本方案演示了如何利用邻近连接技术检测 原位 蛋白质-蛋白质相互作用在 果蝇 幼虫神经肌肉接头。利用该技术，Discs large 和 Hu-li tai shao 被证实可在突触后区域形成复合物，此相互作用此前已通过共免疫沉淀实验被发现。
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摘要
摘要
Discs large（Dlg）是膜相关鸟苷酸激酶家族中一种保守的成员，在Drosophila幼虫神经肌肉接头（NMJ）处作为主要的支架蛋白发挥作用。先前的研究表明，Dlg在幼虫NMJ突触后区域的分布与Hu-li tai shao（Hts）的分布重叠，Hts是哺乳动物adducin蛋白的同源物。此外，基于对整只成年果蝇裂解液进行的共免疫沉淀实验，发现Dlg与Hts可相互形成复合物。然而，由于这些实验的性质，尚不清楚该复合物是否在幼虫发育期间特异性地存在于NMJ处。
邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）是一种近期发展起来的技术，主要用于细胞和组织培养，可检测蛋白质-蛋白质相互作用 原位在该实验中，采用标准免疫组织化学方法，将样本与针对两种目标蛋白的一抗共同孵育。随后使用一对特别设计的寡核苷酸偶联二抗（称为PLA探针）检测一抗，只有当两个探针彼此靠近结合时，才能产生可检测信号。因此，可实现对处于复合物状态的蛋白质的可视化。本文演示了如何利用PLA技术检测 原位 蛋白质-蛋白质相互作用在 果蝇 幼虫神经肌肉接头。该技术在幼虫体壁肌制备物上进行，以证明Dlg与Hts的复合物确实存在于神经肌肉接头的突触后区域。
引言
黑腹果蝇 Discs large（Dlg）是膜相关鸟苷酸激酶家族中一种保守的支架蛋白成员，可协助在细胞质膜特定区域组装大型蛋白质复合物。Dlg最初被鉴定为一种肿瘤抑制蛋白，是上皮细胞顶-基底极性的重要决定因子。 1,2,3Dlg 还在幼虫发育期间谷氨酸能运动神经元的神经肌肉接头（NMJ）处充当主要的支架蛋白模块 4Dlg在幼虫神经肌肉接头处发挥多种作用，其多效性依赖于其与多种蛋白质相互作用的能力 5,6一种这样的蛋白是Hu-li tai shao（Hts），它是哺乳动物adducin蛋白的同源物，后者主要因其在调控肌动蛋白-血影蛋白细胞骨架中的作用而被描述。 7. 之前的研究表明，Dlg 和 Hts 可以相互形成复合物 体外 利用成年果蝇全组织裂解液进行的免疫共沉淀实验 8然而，这些结果的一个不足之处在于，它们并未指明该复合物形成的部位。通过免疫组织化学方法，可观察到Dlg与Hts在幼虫神经肌肉接头的突触后膜区域分布存在重叠，但二者在此区域是否形成复合物仍有待明确。 8如最近所示并在此进一步详细说明，邻近连接分析（Proximity Ligation Assay, PLA）用于检测 原位 Dlg 与 Hts 在幼虫神经肌肉接头处的特异性结合 27.
PLA 是一种相对较新....
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方案
1. 体壁制备
注意：三龄幼虫体壁（用于研究支配体壁肌肉的神经肌肉接头）的制备方法如 Brent 等 10 或 Ramachandran 和 Budnik 11,12 之前所述，但略有修改。
- 解剖
- 饲养果蝇品系及进行杂交实验于 25 °C 采用标准操作程序进行五至六天 13.
- 使用精细镊子从试管或瓶子中挑选爬行的三龄幼虫。
- 在含有磷酸盐缓冲液（PBS）的小型培养皿中清洗幼虫，以去除任何食物颗粒。
- 将一条幼虫置于Sylgard培养皿上，并加入数滴冰浴的PBS浸没幼虫。使用冰浴的PBS有助于使幼虫麻痹，便于操作。在解剖过程中，需始终确保样本完全浸没在PBS中，以防干燥。
- 将幼虫背侧朝上放置，在解剖显微镜下使两条气管可见（图 2A）。用镊子夹住一个微小的图钉，在靠近气门的后端将幼虫固定住（图2B）。用另一根针从口钩附近的前端表皮穿刺。轻轻纵向拉伸幼虫，然后将其固定图2B).
- 使用显微解剖剪，在靠近固定针的后端轻轻夹取，形成一个小开口。切口应足够浅，仅穿透角质层即可。
- 将剪刀的下刃尖端插入切口，沿两条气管束之间的整个背侧中线....
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结果
在野生型三龄幼虫神经肌肉接头（NMJ）中，Dlg 主要分布于 I 型谷氨酸能突触小体的突触后膜，且在 Ib 型突触小体中的 Dlg 免疫反应信号强度高于 Is 型突触小体（图 3A）4。Hts 在肌肉中广泛分布，但在突触后区域富集，其免疫反应信号在两种 I 型突触小体中强度相近，同时也在突触前区域存在（图 3A'）8,17。需要注意的是，Dlg 与 Hts 在突触后区域的分布大部分重叠（图 3A''）8。
为了确定Dlg和Hts是否在神经肌肉接头（NMJ）处形成复合物，我们在幼虫体壁肌制备样本上进行了两种蛋白之间的邻近连接实验（PLA）。在该实验中，使用了一种小鼠抗Dlg抗体，可识别N端的第二个PDZ结构域，以及一种兔抗HtsM抗体，可识别C端的MARCKS同源结构域15,16。在野生型样本中，Dlg与Hts之间的PLA信号特异性地出现在神经肌肉接头处（图3C-C''
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讨论
本报告展示了如何将 PLA 技术应用于黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的神经肌肉接头（NMJ）。该检测方法使用幼虫体壁肌制备样本，旨在检测 NMJ 处内源性蛋白质-蛋白质相互作用。利用该技术，发现 Dlg 与 Hts 在空间上彼此靠近，因此特异性地存在于突触后区域的同一复合物中27。支持该结果的先前研究提供了以下证据：1）Dlg 与 Hts 的免疫反应性分布信号在幼虫 NMJ 的突触后区域存在重叠；2）基于对整只成年果蝇裂解液进行的共免疫沉淀实验，证实 Dlg 与 Hts 可形成复合物；3）Dlg 与 Hts 在上皮连接和突触连接中均存在相互作用8。此外，在突触后区域还检测到 Dlg 与 Pak 之间的 PLA 信号，而二者之间的相互作用已在其他研究中被证实，进一步验证了该方法在 NMJ 研究中的适用性15,20,21。有趣的是，尽管 Pak 与 Wg 在 NMJ 处的免疫反应性分布存在重叠，但二者之间的 PLA 检测并未产生可观察到的信号。该结果表明，并非所有免疫反应性分布重叠的蛋白质都能产生 PLA 信号，因此说明 PLA 在检测蛋白质-蛋白质相.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Bloomington果蝇品系中心提供果蝇品系。同时感谢发育研究杂交瘤库以及耶鲁大学的Lynn Cooley博士提供抗体。特别感谢AhHyun Yoo在稿件撰写过程中提供的帮助。 本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（Krieger）、William和Ada Isabelle Steel基金（Krieger）以及加拿大卫生研究院（Harden）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 镊子（精细 #5） | Almedic | A10-704 | |
| 硅胶盘（Sylgard Disc） | World Precision Instruments | SYLG184 | 将弹性体基础液与固化剂按10:1比例混合，静置30分钟。倒入模具中（例如 使用12孔细胞培养板）。室温下固化至少24小时。解剖时将其粘附于60 × 15 mm培养皿盖内侧。 |
| 显微销钉（Minutien Pins，尖端直径0.0125 mm） | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 显微解剖剪（超精细） | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| 平台载玻片（Platform Slides） | 用透明指甲油将两片22 × 22 mm2盖玻片粘合在显微镜载玻片上，中间留出约<20 mm的间隙用于样品固定。 | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | 该品系已使用GFP标记的平衡染色体重新平衡，可通过GFP信号的缺失筛选纯合突变体。 |
| 1× PBS（磷酸盐缓冲液）：3 mM NaH2PO4，7 mM Na2HPO4，130 mM NaCl，pH 7.0 | NaH2PO4（Caledon Laboratories - 8180-1），Na2HPO4（Caledon - 8120-1），NaCl（Caledon - 7560-1） | ||
| Bouin固定液 | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA（多聚甲醛）：1× PBS中含4% PFA | PFA（Anachemia Science - 66194-300）。配制方法参见 doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006。 | ||
| [header] | |||
| 1× PBT（含Triton的磷酸盐缓冲液）：1× PBS中含0.01% Triton | Triton X-100（Sigma-Aldrich - T8787） | ||
| 1% BSA（牛血清白蛋白）：1% BSA溶于1× PBT | BSA（Bioshop Canada - ALB001）。4 °C保存。 | ||
| 小鼠抗Dlg（Discs large）抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | 用1% BSA按1:10稀释后使用。 |
| 兔抗HtsM（Hu-li tai shao）抗体 | 由耶鲁大学Lynn Cooley博士提供。用1% BSA按1:250稀释后使用。 | ||
| 兔抗Pak（p21激活激酶）抗体 | 由西蒙弗雷泽大学Nicholas Harden博士提供。用1% BSA按1:500稀释后使用。 | ||
| 小鼠抗Wg（Wingless）抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | 用1% BSA按1:5稀释后使用。 |
| 山羊抗Hrp（辣根过氧化物酶）抗体 | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | 用1% BSA按1:200稀释后使用。 |
| FITC标记的驴抗山羊抗体 | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | 用1% BSA按1:200稀释后使用。 |
| Duolink原位PLA探针 抗小鼠 MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink原位PLA探针 抗兔 PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink原位检测试剂 红色 | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1× 洗涤缓冲液A：0.01 M Tris，0.15 M NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris（Caledon Laboratories - 8980-1），NaCl（Caledon - 7560-1），Tween 20（Fisher Scientific - BP337） |
| 1× 洗涤缓冲液B：0.2 M Tris，0.1 M NaCl，pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris（Caledon Laboratories - 8980-1），NaCl（Caledon - 7560-1） |
| 0.01× 洗涤缓冲液B：2 mM Tris，1 mM NaCl，pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris（Caledon Laboratories - 8980-1），NaCl（Caledon - 7560-1） |
| Duolink原位封片介质（含DAPI） | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
参考文献
- Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
- Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scri....
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