Summary
Dieses Protokoll zeigt, wie Proximity Ligation Assay kann verwendet werden, um in situ Protein-Protein-Wechselwirkungen an der Drosophila Larvenneuromuskulären Verbindung nachzuweisen. Mit dieser Technik werden Discs großen und Hu-li tai Shao gezeigt, um einen Komplex an der postsynaptischen Region, eine Vereinigung die vorher durch Co-Immunpräzipitation identifiziert bilden.
Introduction
Drosophila Discs groß (DLG) ist ein konserviertes Mitglied der membranassoziierten Guanylatkinase Familie von Gerüsten Proteine dirigieren die Montage von großen Proteinkomplexen an spezifischen Stellen der Plasmamembran beitragen. Ursprünglich identifiziert als ein Tumorsuppressor-Protein dient Dlg einer wichtigen Determinante der epithelialen apicobasal Polarität 1,2,3. Dlg dient auch als eine Hauptgerüstmoduls an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) der glutamatergen Motoneuronen im Larvenentwicklung 4. Dlg spielt verschiedene Rollen bei der Larven NMJ und seine Polyphänie beruht auf seiner Fähigkeit, mit mehreren Proteinen 5,6 assoziieren. Ein solches Protein ist Hu-li tai Shao (HTS), ein Homolog zu den Säuger adducins, die hauptsächlich in Bezug auf ihre Rolle bei der Regulation des Actin-Zytoskeletts Spektrin 7 beschrieben. Es wurde zuvor gezeigt, dass dlg Hts einen Komplex miteinander anhand von in vitro zu bilden 8. Ein Nachteil dieser Ergebnisse ist jedoch, dass sie nicht anzeigen, wo diese komplexen Formen. Mit der Verwendung von Immunhistochemie, werden die Verteilungen und dlg Hts beobachtet, an der postsynaptischen Membran der Larven NMJs lappen, aber sie sind in einem Komplex in diesem Bereich 8? Wie kürzlich gezeigt und weiter hier beschrieben wird Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden, um für eine in situ-Verbindung zwischen Dlg und Hts speziell auf die Larven NMJ 27 aussehen.
PLA ist eine relativ neue Technik, vor allem in der Zell- und Gewebekultur, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ 9 erkennen kann. In diesem Assay werden primäre Antikörper gegen die beiden Proteine von Interesse mit einem Paar von artspezifischen sekundären Antikörper nachgewiesen, genannt PLA-Sonden, die an Oligonucleotide konjugiert sind (1A, B). Wenn die zwei Proteins sind in unmittelbarer Nähe zueinander befinden (dh innerhalb von wenigen zehn Nanometern), wobei der Abstand zwischen den angebrachten PLA Sonden können durch Hybridisierung von zwei zusätzlichen Anschluß Oligonukleotide (1C) überbrückt werden. In dieser Konformation sind die freien Enden der Stecker Oligonukleotide nahe genug, um einen Kontakt miteinander herzustellen, und einer geschlossenen, ringförmigen DNA-Molekül kann auf in situ-Ligation (1D) ausgebildet werden. Die kreisförmige DNA-Molekül als Matrize für die in situ Wälzkreis Verstärkung, die durch eines der Oligonukleotide an die PLA-Sonden (1E) konjugiert grundiert wird. Sequenzen innerhalb der resultierenden amplifizierten, konkatemeren DNA-Produkt kann dann mit fluoreszenzmarkierten, komplementär Oligonukleotidsonden (1F) visualisiert werden. Da die amplifizierte DNA bleibt an einer der PLA-Sonden, die subzelluläre Lokalisierung des Protein-Protein-Wechselwirkung withi befestigtna Gewebe kann leicht festgestellt werden.
Mehrere Verfahren sind häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen, einschließlich In-vitro-Verfahren, wie Co-Immunopräzipitation, Pulldown-Assays und Hefe-Zwei-Hybrid-Screening, und in-vivo-Techniken, wie Förster Resonance Energy Transfer (FRET) und Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation ( BIFC). Ein Problem der in-vitro-Techniken ist, dass sie nicht erkennen, wo die Wechselwirkung endogen vorkommenden, während die zuvor erwähnten in vivo Techniken beinhalten die künstliche Expression von Fusionsproteinen, die das native Verhalten ihrer endogenen Gegen nicht reflektieren kann. Ein wesentlicher Vorteil der PLA ist, dass es in der Lage die Bestimmung innerhalb eines Gewebes die subzelluläre Lokalisation des endogenen Protein-Interaktoren, die in unmittelbarer Nähe zueinander sind, und wahrscheinlich ein Komplex gebildet ist, mit dem Näherungsgrad erforderlich, um ein Signal, das vergleichbar FR erzeugenET und BIFC. PLA kann Wechselwirkungen mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit aufgrund der Kopplung der Antikörpererkennung und die DNA-Amplifikation nachzuweisen. So kann der Assay diskreten strahlend Signale in Form Pünktchen, die die exakte Position der Wechselwirkung offenbaren erzeugen. Außerdem kann kaum sichtbar Antigene nachgewiesen werden. Schließlich ist PLA eine relativ einfache Technik, um durchzuführen, und es nimmt nicht mehr als eine Standard-immunhistochemischen Verfahren abzuschließen. Daher stellt PLA einen technischen Vorteil gegenüber anderen Protein-Protein-Interaktionsassays, die oft mit langen Vorbereitungszeiten und umfangreiche Fehlersuche ein Problem dar.
Dieses Protokoll zeigt, wie PLA kann dem Drosophila Larven NMJ zwecks Erfassen endogenes Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ aufgebracht werden. Hier wird PLA auf Larvenkörperwand Muskel Zubereitungen, für Dlg und Hts erweisen sich in der Tat in einer Anlage sind im postsynaptischen Region NMJs geführt. PLA wurde zuvor nicht verwendet werden, um die Larven NMJ untersuchen, und es gibt derzeit nur eine Handvoll von publizierten Arbeiten, das diesen Assay in Drosophila Gewebe verwendet wurden. Es ist zu hoffen, daß eine weitere Belichtung der PLA zu dem Drosophila-Gemeinschaft wird der erhöhten Verwendung als zusätzliches Werkzeug führen zu anderen, üblicherweise verwendeten Protein-Protein Interaktionsassays ergänzen.
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Protocol
1. Körper Wand Vorbereitung
HINWEIS: Herstellung der dritten Larvenlarvenkörperwände (zum Studium der NMJs die die Körperwand Muskeln innervieren) wurde durchgeführt, wie zuvor in Brent et al 10 oder Ramachandran und Budnik 11,12 beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen..
- Präparation
- Heben fly Aktien und Kreuzen bei 25 ° C für fünf bis sechs Tage nach Standardverfahren 13.
- Wählen Sie kriechen dritten Larvenstadium von Fläschchen oder Flaschen mit feinen Pinzette.
- Der Larven in eine kleine Petrischale gegeben, die Phosphatpuffer-Saline (PBS), um Essensreste zu entfernen waschen.
- Legen Sie eine einzelne Larve auf eine Sylgard Scheibe und tauchen Sie es in ein paar Tropfen eiskaltem PBS. Mit eiskaltem PBS wird dazu beitragen, zu betäuben die Larve dass es leichter zu manipulieren. Während der gesamten Präparation zu gewährleisten, dass das Präparat immer in PBS eingetaucht, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Positionieren Sie den larva mit seiner Rückenseite nach oben, so dass die beiden Luftröhrenwege unter einem Präpariermikroskop (2A) sichtbar sind. Mit der Pinzette eine minutien Stift zu greifen, Pin die Larve sich am hinteren Ende in der Nähe der Luftlöcher (2B). Mit einem anderen Stift, durchbohren durch die Kutikula am vorderen Ende in der Nähe der Mundhaken. Sanft dehnen die Larve der Länge nach, dann stecken Sie es nach unten (2B).
- Mit Mikrodissektion Schere, klemmen Sie das hintere Ende in der Nähe des Stiftes, um eine kleine Öffnung zu schaffen. Der Schnitt sollte oberflächlich genug, nur durch die Kutikula passieren.
- Dass sich die Spitze der unteren Klinge der Schere in den Einschnitt entlang der gesamten Länge der Rückenmittellinie zwischen den beiden Luftröhrenbahnen (2C) zu schneiden. Richten Sie die Scherenblätter leicht nach oben beim Schneiden um eine Beschädigung der ventralen Körperwand Muskeln.
- Machen Sie eine kleine horizontaler Schnitt leicht anterioren zur Posteriorly platzierten Stift (2C). Stellen Sie einen anderen ähnlichen Schnitt etwas nach vorne platzierten Stift (2C) posterior. Die Schnitte sollten nur durch die Kutikula weiterzugeben.
HINWEIS: Die drei Schnitte aus den Schritten 1.1.7 und 1.1.8 in Kombination sollte ein ähnlich "
"Wenn sie abgeschlossen sind, das heißt, eine linke und rechte Klappe auf der dorsalen Seite der Larvenkörper hergestellt werden soll. - Sorgfältig reinigen, die inneren Organe mit der Zange. Hinzufügen von ein paar kräftigen Tropfen PBS helfen verdrängen die Organe aus dem Larvenkörper, wodurch es einfacher, sie zu entfernen. Vermeiden Sie stoßen die Larven Körper, wie es zu Schäden an der Körperwand Muskeln führen.
- Rollen Sie das Larvenkörpers offen und stecken Sie die Ecken nach unten (2D). Wenn Pinning, strecken den Körper Wand horizontal und vertikal, um eine gleichmäßige spannte Rechteck bilden (see 2G für die Form), kümmert sich nicht um die Körperwand Muskeln in den Prozess zu reißen.
- Beenden Sie entfernen alle verbleibenden inneren Organe (2E).
- Fixierung und Permeabilisierung
- Tauchen Sie die fixierten Körperwände in mehrere Tropfen Bouin-Lösung. Inkubieren für 15 Minuten auf Eis. Alternativ können Sie auch 4% Paraformaldehyd (PFA) als Alternative Haarfestiger; Inkubation 30 Min.
- Dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Triton (PBT) zu spülen.
- Mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Stifte zu entfernen und die Körperwände durch ihre Ecken in eine silikonisierte 0,65 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Bewahren Sie die Körperwände in PBT bei 4 ° C, bis sie für PLA. Für optimale Ergebnisse, starten Sie eine Immunfärbung der Körperwände innerhalb eines Tages oder zwei der Dissektion.
ANMERKUNG: Um auf Reagenzien zu sparen und um sicherzustellen, daß alle Körperwände gleichmäßig während des Assays behandelt wird, kann unterschiedlichen Genotypen in einer einzigen gelegt werdenRohr. Genotypen können durch Abschneiden der Ecken der Körperwände unterschiedlich (siehe 2F für Beispiele) unterschieden werden.
"Wenn sie abgeschlossen sind, das heißt, eine linke und rechte Klappe auf der dorsalen Seite der Larvenkörper hergestellt werden soll. 2. Immunhistochemie
HINWEIS: Immunfärbung von dritten Larvenlarvenkörperwänden wurde durchgeführt, wie zuvor in Brent et al 14 und Ramachandran und Budnik 11 beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen 11,14..
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln sofern nicht anders angegeben.
- Blockierung
- Dreimal für jeweils 10 min Waschen Sie die Körperwände mit PBT.
- Blockieren mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) für 1 Stunde.
- Immunfärbung
- Die Körperwände mit Mäusen und Kaninchen primären Antikörper gegen die beiden Proteine von Interesse Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C (in 1% BSA verdünnt). In diesem Fall verwenden 1.10 Maus-Anti-Dlg und 1: 250 Kaninchen einnti-HtsM 15,16. Antikörper gegen Marker, die nicht in der Maus oder Kaninchen hergestellt werden, können ebenfalls enthalten sein - zB Verwenden von 1: 200 Ziege-Anti-HRP, um die neuronalen Membranen abzugrenzen.
- Für jede 10 Minuten abwaschen mit PBT dreimal.
- Inkubieren mit Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper, die Markierungen (in 1% BSA verdünnt) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C zu erkennen. Als die PLA-Signal wird später mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff sichtbar gemacht, muss ein anderer Fluorophore verwendet werden, um den Marker zu erfassen - zB verwenden 1: 200 FITC-konjugiertem Anti-Ziege, die Ziege-Anti-Hrp Antikörper nachzuweisen. Durch die Verwendung von lichtempfindlichen Reagenzien, halten die Rohre in der Dunkelheit ab diesem Zeitpunkt.
HINWEIS: Der Kit, der verwendet wird, ermöglicht die PLA zwischen primären Antikörpern in Mäusen und Kaninchen durchgeführt werden, erhöht, wobei das Signal auf dem roten Kanal unter konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht. Auf Wunsch sind weitere Kits zur Verfügung, die der Test mit prima durchgeführt werden könnenry Antikörper in anderen Spezies gezüchtet, und das Signal auf anderen Kanälen sichtbar gemacht.
3. Proximity Ligation Assay
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln sofern nicht anders angegeben.
- PLA Probes
- Dreimal für jeweils 10 min Waschen Sie die Körperwände mit PBT.
- Inkubieren mit PLA-Sonden (1: 5-Verdünnung jeder in 1% BSA) für 2 Stunden bei 37 ° C. In diesem Fall verwenden 40 ul der PLA-Sonde-anti-Maus MINUS 40 ul PLA-Sonde-anti-Kaninchen PLUS und 120 ul 1% BSA, um die richtige Eintauchen und Mischen von 5-10 Körperwände zu gewährleisten. Bis zu einer 1:25 Verdünnung der PLA-Sonden können weiterhin in einer ausreichenden Signal-zu-Rausch-Verhältnis (dh bei diesem Experiment) führen.
- Ligation
- Die Körperwände mit Waschpuffer A für 5 Minuten jeweils zweimal waschen.
- Inkubation mit Ligation-Lösung (1.40 Verdünnung Ligase in Ligationspuffer) für 1 Stunde eint 37 ° C. In diesem Fall arbeitet man mit 5 ul Ligase, 40 ul 5 Ligationspuffer und 155 & mgr; l von hochreinem Wasser, um das richtige Eintauchen und das Vermischen von 5-10 Körperwände zu gewährleisten.
- Verstärkung
- Die Körperwände mit Waschpuffer A für 2 min je zweimal waschen.
- Inkubieren mit Verstärkungslösung (1:80 Verdünnung von Polymerase in Amplifikationspuffer) für 2 h bei 37 ° C. In diesem Fall verwenden 2,5 ul Polymerase, 40 ul 5 Verstärkung Puffer und 157,5 ul von hochreinem Wasser, um die richtige Eintauchen und Mischen von 5-10 Körperwände gewährleisten.
- Vorbereitung für Imaging
- Die Körperwände mit Waschpuffer B 10 min je zweimal waschen.
- Mit 0,01x Waschpuffer B einmal für 1 min waschen.
- Äquilibrieren in einigen Tropfen Befestigungslösung für mindestens 30 min vor der Montage, oder über Nacht bei 4 ° C.
- Mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Körperwände übertragen auf eine Plattform Schiebe with ihre Nagelhaut nach unten. Positionieren der Körperwände in Reihen und in der gleichen Orientierung in ein oder zwei Tropfen mountant. Legen Sie eine 22 mm x 40 mm Deckglas über die Zubereitung dabei nicht um Luftblasen zu erzeugen, dann verschließen Sie die Folie mit klarem Nagellack.
- Bewahren Sie die Folien im Dunkeln bei -20 ° C, bis sie zur konfokalen Abbildung.
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Representative Results
In Wildtyp dritten Larvenlarven NMJs wird Dlg überwiegend an der postsynaptischen Membran des Typs I glutamatergen Boutons gefunden, mit Dlg Immunreaktivität Ebenen sein ausgeprägter Typ Ib boutons als Typ Ist boutons (3A) 4. Hts ist im gesamten Muskel vorhanden, aber konzentriert sich an der postsynaptischen Region Hts Immunreaktivität Ebenen sowohl Typ I boutons gleich erscheinen und wird auch präsynaptisch gefunden (3A ') 8,17. Beachten Sie, dass die Verteilungen der Dlg und Hts an der postsynaptischen Bereich (3A '') 8 überlappen weitestgehend.
Zu bestimmen, ob und dlg Hts existieren in einem Komplex an der NMJ, PLA zwischen den beiden Proteinen wurde am Larvenkörperwand Muskelpräparaten durchgeführt. Für diesen Test wird ein Maus-anti-HLG Antikörper, der das zweite PDZ-Domäne am N-Terminus und einem Kaninchen-Anti-Antikörper weist HtsMdaß erfaßt der MARCKS-Homologie-Domäne am C-Terminus wurden verwendet 15,16. In Wildtyp wurde PLA Signal zwischen Dlg und Hts speziell auf die NMJ (3C-C '') beobachtet. Das Signal überwiegend in Umfangsrichtung der präsynaptischen Membran vom Typ I boutons, die durch Hrp demarked lokalisiert war, was anzeigt, daß dlg Hts sind in unmittelbarer Nähe zueinander und wahrscheinlich einen Komplex an der postsynaptischen Bereich zu bilden. Das Ergebnis wurde festgestellt, genau wie unsere negative Kontrolle zu sein, an denen hts 01.103 mutierte NMJs die Hts fehlt Immunreaktivität (3B-B ''), zeigten keine beobachtbaren PLA Signal (3D) 8,17,18. Zusätzlich geführt PLA ohne Zugabe der Kaninchen-anti-HtsM Antikörper produziert kein Signal (Daten nicht gezeigt). Hohe Vergrößerung Blick auf die boutons ergab, dass Dlg und Hts Immunreaktivität grob an der postsynaptischen Region überlappt (3E), Während PLA zwischen den beiden Proteinen führte diskrete puncta angibt, dass nur eine Teilmenge der Gesamt dlg Hts Proteine in komplexen (3F).
Um die Zuverlässigkeit weiter zu testen PLA als Werkzeug, um die Larven NMJ untersuchen wir auch ausgewertet Wechselwirkungen zwischen der Serin / Threonin-p21-activated kinase, Pak, und andere synaptische Proteine 19. Vorherige Co-Immunopräzipitation Experimente haben gezeigt, dass Pak ist Mitglied des Scribble-Komplex, von denen Dlg ist auch Mitglied 20. In Wildtyp NMJs lokalisiert Pak postsynaptischen Dichte (4A, C), wo es für Dlg Lokalisierungs 15,21 erforderlich. Die immunreaktiven Verteilungen Pak und Dlg lappen am postsynaptischen Region (4A '') und PLA zwischen den beiden Proteinen zu einem positiven Signal spezifisch auf den NMJ (4B). Diese Ergebnisse zeigen, dass die beiden Proteine in c verlieren beieinander und werden wahrscheinlich einen Komplex in diesem Bereich bilden. Eine andere synaptische Protein wir für Pak Komplexbindung getestet wurde Wingless (WG), der Drosophila Wnt-Liganden, die zahlreiche Rollen am NMJ 22 spielt. In Wildtyp wird Wg an den präsynaptischen und postsynaptischen Seiten des Typ I boutons bereichert, sondern ist auch als puncta während des Muskelzellplasma (4C) 23 vorhanden. Interessanterweise, obwohl die immunoreaktive Verteilungen Pak und Wg partiell am postsynaptischen Bereich (4C '') überlappt, PLA zwischen den beiden Proteinen produziert keine wahrnehmbare Signal (Figur 4D). Daher Pak und Wg sich nicht in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander am NMJ. Dieses Ergebnis zeigt, dass nicht alle Proteine, die sich überlappenden Immunreaktivitäten durch traditionelle Kolokalisation Experimente zeigen eine PLA-Signal zu erzeugen, und dient als zusätzliche negative Kontrolle.
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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Proximity Ligation Assay. (A) Primär-Antikörper binden an die beiden Proteine von Interesse unter Verwendung von Standard immunhistochemischen Verfahren. (B) Die primären Antikörper werden dann mit einem Paar von artspezifischen sekundären Antikörper nachgewiesen, bezeichnet als PLA-Sonden, die an Oligonucleotide konjugiert sind. (C) Wenn Die beiden Proteine sind in enger Nachbarschaft zueinander, kann der Abstand zwischen den angebrachten PLA Sonden durch Hybridisierung von zwei zusätzlichen Anschluß Oligonukleotide überbrückt werden. (D) In dieser Konformation kann die Verbinder Oligonukleotide eine geschlossene zirkuläre DNA-Molekül nach Ligation in situ bilden . (E) Die kreisförmige DNA-Molekül als Matrize für die in situ-Rolling-Circle-Amplifikation, die durch eine der Oli Primerunggonucleotides den PLA Sonden konjugiert. (F) Sequenzen in der amplifizierten DNA-Produkt werden dann mit fluoreszenzmarkierten, komplementär Oligonukleotidsonden detektiert. Beachten Sie, dass die Figur auf Weibrecht et al. 24 basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
Figur 2: Herstellung von dritten Larvenlarvenkörperwände. (AF) Schemazeichnungen, die ein Körperwand Dissektion. (A) Legen Sie eine einzelne Larve auf eine Sylgard Disc mit seiner Rückenseite nach oben, so dass die beiden Luftröhrenstriche sichtbar sind. (B) Pin die Larve sich an den vorderen und hinteren Enden mit minutien Stifte, Dehnen der Larve der Länge nach in den Prozess. (C) (D) Rollen Sie das Larvenkörpers offen und stecken Sie die Ecken nach unten Dehnen der Körperwand horizontal und vertikal in den Prozess, um eine gleichmäßige spannte Rechteck bilden. (E) ähneln reinigen Sie alle verbleibenden inneren Organe. (F) Gezeigt werden Beispiele für die verschiedenen Möglichkeiten, um die Ecke der Körperwände, um die verschiedenen Genotypen unterscheiden zu schneiden. (G) Blick in eine gestreckte Körperwand Zubereitung nach Abschluss. Das Bild wurde mit einer Digitalkamera auf einem Binokular montiert übernommen. Maßstabsbalken in Tafel F stellt 1 mm. Beachten Sie, dass die Figur auf Ramachandran und Budnik 2010 12 basieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Dlg und Hts existieren in einem Komplex an der postsynaptischen Region Larven NMJs (AB '') Ausschüttungen Dlg (rot) und Hts (grün) in Wildtyp und Mutante hts NMJs (AA. '') Im wilden. -Typ NMJs wird Dlg vorwiegend an der postsynaptischen Membran des Typs I boutons gefunden, mit Dlg Ebenen sein ausgeprägter Typ Ib als liegt boutons. Hts ist im gesamten Muskel vorhanden, sondern auch Konzentrate auf der postsynaptischen Region mit Hts Ebenen ähnlich in beiden Typ I boutons. Die Verteilungen von Dlg und Hts lappen an der postsynaptischen Region. (BB ') NMJs Mutante für hts fehlt Hts Immunreaktivität. Beachten Sie, dass die hts 01.103 Mutation Auswirkungen NMJ Verzweigung 8. (CD '') PLA zwischen Dlg und Hts (rot) Durchgeführt, auf Wildtyp und Mutante hts NMJs. HRP wird die Neuronenmembran (grün) zu markieren. Dargestellt sind hohe Vergrößerung Blick auf ein paar boutons. (CC '') Im Wildtyp wird PLA Signal speziell auf die NMJ beobachtet. Das Signal wird vor allem in Umfangsrichtung der präsynaptischen Membran vom Typ I boutons lokalisiert, was anzeigt, dass dlg Hts sind in unmittelbarer Nähe zueinander und liegen in einer Anlage an der postsynaptischen Region. (D) NMJs Mutante für HTS zeigten keine beobachtbaren PLA Signals. (EF) Dargestellt sind hohe Vergrößerung Blick auf einzelne boutons. (E) Hts und Dlg Immunreaktivität grob Überlappung an der postsynaptischen Region. (F) PLA zwischen Dlg und Hts Ergebnisse in verschiedenen puncta angibt, dass nur eine Teilmenge der Proteine in einem komplexen . Maßstabsbalken in Feld B '' steht für 40 & mgr; m (AB ''); Maßstabsbalken in Tafel D '' repräsentiert 10 um (CD ''); skale bar Panel-F für 5 um (EF). Alle gezeigten NMJs sind von Muskeln 6/7 in Abdominalsegment 4. Die Bilder wurden als zusammengeführt Stacks mit einer Nikon A1R konfokalen Laserrastermikroskop mit NIS-Elements-Software übernommen und mit Adobe Photoshop bearbeitet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Ansicht Figur.
Abbildung 4: Pak besteht in einem Komplex mit Dlg, aber nicht Wg, an der postsynaptischen Region Larven NMJs (AD) Dargestellt sind hohe Vergrößerung Blick auf ein paar boutons (AA '') Ausschüttungen von Pak (grün) und Dlg (.. rot) in Wildtyp NMJs. Pak lokalisiert postsynaptischen Dichte. Beachten Sie, dass die immunreaktiven Verteilungen Pak und Dlg lappen an der postsynaptischen Region. (B) PLA bwischen Pak und Dlg (rot), welche auf Wildtyp NMJs. PLA-Signal wird speziell auf die NMJ beobachtet, was anzeigt, dass die beiden Proteine befinden sich in unmittelbarer Nähe zueinander in dieser Region. (CC '') Ausschüttungen Pak (grün) und Wg (rot) in Wildtyp NMJs. Wg an beiden präsynaptischen und postsynaptischen Seiten des NMJ angereichert, sondern ist auch als puncta gesamten Muskel. Beachten Sie, dass die immunreaktiven Verteilung von Pak wird auch beobachtet, teilweise überlappen mit Wg am postsynaptischen Region. (D) PLA zwischen Pak und Wg (rot), welche auf Wildtyp NMJs. Keine besondere PLA Signal beobachtet, was darauf hinweist, dass die beiden Proteine nicht in enger Nähe zueinander an der NMJ trotz ihrer überlappenden Verteilungen. Maßstabsbalken Panel D für 5 um (AD). Alle NMJs innervieren Muskeln 6/7 in Abdominalsegment 4. Die Bilder wurden als zusammengeführt Stacks mit einer Nikon A1R konfokalen Laserrastermikroskop mit NIS-Elements-Software übernommen und proAdobe Photoshop bearbeitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieser Bericht zeigt, wie PLA kann dem Drosophila Larven NMJ angewendet werden. Der Test basiert auf Larvenkörper Wandmuskulatur, die zum Zwecke des Erfassens endogenen Protein-Protein-Wechselwirkungen an der NMJ vorliegenden geführt. Mit dieser Technik und dlg Hts sind gezeigt, um in enger Nähe zueinander sind, und somit in einem Komplex vorhanden sind, und zwar an der postsynaptischen Bereich 27. Zur Unterstützung dieses Ergebnis hat eine frühere Studie Beweise ihrer Verbindung mit den folgenden Daten ausgestattet: 1) die immunreaktiven Verteilungen Dlg und Hts lappen an der postsynaptischen Region Larven NMJs, 2) Dlg und Hts bilden einen Komplex auf Basis von Co- Immunpräzipitationsexperimenten Einbeziehung gesamten erwachsenen Fliegen Lysaten und 3) Dlg und Hts Interaktion sowohl in epithelialen und synaptischen Verbindungen 8. PLA-Signal an der postsynaptischen Region wurde auch zwischen Dlg und Pak, einer Interaktion bisher in anderen Studien identifiziert beobachtet, wodurch eine weitere credenz der Verwendung dieser Assays beim NMJ 15,20,21. Interessant ist, dass PLA zwischen Pak und Wg zu keiner beobachtbaren Signal, auch wenn ihre immunreaktiven Ausschüttungen am NMJ überlappt. Dieses Ergebnis zeigt, dass nicht alle Proteine, die sich überlappenden immunreaktiven Verteilungen zeigen eine PLA-Signal zu erzeugen, damit angibt, dass PLA bietet eine höhere Auflösung bei der Erkennung von Protein-Protein-Interaktionen als herkömmliche Co-Lokalisationsstudien.
Mehrere Änderungen wurden an der ursprünglichen PLA-Protokoll, um den Test für die Larven NMJ zu optimieren 9,25 (Daten nicht gezeigt). Zunächst wurde festgestellt, daß 1% BSA eine bessere Blockierungsmittel für die Körperwände anstatt der vorgesehenen Blocking Solution. Zweitens, ein starkes Signal-Rausch-Verhältnis, richtige Eintauchen und Mischen der Körperwände in den Reaktionslösungen herzustellen, ist kritisch. Ein Minimum von 200 & mgr; l von fünf bis zehn Körperwände in einer 0,65 ml-Mikrozentrifugenröhrchen wurde als dafür geeignetele bei Inkubation mit dem PLA-Sonden-Ligase oder Polymerase, obwohl die Volumina entsprechend bei der Verarbeitung von mehr Körperwände erhöht werden. Die Signalstärke wurde auch durch eine Erhöhung der Reaktionszeit um 30 Minuten über die empfohlenen Werte verbessert. Drittens wurde eine serielle Verdünnung der Test PLA Sonden durchgeführt, um das Gleichgewicht zwischen Reagenz Erhaltung und Signalstärke zu optimieren. Für die Experimente in diesem Bericht ausgeführt wird, bis zu einer Verdünnung 01.25 - von der empfohlenen Verdünnung 1: 5 - noch produzieren eine angemessene Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Man beachte, dass die Optimierung der Ligation und Amplifikationsreaktionen wurden nicht durchgeführt. Schließlich wird, wie PLA kann empfindlich auf kleinste Veränderungen zu sein, es wird empfohlen, dass die unterschiedlichen Genotypen eines einzelnen Experiments sind in einem einzigen Rohr angeordnet, so dass die Steuerung und Experimenten gleichermaßen während des Assays behandelt. Genotypen können durch Abschneiden der Ecken der Körperwände unterschiedlich unterscheiden.
Several Methoden werden Drosophila-Protein-Protein-Wechselwirkungen, einschließlich Hefe-Zwei-Hybrid-Screening, Co-Immunpräzipitation und FRET detektieren. Aber wie diese Verfahren vergleichen gegen PLA und seine Fähigkeit, Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ sichtbar? Hefe-Zwei-Hybrid kann direkten Nachweis der Bindung zwischen Drosophila Proteine in Hefe exprimiert wird, und es hat sich in der Hochdurchsatz-Genom-weiten Bildschirmen verwendet. Obwohl viele der identifizierten Wechselwirkungen biologisch relevant, der Test ergibt oft falsch-positive. Zusätzlich können falsche Negative aus mehreren Gründen auftreten: die Proteine auf Transkriptionsfaktor-Domänen, die die Bindung stören könnten fusioniert vielen Wechselwirkungen erforderlich posttranslationale Modifikationen, die in Hefe nicht auftreten, und der Kern (wo der Assay stattfindet) kann ein geeignetes Umfeld für einige Wechselwirkungen richtig bilden nicht sein. Solche Fragen sind nicht mit PLA begegnet, wie es sich mit endogenen Proteinen in ihrer Mutter environment. Eine Methode, die verwendet werden können, um Wechselwirkungen zwischen endogenen Proteinen erkennen ist Coimmunpräzipitation. Experimente mit Drosophila-Lysaten kann das Gewebe und Phase des Lebenszyklus, in dem eine Wechselwirkung tritt offenbaren. Wie jedoch Lysat Bildung beinhaltet das Aufbrechen der Zellen, um die Proteine zu extrahieren, die Zellen innerhalb des Gewebes, in dem die Wechselwirkung tritt, sowie ihre subzelluläre Lokalisierung, nicht beurteilt werden kann - anders als in PLA. Weiterhin erkennt Coimmunpräzipitation Proteinkomplexbindung und kann nicht unterscheiden, welche Proteine im Komplex sind in unmittelbarer Nähe zueinander. Es gibt Methoden, wie FRET Verfügung Drosophilists zur Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in der Zelle ermöglichen. Allerdings FRET beinhaltet die Überexpression von transgenen Proteinen zu fluoreszierenden Tags verschmolzen und kann endogenes Protein Verhalten wie in PLA wider.
Trotz der Vorteile gibt es einige BegrenzIonen bei der Verwendung von PLA. Eine solche Einschränkung ist die Verfügbarkeit von primären Antikörpern gegen die Proteine von Interesse, die in verschiedenen Arten hergestellt werden. Dieses Problem kann leicht durch die Verwendung von markierten transgenen Proteinen umgangen werden können, wenn sie nicht wirklich repräsentativ für die endogene Interaktion. Ein weiteres Problem ist, dass PLA möglicherweise falsche, beispielsweise wenn die zwei primäre Antikörper sterisch seitig behindern oder wenn das Epitop von einem der primären Antikörper umfasst die Protein-Protein-Interaktionsstelle. Darüber hinaus, obwohl PLA erkennt Proteine, die in unmittelbarer Nähe zueinander sind, ist es nicht zwischen direkten und indirekten Protein-Protein-Wechselwirkungen zu unterscheiden, im Gegensatz zu in Pull-down-Assays und Hefe-Zwei-Hybrid-Screening. Darüber hinaus wird PLA zwischen endogenen Proteinen nicht erkennen, welche Bereiche für die Interaktion verantwortlich sind. Somit werden andere Protein-Protein Interaktionsassays wie vor erforderlich, um die vollständige Charakterisierung der Wechselwirkung werden molecularly.
Forscher haben begonnen, mit Super-Resolution Mikroskopie, die räumliche Architektur des Drosophila-Larven NMJ Karte, mit einer Auflösung von zehn Nanometern erreicht 26. PLA, mit vergleichbarem Molekularauflösung, sollte eine kostengünstige, technisch einfache Ergänzung zu diesen Studien, die in den Aufbau eine detaillierte Ansicht der Organisation der zahlreichen Proteine an der NMJ helfen werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken dem Bloomington Drosophila Stock Center für die Bereitstellung von Flug Aktien. Wir danken auch den Entwicklungs Studies Hybridoma Bank und Dr. Lynn Cooley (Yale University) für die Bereitstellung von Antikörpern. Ein besonderer Dank geht an AhHyun Yoo für ihre Hilfe zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (Krieger), die William und Ada Isabelle Steel Fund (Krieger) und der kanadischen Institutes of Health Research (Harden) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps (fine #5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Precision Instruments | SYLG184 | Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60 x 15 mm Petri dish lid when dissecting. |
| Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection Scissors (ultra fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Platform Slides | Glue two 22 x 22 mm2 coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20 mm gap in between for sample mounting. | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal. |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1) | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS | PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787) | ||
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT | BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 °C. | ||
| mouse anti-Dlg (Discs large) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Use at a 1:10 dilution in 1% BSA. |
| rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) | Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA. | ||
| rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) | Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA. | ||
| mouse anti-Wg (Wingless) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | Use at a 1:5 dilution in 1% BSA. |
| goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| FITC-conjugated donkey anti-goat | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Wash Buffer A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337) |
| 1x Wash Buffer B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| 0.01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
References
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