Summary
此协议演示如何接近结扎检测试剂盒可用于检测原位蛋白质-蛋白质相互作用的果蝇幼虫神经肌肉接头。利用这种技术，光盘大和胡立泰邵示，以形成一复合的突触后区域，预先通过共免疫沉淀鉴定的关联。
Introduction
果蝇光盘大（DLG）是支架蛋白，帮助协调的大蛋白质复合物的装配在质膜的特定位点的膜相关鸟苷酸激酶家族的保守构件。最初鉴定为肿瘤抑制蛋白，了Dlg用作上皮apicobasal极性1,2,3的重要决定因素。 DLG还担任以谷氨酸运动神经元的神经肌肉接头（NMJ）幼虫发育期间4的一大棚架模块。 DLG扮演的幼虫NMJ不同的角色，其多效依靠其与多种蛋白质5,6联系起来的能力。一个这样的蛋白是胡立泰邵（HTS），同源到主要被问候的调节肌动蛋白细胞骨架血影7描述自己的角色哺乳动物adducins。先前已表明了Dlg和HTS可以形成彼此基于体外复杂8共免疫沉淀实验。这些结果的一个缺点，但是，是它们不表示其中这个复杂的形式。通过使用免疫组化，和了Dlg HTS的分布观察幼虫NMJs的突触后膜重叠，但他们在该地区8复杂？由于最近的研究显示，进一步这里详述，接近结扎测定（PLA）是用来专门寻找一个在了Dlg和HTS之间的关联就地在幼虫NMJ 27。
PLA是一种使用主要集中在细胞和组织培养，可以检测原位 9蛋白质-蛋白质相互作用相对较新的技术。在该试验中，对两种蛋白的兴趣初级抗体与一对种特异性的第二抗体来检测，称为PLA探针，其缀合到寡核苷酸（ 图1A，B）。如果这两个蛋白s为在（内几十纳米的IE）靠近彼此，附加的PLA探针之间的距离可以通过增加两个连接器的寡核苷酸（ 图1C）的杂交来桥接。在这个构象中，连接器的寡核苷酸的自由端靠得足够近，以使彼此接触，以及一个闭合环状DNA分子可以在原位结扎（ 图1D）来形成。该环状DNA分子用作原位滚环扩增，这是由偶联到PLA探针（ 图1E）的寡核苷酸的一个引物的模板。所得扩增，concatemeric DNA产物中的序列然后可以可视化用荧光标记的，互补的寡核苷酸探针（ 图1F）。由于扩增的DNA保持附着到一个PLA探针，蛋白质 - 蛋白质相互作用withi的亚细胞定位NA组织可以很容易地确定。
几种方法通常用于检测蛋白质-蛋白质相互作用包括例如共免疫沉淀体外技术，下拉测定法和酵母双杂交筛选，并在如荧光共振能量转移（FRET）和双分子荧光互补体内技术（附设）。的体外技术的缺陷在于，它们不识别，其中相互作用是内源性存在的，而在上述的体内技术包括融合蛋白的人工表达，可能无法反映其内源性的对应的本机的行为。 PLA的一个主要优点是，它能够在组织内确定的内源蛋白相互作用物是在靠近彼此并可能形成复合物的亚细胞定位的，以产生一个信号是可比的FR所需亲密度ET和附设。 PLA可以检测具有高特异性和灵敏度的相互作用由于抗体识别和DNA扩增的耦合。因此，该测定法可以产生在泪点中，揭示了相互作用的确切位置的形式的离散，明亮的信号。此外，几乎不可见的抗原可被检测到。最后，PLA是一种相对简单的技术来执行，这需要不超过一个标准的免疫程序来完成。因此，PLA提供了技术优势，常常困扰着长的制备时间和广泛的故障排除其它的蛋白质 - 蛋白质相互作用测定。
此协议演示PLA如何可以适用于果蝇幼虫NMJ用于检测原位的内源蛋白质-蛋白质相互作用的目的。这里，聚乳酸的是幼虫体壁肌肉制剂哪里了Dlg和HTS被示为在一个复杂的确实存在于NMJs的突触后区域进行。解放军过去一直没有被用于研究幼虫NMJ，并有目前只有少数已经使用这个实验果蝇组织中发表的论文。希望解放军进一步暴露在果蝇社会将导致作为一个额外的工具，它越来越多地使用，以补充其他更常用的蛋白质-蛋白质相互作用分析。
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Protocol
1.体壁准备
注意：3龄幼虫体壁的制备（用于NMJs其支配体壁肌肉的研究）中的如先前在Brent 等 10，或德兰和Budnik 11,12所述进行，但具有一些修改。
- 解剖
- 提高苍蝇种群和杂交在25℃下，使用标准方法13 5〜6 天。
- 挑选使用细镊子小瓶或瓶爬三龄幼虫。
- 洗在含有磷酸盐缓冲盐水（PBS），以除去任何食物颗粒的小皮氏培养皿的幼虫。
- 将一个单一的幼虫到SYLGARD盘，沉浸在一个几滴冰冷的PBS。用冰冷的PBS将有助于眩晕使其更容易操纵幼虫。整个夹层，确保该制剂总是浸没在PBS中，以防止其干燥。
- 定位LARVA其背侧朝上使得两个气管道是在解剖显微镜（ 图2A）下可见。使用镊子抓住一个minutien销，销的幼虫向下在靠近气孔（ 图2B）的后端。与其他针，刺透角质层在靠近口钩的前端。轻轻舒展幼虫出纵向，则针下来（ 图2B）。
- 采用显微剪，捏近销后端来创建一个小口。切口应肤浅不够的，只是通过角质层。
- 放置剪刀的底部叶片的尖端插入切口，沿着两个气管束（ 图2C）之间的背中线的整个长度切割。切割时避免损坏腹体壁肌肉点剪刀片轻微向上。
- 做一个小切口水平稍微先于后eriorly放置销（ 图2C）。使另一个类似的切口略微后方的前方放置的销（ 图2C）。切口应该只通过角质层。
注：从步骤1.1.7和1.1.8结合起来应该像一个三切口“
“已完成时， 也就是说 ，在幼虫体的背侧的左和右挡板应来制造。 - 认真清理内脏的镊子。加入数滴有力PBS将有助于取代器官出幼虫体内，从而使其更容易将其删除。避免戳幼虫的身体，因为它会造成对身体的损害墙上的肌肉。
- 打出幼虫体内开放，针角向下（ 图2D）。当寄托，舒展身体墙面水平和垂直方向形成均匀的张矩形（SEE 图2G为形状），小心不要撕破体壁肌肉中的过程。
- 完成删除任何剩余的内脏（ 图2E）。
- 固定和透
- 沉浸在固定体墙壁几滴布安的解决方案。孵育在冰上15分钟。另外，使用4％多聚甲醛（PFA）作为替代固定剂;温育30分钟。
- 漂洗三次，磷酸盐缓冲溶液用Triton（PBT）。
- 用细镊子，小心地取出针和体壁由自己的角落转移到硅化0.65毫升的离心管。
- 存储体墙壁PBT在4°C，直到准备PLA。为了达到最佳效果，开始一两天夹层内的免疫染色体墙壁。
注意：为了节省试剂，并确保所有体壁在测定期间一视同仁，不同基因型可以放置成一个单一的管。基因型可以通过切割主体壁的角部不一样（ 见图2F的例子）来区分。
“已完成时， 也就是说 ，在幼虫体的背侧的左和右挡板应来制造。 2.免疫组化
。如前面布伦特等 14德兰和Budnik 11所述进行免疫染色的三龄幼虫体墙，但也有一些改动11,14：注意。
注：执行所有步骤在室温和温和搅拌，除非另有说明。
- 闭塞
- 与PBT，每次10分钟洗身壁三次。
- 用1％牛血清白蛋白（BSA）的1小时阻断。
- 染色
- 孵育体壁与小鼠和兔的初级抗体对两种蛋白质的利益为2小时，在室温下，或过夜，在4℃（稀释在1％BSA）。在这种情况下，使用1点10小鼠抗了Dlg和1：250的兔一NTI-HtsM 15,16。针对未在小鼠或兔制成标记抗体也被包括- 例如 ，使用1：200的山羊抗-HRP来描绘神经元膜。
- 与PBT，每次10分钟洗三次。
- 用荧光标记的二抗孵育，以检测标志物（稀释在1％BSA）处理2小时，在室温下，或过夜，在4℃。作为PLA信号后可视化用红色荧光团，另一个荧光团必须被用来检测标记物- 例如 ，使用1：200的FITC缀合的抗山羊检测山羊抗HRP抗体。由于使用的光敏感的试剂，保持在黑暗中的管从这时开始。
注意：所使用的试剂盒可用于PLA将在小鼠和兔升高初级抗体之间进行的，以可视化下共聚焦显微镜红色通道的信号。如果需要的话，其他的试剂盒可允许测定用表面进行RY抗体提出在其他物种，并且在其他信道上可视信号。
3.接近结扎分析
注：执行所有步骤在室温和温和搅拌，除非另有说明。
- 解放军探头
- 与PBT，每次10分钟洗身壁三次。
- 孵育与PLA探针（1：5稀释的每个中的1％BSA）2小时，在37℃。在这种情况下，使用40微升PLA探针抗小鼠MINUS，40微升PLA探针抗兔PLUS，或120微升的1％BSA的，以确保为5-10体壁适当浸泡和混合。高达1:25稀释的PLA探针仍然可导致足够的信噪比（ 即 ，对于这个实验）。
- 结扎
- 每次5分钟洗身体的墙壁用洗涤缓冲液A的两倍。
- 孵育结扎溶液（1:40稀释连接酶的连接缓冲液）进行1小时的吨37℃。在这种情况下，使用5微升连接酶，40微升5连接缓冲液和155微升的高纯度水，以确保为5-10体壁适当浸泡和混合。
- 放大
- 每个2分钟洗身体的墙壁用洗涤缓冲液A的两倍。
- 孵育在37℃下扩增溶液（1:80稀释聚合酶的扩增缓冲液）处理2小时。在这种情况下，使用2.5微升聚合酶，40微升5扩增缓冲液和157.5微升的高纯度水，以确保为5-10体壁适当浸泡和混合。
- 成像准备
- 每10分钟，洗身壁用洗涤缓冲液B的两倍。
- 与0.01X洗涤液B一次，持续1分钟洗净。
- 平衡在几滴为至少30分钟的安装溶液的安装之前，或过夜储存于4℃。
- 用细镊子，小心身体墙壁转移到一个平台幻灯片瓦特第i个他们的角质层朝下。定位体壁中的行数和在内部封固的一个或两个压降相同的方向。将22毫米×40mm的盖玻片上的准备，注意不要产生气泡，然后用密封透明指甲油的幻灯片。
- 储存在黑暗中在-20℃下将载玻片直到准备共焦成像。
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Representative Results
在野生型的第三龄幼虫NMJs，的DLG为主发现在I型谷氨酸突触小结的突触后膜，用了Dlg免疫水平是在式Ib的终扣更加明显比类型是终扣（ 图3A）4。 HTS是整个肌肉存在，但集中于与HTS免疫反应水平出现等于在两个I型终扣突触后区域，并且还发现了突触前（ 图3A'）8,17。注意了Dlg和HTS的分布在突触后区域（ 图3A''）8很大程度上重叠。
如果要判断了Dlg和HTS存在于一个复杂的NMJ，PLA两种蛋白质之间的幼虫体壁肌肉的准备工作完成。对于该测定，小鼠抗了Dlg抗体，其检测在N-末端和兔抗HtsM抗体的第二PDZ结构域其检测在C-末端MARCKS同源域被用来15,16。在野生型，PLA了Dlg和HTS之间的信号，观察具体地说在NMJ（ 图3C-C''）。所述信号大多局限在圆周向I型终扣，将其周围限定由HRP的突触前膜，从而表明了Dlg和HTS非常靠近彼此并可能形成复合物，在突触后的区域。结果被确定为具体的作为我们的阴性对照，涉及缺乏HTS免疫HTS 01103突变NMJs（ 图3B-B''），没有表现出可观察到的聚乳酸的信号（ 图3D）8,17,18。此外，聚乳酸进行不添加兔抗HtsM抗体不产生信号（数据未显示）。所述终扣的高放大视图显示了Dlg和HTS免疫严重重叠在突触后区域（ 图3E）的，而这两种蛋白之间PLA导致谨慎泪点指示该总了Dlg和HTS蛋白的一个子集是在复杂的（ 图3F）。
进一步测试PLA的可靠性研究幼虫NMJ的工具，我们还评估了丝氨酸/苏氨酸的p21活化激酶，白，以及其他突触蛋白19之间的相互作用。先前免疫共沉淀实验表明，Pak是自由曲线复杂，其中了Dlg也是构件20的构件。在野生型NMJs，白定位于突触后密度（ 图4A，C）中，在那里它需要了Dlg定位15,21。白和了Dlg的免疫反应性分布的两种蛋白质产生了阳性信号特别在NMJ（ 图4B）之间重叠在突触后区域（ 图4A''），和聚乳酸。这些结果表明，这两种蛋白是在C失去相互接近，并有可能形成在该区域的复合物。我们测试了白复合物结合另一突触蛋白是无翅（WG）， 果蝇 Wnt配体，这在NMJ 22起着许多作用。在野生型，Wg的富集在I型终扣的突触前和突触后两侧，但也存在在整个肌肉细胞质（ 图4C'）23泪点。有趣的是，虽然白和的Wg的免疫反应性的分布部分地重叠在突触后区域（ 图4C''），聚乳酸两种蛋白质之间产生没有可观察的信号（ 图4D）。因此，白和Wg的不靠近彼此在NMJ。这个结果表明，并非所有示出通过传统的共定位实验重叠免疫反应的蛋白质将产生一个PLA信号，并作为一个额外的阴性对照。
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图1：接近结扎分析示意图。 （A）的初级抗体结合于感兴趣的两种蛋白质使用标准免疫程序。（B）中的第一抗体，然后用一对种特异性的第二抗体来检测，称为PLA探头，它被缀合的寡核苷酸。（℃）如两种蛋白质都在靠近彼此，附加的PLA探针之间的距离可以通过两个附加连接的寡核苷酸杂交来桥接。（D）在本形态中，连接寡核苷酸可以在原位结扎形成闭合环状DNA分子（E） 在原位的环状DNA分子用作模板用于滚环扩增，这是由OLI之一引gonucleotides缀合到PLA探针。（F）中扩增的DNA产物中的序列，然后用荧光标记的，互补的寡核苷酸探针检测出来。请注意，这个数字是基于Weibrecht 等 24。 请点击此处查看图的放大版本。
图2：三龄幼虫体壁准备。 （AF）表示体壁夹层的原理图。（A）将单幼虫到SYLGARD盘，其背面朝上，使两个气管大片都是可见的。（B）引脚幼虫下来的前，后两端与minutien销，拉伸幼虫出纵向的过程中。（C） （D）打出幼虫体内开放，针角下来，水平和垂直拉伸体壁的过程中，形成一个均匀的张矩形。（E）清洁出图中所示的任何剩余的内部器官。（F）是的不同的方式来切断体壁的拐角，以便区分不同基因型的例子。（G）的视图的拉伸体壁的准备完成时。该照片是用数码相机安装在解剖显微镜。在F组比例尺为1毫米。请注意，这个数字是基于德兰和Budnik，2010 12。 请点击此处查看图的放大版本。
图3：了Dlg和HTS存在于复杂的幼虫NMJs的突触后区（AB''）了 Dlg（红色）和HTS（绿色）中的野生型的分布和HTS突变NMJs（AA''）在野外。 -type NMJs，的DLG主要发现于Ⅰ型终扣的突触后膜，用了Dlg层次更加明显的Ib型比终扣。 HTS是整个肌肉本，而且集中围绕突触后区域，具有HTS水平是在I型终扣相似。了Dlg和HTS的重叠分布在突触后的区域。（BB'）NMJs突变的HTS缺乏HTS免疫反应。需要注意的是HTS 01103突变的影响NMJ分支8。（CD''）了 Dlg和HTS之间的PLA（红）对野生型执行， 高温超导突变体NMJs。 HRP是用来标记神经元膜（绿色）。示出的是几个终扣。（CC''）在野生型高倍率的观点，PLA信号在NMJ具体观察到。所述信号大多局限在圆周向I型终扣的突触前膜，这表明了Dlg和HTS非常接近，彼此存在于复杂的突触后的区域。（D）的 NMJs突变为HTS显示没有可观察到的聚乳酸的信号。 （EF）显示的是单突触小结的高倍率的意见。（E）在突触后区域HTS和了Dlg免疫严重重叠。了Dlg和HTS结果在不同的泪点之间（F）的聚乳酸指示该蛋白质的一个子集是在一个复杂的。在面板B'标尺'代表40微米（AB'）;在面板D'标尺'代表10微米（CD''）; SCAL在F组Ë条代表5微米（EF）。所有显示的NMJs来自肌肉中的6/7腹节4影像拍摄与使用尼康A1R激光扫描共聚焦显微镜与NIS-Elements软件合并协议栈，并与Adobe Photoshop处理。 请点击此处查看的放大版数字。
图4：白中存在与了Dlg一个复杂的，但不是WG，在幼虫NMJs的突触后区域（AD）的图中所示是一个几终扣高倍率次（AA'）百（绿）和了Dlg的分布（。红色）的野生型NMJs。朴定位于突触后密度。需要注意的是白和多元学习津贴的免疫反应分布在突触后区重叠。（B）PLA Between乐和了Dlg（红色）在野生型NMJs执行。 PLA信号在NMJ具体观察到，这表明这两种蛋白是在靠近彼此在这个区域。（CC''）中的野生型NMJs分布朴（绿色）和Wg的（红色）的。 WG富集在两个突触前和突触后的NMJ的两侧，但也存在在整个肌肉泪点。需要注意的是白的免疫反应分布也观察到的Wg在突触后区部分重叠。（D）白及的Wg（红色）与中国人民解放军野生型NMJs执行。没有具体的PLA信号被观察到，这表明这两种蛋白是不靠近彼此在NMJ尽管它们重叠分布。在D组比例尺代表5微米（AD）。所有NMJs受神经支配的肌肉6/7的腹节4影像拍摄与使用尼康A1R激光扫描共聚焦显微镜与NIS-Elements软件合并栈，和亲cessed与Adobe Photoshop， 请点击这里查看图的放大版本。
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Discussion
这份报告表明解放军如何应用到果蝇幼虫NMJ。该试验于幼虫体壁肌肉制剂执行用于检测内源蛋白质 - 蛋白质相互作用存在于NMJ的目的。利用这种技术，了Dlg和HTS示出为接近彼此，从而在一个复杂的存在，特别是在突触后区域27。为了支持这一结果，先前的研究已经提供了如下的数据的关联的证据：1）和了Dlg HTS的免疫反应性分布在幼虫NMJs的突触后区重叠，2）了Dlg和HTS形成复合体的基础上共免疫沉淀实验涉及整个成年飞裂解物，和3）了Dlg和HTS在上皮和突触结8相互作用。了Dlg和朴，以前在其他研究中发现了一个互动之间也观察到PLA信号的突触后区域，从而提供进一步的克雷德NCE采用此法在NMJ 15,20,21的。有趣的是，百和的Wg之间解放军导致没有明显的信号，即使他们的免疫反应分布重叠在NMJ。这个结果表明，并非所有的，显示重叠免疫反应的蛋白质的分布将产生一个PLA信号，因此表明PLA提供在检测比传统的共定位研究蛋白质 - 蛋白质相互作用的更高的分辨率。
多种变化，以原来的PLA协议作出以优化测定的幼虫NMJ（数据未显示）9,25。首先，它被确定的1％BSA是一个更好的封闭剂为主体壁，而不是提供封闭液。第二，以产生一个强有力的信噪比体内壁的，适当的浸泡和混合在反应溶液是至关重要的。甲五到十分体壁最小的200微升在0.65 ml离心管被认为suitab乐与解放军探头，连接酶或聚合酶孵化时，虽然卷可以处理更多的身体墙壁时，相应地增加。信号强度也通过在30分钟以上的推荐次数的增加，反应时间增加。第三，进行聚乳酸的探针系列稀释试验来优化试剂保护和信号强度之间的平衡。对于本报告中进行的，高达1:25稀释的实验 - 从推荐1:5稀释 - 仍然可以产生一个合理的信噪比。注意结扎和扩增反应的最优化进行了不执行。最后，由于聚乳酸可以是微小变化敏感，强烈建议不同基因型的单个实验的被放置在一个单一的管，以便控制和实验测定期间同等对待。基因型可以通过切割主体壁的角部不同来区分。
Severa的升方法用于检测果蝇蛋白质-蛋白质相互作用，包括酵母双杂交筛选，免疫共沉淀和FRET。但是，如何这些方法对解放军和可视化原位蛋白质-蛋白质相互作用的能力比较？酵母双杂交可以检测直接在酵母中表达果蝇蛋白质之间的结合，并且它在高通量全基因组的屏幕被使用。虽然许多已确定的相互作用是生物学相关的检测往往会产生误报。此外，假阴性可以发生于多种原因：蛋白质融合到转录因子结构域可具有结合干扰，许多相互作用需要不发生在酵母翻译后修饰，和细胞核（其中所述测试发生）可不是一个合适的环境，某些交互以适当地形成。它与内源性蛋白成交在家乡ENVIR这些问题都没有遇到与PLAonment。可用于检测内源蛋白之间的相互作用的一种方法是免疫共沉淀。涉及果蝇裂解物实验可以揭示在其中发生相互作用的生命周期的组织和阶段。然而，如裂解物形成涉及破碎细胞以提取蛋白质，在其中相互作用发生在组织中的细胞，以及其亚细胞定位，不能评估 - 不像在PLA。此外，共免疫沉淀检测蛋白质复合物的结合，不能区分该复合内蛋白质在接近彼此。有方法如FRET供Drosophilists允许的小区内蛋白质 - 蛋白质相互作用的可视化。然而，FRET涉及融合到荧光标记的转基因蛋白的表达，不反映内源性蛋白的行为在解放军。
尽管它有优点，也有一些limitat离子在使用PLA。一个这样的限制是针对感兴趣这是在不同物种所作的蛋白质的初级抗体的可用性。这个问题可以很容易地使用转基因标记蛋白的规避，尽管他们可能不是真正代表内生互动。另一个问题是，聚乳酸可能产生假阴性， 例如 ，当两个初级抗体在空间上阻碍彼此或当初级抗体之一的表位涉及蛋白质-蛋白质相互作用位点。此外，虽然聚乳酸检测的蛋白质;这些都是接近彼此，它不直接和间接的蛋白质 - 蛋白质相互作用区分，不像在下拉测定法和酵母双杂交筛选。此外，内源蛋白质之间PLA不会识别哪些域是负责的相互作用。因此，其它的蛋白质 - 蛋白质相互作用测定法仍然是需要的充分表征的相互作用molecularl年。
研究人员利用超分辨率显微镜来绘制果蝇幼虫NMJ的空间架构开始，随着正在实现几十纳米的26项决议。 PLA，其可比分子的分辨率，应该提供一个低成本，在技术上简单补充这些研究，将在建立的许多蛋白质在NMJ的组织的详细视图帮助。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢布鲁明顿果蝇库存中心提供飞股票。我们也感谢发展研究杂交瘤细胞银行和林恩博士库利（耶鲁大学）提供抗体。特别感谢以AhHyun侑为她的手稿帮助。这项工作是由来自加拿大自然科学和工程研究理事会（克里格），威廉和Ada伊莎贝尔钢铁基金（克里格），和健康研究加拿大学院（哈登）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps (fine #5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Precision Instruments | SYLG184 | Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60 x 15 mm Petri dish lid when dissecting. |
| Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection Scissors (ultra fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Platform Slides | Glue two 22 x 22 mm2 coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20 mm gap in between for sample mounting. | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal. |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1) | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS | PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787) | ||
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT | BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 °C. | ||
| mouse anti-Dlg (Discs large) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Use at a 1:10 dilution in 1% BSA. |
| rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) | Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA. | ||
| rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) | Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA. | ||
| mouse anti-Wg (Wingless) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | Use at a 1:5 dilution in 1% BSA. |
| goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| FITC-conjugated donkey anti-goat | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Wash Buffer A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337) |
| 1x Wash Buffer B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| 0.01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
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