Summary
Questo protocollo dimostra come Proximity legatura test può essere utilizzato per rilevare in situ interazioni proteina-proteina in Drosophila larvale neuromuscolare giunzione. Con questa tecnica, dischi grandi e Hu-li Shao tai sono presenti per formare un complesso in corrispondenza della zona postsinaptico, un'associazione precedentemente identificato mediante co-immunoprecipitazione.
Introduction
Drosophila dischi di grandi dimensioni (Dlg) è un membro conservato della guanilato famiglia chinasi associata alla membrana di ponteggi proteine che aiutano a orchestrare l'assemblaggio di grandi complessi proteici in siti specifici della membrana plasmatica. Originariamente identificato come una proteina soppressore del tumore, Dlg serve come un importante determinante di epiteliale 1,2,3 apicobasal polarità. Dlg serve anche come un importante modulo di ponteggio a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ) dei motoneuroni glutamatergici durante lo sviluppo larvale 4. Dlg svolge ruoli diversi al larvale NMJ, e la sua pleiotropismo si basa sulla sua capacità di associare con più proteine 5,6. Una di queste proteine è Hu-li tai shao (Hts), un omologo alle adducins mammiferi che sono stati descritti principalmente per quanto riguarda i loro ruoli nella regolazione della actina-spettrina citoscheletro 7. È stato precedentemente dimostrato che Dlg e Hts possono formare un complesso con l'altro sulla base in vitro 8. Una carenza di questi risultati, tuttavia, è che non indicano dove Questo forme complesse. Con l'uso di immunoistochimica, le distribuzioni di Dlg e HTS vengono osservate per sovrapporsi alla membrana postsinaptica del NMJs larvali, ma sono in un complesso in questa regione 8? Come recentemente dimostrato e dettagliato ulteriormente qui, di prossimità legatura Assay (PLA) è utilizzato per cercare un in situ associazione tra Dlg e Hts specificamente al larvale NMJ 27.
PLA è una relativamente nuova tecnica utilizzata principalmente in cellule e tessuti cultura in grado di rilevare le interazioni proteina-proteina in situ 9. In questo saggio, gli anticorpi primari contro le due proteine di interesse vengono rilevati con un paio di anticorpi secondari specie-specifici, definito sonde PLA, che sono coniugati ad oligonucleotidi (Figura 1A, B). Se le due proteines sono in stretta vicinanza l'uno all'altro (cioè entro poche decine di nanometri), la distanza tra le sonde PLA allegate può essere colmato attraverso ibridazione di oligonucleotidi due connettori aggiuntivi (Figura 1C). In questa conformazione, le estremità libere delle oligonucleotidi connettore sono abbastanza vicino per fare contatto con l'altro, e una molecola di DNA circolare chiuso possono essere formati su di legatura in situ (Figura 1D). La molecola di DNA circolare serve come modello per in situ cerchio di rotolamento di amplificazione, che è innescato da uno degli oligonucleotidi coniugati alle sonde PLA (Figura 1E). Sequenze all'interno amplificato, prodotto DNA concatemeric risultante possono poi essere visualizzati con, sonde oligonucleotidiche complementari fluorescenza marcata (Figura 1F). Poiché il DNA amplificato rimane attaccato ad una delle sonde PLA, la localizzazione subcellulare della proteina-proteina interazione withina tessuto può essere prontamente accertata.
Diversi metodi sono comunemente usati per rilevare le interazioni proteina-proteina anche in tecniche in vitro, come co-immunoprecipitazione, pull-down test e lievito di screening doppio ibrido, e in tecniche vivo come il trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) e bimolecolari complementazione fluorescenza ( BiFC). Una trappola delle tecniche in vitro è che essi non identificano in cui l'interazione è endogeno in corso, mentre le tecniche vivo il citate in coinvolgono l'espressione artificiale di proteine di fusione che non può riflettere il comportamento nativo dei loro omologhi endogeni. Uno dei principali vantaggi di PLA è che è in grado di determinare all'interno di un tessuto la localizzazione subcellulare di interattori proteici endogeni che sono in stretta vicinanza l'uno all'altro e probabilmente formano un complesso, con il grado di vicinanza necessaria per generare un segnale è paragonabile alla FRET e BiFC. PLA può rilevare interazioni con alta specificità e sensibilità a causa dell'accoppiamento del riconoscimento anticorpale e amplificazione del DNA. Così, il dosaggio può generare segnali luminosi discreti, in forma di puncta che rivelano la posizione esatta dell'interazione. Inoltre, gli antigeni difficilmente visibili possono essere rilevati. Infine, PLA è una tecnica relativamente semplice da eseguire, e non richiede una procedura di immunoistochimica standard per completare. Pertanto, PLA offre un vantaggio tecnico rispetto agli altri saggi di interazione proteina-proteina che sono spesso afflitto con tempi lunghi di preparazione e ampie risoluzione dei problemi.
Questo protocollo illustra come PLA può essere applicato al Drosophila larvale NMJ al fine di rilevare le interazioni proteina-proteina endogena in situ. Qui, PLA viene eseguita su preparazioni muscolari parete corpo larvali dove Dlg e Hts sono mostrati di esistere davvero in un complesso in zona post-sinaptica di NMJs. PLA non è stata precedentemente utilizzata per studiare la larvale NMJ, e ci sono al momento solo una manciata di articoli pubblicati che hanno utilizzato questo test nel tessuto Drosophila. Si spera che ulteriore esposizione del PLA per la comunità Drosophila si tradurrà in un maggiore ricorso come uno strumento aggiuntivo per integrare altri, più comunemente usati proteina-proteina saggi di interazione.
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Protocol
1. Preparazione parete Corpo
NOTA: Preparazione di terzo stadio larvale pareti corpo (per lo studio delle NMJs che innervano i muscoli della parete corpo) è stata eseguita come precedentemente descritto in Brent et al 10, o Ramachandran e Budnik 11,12, ma con alcune modifiche..
- Dissezione
- Sollevare scorte mosca e croci a 25 ° C per 5-6 giorni usando procedure standard 13.
- Scegli strisciando terzo instar larve di fiale o flaconi utilizzando una pinza sottile.
- Lavare le larve in un piccolo piatto di Petri contenente tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere eventuali particelle di cibo.
- Posizionare un larva su un disco Sylgard e immergerlo in alcune gocce di ghiaccio freddo PBS. Utilizzando ghiacciata PBS aiuterà stordire la larva rendendo più facile da manipolare. Durante la dissezione, assicurarsi che la preparazione è sempre immerso in PBS per evitare che si asciughi.
- Posizionare il larva con il suo lato dorsale rivolto verso l'alto in modo che i due tratti tracheali sono visibili al microscopio da dissezione (Figura 2A). Utilizzando le pinze per afferrare un perno minutien, pin la larva giù alla fine posteriore vicino alle spiracoli (Figura 2b). Con un altro perno, penetrare attraverso la cuticola all'estremità anteriore vicino i ganci bocca. Allungare delicatamente la larva fuori il lungo, poi pin basso (Figura 2B).
- Utilizzando forbici microdissezione, pizzicare la fine posteriore vicino al pin per creare una piccola apertura. L'incisione dovrebbe essere abbastanza superficiale passare solo attraverso la cuticola.
- Posizionando la punta della lama inferiore delle forbici nell'incisione, tagliare lungo l'intera lunghezza della linea mediana dorsale tra i due tratti tracheali (Figura 2C). Puntare le lame a forbice leggermente verso l'alto quando il taglio per evitare di danneggiare i muscoli della parete del corpo ventrali.
- Fai una piccola incisione orizzontale leggermente anteriore al postpin eriorly-posto (Figura 2C). Fare un'altra incisione simile poco posteriore al pin anteriormente classificata (Figura 2C). Le incisioni dovrebbero solo passare attraverso la cuticola.
NOTA: Le tre incisioni di passaggi 1.1.7 e 1.1.8 combinati dovrebbe assomigliare ad un "
"Una volta completato, cioè, un lembo sinistro e destro sul lato dorsale del corpo larvale dovrebbe essere prodotto. - Pulire accuratamente fuori gli organi interni con le pinze. Aggiungendo qualche goccia forti di PBS aiuterà spostare gli organi dal corpo larvale, rendendo così più facile per rimuoverli. Evitare colpendo il corpo larvale in quanto causerà danni ai muscoli della parete del corpo.
- Srotolare il corpo larvale aperto e appuntare gli angoli verso il basso (Figura 2D). Quando pinning, allungare la parete del corpo sia orizzontalmente che verticalmente per formare un rettangolo uniformemente-tensione (see Figura 2G per la forma), facendo attenzione a non strappare i muscoli della parete del corpo nel processo.
- Finire rimuovendo eventuali organi interni rimanenti (Figura 2E).
- Fissazione e permeabilizzazione
- Immergere le pareti del corpo appuntato alcune gocce di soluzione di Bouin. Incubare per 15 minuti sul ghiaccio. In alternativa, utilizzare 4% paraformaldeide (PFA) come fissativo alternativo; incubare per 30 min.
- Risciacquare tre volte con tampone fosfato Saline con Triton (PBT).
- Utilizzando una pinza sottile, rimuovere con attenzione i perni e trasferire le pareti del corpo da parte dei loro angoli in un siliconato 0,65 ml provetta.
- Conservare le pareti del corpo in PBT a 4 ° C fino al momento PLA. Per ottenere risultati ottimali, avviare immunocolorazione le pareti del corpo entro un giorno o due di dissezione.
NOTA: Per risparmiare i reagenti e di garantire che tutte le pareti del corpo sono trattati allo stesso modo durante il test, diversi genotipi possono essere inseriti in un unicotube. I genotipi possono distinguere tagliando gli angoli delle pareti del corpo diverso (vedere Figura 2F per gli esempi).
"Una volta completato, cioè, un lembo sinistro e destro sul lato dorsale del corpo larvale dovrebbe essere prodotto. 2. immunoistochimica
NOTA: immunocolorazione di terzo stadio larvale pareti corpo è stata eseguita come precedentemente descritto in Brent et al 14 e Ramachandran e Budnik 11, ma con alcune modifiche 11,14..
NOTA: Eseguire tutte le operazioni a temperatura ambiente e con agitazione se non diversamente specificato.
- Blocco
- Lavare le pareti del corpo con PBT tre volte per 10 minuti ciascuno.
- Blocco con 1% albumina sierica bovina (BSA) per 1 ora.
- Immunostaining
- Incubare le pareti del corpo con anticorpi primari di topo e di coniglio contro le due proteine di interesse (diluito in 1% BSA) per 2 ore a temperatura ambiente, o per una notte a 4 ° C. In questo caso, utilizzare il mouse 01:10 anti-Dlg e 1: 250 coniglio unNTI-HtsM 15,16. Gli anticorpi contro i marcatori che non sono fatti nel topo o di coniglio possono essere inclusi - per esempio, utilizzare 1: 200 di capra anti-Hrp per delineare le membrane neuronali.
- Lavare con PBT tre volte per 10 minuti ciascuno.
- Incubare con anticorpi secondari coniugati fluoroforo per rilevare marcatori (diluito in 1% BSA) per 2 ore a temperatura ambiente, o per una notte a 4 ° C. Poiché il segnale PLA viene successivamente visualizzata con un fluoroforo rosso, un'altra fluoroforo deve essere utilizzato per rilevare il marcatore - esempio, utilizzare 1: 200 FITC-coniugato anti-capra per rilevare l'anticorpo anti-Hrp capra. Grazie all'uso di reagenti sensibili alla luce, mantenere i tubi al buio da questo punto in poi.
NOTA: Il kit utilizzato permette di PLA da eseguire tra anticorpi primari sollevate nel topo e coniglio, con il segnale visualizzato sul canale rosso al microscopio confocale. Se lo si desidera, altri kit sono disponibili che consentono il dosaggio di essere fatto con primaanticorpi Ry sollevate in altre specie, e il segnale visualizzati su altri canali.
3. prossimità legatura Assay
NOTA: Eseguire tutte le operazioni a temperatura ambiente e con agitazione se non diversamente specificato.
- PLA Sonde
- Lavare le pareti del corpo con PBT tre volte per 10 minuti ciascuno.
- Incubare con sonde PLA (1: 5 di diluizione ciascuno in 1% BSA) per 2 ore a 37 ° C. In questo caso, utilizzare 40 ml di PLA sonda anti-topo MENO, 40 ml di sonda PLA PLUS anti-coniglio e 120 ml di 1% BSA per garantire il corretto immersione e miscelazione di 5-10 pareti del corpo. Fino ad una diluizione 1:25 sonde PLA ancora può risultare in un rapporto adeguato segnale-rumore (cioè, per questo esperimento).
- Legatura
- Lavare le pareti del corpo con tampone di lavaggio A due volte per 5 minuti ciascuno.
- Incubare con la soluzione di legatura (1:40 diluizione della Ligase in tampone legatura) per 1 ora at 37 ° C. In questo caso, usare 5 ml di Ligase, 40 ml di tampone 5 legatura e 155 ml di acqua ad elevata purezza per garantire il corretto immersione e miscelazione di 5-10 pareti del corpo.
- Amplificazione
- Lavare le pareti del corpo con tampone di lavaggio A due volte per 2 minuti ciascuna.
- Incubare con la soluzione Amplification (1:80 diluizione della polimerasi in tampone Amplificazione) per 2 ore a 37 ° C. In questo caso, utilizzare 2,5 ml di polimerasi, 40 ml di 5 buffer di amplificazione e 157,5 ml di acqua ad elevata purezza per garantire il corretto immersione e miscelazione di 5-10 pareti del corpo.
- Preparazione Imaging
- Lavare le pareti del corpo con tampone di lavaggio B due volte per 10 minuti ciascuno.
- Lavare con 0,01X tampone di lavaggio B una volta per 1 min.
- Equilibrare in poche gocce di soluzione di montaggio per almeno 30 minuti prima del montaggio, o conservare una notte a 4 ° C.
- Utilizzando una pinza sottile, trasferire accuratamente le pareti del corpo su una piattaforma scorrevole wesimo loro cuticole rivolto verso il basso. Posizionare le pareti del corpo in righe e nello stesso orientamento in una o due gocce di montante. Posizionare un 22 mm x 40 millimetri coprioggetto sulla preparazione facendo attenzione a non creare bolle d'aria, quindi sigillare il vetrino con smalto trasparente.
- Conservare i vetrini al buio a -20 ° C fino al momento per l'imaging confocale.
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Representative Results
In wild-type terzo stadio larvale NMJs, Dlg è prevalentemente trova a livello della membrana post-sinaptica di tipo I boutons glutamatergiche, con livelli di immunoreattività Dlg essere più pronunciato in tipo IB boutons di tipo è boutons (figura 3A) 4. Hts è presente in tutto il muscolo, ma si concentra in zona post-sinaptica con Hts livelli immunoreattività appare uguale in entrambi di tipo I boutons, ed è anche trovato presinapticamente (figura 3A ') 8,17. Si noti che le distribuzioni di Dlg e Hts in gran parte si sovrappongono alla regione postsinaptica (figura 3A '') 8.
Per determinare se Dlg e Hts esistono in un complesso al NMJ, PLA tra le due proteine è stata effettuata su corpo larvale preparati muscolari della parete. Per questo test, un topo anti-Dlg anticorpo che rileva il secondo dominio PDZ al N-terminale e un anticorpo anti-coniglio HtsMche rileva il dominio MARCKS-omologia al C-terminale sono stati usati 15,16. In wild-type, segnale PLA tra Dlg e Hts è stata osservata specificamente al NMJ (Figura 3C-C ''). Il segnale localizzato principalmente circonferenzialmente alla membrana presinaptica di I boutons tipo, che è stato demarked da Hrp, indicando così che Dlg e Hts sono in stretta vicinanza l'uno all'altro e probabilmente formano un complesso in corrispondenza della zona postsinaptico. Il risultato è stato determinato per essere specifico come il nostro controllo negativo, coinvolgendo HTS 01.103 NMJs mutanti che mancano Hts immunoreattività (Figura 3B-B ''), ha mostrato nessun segnale osservabile PLA (Figura 3D) 8,17,18. Inoltre, PLA eseguita senza aggiungere l'anticorpo di coniglio anti-HtsM prodotto alcun segnale (dati non mostrati). Vista alto ingrandimento dei boutons rivelato che Dlg e Hts immunoreattività grossolanamente sovrapposta alla regione postsinaptica (Figura 3E)Mentre PLA tra le due proteine provocato puncta discreta indicare che solo un sottoinsieme del totale proteine Dlg e Hts sono in complesso (figura 3F).
Per testare ulteriormente l'affidabilità di PLA come strumento per studiare il larvale NMJ, abbiamo anche valutato le interazioni tra la p21-chinasi attivata serina / treonina, Pak, e altre proteine sinaptiche 19. Precedenti esperimenti di co-immunoprecipitazione hanno mostrato che Pak è un membro del complesso Scarabocchio, di cui Dlg è anche membro 20. In wild-type NMJs, Pak localizza alla densità postsinaptica (4A, C), dove è necessario per la localizzazione Dlg 15,21. Le distribuzioni immunoreattive di Pak e Dlg sovrappongono in corrispondenza della zona postsinaptico (Figura 4A ''), e PLA tra le due proteine comportato un segnale positivo specificamente al NMJ (Figura 4B). Questi risultati indicano che le due proteine sono in c perdere vicinanza l'uno all'altro e sono probabilmente formando un complesso in questa regione. Un'altra proteina sinaptica abbiamo testato per complesso Pak legame era senza ali (Wg), il ligando Drosophila Wnt, che svolge numerosi ruoli al NMJ 22. In wild-type, Wg si arricchisce sui lati presinaptici e postsinaptici di tipo I boutons, ma è anche presente come puncta tutto il citoplasma muscolare (Figura 4C ') 23. È interessante notare che, anche se le distribuzioni immunoreattive di Pak e Wg parzialmente sovrapposti in corrispondenza della zona postsinaptico (Figura 4C ''), PLA tra le due proteine prodotto alcun segnale osservabile (Figura 4D). Pertanto, Pak e Wg non sono in stretta vicinanza l'uno all'altro al NMJ. Questo risultato dimostra che non tutte le proteine che mostrano immunoreactivities sovrapposti mediante esperimenti di co-localizzazione tradizionali genereranno un segnale PLA, e serve come controllo negativo aggiuntivo.
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Figura 1: Schema di prossimità legatura Assay. (A) anticorpi primari legano ai due proteine di interesse utilizzando procedure immunoistochimiche standard. (B) Gli anticorpi primari vengono quindi rilevati con un paio di anticorpi secondari specie-specifici, definito sonde PLA, che sono coniugati ad oligonucleotidi. (C) Se le due proteine sono in stretta vicinanza l'uno all'altro, la distanza fra le sonde PLA allegate può essere colmato attraverso ibridazione di oligonucleotidi due connettori aggiuntivi. (D) In questa conformazione, gli oligonucleotidi connettore può formare una molecola di DNA circolare chiuso su in situ legatura . (E) La molecola di DNA circolare serve come modello per in situ rotolamento cerchio di amplificazione, che è innescato da uno degli oligonucleotides coniugati a sonde PLA. (F) sequenze all'interno del prodotto di DNA amplificato vengono rilevati con, sonde oligonucleotidiche complementari fluorescenza marcata. Si noti che la cifra si basava su Weibrecht et al. 24. Cliccare qui per vedere una versione più grande della figura.
Figura 2: Preparazione del terzo stadio larvale pareti del corpo. (AF) disegni schematici rappresentano una dissezione parete del corpo. (A) Inserire una singola larva su un disco Sylgard con il suo lato dorsale rivolto verso l'alto in modo che i due tratti tracheali sono visibili. (B) Pin la larva giù alle estremità anteriore e posteriore con perni minutien, estende la larva fuori della lunghezza del processo. (C) (D) Per svolgere il corpo larvale aperto e appuntare gli angoli verso il basso, si estende la parete del corpo sia orizzontalmente che verticalmente nel processo per formare un rettangolo di uniforme-tensione. (E) Clean eventuali organi interni rimanenti. (F) presenti sono degli esempi dei diversi modi per ridurre l'angolo delle pareti del corpo al fine di distinguere i diversi genotipi. (G) Veduta di un preparato parete del corpo allungato una volta completato. La foto è stata scattata con una fotocamera digitale montata su un microscopio da dissezione. Bar Scala in Pannello F rappresenta 1 mm. Si noti che la cifra si basava su Ramachandran e Budnik 2010 12. Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.
Figura 3: Dlg e Hts esistono in un complesso in zona post-sinaptica di NMJs larvali (AB '') Distribuzione di Dlg (rosso) e Hts (verde) in wild-type e HTS NMJs mutanti (AA. '') In selvaggio. di tipo NMJs, Dlg si trova soprattutto a livello della membrana post-sinaptica di tipo I boutons, con livelli Dlg essere più pronunciato in tipo Ib di Is boutons. Hts è presente in tutto il muscolo, ma si concentra anche nella regione postsinaptica, con livelli Hts essendo simile in entrambi tipo I boutons. Le distribuzioni di Dlg e Hts si sovrappongono in corrispondenza della zona post-sinaptica. (BB '') mutante NMJs per HTS mancanza Hts immunoreactivity. Si noti che l'HTS 01.103 effetti della mutazione NMJ ramificazione 8. (CD '') PLA tra Dlg e Hts (rosso) Eseguita su wild-type e HTS NMJs mutanti. HRP è usato per marcare la membrana neuronale (verde). Vengono mostrati vista ad alto ingrandimento di qualche boutons. (CC '') nella wild-type, il segnale PLA si osserva specificamente al NMJ. Il segnale è localizzato principalmente circonferenzialmente alla membrana presinaptica di tipo I boutons, indicando che Dlg e Hts sono in stretta vicinanza l'uno all'altro ed esistono in un complesso in corrispondenza della zona postsinaptico. (D) NMJs mutante per HTS mostrò nessun segnale osservabile PLA. (EF) riportati sono viste ad alto ingrandimento dei singoli boutons. (E) Hts e Dlg immunoreactivity grossolanamente sovrapposizione regione postsinaptica. (F) PLA tra Dlg e Hts risultati in puncta distinta indica che solo un sottoinsieme delle proteine sono in un complesso . Bar Scala in Pannello di B '' rappresenta 40 micron (AB ''); barra della scala in Pannello di D '' rappresenta 10 micron (CD ''); scale bar in Pannello F rappresenta il 5 micron (EF). Tutti NMJs indicati sono da muscoli 6/7 del segmento addominale 4. Le immagini sono state prese come pile fusi utilizzando una scansione laser microscopio confocale Nikon A1R con software NIS-Elements, e trattati con Adobe Photoshop. Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.
Figura 4: Pak esiste in un complesso con Dlg, ma non Wg, in corrispondenza della zona post-sinaptica di NMJs larvali (AD) Vengono mostrati vista ad alto ingrandimento di alcuni boutons (AA '') Distribuzione di Pak (verde) e Dlg (.. rosso) in wild-type NMJs. Pak localizza alla densità postsinaptica. Si noti che le distribuzioni immunoreattive di Pak e Dlg sovrappongono alla regione postsinaptica. (B) b PLAra Pak e Dlg (rosso) eseguite su wild-type NMJs. Segnale di PLA si osserva specificamente al NMJ, indicando che le due proteine sono in prossimità di ogni altro in questa regione. (CC '') Distribuzione di Pak (verde) e Wg (rosso) a wild-type NMJs. Wg è arricchito su entrambi i lati presinaptici e postsinaptici della NMJ, ma è anche presente come puncta tutto il muscolo. Si noti che la distribuzione immunoreattiva di Pak si osserva anche a sovrapporsi in parte con Wg presso la regione postsinaptica. (D) PLA tra Pak e Wg (rosso) effettuato su wild-type NMJs. Nessun segnale specifico PLA si osserva, indicando che le due proteine non sono in stretta vicinanza l'uno all'altro al NMJ nonostante le loro distribuzioni sovrapposti. Bar Scala in Pannello di D rappresenta il 5 micron (AD). Tutti NMJs innervano i muscoli 6/7 del segmento addominale 4. Le immagini sono state prese come pile fusi utilizzando una scansione laser microscopio confocale Nikon A1R con software NIS-Elements, e protrasformati con Adobe Photoshop. Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.
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Discussion
Questo rapporto dimostra come PLA può essere applicata alla Drosophila larvale NMJ. Il test viene eseguito su preparazioni muscolari parete corpo larvali al fine di rilevare le interazioni proteina-proteina endogeni presenti al NMJ. Con questa tecnica, Dlg e HTS vengono mostrati per essere in stretta vicinanza l'uno all'altro, e pertanto esistere in un complesso, in particolare in corrispondenza della zona 27 postsinaptico. A sostegno di questo risultato, un precedente studio ha fornito prove della loro associazione con i seguenti dati: 1) le distribuzioni immunoreattive del Dlg e Hts si sovrappongono alla regione post-sinaptica di NMJs larvali, 2) Dlg e Hts formano un complesso basato sulla cooperazione esperimenti di immunoprecipitazione coinvolgono tutta adulto mosca lisati, e 3) Dlg e Hts interagiscono sia epiteliali e giunzioni sinaptiche 8. È stato inoltre osservato segnale PLA corrispondenza della zona postsinaptico tra Dlg e Pak, un'interazione precedentemente identificati in altri studi, fornendo così ulteriormente Credence di utilizzare questo test al NMJ 15,20,21. È interessante notare che, PLA tra Pak e Wg provocato nessun segnale osservabile, anche se le loro distribuzioni immunoreattive sovrapposti al NMJ. Questo risultato dimostra che non tutte le proteine che mostrano sovrapposizione distribuzioni immunoreattive genererà un segnale di PLA, quindi indicare che PLA offre una risoluzione più alta nel rilevare le interazioni proteina-proteina di studi co-localizzazione tradizionali.
Diverse modifiche sono state apportate al protocollo originale PLA per ottimizzare il dosaggio per il NMJ larvale (dati non mostrati) 9,25. In primo luogo, è stato determinato che 1% BSA è un agente bloccante meglio per le pareti del corpo al posto della soluzione di blocco fornito. In secondo luogo, per produrre un forte rapporto segnale-rumore, immersione e corretta miscelazione delle pareti del corpo nelle soluzioni di reazione è critica. Un minimo di 200 ml per 5-10 pareti del corpo in una provetta 0,65 ml microcentrifuga è ritenuto suitable cui incubazione con il PLA sonde, ligasi o polimerasi, anche se i volumi possono essere aumentati di conseguenza quando si elaborano più pareti del corpo. La potenza del segnale è stata rafforzata anche aumentando i tempi di reazione di 30 minuti oltre i tempi consigliati. Terzo, un test di diluizione in serie delle sonde PLA è stata eseguita per ottimizzare il bilanciamento tra conservazione del reagente e la forza del segnale. Per gli esperimenti condotti in questa relazione, fino ad una diluizione 1:25 - dalla consigliato diluizione 1: 5 - possono ancora produrre un ragionevole rapporto segnale-rumore. Si noti che l'ottimizzazione delle reazioni di amplificazione legatura e non è stato memorizzato. Infine, come PLA può essere sensibile alle variazioni minuto, si raccomanda che i diversi genotipi di un singolo esperimento sono posti in un unico tubo in modo che i controlli e gli esperimenti sono trattati allo stesso modo durante il dosaggio. I genotipi possono distinguere tagliando gli angoli delle pareti del corpo diverso.
SeveraMetodi l vengono utilizzati per rilevare Drosophila interazioni proteina-proteina tra cui lievito di screening doppio ibrido, co-immunoprecipitazione e FRET. Ma come fanno questi metodi confrontano contro PLA e la sua capacità di visualizzare le interazioni proteina-proteina in situ? Lievito doppio ibrido in grado di rilevare direttamente vincolante tra le proteine di Drosophila espresse nel lievito, ed è stato utilizzato in schermi genoma elevato throughput. Anche se molte delle interazioni individuate sono biologicamente rilevanti, l'analisi spesso produce falsi positivi. Inoltre, i falsi negativi possono verificarsi per diverse ragioni: le proteine sono fusi a domini fattore di trascrizione che possono interferire con il legame, molte interazioni richiedono modificazioni post-traslazionali che non vivono nel lievito, e il nucleo (dove il test avviene) può non essere un ambiente adatto per alcune interazioni per formare correttamente. Tali problemi non si incontrano con PLA, come si tratta di proteine endogene nella loro nativa Envirbiente. Un metodo che può essere utilizzato per rilevare le interazioni tra proteine endogene è co-immunoprecipitazione. Gli esperimenti che coinvolgono lisati Drosophila possono rivelare il tessuto e fase del ciclo di vita in cui si verifica una interazione. Tuttavia, come la formazione lisato coinvolge perturbare le cellule per estrarre le proteine, le cellule all'interno del tessuto in cui l'interazione avviene in, e anche la sua localizzazione subcellulare, non possono essere valutati - a differenza di PLA. Inoltre, co-immunoprecipitazione rileva complesso proteina legante e non può distinguere quale proteine all'interno del complesso sono in stretta vicinanza l'uno all'altro. Esistono metodi come FRET disposizione Drosophilists che permettono la visualizzazione delle interazioni proteina-proteina all'interno della cellula. Tuttavia, FRET comporta l'iperespressione delle proteine transgeniche fuse a tag fluorescenti e potrebbe non riflettere il comportamento della proteina endogena come in PLA.
Nonostante i suoi vantaggi, ci sono alcuni limitationi quando si utilizza PLA. Una tale limitazione è la disponibilità di anticorpi primari contro le proteine di interesse che sono fatti in specie diverse. Questo problema può essere facilmente aggirato con l'uso di proteine transgeniche contrassegnate, se non possono essere effettivamente rappresentativi dell'interazione endogena. Un altro problema è che PLA può produrre falsi negativi, ad esempio quando i due anticorpi primari stericamente ostacolano l'altro o quando l'epitopo di una delle anticorpi primari comporta il sito di interazione proteina-proteina. Inoltre, anche se PLA rileva proteine che sono in stretta vicinanza l'uno all'altro, non distingue tra le interazioni dirette ed indirette proteina-proteina, a differenza in saggi di pull-down e lievito di screening del doppio ibrido. Inoltre, PLA tra proteine endogene non individuare quali domini sono responsabili per l'interazione. Così, saranno ancora necessari altri saggi di interazione proteina-proteina per caratterizzare completamente l'interazione molecularly.
I ricercatori hanno iniziato a utilizzare super-risoluzione microscopio per mappare l'architettura spaziale del Drosophila larvale NMJ, con risoluzioni di decine di nanometri stati raggiunti 26. PLA, con la risoluzione molecolare comparabili, dovrebbe fornire un basso costo, tecnicamente semplice complemento a questi studi che aiuteranno a costruire una vista dettagliata dell'organizzazione delle numerose proteine del NMJ.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Bloomington Drosophila Stock Center per la fornitura di scorte mosca. Ringraziamo anche il Developmental Studies Ibridoma Bank e il dottor Lynn Cooley (Yale University) per la fornitura di anticorpi. Un ringraziamento particolare va a AhHyun Yoo per il suo aiuto sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (Krieger), William e Ada Isabelle Steel Fund (Krieger), e la Canadian Institutes of Health Research (Harden).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps (fine #5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Precision Instruments | SYLG184 | Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60 x 15 mm Petri dish lid when dissecting. |
| Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection Scissors (ultra fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Platform Slides | Glue two 22 x 22 mm2 coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20 mm gap in between for sample mounting. | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal. |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1) | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS | PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787) | ||
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT | BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 °C. | ||
| mouse anti-Dlg (Discs large) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Use at a 1:10 dilution in 1% BSA. |
| rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) | Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA. | ||
| rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) | Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA. | ||
| mouse anti-Wg (Wingless) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | Use at a 1:5 dilution in 1% BSA. |
| goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| FITC-conjugated donkey anti-goat | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Wash Buffer A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337) |
| 1x Wash Buffer B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| 0.01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
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