Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Påvisning af Published: January 20, 2015 doi: 10.3791/52139
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University, 2Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

Summary

Denne protokol viser, hvordan Proximity ligeringsassayet kan anvendes til at påvise in situ protein-protein interaktioner på Drosophila larver neuromuskulære junction. Med denne teknik, er Diske store og Hu-li tai Shao vist at danne et kompleks på den postsynaptiske region, en forening tidligere identificeret gennem samarbejde immunoudfældning.

Introduction

Drosophila Discs store (Dlg) er et konserveret medlem af membran-associeret guanylat kinase familien af stilladser proteiner, der hjælper organisere samlingen af store proteinkomplekser på specifikke steder af plasmamembranen. Oprindeligt identificeret som en tumor suppressor protein DLG tjener som en vigtig faktor for epitelial apicobasal polaritet 1,2,3. DLG fungerer også som en vigtig stillads modul ved den neuromuskulære forbindelse (NMJ) af glutamaterge motoriske neuroner i larveudvikling 4. DLG spiller forskellige roller på den larve NMJ, og dens pleiotropism afhængig af sin evne til at associere med flere proteiner 5,6. Et sådant protein er Hu-li tai Shao (HTS), en homolog til de mammale adducins, der hovedsageligt er beskrevet i forhold til deres roller i regulering af actin-spektrin cytoskeleton 7. Det er tidligere blevet vist, at DLG og Hts kan danne et kompleks med hinanden baseret på in vitro 8. En mangel af disse resultater, er imidlertid, at de ikke angiver, hvor det komplekse former. Med brug af immunhistokemi er fordelingerne af DLG og Hts observeret at overlappe på den postsynaptiske membran af larver NMJs, men er de i et kompleks i denne region 8? Som nylig vist og beskrevet yderligere her er Proximity ligeringsassayet (PLA), der anvendes til at lede efter en in situ association mellem DLG og Hts specifikt på larver NMJ 27.

PLA er en relativt ny teknik, der anvendes for det meste i celle- og vævskultur, der kan detektere protein-protein-interaktioner in situ 9. I dette assay er primære antistoffer mod de to proteiner af interesse detekteres med et par artsspecifikke sekundære antistoffer, betegnet PLA sonder, der er konjugeret til oligonukleotider (figur 1A, B). Hvis to proteins er i tæt nærhed af hinanden (dvs. inden for et par snese nanometer), afstanden mellem de vedlagte PLA prober kan bro gennem hybridisering af to yderligere stik oligonukleotider (figur 1c). I denne konformation, de frie ender af forbindelsesdelene oligonukleotider er tæt nok til at komme i kontakt med hinanden, og en lukket cirkulært DNA-molekyle kan dannes ved in situ ligering (figur 1D). Den cirkulære DNA-molekyle tjener som en template for in situ rullende cirkel amplifikation, der primes af en af oligonukleotiderne konjugeret til PLA prober (figur 1E). Sekvenser inden den resulterende amplificerede, concatemeric DNA-produkt kan derpå visualiseret med fluorescensmærkede komplementære oligonukleotidprober (figur 1F). Da det amplificerede DNA forbliver fastgjort til en af ​​PLA prober den subcellulære lokalisering af protein-protein-interaktion withina væv kan let bestemmes.

Flere metoder er almindeligt anvendt til at påvise protein-protein interaktioner, herunder in vitro-teknikker, såsom co-immunopræcipitation, pull-down assays og gær to-hybrid screening, og in vivo teknikker, såsom Förster Resonance Energy Transfer (FRET), og bimolekylær Fluorescence Komplementering ( BiFC). En fælde af in vitro-teknikker er, at de ikke identificere, hvor interaktionen endogent forekommende, mens ovennævnte in vivo teknikker involverer den kunstige ekspression af fusionsproteiner, der kan afvige fra det native adfærd af deres endogene modstykker. En stor fordel af PLA er, at det er i stand til at bestemme i et væv den subcellulære lokalisering af endogent protein interaktionskandidater, som er i tæt nærhed af hinanden og sandsynligvis danner et kompleks med graden af ​​nærhed kræves for at generere et signal, der kan sammenlignes med FRET og BiFC. PLA kan detektere interaktioner med høj specificitet og sensitivitet på grund af koblingen af ​​antistof anerkendelse og DNA-amplifikation. Således kan assayet generere diskrete lyse signaler i form af puncta at afsløre den nøjagtige position af interaktionen. Desuden kan næppe synlige antigener påvises. Endelig PLA er en forholdsvis simpel teknik til at udføre, og det tager længere end en standard immunhistokemiske procedure at fuldføre. Derfor PLA giver en teknisk fordel i forhold til andre protein-protein interaktion assays, som ofte plaget med lange tilberedningstider og omfattende fejlfinding.

Denne protokol viser, hvordan PLA kan anvendes til Drosophila larvestadiet NMJ med henblik på detektering af endogene protein-protein-interaktioner in situ. Her er PLA udføres på larver krop væg muskel præparater, hvor DLG og Hts er vist til faktisk eksistere i et kompleks på den postsynaptiske region NMJs. PLA ikke tidligere er blevet anvendt til at undersøge larve NMJ, og der er på nuværende tidspunkt kun en håndfuld af offentliggjorte papirer, der har brugt denne analyse i Drosophila væv. Det er håbet, at yderligere eksponering af PLA til Drosophila samfund vil resultere i øget anvendelse som et supplerende redskab til at supplere andre, mere almindeligt anvendte protein-protein interaktion assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Krop Wall Forberedelse

BEMÆRK: Forberedelse af tredje stadie larver krop vægge (til undersøgelse af de NMJs der innerverer kropsvæggen muskler) blev udført som tidligere beskrevet i Brent et al 10, eller Ramachandran og Budnik 11,12, men med nogle ændringer..

  1. Dissektion
    1. Hæv flyve lagre og kors ved 25 ° C i fem til seks dage under anvendelse af standard procedurer 13.
    2. Pick kravlende tredje stadie larver fra hætteglas eller flasker med fin pincet.
    3. Vask larver i en lille petriskål indeholdende Phosphate Buffer Saline (PBS) for at fjerne madrester.
    4. Placer et enkelt larve på en Sylgard disk og fordybe det i et par dråber iskold PBS. Brug iskold PBS vil hjælpe bedøve larve gør det lettere at manipulere. Gennem dissektion sikre, at præparatet altid er nedsænket i PBS for at hindre det fra udtørring.
    5. Placer laRVA med sin dorsale opad, så de to luftrør skrifter er synlige under et dissektionsmikroskop (figur 2A). Brug af pincet til at gribe en minutien pin, pin larve ned ved den bageste ende nær Spirakler (figur 2B). Med en anden pin, gennemtrænge neglebånd ved den forreste ende nær mundingen kroge. Forsigtigt strække larve ud i længderetningen, så pin det ned (figur 2B).
    6. Ved hjælp mikrodissektions saks, klemme den bageste ende nær stiften for at skabe en lille åbning. Snittet skal være overfladisk nok bare passere gennem neglebånd.
    7. Placere spidsen af den nederste klinge af saksen i indsnittet, skåret langs hele længden af den dorsale midterlinie mellem de to luftrør skrifter (figur 2C). Pege sakseblade lidt opad, når der skæres at undgå at beskadige de ventrale krop væg muskler.
    8. Lav en lille vandret snit lidt anterior til stillingeneriorly placerede stift (figur 2C). Lav en anden lignende snit lidt posteriort for fortil placerede stift (figur 2C). Snittene skal blot passere gennem neglebånd.
      BEMÆRK: De tre indsnit fra trin 1.1.7 og 1.1.8 Tilsammen skal ligne en " "Når det er udfyldt, dvs. en venstre og højre hånd klap på den dorsale side af larvernes kroppen bør produceres.
    9. Rengør forsigtigt de indre organer med pincet. Tilføje et par kraftfulde dråber PBS vil hjælpe med at flytte organer ud af larvestadiet kroppen, og dermed gøre det lettere at fjerne dem. Undgå at stikke den larve krop, da det vil forårsage skader på kroppen væg muskler.
    10. Folde den larve krop åben og pin hjørnerne ned (figur 2D). Når pinning, strække kroppen væggen både vandret og lodret for at danne en jævnt spændt rektangel (see Figur 2G til formen), pas på ikke at rive kropsvæggen muskler i processen.
    11. Afslut fjerne eventuelle resterende indre organer (Figur 2E).
  2. Fiksering og Permeabilisering
    1. Nedsænkes fastgjorte kroppens vægge i nogle dråber Bouins Solution. Inkuber i 15 minutter på is. Alternativt kan du bruge 4% paraformaldehyd (PFA) som alternativ fiksativ; inkuber i 30 min.
    2. Skyl tre gange med Phosphatbufferopløsning med Triton (PBT).
    3. Ved hjælp af fine pincet, fjern forsigtigt benene og overføre kroppen vægge ved deres hjørner i et silikoniseret 0,65 ml mikrocentrifugerør.
    4. Opbevar kroppen vægge i PBT ved 4 ° C, indtil klar til PLA. For at opnå optimale resultater begynde immunfarvning kroppen vægge inden for en dag eller to af dissektion.
      BEMÆRK: For at spare på reagenser og sikre, at alle kroppens vægge behandles lige under analysen, kan forskellige genotyper placeres i en enkeltrør. Genotyper kan skelnes ved at skære hjørner af kroppen vægge forskelligt (se figur 2F for eksempler).

2. Immunohistokemi

BEMÆRK: immunfarvning af tredje stadie larver krop vægge blev udført som tidligere beskrevet i Brent et al 14 og Ramachandran og Budnik 11, men med nogle modifikationer 11,14..
BEMÆRK: Udfør alle trin ved stuetemperatur og under forsigtig omrøring, medmindre andet er angivet.

  1. Blokering
    1. Vask kroppen vægge med PBT tre gange i 10 min hver.
    2. Blok med 1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time.
  2. Immunfarvning
    1. Inkubér kroppens vægge med muse og kanin primære antistoffer mod de to proteiner af interesse (fortyndet i 1% BSA) i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C. I dette tilfælde skal du bruge 01:10 muse-anti-DLG og 1: 250 kanin aNTI-HtsM 15,16. Antistoffer mod markører, der ikke er fremstillet i mus eller kanin kan også inkluderes - fx bruge 1: 200 gede-anti-HRP at afgrænse de neuronale membraner.
    2. Vask med PBT tre gange i 10 minutter hver.
    3. Inkuber med fluoroforen-konjugerede sekundære antistoffer til påvisning af markører (fortyndet i 1% BSA) i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C. Som PLA signal senere visualiseres med en rød fluorofor skal anden fluorofor anvendes til at detektere den markering - fx bruge 1: 200 FITC-konjugeret anti-ged at detektere gede-anti-HRP-antistof. På grund af anvendelsen af ​​lysfølsomme reagenser holde rørene i mørke fra dette punkt og fremefter.
      BEMÆRK: kit, der anvendes tillader PLA skal udføres mellem primære antistoffer i mus og kaniner, med signalet visualiseret på den røde kanal under konfokal mikroskopi. Hvis det ønskes, er tilgængelige andre kits, der tillader assayet skal ske med primary-antistoffer i andre arter, og signalet visualiseret på andre kanaler.

3. Nærhed ligeringsassayet

BEMÆRK: Udfør alle trin ved stuetemperatur og under forsigtig omrøring, medmindre andet er angivet.

  1. PLA Probes
    1. Vask kroppen vægge med PBT tre gange i 10 min hver.
    2. Inkuber med PLA prober (1: 5 fortynding hver i 1% BSA) i 2 timer ved 37 ° C. I dette tilfælde bruger 40 pi PLA probe anti-muse minus 40 pi PLA probe anti-kanin PLUS og 120 pi 1% BSA for at sikre korrekt nedsænkning og blanding af 5-10 kroppens vægge. Op til 1:25 fortynding af PLA prober kan stadig resultere i et passende signal-til-støjforhold (dvs. til dette eksperiment).
  2. Ligering
    1. Vask kroppen vægge med vaskebuffer A to gange i 5 minutter hver.
    2. Inkuber med Ligering opløsning (1:40 fortynding af Ligase i ligeringsbuffer) i 1 time ent 37 ° C. I dette tilfælde anvende 5 pi ligase 40 pi af 5 ligeringsbuffer og 155 pi højvande renhed for at sikre korrekt nedsænkning og blanding af 5-10 kroppens vægge.
  3. Forstærkning
    1. Vask kroppen vægge med vaskebuffer A to gange i 2 minutter hver.
    2. Inkuber med Amplification opløsning (1:80 fortynding af polymerase i Amplification puffer) i 2 timer ved 37 ° C. I dette tilfælde anvender 2,5 pi polymerase, 40 pi af 5 Amplification Buffer og 157,5 pi højvande renhed for at sikre korrekt nedsænkning og blanding af 5-10 kroppens vægge.
  4. Forberedelse til Imaging
    1. Vask kroppen vægge med vaskebuffer B to gange i 10 minutter hver.
    2. Vask med 0.01x Wash Buffer B gang for 1 min.
    3. Ækvilibrer i et par dråber monteringsløsning til mindst 30 minutter før montering eller gemme natten over ved 4 ° C.
    4. Ved hjælp af fine tænger, omhyggeligt overføre kroppen vægge på en platform dias wed deres neglebånd nedad. Placer kroppen vægge i rækker og i samme retning i en dråbe eller to af mountant. Placer en 22 mm x 40 mm dækglas over forberedelse pas på ikke at generere luftbobler, så forsegle dias med klar neglelak.
    5. Opbevar dias i mørke ved -20 ° C indtil den er klar til konfokal billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I vildtype tredje stadie larver NMJs er Dlg overvejende findes på den postsynaptiske membran af type I glutamaterge boutons, med DLG immunoreaktivitet niveauer bliver mere udtalt i type IB boutons end typen Er boutons (figur 3A) 4. Hts er til stede i hele musklen, men koncentrerer på den postsynaptiske region med Hts immunoreaktivitet niveauer vises ens i både type I boutons, og findes også præsynaptisk (figur 3A) 8,17. Bemærk, at fordelingerne af DLG og Hts stort set overlapper på den postsynaptiske region (figur 3A ') 8.

For at bestemme om DLG og Hts eksisterer i et kompleks på NMJ, PLA mellem de to proteiner blev udført på larvernes kropsvæg muskel præparater. Til dette assay, en muse-anti-Dlg antistof, der detekterer den anden PDZ-domæne ved N-terminus og en kanin anti-HtsM antistofder detekterer MARCKS-homologidomænet ved C-terminalen blev anvendt 15,16. I vildtype blev PLA signal mellem DLG og Hts observeret specifikt på NMJ (figur 3C-C ''). Signalet hovedsagelig lokaliseret perifert til den præsynaptiske membran type I boutons, som blev demarkerede af HRP, hvilket viser, at DLG og Hts er i tæt nærhed til hinanden og sandsynligvis danner et kompleks på den postsynaptiske region. Resultatet blev bestemt til at være specifik, da vores negative kontrol, der involverer HTS 01.103 mutant NMJs der mangler Hts immunoreaktivitet (figur 3B-B ''), viste ingen observerbare PLA signal (figur 3D) 8,17,18. Desuden PLA udføres uden tilsætning af kanin-anti-HtsM antistof produceret noget signal (data ikke vist). Stor forstørrelse udsigt over boutons afslørede, at DLG og Hts immunoreaktivitet groft overlappet på den postsynaptiske region (Figur 3E), Mens PLA mellem de to proteiner resulterede i diskret puncta indikerer, at kun en delmængde af de samlede DLG og Hts proteiner er i kompleks (figur 3F).

For yderligere at teste pålideligheden af PLA som et værktøj til at studere larvestadiet NMJ vi også vurderet interaktioner mellem serin / threonin p21-aktiveret kinase, Pak og andre synaptiske proteiner 19. Tidligere co-immunpræcipitationseksperimenter har vist, at Pak er et medlem af Scribble kompleks, som DLG også et element 20. I vildtype NMJs, Pak lokaliserer til den postsynaptiske densitet (figur 4A, C), hvor det er nødvendigt for Dlg lokalisering 15,21. De immunoreaktive distributioner Pak og DLG overlapper på den postsynaptiske region (figur 4A ''), og PLA mellem de to proteiner resulterede i et positivt signal specifikt på NMJ (figur 4B). Disse resultater indikerer, at de to proteiner er i C miste nærhed til hinanden og er sandsynligvis danne et kompleks i denne region. En anden synaptiske protein vi testet for Pak kompleks binding blev Wingless (WG), Drosophila Wnt ligand, som spiller mange roller i NMJ 22. I vildtype er Wg beriget på præsynaptiske og postsynaptiske sider af type I Boutons, men er også til stede som puncta hele musklen cytoplasmaet (figur 4C) 23. Interessant, selvom immunreaktive distributioner Pak og Wg delvist overlappet på den postsynaptiske region (figur 4C '), PLA mellem de to proteiner produceret ingen observerbar signal (figur 4D). Derfor Pak og Wg ikke er i tæt nærhed til hinanden på NMJ. Dette resultat viser, at ikke alle proteiner, der viser overlappende immunoreaktiviteter gennem traditionelle co-lokalisering eksperimenter vil generere en PLA signal, og tjener som en yderligere negativ kontrol.

ent "FO: keep-together.within-side =" altid "> Figur 1
Figur 1: Skematisk diagram af Proximity ligeringsassayet. (A) primære antistoffer bindes til de to proteiner af interesse under anvendelse af standard immunhistokemiske procedurer. (B) primære antistoffer påvises derefter med et par artsspecifikke sekundære antistoffer, betegnet PLA sonder, der er konjugeret til oligonukleotider. (C), hvis de to proteiner er tæt på hinanden, kan afstanden mellem de vedlagte PLA prober bro gennem hybridisering af to yderligere stik oligonukleotider. (D) i denne konformation, kan forbindelsesdelene oligonukleotider danner en lukket cirkulært DNA-molekyle ved in situ ligering . (E) Den cirkulære DNA-molekyle tjener som en template for in situ rullende cirkel amplifikation, der primes af en af oligonucleotides konjugeret til PLA prober. (F) sekvenser i det amplificerede DNA-produkt påvises derefter med fluorescens-mærkede, komplementære oligonukleotidprober. Bemærk, at tallet var baseret på Weibrecht et al. 24. Klik her for at se en større udgave af figuren.

Figur 2
Figur 2: Fremstilling af tredje stadie larver krop vægge. (AF) skematiske tegninger, der repræsenterer et organ væg dissektion. (A) Placer et enkelt larve på en Sylgard disk med dorsale opad, så de to luftrør skrifter er synlige. (B) Pin larven ned på de forreste og bageste ender med minutien stifter, der strækker larve i længderetningen i processen. (C) (D) folde den larve krop åben og pin hjørnerne ned, strække kroppen væg både horisontalt og vertikalt i processen til at danne en jævnt spændt rektangel. (E) Rent eventuelle resterende indre organer. (F) Der er vist eksempler på de forskellige måder at skære hjørnet af kroppen vægge for at skelne mellem forskellige genotyper. (G) Udsigt til en strakt præparat krop væggen, når afsluttet. Billedet er taget med et digitalt kamera monteret på et dissektionsmikroskop. Scale bar i panel F repræsenterer 1 mm. Bemærk, at tallet var baseret på Ramachandran og Budnik 2010 12. Klik her for at se en større udgave af figuren.


Figur 3: DLG og Hts eksisterer i et kompleks på den postsynaptiske region larver NMJs (AB ') Udlodning af Dlg (rød) og Hts (grøn) i vildtype og hts mutant NMJs (AA.') I naturen. -typen NMJs er Dlg overvejende findes på den postsynaptiske membran af type I boutons, med DLG niveauer bliver mere udtalt i typen Ib end Er boutons. Hts er til stede i hele musklen, men også koncentrater omkring den postsynaptiske regionen, med Hts niveauer er ens i begge type I boutons. Fordelingerne af DLG og Hts overlapper på den postsynaptiske region. (BB ') NMJs mutant for HTS mangler Hts immunoreaktivitet. Bemærk, at HTS 01.103 mutation effekter NMJ forgrening 8. (CD '') PLA mellem DLG og Hts (rød) Udført på vildtype og hts mutant NMJs. HRP anvendes til at markere den neuronale membran (grøn). Vist er stor forstørrelse visninger af et par boutons. (CC '') I vildtype, er PLA signal observeres specifikt på NMJ. Signalet er hovedsagelig lokaliseret perifert til den præsynaptiske membran type I boutons, hvilket indikerer, at DLG og Hts er i tæt nærhed af hinanden, og der findes i et kompleks på den postsynaptiske region. (D) NMJs mutant for HTS viste ingen observerbare PLA signal. (EF) Vist er høj forstørrelse synspunkter enkelt boutons. (E) Hts og DLG immunreaktivitet groft overlap på den postsynaptiske region. (F) PLA mellem DLG og Hts resulterer i særskilte puncta indikerer, at kun en delmængde af proteinerne i en kompleks . Scale bar i panel B '' betegner 40 pm (AB '); Målestokken i Panel D '' udgør 10 um (CD ''); scale bar i panel F udgør 5 um (EF). Alle viste NMJs er fra muskler 6/7 i abdominal segment 4. Billeder blev taget som fusioneret stakke ved hjælp af en Nikon A1R laserscanning konfokal mikroskop med NIS-Elements software, og er behandlet med Adobe Photoshop. Klik her for at se en større udgave af figur.

Figur 4
Figur 4: Pak eksisterer i et kompleks med DLG, men ikke Wg, på den postsynaptiske region larver NMJs (AD) Vist er stor forstørrelse udsigt over et par boutons (AA ') Udlodning af Pak (grøn) og DLG (.. rød) i vildtype NMJs. Pak lokaliserer til den postsynaptiske densitet. Bemærk, at immunoreaktive fordelinger af Pak og DLG overlapper på den postsynaptiske region. (B) PLA Between Pak og DLG (rød) udført på vildtype NMJs. Observeres PLA signal specifikt på NMJ, hvilket indikerer, at de to proteiner er i tæt nærhed til hinanden i denne region. (CC ') Fordelingerne af Pak (grøn) og Wg (rød) i vildtype-NMJs. Wg er beriget på både præsynaptiske og postsynaptiske sider af NMJ, men er også til stede som puncta hele musklen. Bemærk, at det immunoreaktive fordeling af Pak også observeret delvis overlapper Wg på den postsynaptiske region. (D) PLA mellem Pak og Wg (rød) udføres på vildtype-NMJs. Der observeres ingen specifik PLA signal, hvilket indikerer, at de to proteiner ikke er i tæt nærhed til hinanden på NMJ trods deres overlappende distributioner. Scale bar i Panel D betegner 5 um (AD). Alle NMJs innerverer muskler 6/7 i abdominal segment 4. Billeder blev taget som fusioneret stakke ved hjælp af en Nikon A1R laserscanning konfokal mikroskop med NIS-Elements software, og probehandle med Adobe Photoshop. Klik her for at se en større udgave af figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne rapport viser, hvordan PLA kan anvendes på Drosophila larvernes NMJ. Assayet udføres på larvestadiet Kropsvæggen muskel præparater med henblik på påvisning af endogene protein-protein interaktioner stede på NMJ. Med denne teknik er DLG og Hts vist at være i tæt nærhed af hinanden, og således findes i et kompleks, specielt på den postsynaptiske region 27. Til støtte for dette resultat, har en tidligere undersøgelse dokumenteret, at de sammen med følgende data: 1) de immunoreaktive fordelinger af DLG og Hts overlapper på den postsynaptiske region larver NMJs, 2) DLG og Hts danner et kompleks baseret på samarbejde immunopræcipitationsforsøg involverer hele den voksne flyve lysater, og 3) DLG og Hts interagerer i både epitel og synaptiske vejkryds 8. Blev også observeret PLA signal på den postsynaptiske region mellem DLG og Pak, en interaktion tidligere identificeret i andre undersøgelser, hvilket giver yderligere CREDEnce af anvendelse af dette assay på NMJ 15,20,21. Interessant, PLA mellem Pak og Wg medførte ingen observerbar signal, selv om deres immunoreaktive distributioner overlappede på NMJ. Dette resultat viser, at ikke alle proteiner, som viser overlappende immunreaktive distributioner vil generere en PLA signal derfor indikerer, at PLA giver en højere opløsning til påvisning af protein-protein-interaktioner end traditionelle co-lokalisering studier.

Flere ændringer i forhold til den oprindelige PLA-protokollen for at optimere analysen for larvernes NMJ (data ikke vist) 9,25. Først blev det bestemt, at 1% BSA er en bedre blokerende middel til kroppen vægge i stedet for billede Blokering Solution. For det andet, for at producere et stærkt signal-til-støjforhold, korrekt nedsænkning og blanding af kroppens vægge i reaktionsopløsninger er kritisk. Mindst 200 pi i fem til ti krop vægge i et 0,65 ml mikrocentrifugerør blev anset Velegnle når inkubation med PLA sonder, ligase eller polymerase, selvom de mængder, der kan øges tilsvarende ved behandling mere krop vægge. Signalstyrke blev også forbedret ved at øge reaktionstiden med 30 minutter over de anbefalede tidspunkter. For det tredje blev en seriefortynding test af PLA prober udført for at optimere balancen mellem reagens bevaring og signalstyrke. Til eksperimenterne udført i denne rapport, op til 1:25 fortynding - fra den anbefalede 1: 5 fortynding - kan stadig frembringe et rimeligt signal-til-støj-forholdet. Bemærk, at optimering af ligeringen og amplifikationsreaktioner blev ikke udført. Endelig da PLA kan være følsom over for ændringer minut, anbefales det kraftigt, at de forskellige genotyper af et enkelt forsøg er placeret i et enkelt rør, således at de kontroller og eksperimenter behandles lige under analysen. Genotyper kan skelnes ved at skære hjørner af kroppen vægge forskelligt.

Several metoder anvendes til påvisning af Drosophila protein-protein interaktioner, herunder gær to-hybrid screening, co-immunpræcipitering og FRET. Men hvordan disse metoder sammenligne med PLA og dens evne til at visualisere protein-protein interaktioner in situ? Gær to-hybrid kan detektere direkte binding mellem Drosophila proteiner udtrykt i gær, og det er blevet anvendt i high-throughput genom-dækkende skærme. Selvom mange af de identificerede interaktioner er biologisk relevant, analysen ofte producerer falsk-positive. Desuden kan falske negativer forekomme for flere grunde: proteinerne er fusioneret til transkriptionsfaktor domæner, som kan interferere med binding mange interaktioner kræver post-translationelle modifikationer, som ikke forekommer i gær, og kernen (hvor analysen finder sted) kan ikke være et passende miljø for nogle interaktioner til korrekt form. Sådanne spørgsmål er ikke stødt på med PLA, da det omhandler endogene proteiner i deres oprindelige envirjøet. En fremgangsmåde, der kan anvendes til at detektere interaktioner mellem endogene proteiner co-immunofældning. Eksperimenter med Drosophila lysater kan afsløre vævet og trin i livscyklussen, hvor en interaktion forekommer. Men som lysat dannelse involverer sprængning af cellerne til at udtrække proteinerne, de celler i væv, i hvilket vekselvirkningen forekommer i, samt dets subcellulære lokalisering, kan ikke vurderes - i modsætning til i PLA. Endvidere co-immunpræcipitering detekterer protein-kompleks bindende og kan ikke skelne mellem, hvilke proteiner i komplekset er i tæt nærhed til hinanden. Der findes metoder, såsom FRET rådighed for Drosophilists der tillader visualisering af protein-protein-interaktioner i cellen. Men FRET involverer overekspression af transgene proteiner fusioneret til fluorescerende tags og kan afvige endogent protein adfærd som i PLA.

Trods sine fordele, er der nogle limitationer ved brug PLA. En sådan begrænsning er tilgængeligheden af ​​primære antistoffer mod proteinerne af interesse, som er lavet i forskellige arter. Dette problem kan nemt omgås ved anvendelse af mærkede transgene proteiner, selv om de måske ikke er helt repræsentativt for den endogene interaktion. Et andet problem er, at PLA kan frembringe falske negativer, fx når de to primære antistoffer sterisk hindre hinanden, eller når epitopen af en af de primære antistoffer involverer protein-protein-interaktion site. Desuden, selv om PLA detekterer proteiner, som er i tæt nærhed af hinanden, ikke skelner den mellem direkte og indirekte vekselvirkninger protein-protein, i modsætning til pull-down assays og gær to-hybrid screening. Endvidere vil PLA mellem endogene proteiner ikke identificere, hvilke domæner er ansvarlig for interaktionen. Således vil andre protein-protein interaktion assays stadig være behov for fuldt ud at karakterisere interaktionen molecularly.

Forskere er begyndt at bruge super-opløsning mikroskopi at kortlægge den rumlige arkitektur Drosophila larvestadiet NMJ, med beslutninger af snesevis af nanometer opnås 26. PLA, med sin sammenlignelig molekylære beslutning, bør give en lav pris, teknisk enkel supplement til disse undersøgelser, der vil støtte i at opbygge et detaljeret billede af organiseringen af ​​de mange proteiner på NMJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Bloomington Drosophila Stock Center for at give flyve bestande. Vi takker også Developmental Studies Hybridoma Bank og Dr. Lynn Cooley (Yale University) til at tilvejebringe antistoffer. En særlig tak går til AhHyun Yoo for hendes hjælp på manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (Krieger), William og Ada Isabelle Steel Fund (Krieger) og den canadiske Institutes of Health Research (Harden).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps (fine #5) Almedic A10-704
Sylgard Disc World Precision Instruments SYLG184 Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60 x 15 mm Petri dish lid when dissecting.
Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) Fine Science Tools 26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine) Fine Science Tools 15200-00
Platform Slides Glue two 22 x 22 mm2 coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20 mm gap in between for sample mounting.
w1118 Bloomington Drosophila Stock Center 3605
hts01103 Bloomington Drosophila Stock Center 10989 Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.
Name Company Catalog Number Comments
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discs large) Developmental Studies Hybridoma Bank 4F3 Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.
mouse anti-Wg (Wingless) Developmental Studies Hybridoma Bank 4D4 Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.
goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) Jackson              ImmunoResearch 123-065-021 Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
FITC-conjugated donkey anti-goat Jackson             ImmunoResearch 705-095-003 Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS Sigma-Aldrich DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents Red Sigma-Aldrich DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 Sigma-Aldrich DUO82049 Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 Sigma-Aldrich DUO82049 Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 Sigma-Aldrich DUO82049 Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
  2. Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
  3. Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
  4. Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
  5. Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
  6. Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
  7. Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
  8. Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
  9. Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
  10. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
  11. Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
  12. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  13. Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).
  14. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
  15. Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
  16. Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
  17. Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
  18. Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
  19. Bokoch, G. M. Biology of the p21-Activated Kinases. Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).
  20. Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
  21. Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
  22. Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  23. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
  24. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  25. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
  26. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
  27. Wang, S., et al. Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).

Tags

Neuroscience adducin krop væg dissektion udviklingsmæssige biologi Diske store, Hu-li tai Shao immunhistokemi neuromuskulære forbindelse neurovidenskab protein-protein interaktion Nærhed ligeringsassayet tredje stadie larver
Påvisning af<em&gt; In Situ</em&gt; Protein-protein-komplekser på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Neuromuskulær Junction Brug Proximity ligeringsassayet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Yoo, S., Kim, H. y., Wang, … More

Wang, S., Yoo, S., Kim, H. y., Wang, M., Zheng, C., Parkhouse, W., Krieger, C., Harden, N. Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (95), e52139, doi:10.3791/52139 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter