Summary
このプロトコルは、近接ライゲーションアッセイは、ショウジョウバエの幼虫神経筋接合部で、その場のタンパク質-タンパク質相互作用に検出するために使用することができる方法を示しています。この技術では、大規模で胡-LIの太極拳シャオディスクは、シナプス後の領域に、以前に共免疫沈降を介して同定関連を複合体を形成することが示されている。
Introduction
（Dlgという）大ショウジョウバエディスクは、原形質膜の特定の部位での大きなタンパク質複合体の集合を編成助ける足場タンパク質の膜結合グアニル酸キナーゼファミリーの保存されたメンバーである。腫瘍抑制タンパク質は、Dlgという上皮apicobasal極性1,2,3の重要な決定因子として機能するように最初に同定された。 DLGはまた幼虫の発育4中のグルタミン酸作動性運動ニューロンの神経筋接合部（NMJ）での主要な足場モジュールとして提供しています。 DLGは幼虫NMJでの多様な役割を果たし、その多面発現は、複数のタンパク質5,6と会合する能力に依存しています。このようなタンパク質の1つは、胡-LIの太極拳シャオ（HTS）、主にアクチンスペクトリン細胞骨格7の調節における役割に関してに記載されている哺乳類adducinsにホモログである。これは、以前には、Dlgおよびフーバー、インビトロに基づいて、互いに複合体を形成することができることが示されている8を含む共免疫沈降実験。これらの結果の一つの欠点は、しかし、それらはここで、この複合体の形態を示すものではないということである。免疫組織化学を使用することにより、Dlgというおよびフーバーの分布は、幼虫のNMJのシナプス後膜にオーバーラップすることが観察されますが、この領域8で複合体中にありますか？最近示されており、ここでさらに詳述されるように、近接ライゲーションアッセイ（PLA）は、幼虫のNMJ 27で特異的には、Dlgとフーバーの間にその場での関連で検索するために使用されます。
PLAは、主にその場 9 でのタンパク質-タンパク質相互作用を検出することができ、細胞および組織培養に使用される比較的新しい技術である。このアッセイでは、目的の2つのタンパク質に対する一次抗体は、種特異的二次抗体の対を用いて検出される、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたPLAプローブと呼ばれる（ 図1A、B）。 2タンパク質の場合sは、添付のPLAのプローブ間の距離は、2つの追加のコネクターオリゴヌクレオチド（ 図1C）のハイブリダイゼーションを介してブリッジすることができる（数十ナノメートル以内すなわち ）は、互いに近接している。この立体配座において、コネクタオリゴヌクレオチドの自由端が互いに接触するのに十分近く、閉じた環状DNA分子は、in situ ライゲーション （ 図1D）に基づいて形成することができる。環状DNA分子は、PLAプローブ（ 図1E）にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドのいずれかによって準備され、その場でのローリングサークル増幅のための鋳型として働く。得られた増幅、コンカテマーDNA産物内の配列は、次いで、蛍光標識された相補的オリゴヌクレオチドプローブ（ 図1F）で可視化することができる。増幅されたDNAは、PLAプローブの1つは、タンパク質 - タンパク質相互作用withiの細胞内局在に付着したままであるので組織ナ容易に確認することができる。
いくつかの方法は、一般に、共免疫沈降、プルダウンアッセイおよび酵母ツーハイブリッドスクリーニングなどのインビトロ技術において 、そのようなフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）と二分子蛍光相補性（のようなインビボ技術を含むタンパク質-タンパク質相互作用を検出するために使用されるBIFC）。 インビトロ技術の落とし穴は、相互作用が内生的に発生している場所で 、前述のインビボ技術は、それらの内因性の対応のネイティブ動作を反映していない可能性が融合タンパク質の人工的な発現を伴うながら、彼らは、特定していないということです。 PLAの1つの主な利点は、それがFRに匹敵する信号を生成するために必要な近さの程度と、組織内で互いに近接していると可能性が高い複合体を形成する内因性タンパク質の相互作用因子の細胞内局在を決定することができるということであるETとBIFC。 PLA起因抗体認識およびDNA増幅のカップリングに高い特異性と感度との相互作用を検出することができる。したがって、このアッセイは、相互作用の正確な位置を明らかに涙の形で個別の、明るい信号を生成することができる。また、ほとんどの可視抗原を検出することができる。最後に、PLAは、実行する比較的簡単な技術ではない、それが完了するために、標準的な免疫組織化学的手順よりも、もはやかかる。従って、PLAは、多くの場合、長い準備時間と広範なトラブルに悩まされている他のタンパク質 - タンパク質相互作用アッセイを介して技術的な利点を提供する。
このプロトコルは、PLAは、 その場での内因性のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するために、ショウジョウバエ幼虫NMJに適用することができる方法を示す。ここでは、PLAは、は、Dlgおよびフーバーが実際のNMJのシナプス後領域に複合体中に存在することが示されている幼虫の体壁筋調製物に対して行われる。 PLAは、以前に幼虫のNMJを研究するために使用されていなかった、とショウジョウバエの組織でこのアッセイを使用している論文のほんの一握りは、現状であります。これは、 ショウジョウバエコミュニティにPLAのさらなる暴露は、他のより一般的に使用されるタンパク質-タンパク質相互作用アッセイを補完する追加のツールとしての利用増加につながることが期待されている。
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Protocol
1.ボディウォール準備
NOTE：（体壁の筋肉を神経支配のNMJの研究のための）第三齢幼虫の体壁の調製先にブレントに記載したように行ったら 10、またはラマチャンドラとBudnik 11,12が、いくつかの修正を加えた。
- 解剖
- 標準的な手順13を使用して五から六日間、25℃でフライ株式や十字架を上げる。
- 細かい鉗子を使用してバイアルまたはボトルから3齢幼虫をクロールピック。
- 任意の食物粒子を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含有する小さなペトリ皿に幼虫を洗浄する。
- シルガードディスクに、単一の幼虫を置き、氷冷PBSの数滴でそれを浸す。氷冷したPBSを使用すると、簡単に操作すること幼虫を気絶させるのに役立ちます。解剖を通して、準備は常に乾燥からそれを防ぐために、PBS中に沈められていることを確認してください。
- ラを配置します2気管路は解剖顕微鏡（ 図2A）の下に表示されるようにその背側を上にしてRVA。鉗子を使用して、minutienピンを把持気門（ 図2B）の近くに後端で幼虫を突き止めるする。別のピンを使用すると、口のフックに近い前方の終わりにキューティクルを貫通。ゆっくりと（ 図2B）、それを突き止めるその後、縦に幼虫を伸ばす。
- 顕微解剖はさみを使って、小さな開口部を作成するために、ピンの近くに後部の端をつまんで。切開はちょうどキューティクルを通過するのに十分表面的でなければならない。
- 2気管路（ 図2C）との間の背側正中線の全長に沿って切断し、切開部に鋏の底刃の先端を配置する。腹側体壁の筋肉を損傷しないように切断する際に、わずかに上向きにはさみの刃を向け。
- 小さな水平切開を行い、わずかにポストの前方eriorly-置かピン（ 図2C）。別の類似の切開がやや前方に-置かピン（ 図2C）に後方を確認します。切開はちょうどキューティクルを通過する必要があります。
注：似ている必要があります合わせてステップ1.1.7と1.1.8から3切開」
完成した時」、 すなわち 、幼虫の体の背側の左右のフラップが生成されるべきである。 - 慎重にピンセットで内臓をきれいに。 PBSの少数の力強い滴を追加すると、幼虫の体から臓器を変位ため、それが簡単にそれらを削除することに役立ちます。それは体壁の筋肉の損傷の原因になりますように幼虫の体を突っついは避けてください。
- オープン幼虫の体を広げると（ 図2D）のコーナーを突き止める。ピン止めするとき、均等に張力をかけ長方形を形成するように水平方向と垂直方向の両方で体壁を伸ばす（それ形状の電子図2G）、その過程で体壁の筋肉を引き裂くないように注意しながら。
- 残りの内臓（ 図2E）を除去完了。
- 固定および透過
- ブアン溶液を数滴に固定体の壁を浸し。氷上で15分間インキュベートする。あるいは、代替固定液として4％パラホルムアルデヒド（PFA）を使用。 30分間インキュベートする。
- トリトンとのリン酸緩衝生理食塩水（PBT）で3回洗浄します。
- 細かい鉗子を使用して、慎重にピンを取り外し、シリコン処理0.65ミリリットルマイクロ遠心チューブに彼らのコーナーによって身体の壁を転送する。
- PLAの準備が整うまで4℃でPBTの体壁を保管してください。最適な結果を得るために、一日または解剖の2以内に身体壁を免疫染色始める。
注：試薬上のアイコンをクリックすると、すべての体壁がアッセイ中に平等に扱われることを保証するために、異なる遺伝子型は、単一の中に入れることができるチューブ。遺伝子型（例については、図2Fを参照）異なっ体壁の角を切断することによって区別することができる。
完成した時」、 すなわち 、幼虫の体の背側の左右のフラップが生成されるべきである。 2.免疫組織化学
注：三齢幼虫の体壁の免疫染色は、以前にブレントら 14とラマチャンドランとBudnik 11に記載のように行ったが、いくつかの変更11,14とした。
注：特に明記しない限り、室温で、穏やかに攪拌しながら、すべての手順を実行します。
- 阻止
- 10分間ずつPBTで三回体の壁を洗ってください。
- 1時間、1％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックする。
- 免疫染色
- 目的の2つのタンパク質に対するマウスおよびウサギ一次抗体と体壁をインキュベートし、室温で2時間、または4℃で一晩のために（1％BSAで希釈）。 250ウサギaの場合：この場合は、1：10のマウス抗は、Dlgおよび1を使用NTI-HTSM 15,16。マウスまたはウサギで行われていないマーカーに対する抗体も含まれることができる- 例えば 、1を使用：200ヤギ抗HRPニューロン膜を描写する。
- PBTで10分間ずつ3回洗浄する。
- 室温で2時間、または4℃で一晩のために（1％BSAで希釈）のマーカーを検出するためのフルオロフォア結合二次抗体と共にインキュベートする。ヤギ抗HRP抗体を検出するために、200 FITC結合抗ヤギ： 例えば 1を使用する- PLA信号は後で赤色蛍光体で可視化されるように、別のフルオロフォアは、マーカーを検出するために使用されなければならない。による感光性試薬の使用、以降この点から、暗所で管を保持する。
注：PLAは、共焦点顕微鏡下で赤チャンネル上で可視化信号と、マウスおよびウサギで育った一次抗体との間で実行されるために使用されているキットができます。所望であれば、他のキットは、アッセイがプリマで行うことができるように利用可能であるRY他の種で作製された抗体、および他のチャネル上で可視化シグナル。
3.近接ライゲーションアッセイ
注：特に明記しない限り、室温で、穏やかに攪拌しながら、すべての手順を実行します。
- PLAプローブ
- 10分間ずつPBTで三回体の壁を洗ってください。
- 37℃で2時間：（1％BSAで5希釈の各1）PLAプローブとインキュベートする。この場合、5-10体壁の適切な浸漬及び混合を確実にするためにPLAプローブ抗マウスMINUS40μlの、PLAプローブ抗ウサギPLUS40μlの1％BSAの120μlのを使用する。 PLAプローブ1:25希釈までまだ（この実験のために、すなわち 、）十分な信号対雑音比をもたらすことができる。
- ライゲーション
- 5分間ずつ二回洗浄バッファーAで体の壁を洗ってください。
- 1時間aのライゲーション溶液（連結緩衝液中でリガーゼの1：40希釈）でインキュベートT 37℃。この場合は、5〜10体の壁の適切な浸漬及び混合を確実にするためにリガーゼの5μL、5ライゲーション緩衝液40μlの高純度水を155μlのを使用しています。
- 増幅
- 2分間ずつ二回洗浄バッファーAで体の壁を洗ってください。
- 37℃で2時間、増幅溶液（増幅緩衝液中のポリメラーゼの1:80希釈）と共にインキュベートする。この場合は、5〜10体の壁の適切な浸漬及び混合を確実にするためにポリメラーゼ2.5μlの、5増幅緩衝液40μlの高純度水の157.5μLを使用しています。
- イメージングのための準備
- 10分間ずつ二回洗浄緩衝液Bで体の壁を洗ってください。
- 1分間に一度0.01X洗浄緩衝液Bで洗浄する。
- 取り付けの前に少なくとも30分間取付溶液数滴で平衡化、または4℃で一晩保存する。
- 微細なピンセットを使用して、慎重にプラットフォームスライドワットに体壁を転送するi番目の彼らのキューティクルを下に向けて。行と封入の低下や2内の同じ向きで体壁を配置します。その後明確なマニキュア液でスライドをシール、気泡を発生させないように注意しながら準備を介して22ミリメートル×40 mmのカバースリップを置きます。
- 共焦点イメージングのための準備ができるまで-20℃の暗所でスライドを保管してください。
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Representative Results
野生型の第3齢幼虫のNMJでは、Dlgというは、主にタイプが終末であるよりは、Dlg免疫反応性レベルはIb型終末においてより顕著であることで、I型グルタミン酸作動性神経繊維末端のシナプス後膜で発見された（ 図3A）4。 HTSが筋肉全体で存在するが、両方のI型繊維末端に等しい登場フーバー免疫反応性レベルのシナプス後の領域に集中し、また、（ 図3A '）シナプス前発見された8,17。は、Dlgとフーバーの分布が大きくシナプス後領域（ 図3A ''）8で重複することに注意してください。
は、DlgとフーバーはNMJでの複合体中に存在するかどうかを判断するには、PLAは2つのタンパク質間の幼虫の体壁筋標本で実施した。このアッセイでは、N末端およびウサギ抗HTSM抗体で第2のPDZドメインを検出するマウス抗Dlgという抗体これはC末端のMARCKS相同ドメイン15,16を用いた検出。野生型では、は、Dlgおよびフーバーの間PLA信号がNMJ（ 図3C-C ''）で特異的に観察された。信号は、主にこのようにしては、Dlgおよびフーバーが互いに近接していると思わシナプス後領域に複合体を形成することを示し、HRPによりdemarkedたタイプI終末のシナプス前膜に円周方向に局在した。結果はフーバーの免疫反応性を欠いているのhts 01103変異体のNMJを含む、我々の陰性対照として特異的であることが決定された（ 図3B-B 'は'）、観察可能なPLA信号（ 図3D）8,17,18 を示 さなかった。さらに、PLAは、ウサギ抗HTSM抗体を添加せずに行った（データは示していない）シグナルを生じなかった。終末の高倍率ビューは、DlgとのHTS免疫反応性が著しくシナプス後領域（ 図3E）に重なっていることを明らかにした、2つのタンパク質間のPLAのに対し、総は、Dlgおよびフーバータンパク質のサブセットのみを複合体（ 図3F）であることを示す控えめ涙点をもたらした。
さらに幼虫NMJを研究するためのツールとしてのPLAの信頼性をテストするために、我々はまた、セリン/スレオニンp21活性化キナーゼ、パック、および他のシナプス蛋白質19との間の相互作用を評価した。以前の免疫共沈降実験は、パックは、Dlgはまた、部材20となっている落書き複合体のメンバーであることを示している。野生型のNMJで、朴は、それがは、Dlgのローカライズ15,21に必要とされるシナプス後密度（ 図4A、C）、に局在する。 PAKとは、Dlgの免疫反応性分布は、シナプス後領域（ 図4A ''）でオーバーラップし、そして2つのタンパク質間のPLAは、具体的NMJ（ 図4B）で正のシグナルをもたらした。これらの結果は、2つのタンパク質がcであることを示している互いに近接を失う可能性が、この領域で複合体を形成している。私たちは朴複雑な結合について試験別のシナプスタンパク質は、ウィングレス（WG）、NMJ 22で数々の役割を果たしているショウジョウバエの Wntリガンド、だった。野生型では、Wgは、タイプI終末のシナプス前およびシナプス後側に濃縮されただけでなく、筋肉の細胞質（ 図4C '）を通して涙点23として存在している。興味深いことに、部分的にシナプス後領域（ 図4C ''）で重なっPAKとのWgの免疫反応性の分布かかわらず、2つのタンパク質間のPLAは観察可能な信号（ 図4D）を生じなかった。したがって、パック及びWgがNMJにおける互いに近接していない。この結果は、従来の共局在実験により重複免疫反応性を示さないで、すべてのタンパク質がPLA信号を生成することを示している、と追加の陰性対照として役立つ。
常に ">：" =キープtogether.withinページFO」ENT
図1：近接ライゲーションアッセイの模式図。 （A）一次抗体は、標準的な免疫組織化学的手順を用いて、目的の2つのタンパク質に結合する。（B）一次抗体は、次に、種特異的二次抗体の対を用いて検出される、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたPLAプローブと称される。（C）場合二つのタンパク質が互いに近接している、添付のPLAのプローブ間の距離は、二つの追加のコネクタのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを介して架橋させることができる。（D）は 、このコンホメーションでは、コネクタのオリゴヌクレオチドは、 その場でのライゲーションの際に閉じた環状DNA分子を形成することができる（E）環状DNA分子は、オリゴ糖のいずれかによって準備され、その場でのローリングサークル増幅のための鋳型として作用増幅したDNA産物中にPLAプローブにコンジュゲートgonucleotides。（F）配列は、次いで、蛍光標識された、相補的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される。図はWeibrecht ら 24に基づいていたことに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：三齢幼虫の体壁の準備。 2気管路が見えるように体壁切開を表す（AF）の模式図。（A）は 、その背側を上にしてシルガードディスクに、単一の幼虫を置きます。（B）ピン幼虫を下前方および後方端にプロセスで縦に幼虫を伸ばしminutienピン、と。（C） ''。（D）に均等に張力をかけ長方形を形成する過程で水平方向と垂直方向の両方で体壁を伸ばし、開いた幼虫の体を広げるとダウンコーナーをピン。（E）を似ている必要がありますうち残りの内臓。（F）示すのは、異なる遺伝子型を区別するために、本 体の壁の角を切断するためのさまざまな方法の例である。延伸体壁調製物（G）を表示完了した。画像は解剖顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラで撮影した。パネルFでのスケールバーは1ミリメートルを表します。図はラマチャンドランとBudnik、2010年12に基づいていたことに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：は、Dlgとフーバーは、幼虫のNMJのシナプス後領域での複合体中に存在する（AB ''）（ '野生で。は、Dlg（赤）とフーバーの分布（緑）は、野生型とHTS変異体のNMJでAA）。」のNMJを-type、は、Dlgは、主には、Dlgレベルが終末であるよりIb型においてより顕著であることで、I型終末のシナプス後膜で発見された。 HTSが筋肉全体で存在しているだけでなく、フーバーレベルは両方のI型繊維末端に似ていると、シナプス後領域の周囲に集中する。は、Dlgとフーバーの分布シナプス後の領域にオーバーラップする。（B-B ''）のNMJ変異型HTSには、HTS免疫反応性を欠いている。 HTS 01103突然変異の影響NMJは8分岐ことに注意してください。（CD ''）は、Dlgとフーバーの間にPLAを（赤）は、野生型とHTS変異体のNMJで実行。 HRPは、神経細胞膜（緑）をマークするために使用されます。いくつかの終末。（CC '）は、野生型での高倍率のビューがある示す、PLA信号がNMJで特異的に観察される。信号は、主には、Dlgおよびフーバーが互いに近接しているとシナプス後領域において複合体に存在することを示す、タイプI終末のシナプス前膜に円周方向に局在している。htsのための（D）のNMJ変異は観察PLAシグナルを示さなかった。 （EF）タンパク質のサブセットのみが複雑であることを示す明確な涙点では、Dlgとフーバーの結果との間で、単一の神経繊維末端の高倍率図である。（E）フーバーとは、Dlg免疫反応性著しくシナプス後の領域にオーバーラップする。（F）PLAが示され。パネルB中のスケールバーは、 ''（ 'AB）が40μmを表し';パネルD '中のスケールバーは、「（」を10μmCD）を表す]。年度パネルFの電子バーは5μmの（EF）を示している。示されているすべてのNMJ 4.画像はNIS要素·ソフトウェアとニコンA1Rレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用してマージされたスタックとして採用し、Adobe Photoshopので処理した。腹部のセグメントの筋肉6/7からのものの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。
図4：朴は幼虫のNMJのシナプス後領域において、Wgのは、Dlgとの複合体で存在しますが、しない（AD）示すのは、いくつかの神経繊維末端の高倍率図である（A-A ''）パック（緑）とは、Dlgの分布（。野生型のNMJにおける赤）。朴は、シナプス後密度に局在する。 PAKとは、Dlgの免疫反応性の分布は、シナプス後の領域にオーバーラップすることに注意してください。（B）PLA Between PAKとは、Dlg（赤）は、野生型のNMJで実行。 PLAの信号は、2つのタンパク質が、この領域において互いに近接していることを示す、NMJで特異的に観察される。（CC '）は、野生型のNMJにおけるパック（緑）のWg（赤）の分布。 WgがNMJのシナプス前及びシナプス後の両側に富むだけでなく、筋肉を通して涙点として存在している。朴の免疫反応性分布も部分的にシナプス後領域においてWgのと重なるように観察されることに注意してください。PAKとWgの（赤）の間（D）PLAは、野生型のNMJで実行。特定のPLAの信号は、2つのタンパク質が重複分布にもかかわらず、NMJで互いに近接していないことを示し、観察されない。パネルD中のスケールバーは5μmで（AD）を示している。腹部のセグメントのすべてのNMJ神経支配の筋肉6/7 4.画像はNIS要素·ソフトウェアとニコンA1Rレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用してマージされたスタックとして採用し、プロたAdobe Photoshopのでcessed。 図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このレポートは、PLAは、ショウジョウバエの幼虫NMJに適用する方法を示しています。アッセイは、NMJで存在する内因性のタンパク質 - タンパク質相互作用を検出するため幼虫体壁筋調製物に対して行われる。この技術では、は、Dlgおよびフーバーは、互いに近接しているため、特にシナプス後領域27において、複合体中に存在することが示されている。この結果を支持して、以前の研究では、次のデータとの関連付けの証拠を提供した：1）は、Dlgとフーバーの免疫反応性の分布が幼虫のNMJのシナプス後領域において重複し、2）は、Dlgとフーバーは共同に基づいて複合体を形成する免疫沈降大人になってからフライ溶解物を含む実験、および3）は、Dlgとフーバーは、上皮細胞とシナプス接合部8の両方で相互作用。シナプス後領域におけるPLA信号も一層クレーデを提供し、は、Dlgおよびパック、以前に他の研究において同定相互作用の間で観察されたNMJ 15,20,21でこのアッセイを使用してのNCEの。興味深いことに、朴とWgの間のPLAは、その免疫反応性の分布がNMJで重なっていても、観察可能なシグナルをもたらした。この結果は、免疫反応性の分布に重複表示されない全てのタンパク質は、したがって、PLAは、従来の共局在の研究よりも、タンパク質 - タンパク質相互作用を検出することで、より高い分解能を提供することを示す、PLA信号を生成することを実証する。
複数の変更は、幼虫のNMJ（データは示さず）9,25のためのアッセイを最適化するために、元のPLAプロトコルに行われた。まず、1％BSAの代わりに提供ブロッキング溶液の体壁のための優れたブロッキング剤であることが決定された。次に、反応溶液中に本体壁の強力な信号対雑音比、適切な浸漬及び混合を生成することが重要である。 0.65ミリリットルマイクロ遠心チューブ中で五から十体の壁のために200μlの最小値はSUITABとみなされましたル以上の身体壁を処理するときにボリュームがそれに応じて増加させることができるものの、PLAプローブ、リガーゼまたはポリメラーゼとインキュベートするとき。信号強度はまた、推奨される時間を30分かけて反応時間を増加させることにより増強された。第三に、PLAプローブの連続希釈試験は、試薬の節約と信号強度とのバランスを最適化するために行った。推奨される1から - までの1:25希釈のため、本報告書で行われた実験の場合：5希釈 - まだ合理的な信号対雑音比を生成することができます。ライゲーションの最適化に注意し、増幅反応は行わなかった。 PLAは微細な変化に敏感であることができますように最後に、それは強くコントロールと実験はアッセイ中に平等に扱われるように一回の実験の異なる遺伝子型が単一のチューブ内に配置されていることをお勧めします。遺伝子型が異なる身体の壁の角を切断することによって区別することができる。
Severaのlの方法は、酵母ツーハイブリッドスクリーニング、共免疫沈降及びFRETを含むショウジョウバエのタンパク質-タンパク質相互作用を検出するために使用される。しかし、どのようにこれらのメソッドは、PLAとその場でタンパク質-タンパク質相互作用を視覚化する能力と比較しますか？酵母ツーハイブリッドは、酵母で発現ショウジョウバエのタンパク質間の直接結合を検出することができ、それはハイスループットゲノムワイドスクリーニングにおいて使用されてきた。識別された相互作用の多くは生物学的に関連あるが、アッセイは、多くの場合、偽陽性を生成します。また、偽陰性は、複数の理由で発生する可能性があります、タンパク質が結合を妨げる可能性がある転写因子ドメインに融合され、多くの相互作用が酵母には存在しない翻訳後修飾を必要とし、（アッセイが行われる）核かもしれないいくつかの相互作用が適切に形成するために適した環境ではない。それは彼らのネイティブENVIRに内因性タンパク質を扱うような問題は、PLAに遭遇していないonment。内因性タンパク質の間の相互作用を検出するために使用することができる1つの方法は、共免疫沈降である。 ショウジョウバエの溶解物を含む実験は、相互作用が発生したライフサイクルにおける組織とステージを明らかにすることができる。溶解物の形成は、タンパク質を抽出するために細胞を破壊することを含むようしかし、相互作用がで発生する組織内の細胞、ならびにその細胞内局在性を評価することができない - PLAとは異なり。さらに、共免疫沈降は、結合タンパク質複合体を検出し、複合体内のタンパク質が互いに近接しているものを区別することができない。細胞内のタンパク質 - タンパク質相互作用の可視化を可能Drosophilistsに入手可能なFRETなどの方法がある。しかし、FRETは、蛍光タグに融合したトランスジェニックタンパク質の過剰発現を伴い、PLAのように、内因性タンパク質の挙動とは異なる場合があります。
その利点にもかかわらず、いくつかのlimitatがあるイオンは、PLAを使用する場合。そのような制限は、異なる種で作られ、目的のタンパク質に対する一次抗体の利用可能性である。彼らは内因性の相互作用の真の代表ではないかもしれないが、この問題は簡単に、タグ付けされたトランスジェニックタンパク質の使用を回避することができる。もう一つの問題は、2つの一次抗体が立体的に互いを妨げる場合、または一次抗体のいずれかのエピトープは、タンパク質-タンパク質相互作用部位を含む場合PLAは、 例えば、偽陰性を作り出すことができることである。 PLAが互いに近接しているタンパク質を検出するが、また、それは、プルダウンアッセイおよび酵母ツーハイブリッドスクリーニングとは異なり、直接および間接的なタンパク質 - タンパク質相互作用を区別しない。また、PLAは内因性のタンパク質間の相互作用の原因であるドメインが識別されません。したがって、他のタンパク質 - タンパク質相互作用アッセイは、まだ完全に相互作用を特徴付けるために必要とされるmolecularlY。
研究者は、26を達成さ数十ナノメートルの解像度で、 ショウジョウバエ幼虫NMJの空間的なアーキテクチャをマッピングする超解像顕微鏡を使用して開始しました。 PLAは、その同等の分子分解能で、低コスト、NMJでの多数のタンパク質の組織の詳細図を構築するのに役立ちますこれらの研究に技術的に簡単な補完を提供する必要があります。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
私たちは、ハエの株式を提供するためのブルーミントンショウジョウバエストックセンターに感謝します。我々はまた、抗体を提供するための発達研究ハイブリドーマバンク博士リン·クーリー（エール大学）を感謝。特別な感謝は、原稿上で彼女の助けをAhHyunユに行く。この作品は、自然科学とカナダの工学研究評議会（クリーガー）、ウィリアムとエイダイザベルスチール基金（クリーガー）、およびカナダ衛生研究所（ハーデン）からの補助金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps (fine #5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Precision Instruments | SYLG184 | Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60 x 15 mm Petri dish lid when dissecting. |
| Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection Scissors (ultra fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Platform Slides | Glue two 22 x 22 mm2 coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20 mm gap in between for sample mounting. | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal. |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1) | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS | PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787) | ||
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT | BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 °C. | ||
| mouse anti-Dlg (Discs large) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Use at a 1:10 dilution in 1% BSA. |
| rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) | Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA. | ||
| rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) | Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA. | ||
| mouse anti-Wg (Wingless) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | Use at a 1:5 dilution in 1% BSA. |
| goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| FITC-conjugated donkey anti-goat | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Wash Buffer A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337) |
| 1x Wash Buffer B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| 0.01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
References
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