الطرق التي يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات بين البروتينات الذاتية هو المشارك مناعي. يمكن أن التجارب التي تنطوي لست] ذبابة الفاكهة تكشف الأنسجة ومرحلة في دورة حياة التي يحدث فيها التفاعل. لكن، وكما يتضمن تشكيل المحللة تعطيل الخلايا لاستخراج البروتينات والخلايا داخل الأنسجة التي تفاعل يحدث في، وكذلك توطين التحت خلوية لها، لا يمكن أن تقيم - على خلاف في جيش التحرير الشعبى الصينى. وعلاوة على ذلك، وشارك في مناعي بالكشف عن البروتين مجمع ملزمة وغير قادرين على التمييز الذي البروتينات داخل المجمع هي على مقربة من بعضها البعض. هناك طرق مثل الحنق المتاحة لDrosophilists التي تسمح التصور من البروتين البروتين التفاعلات داخل الخلية. ومع ذلك، الحنق ينطوي على overexpression من البروتينات المعدلة وراثيا تنصهر إلى علامات الفلورسنت، وقد لا تعكس السلوك البروتين الذاتية كما في جيش التحرير الشعبى الصينى.

وعلى الرغم من مزاياه، وهناك بعض limitatأيونات عند استخدام جيش التحرير الشعبى الصينى. واحد مثل هذا التقييد هو توافر الأجسام المضادة الأولية ضد البروتينات من الفائدة التي تتم في الأنواع المختلفة. يمكن بسهولة التحايل على هذه المشكلة مع استخدام البروتينات المعدلة وراثيا ذات الكلمات الدلالية، على الرغم من أنها قد لا تكون ممثلا حقيقيا للتفاعل الذاتية. وثمة مسألة أخرى هي أن جيش التحرير الشعبى الصينى قد تنتج السلبيات الكاذبة، على سبيل المثال عندما اثنين من الأجسام المضادة الأولية sterically تعيق بعضها البعض أو عند حاتمة واحد من الأجسام المضادة الأولية ينطوي على موقع التفاعل البروتين البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن جيش التحرير الشعبى الصينى بالكشف عن البروتينات التي هي على مقربة من بعضها البعض، وأنه لا يميز بين التفاعلات المباشرة وغير المباشرة البروتين البروتين، خلافا لما حدث في المقايسات المنسدلة والخميرة فحص اثنين من الهجين. وعلاوة على ذلك، سوف PLA بين البروتينات الذاتية لا تحديد المجالات التي هي المسؤولة عن التفاعل. وهكذا، لا تزال هناك حاجة أخرى المقايسات التفاعل البروتين البروتين لتوصيف كامل للتفاعل molecularlذ.

وقد بدأ الباحثون باستخدام فائقة الدقة المجهري لرسم خريطة للبنية المكانية من ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ، مع قرارات عشرات نانومتر يجري تحقيق 26. جيش التحرير الشعبى الصينى، مع قرارها الجزيئي للمقارنة، ينبغي أن توفر منخفضة التكلفة، من الناحية الفنية تكملة بسيطة لهذه الدراسات التي من شأنها أن تساعد في بناء على عرض تفصيلي لتنظيم العديد من البروتينات في NMJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر ذبابة الفاكهة مركز بلومينغتون المالية لتوفير مخزون الطاير. كما نشكر البنك دراسات الإنمائية هجين والدكتور لين كولي (جامعة ييل) لتوفير الأجسام المضادة. شكر خاص يذهب إلى AhHyun يو لمساعدتها على المخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (كريجر)، ويليام وادا إيزابيل صندوق الصلب (كريجر)، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (هاردن).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps (fine #5) Almedic A10-704
Sylgard Disc World Precision Instruments SYLG184 Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60 x 15 mm Petri dish lid when dissecting.
Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) Fine Science Tools 26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine) Fine Science Tools 15200-00
Platform Slides Glue two 22 x 22 mm2 coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20 mm gap in between for sample mounting.
w1118 Bloomington Drosophila Stock Center 3605
hts01103 Bloomington Drosophila Stock Center 10989 Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.
Name Company Catalog Number Comments
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discs large) Developmental Studies Hybridoma Bank 4F3 Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.
mouse anti-Wg (Wingless) Developmental Studies Hybridoma Bank 4D4 Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.
goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) Jackson              ImmunoResearch 123-065-021 Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
FITC-conjugated donkey anti-goat Jackson             ImmunoResearch 705-095-003 Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS Sigma-Aldrich DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents Red Sigma-Aldrich DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 Sigma-Aldrich DUO82049 Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 Sigma-Aldrich DUO82049 Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 Sigma-Aldrich DUO82049 Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
  2. Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
  3. Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
  4. Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
  5. Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
  6. Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
  7. Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
  8. Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
  9. Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
  10. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
  11. Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
  12. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  13. Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).
  14. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
  15. Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
  16. Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
  17. Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
  18. Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
  19. Bokoch, G. M. Biology of the p21-Activated Kinases. Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).
  20. Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
  21. Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
  22. Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  23. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
  24. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  25. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
  26. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
  27. Wang, S., et al. Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).

Tags

علم الأعصاب، العدد 95، adducin، الجسم جدار التشريح، وعلم الأحياء التطوري، أقراص كبيرة،
الكشف عن<em&gt; في الموقع</em&gt; مجمعات البروتين البروتين في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Yoo, S., Kim, H. y., Wang, … More

Wang, S., Yoo, S., Kim, H. y., Wang, M., Zheng, C., Parkhouse, W., Krieger, C., Harden, N. Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (95), e52139, doi:10.3791/52139 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter