Summary
Dit protocol toont hoe Proximity Ligatie Assay kunnen worden toegepast voor aantonen in situ eiwit-eiwit interacties bij de Drosophila larven neuromusculaire junctie. Met deze techniek worden Schijven grote en Hu-li tai Shao aangetoond dat een complex in het postsynaptische gebied, een associatie eerder geïdentificeerd door middel co-immunoprecipitatie vormen.
Introduction
Drosophila Discs grote (Dlg) is een geconserveerde lid van de membraan-geassocieerde guanylate kinase familie van steigers eiwitten die helpen orkestreren de assemblage van grote eiwitcomplexen op specifieke plaatsen van het plasmamembraan. Oorspronkelijk geïdentificeerd als een tumor suppressor eiwit, Dlg fungeert als een belangrijke determinant van epitheliale apicobasal polariteit 1,2,3. DLG dient ook als een grote steiger module bij de neuromusculaire junctie (NMJ) in de door glutamaat motorische neuronen tijdens de larvale ontwikkeling 4. DLG speelt diverse rollen in het larvale NMJ, en haar pleiotropism vertrouwt op zijn vermogen om te associëren met meerdere eiwitten 5,6. Een dergelijk eiwit is Hu-li tai Shao (HTS), een homoloog aan het zoogdier adducins die voornamelijk beschreven met betrekking tot hun rol bij het reguleren van het actine-cytoskelet spectrin 7. Eerder is aangetoond dat Dlg en Hts een complex die berusten op in vitro kunnen vormen 8. Een tekortkoming van deze resultaten is echter dat zij niet aan waar deze complexe vormen. Met behulp van immunohistochemie, worden de verdelingen van Dlg en Hts waargenomen overlappen de postsynaptische membraan van larvale NMJs, maar zijn ze in een complex in deze regio 8? Zoals onlangs aangetoond en verder hier beschreven, wordt Proximity Ligatie Assay (PLA) gebruikt om te zoeken naar een in situ associatie tussen Dlg en Hts specifiek op het larvale NMJ 27.
PLA is een relatief nieuwe techniek meestal gebruikt in cel- en weefselkweek dat eiwit-eiwit interacties kan detecteren situ 9. In deze assay worden primaire antilichamen tegen de twee eiwitten van belang gedetecteerd met een paar species-specifieke secundaire antilichamen, aangeduid PLA probes die zijn geconjugeerd met oligonucleotiden (Figuur 1A, B). Als de twee eiwittens in dichte nabijheid van elkaar (dat wil zeggen binnen enkele tientallen nanometers), de afstand tussen de bijgevoegde PLA probes kunnen worden overbrugd door hybridisatie van twee extra connector oligonucleotiden (Figuur 1C). In deze conformatie, de vrije uiteinden van de connector oligonucleotiden dicht genoeg bij contact met elkaar maken, en een gesloten circulair DNA-molecuul kan worden opgericht onder in situ ligatie (figuur 1D). Het circulaire DNA-molecuul als een matrijs voor in situ rolling circle amplificatie, die gevuld is met één van de oligonucleotiden geconjugeerd aan de PLA probes (figuur 1E). Sequenties in het resulterende geamplificeerde, concatemere DNA product kan vervolgens worden gevisualiseerd met fluorescent gelabelde complementaire oligonucleotide probes (Figuur 1F). Aangezien het geamplificeerde DNA blijft aan een van de PLA probes, de subcellulaire lokalisatie van het eiwit-eiwit interacties withina weefsel kan worden geconstateerd.
Verschillende werkwijzen worden gewoonlijk gebruikt om eiwit-eiwit interacties te detecteren zoals in vitro technieken zoals co-immunoprecipitatie, pull-down assays en gist twee-hybride screening en in vivo technieken zoals Förster Resonance Energy Transfer (FRET) en Bimoleculaire Fluorescentie complementatie ( BiFC). Een valkuil van de in vitro technieken is dat zij niet identificeren waar de interactie endogeen plaatsvindt, terwijl de hiervoor genoemde in vivo technieken omvatten de kunstmatige expressie van fusie-eiwitten die niet de natieve gedrag van hun endogene tegenhangers kunnen weerspiegelen. Een groot voordeel van PLA is dat het kan bepalen in een weefsel subcellulaire lokalisatie van endogeen eiwit interactors die dicht bij elkaar waarschijnlijk vormen van een complex met de mate van nabijheid nodig is om een signaal dat vergelijkbaar FR genererenET en BiFC. PLA kunnen interacties met hoge specificiteit en gevoeligheid te detecteren vanwege de koppeling van antilichaam herkenning en DNA amplificatie. Aldus kan de assay discrete, heldere signalen in de vorm van puncta dat de exacte positie van de interactie onthullen genereren. Bovendien kan nauwelijks zichtbaar antigenen gedetecteerd. Tenslotte PLA is een betrekkelijk eenvoudige techniek uit te voeren, en het duurt niet langer dan een standaard immunohistochemische procedure te voltooien. Daarom PLA biedt een technisch voordeel ten opzichte van andere eiwit-eiwit interactie assays die vaak worden geplaagd met lange bereidingstijden en uitgebreide probleemoplossing.
Dit protocol toont hoe PLA kan worden toegepast op de Drosophila larven NMJ voor de opsporing van endogeen eiwit-eiwit interacties in situ. Hier PLA wordt uitgevoerd op larvale lichaamswand spier preparaten Dlg en Hts getoond inderdaad bestaan in een complex op de postsynaptische regio NMJs. PLA is niet eerder gebruikt om de larven NMJ bestuderen en er momenteel slechts een handvol gepubliceerde artikelen die deze test in Drosophila weefsel gebruikt. Het is te hopen dat de verdere blootstelling van PLA aan de Drosophila gemeenschap zal resulteren in een toenemend gebruik hiervan als een extra instrument om andere, meer algemeen gebruikte eiwit-eiwit interactie assays te vullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Body muur voorbereiden
OPMERKING: Bereiding van derde instar larven lichaamwanden (voor studie van de NMJs waarvan de lichaamswand spieren innerveren) werd uitgevoerd zoals eerder beschreven in Brent et al 10 of Ramachandran en Budnik 11,12, maar met enkele wijzigingen..
- Ontleding
- Hef fly voorraden en kruisen bij 25 ° C gedurende 5-6 dagen volgens standaardprocedures 13.
- Pick kruipen derde instar larven uit flesjes of flessen met behulp van fijne pincet.
- Was de larven in een kleine petrischaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om eventuele etensresten te verwijderen.
- Plaats één larve op een Sylgard schijf en dompel het in een paar druppels ijskoude PBS. Met behulp van ijskoude PBS zal helpen verdoven de larve waardoor het makkelijker te manipuleren. Gedurende de dissectie, opdat de uitwerking altijd ondergedompeld in PBS om te voorkomen drogen.
- Plaats de laRvA met zijn rug naar boven zodat de twee tracheale stukken zijn zichtbaar onder een dissectie microscoop (Figuur 2A). Met behulp van de tang om een minutien pin te begrijpen, speld de larve neer op het achterste einde nabij het spiracles (Figuur 2B). Met een andere pin, doorboren de cuticula aan het voorste uiteinde in de buurt van de mond haken. Voorzichtig rekken de larve uit in de lengte, dan pin het naar beneden (Figuur 2B).
- Met behulp van microdissection schaar, knijp het achterste einde nabij de pin naar een kleine opening te creëren. De incisie moet oppervlakkig genoeg om alleen passeren de cuticula zijn.
- De punt van het onderste blad van de schaar in de incisie, snede langs de gehele lengte van de middellijn tussen de tracheale stukken (figuur 2C). Richt de schaar bladen iets naar boven bij het snijden te voorkomen dat schade aan de ventrale lichaam muur spieren.
- Maak een kleine horizontale incisie iets anterior aan de posteriorly geplaatste pen (figuur 2C). Maak een andere soortgelijke incisie iets posterior aan de naar voren geplaatste pen (figuur 2C). De incisies moet gewoon passeren de cuticula.
OPMERKING: De drie incisies uit stappen 1.1.7 en 1.1.8 in combinatie zou een te lijken "
"Wanneer voltooid, dat wil zeggen, een linker- en rechter klep aan de dorsale zijde van het larvale lichaam moeten worden geproduceerd. - Reinig voorzichtig uit de inwendige organen met de tang. Het toevoegen van een paar krachtige druppels PBS zal helpen verdringen de organen uit het larvale lichaam, waardoor het makkelijker om ze te verwijderen. Vermijd poking het larvale lichaam als het schade aan de lichaamswand spieren veroorzaken.
- Wikkel het larvale lichaam open en speld de hoeken naar beneden (figuur 2D). Wanneer pinning, strek het lichaam muur zowel horizontaal als verticaal naar een gelijkmatig gespannen rechthoek vormen (see Figuur 2G voor de vorm), zorg ervoor dat u het lichaam muur spieren in het proces te scheuren.
- Eindig het verwijderen van alle resterende interne organen (figuur 2E).
- Fixatie en Permeabilisatie
- Dompel de gespeld lichaam muren in enkele druppels van Bouin's oplossing. Incubeer gedurende 15 minuten op ijs. U kunt ook gebruik maken van 4% paraformaldehyde (PFA) als alternatief fixatief; incubeer gedurende 30 minuten.
- Spoel driemaal met fosfaatbuffer Saline met Triton (PBT).
- Met behulp van fijne tang, voorzichtig de pennen te verwijderen en breng het lichaam muren door hun hoeken in een gesiliconiseerde 0,65 ml microcentrifugebuis.
- Bewaar het lichaam wanden PBT bij 4 ° C tot klaar voor PLA. Voor een optimaal resultaat, start immuunkleuring het lichaam muren binnen een dag of twee van dissectie.
OPMERKING: Om te besparen op reagentia en dat alle lichaamwanden gelijk tijdens de assay worden behandeld, kunnen verschillende genotypen in één geplaatstbuis. Genotypen te onderscheiden door het snijden van de hoeken van het lichaam wanden verschillend (zie figuur 2F voorbeelden).
"Wanneer voltooid, dat wil zeggen, een linker- en rechter klep aan de dorsale zijde van het larvale lichaam moeten worden geproduceerd. 2. Immunohistochemistry
OPMERKING: Immunokleuring derde instar larven lichaamwanden werd uitgevoerd zoals eerder beschreven in Brent et al 14 en Ramachandran en Budnik 11, maar met enkele wijzigingen 11,14..
Opmerking: Voer alle stappen bij kamertemperatuur onder zacht schudden, tenzij anders vermeld.
- Blokkeren
- Was het lichaam muren met PBT driemaal gedurende 10 minuten elk.
- Blokkeren met 1% runderserumalbumine (BSA) gedurende 1 uur.
- Immunostaining
- Incubeer het lichaam muren met muis en konijn primaire antilichamen tegen de twee eiwitten van belang (verdund in 1% BSA) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. In dit geval gebruikt 01:10 muis anti-Dlg en 1: 250 konijn eennti-HTSM 15,16. Antilichamen tegen markers die niet zijn gemaakt in de muis of konijn kan ook opgenomen worden - bijvoorbeeld, gebruiken 1: 200 geit anti-Hrp aan de neuronale membranen af te bakenen.
- Was met PBT driemaal gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer met fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen tegen de markers (verdund in 1% BSA) detecteren 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Aangezien de PLA signaal later gevisualiseerd met een rode fluorofoor, moet een andere fluorofoor worden gebruikt om de marker te detecteren - bijvoorbeeld gebruik 1 200 FITC-geconjugeerd anti-geit geit anti HRP antilichaam detecteren. Door het gebruik van lichtgevoelige reagentia, houdt de buizen in het donker vanaf dit punt.
OPMERKING: De kit die gebruikt maakt PLA wordt uitgevoerd tussen primaire antilichamen opgewekt in muizen en konijnen, met het signaal gevisualiseerd op het rode kanaal onder confocale microscopie. Indien gewenst, andere pakketten verkrijgbaar waarmee de test wordt uitgevoerd met primary antilichamen opgewekt in andere soorten, en het signaal gevisualiseerd op andere kanalen.
3. Proximity ligatiebepaling
Opmerking: Voer alle stappen bij kamertemperatuur onder zacht schudden, tenzij anders vermeld.
- PLA Probes
- Was het lichaam muren met PBT driemaal gedurende 10 minuten elk.
- Incubeer met PLA probes (1: 5 verdunning elk in 1% BSA) gedurende 2 uur bij 37 ° C. In dit geval gebruikt 40 pl PLA probe antimuis MIN, 40 pl PLA probe anti-konijn PLUS en 120 gl 1% BSA om de juiste onderdompeling en mengen van 5-10 lichaamwanden waarborgen. Tot een 1:25 verdunning van de PLA probes nog, een voldoende signaal-ruisverhouding (dwz voor dit experiment).
- Ligatie
- Was het lichaam muren met Wasbuffer A tweemaal gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer met Ligatie oplossing (1:40 verdunning van ligase in Ligatie buffer) gedurende 1 uur eent 37 ° C. In dit geval gebruikt 5 ui Ligase, 40 ui van 5 Ligatie buffer en 155 gl zuiver water om de juiste onderdompeling en mengen van 5-10 lichaamwanden waarborgen.
- Amplification
- Was het lichaam muren met Wasbuffer A tweemaal gedurende 2 minuten elk.
- Incubeer met Amplificatie oplossing (1:80 verdunning van polymerase in Amplification buffer) gedurende 2 uur bij 37 ° C. In dit geval gebruikt 2,5 pl polymerase, 40 ui van 5 amplificatiebuffer en 157,5 pl zuiver water om de juiste onderdompeling en mengen van 5-10 lichaamwanden waarborgen.
- Voorbereiding voor Imaging
- Was het lichaam muren met Wasbuffer B twee keer voor 10 minuten elk.
- Wassen met 0.01x Wasbuffer B eenmaal voor 1 min.
- Equilibreren enkele druppels bevestigingsoplossing ten minste 30 minuten voor de montage of bewaar overnacht bij 4 ° C.
- Met behulp van fijne tang, zorgvuldig het lichaam muren te zetten op een platform dia wet hun nagelriemen naar beneden. Plaats het lichaam muren in rijen en in dezelfde richting binnen een druppel of twee van inbedmiddel. Plaats een 22 mm x 40 mm dekglaasje over de voorbereiding zorg luchtbellen niet te genereren, dan sluit de dia met heldere nagellak.
- Bewaar de objectglaasjes in het donker bij -20 ° C tot klaar voor confocale beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In wild-type derde instar larvale NMJs, wordt Dlg voornamelijk te vinden op de postsynaptische membraan van type I glutamatergische boutons, met Dlg immunoreactiviteit niveaus zijn meer uitgesproken bij type Ib boutons dan type is boutons (figuur 3A) 4. HTS gehele spier aanwezig maar concentreert op de postsynaptische regio Hts immunoreactiviteit niveaus opgenomen gelijk zowel type I boutons en ook presynaptisch gevonden (Figuur 3A) 8,17. Merk op dat de verdelingen van Dlg en Hts grotendeels overlappen de postsynaptische (Figuur 3A ') 8.
Om te bepalen of Dlg en Hts bestaan in een complex in de NMS, PLA tussen de twee eiwitten werd uitgevoerd op larvale lichaamswand spier preparaten. Voor deze test wordt een muis anti-Dlg antilichaam dat het tweede PDZ-domein aan de N-terminus en een konijn anti-HTSM antilichaam detecteertdat detecteert het MARCKS-homologie domein aan de C-terminus gebruikt 15,16. In wild-type, werd PLA signaal tussen Dlg en Hts waargenomen specifiek op de NMJ (Figuur 3C-C ''). Het signaal meestal omtrek gelokaliseerd aan het presynaptische membraan van type I boutons, die werd demarked door Hrp, daarmee aangevend dat Dlg en Hts in dichte nabijheid van elkaar en waarschijnlijk vormen een complex in het postsynaptische gebied. Het resultaat werd bepaald specifiek als onze negatieve controle mogelijk moet maken met hts 01.103 mutant NMJs dat immunologische Hts ontbreekt (figuur 3B-B ''), toonde geen waarneembare PLA signaal (figuur 3D) 8,17,18. Bovendien PLA uitgevoerd zonder toevoeging van konijnen anti-HTSM antilichaam geen signaal (gegevens niet getoond). Hoge uitzicht vergroting van de boutons bleek dat Dlg en Hts immunologische grove overlapt op het postsynaptische gebied (figuur 3E)Terwijl PLA tussen de twee eiwitten resulteerde in discrete puncta aangeeft dat slechts een subset van de totale Dlg en Hts eiwitten in complexe (figuur 3F).
Om de betrouwbaarheid van PLA verder te testen als middel om de larven NMJ bestuderen ook geëvalueerd interactie tussen de serine / threonine-kinase p21 geactiveerd, Pak, en andere synaptische eiwitten 19. Vorige co-immunoprecipitatie experimenten hebben aangetoond dat Pak is een lid van de Scribble complex, waarvan Dlg ook lid 20. In wildtype NMS, Pak lokaliseert de postsynaptische dichtheid (Figuur 4A, C), wanneer deze nodig is voor Dlg lokalisatie 15,21. De immunoreactieve verdelingen van Pak en Dlg overlappen de postsynaptische (Figuur 4A ') en PLA tussen de twee eiwitten tot een positief signaal specifiek op de NMJ (Figuur 4B). Deze resultaten geven aan dat de twee eiwitten in c verliezen nabijheid van elkaar zijn waarschijnlijk de vorming van een complex in deze regio. Een andere synaptische eiwitten we getest Pak complexe binding was Vleugelloze (Wg), de Drosophila Wnt-ligand, die op het NMJ 22 tal rollen speelt. In wild-type, wordt Wg verrijkt presynaptische en postsynaptische zijden van type I boutons, maar is ook aanwezig als puncta gehele spier cytoplasma (Figuur 4C) 23. Interessant genoeg de immunoreactieve verdelingen van Pak en Wg gedeeltelijk overlappen bij de postsynaptische (Figuur 4C ''), PLA tussen de twee eiwitten geen waarneembare signaal (figuur 4D). Daarom Pak en Wg niet dicht bij elkaar aan de NMJ. Dit resultaat toont aan dat niet alle eiwitten die overlappende immunoreactiviteiten via traditionele co-localisatie experimenten tonen een PLA signaal zal genereren, en dient als extra negatieve controle.
ent "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 1: Schematische weergave van Proximity Ligatie Assay. (A) Primaire antilichamen aan de twee eiwitten van belang onder toepassing van standaard immunohistochemische procedures. (B) De primaire antilichamen worden dan gedetecteerd met een paar species-specifieke secundaire antilichamen, aangeduid PLA probes, die zijn geconjugeerd met oligonucleotiden. (C) als de twee eiwitten in dichte nabijheid van elkaar, de afstand tussen de bijgevoegde PLA probes worden overbrugd door hybridisatie van twee extra connector oligonucleotiden. (D) In deze conformatie kan de connector oligonucleotiden een gesloten circulair DNA molecuul na in situ ligatie . (E) De circulaire DNA-molecuul als een matrijs voor in situ rolling circle amplificatie, die gevuld is met één van de oligonucleotides geconjugeerd aan de PLA probes. (F) sequenties binnen het geamplificeerde DNA-product wordt vervolgens gedetecteerd met fluorescent gelabelde complementaire oligonucleotide probes. Merk op dat het cijfer was gebaseerd op Weibrecht et al. 24. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Bereiding van derde instar larven lichaamwanden. (AF) Schematische tekeningen die een lichaamswand dissectie. (A) Plaats één larve op een Sylgard disc met zijn rug naar boven zodat de twee stukken tracheale zichtbaar. (B) Pin de larve neer de voorste en achterste einden met minutien pennen, strekken de larve uit lengterichting in het proces. (C) (D) Wikkel het larvale lichaam open en speld de hoeken naar beneden, dat zich uitstrekt van het lichaam muur zowel horizontaal als verticaal in het proces om een gelijkmatig gespannen rechthoek vormen. (E) Clean uit de resterende interne organen. (F) worden enkele voorbeelden getoond van de verschillende manieren om de hoek van het lichaam muren om verschillende genotypen onderscheiden snijden. (G) Gezicht op een uitgerekte lichaam muur voorbereiding wanneer voltooid. De foto is genomen met een digitale camera gemonteerd op een dissectie microscoop. Schaal bar in Panel F vertegenwoordigt 1 mm. Merk op dat het cijfer was gebaseerd op Ramachandran en Budnik 2010 12. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Dlg en Hts bestaan in een complex aan de postsynaptische gebied van larvale NMJs (AB '') Uitkering van Dlg (rood) en Hts (groen) in wild-type en hts mutant NMS (AA. '') In het wild. -type NMJs, wordt Dlg vooral aangetroffen op de postsynaptische membraan van type I boutons, met Dlg levels zijn meer uitgesproken bij type Ib dan Is boutons. Hts is de hele spier aanwezig maar ook concentreert zich rond de postsynaptische regio, met Hts niveaus zijn vergelijkbaar in beide type I boutons. De verdelingen van Dlg en Hts overlappen op het postsynaptische gebied. (BB '') NMJs mutant voor hts missen Hts immunoreactiviteit. Merk op dat de hts 01.103 mutatie effecten NMJ vertakking 8. (CD '') PLA tussen Dlg en Hts (rood) Uitgevoerd op wild-type en hts mutant NMJs. HRP wordt gebruikt om de neuronale membraan (groen) markeren. Getoond zijn hoog uitzicht vergroting van enkele boutons. (CC '') In het wild-type, wordt PLA signaal specifiek waargenomen op de NMJ. Het signaal wordt meestal omtrek gelokaliseerd aan het presynaptische membraan van type I boutons, wat aangeeft dat Dlg en Hts in dichte nabijheid van elkaar bestaan in een complex in het postsynaptische gebied. (D) NMJs mutant hts vertoonden geen waarneembare PLA signaal. (EF) weergegeven die hoog uitzicht vergroting enkelvoudige boutons. (E) Hts en Dlg immunoreactiviteit grove overlap op de postsynaptische gebied. (F) PLA tussen Dlg en Hts resulteert in verschillende puncta aangeeft dat slechts een subset van de eiwitten in een complex . Schaal bar in Paneel B '' staat voor 40 micrometer (AB ''); schaal bar in Panel D '' staat voor 10 micrometer (CD ''); scale bar in Panel F vertegenwoordigt 5 micrometer (EF). Alle getoonde NMJs zijn van spieren 6/7 in abdominale segment 4. Beelden werden genomen als samengevoegd stapels met een Nikon A1R laser scanning confocale microscoop met NOS-Elements-software, en bewerkt met Adobe Photoshop. Klik hier om een grotere versie van de foto figuur.
Figuur 4: Pak bestaat in een complex met Dlg, maar niet Wg, op het postsynaptische gebied van larvale NMJs (AD) Getoond worden hoge uitzicht op vergroting van enkele boutons (AA '') Uitkering van Pak (groen) en Dlg (.. rood) in het wild-type NMJs. Pak lokaliseert de postsynaptische dichtheid. Merk op dat de immuunreactieve distributies van Pak en Dlg overlappen op het postsynaptische gebied. (B) PLA between Pak en Dlg (rood) uitgevoerd op wild-type NMJs. PLA signaal specifiek waargenomen in de NMS, wat aangeeft dat de twee eiwitten zijn dicht bij elkaar in deze regio. (CC ') Distributions van Pak (groen) en Wg (rood) in wildtype NMS. Wg verrijkt zowel de presynaptische en postsynaptische zijden van de NMJ, maar is ook aanwezig als puncta gehele spier. Merk op dat de immuunreactieve verdeling van Pak ook wordt waargenomen om gedeeltelijk overlappen met Wg bij de postsynaptische regio. (D) PLA tussen Pak en Wg (rood) uitgevoerd op wild-type NMJs. Geen specifieke PLA-signaal waargenomen, wat aangeeft dat de twee eiwitten zijn niet dicht bij elkaar in de NMS ondanks hun overlappende verdelingen. Schaal bar in Paneel D vertegenwoordigt 5 micrometer (AD). Alle NMJs innervate spieren 6/7 in abdominale segment 4. Beelden werden genomen als samengevoegd stapels met een Nikon A1R laser scanning confocale microscoop met NOS-Elements-software, en de proopend met Adobe Photoshop. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit rapport toont aan hoe PLA kan worden toegepast op de Drosophila larven NMJ. De test wordt uitgevoerd op larvale lichaamswand spier voorbereiding van de opsporing van endogeen eiwit-eiwit interacties bij het NMJ. Met deze techniek Dlg en Hts worden getoond in dichte nabijheid van elkaar, en dus bestaan in een complex, specifiek op de postsynaptische gebied 27. Ter ondersteuning van dit resultaat, heeft een eerdere studie het bewijs van hun associatie met de volgende gegevens: 1) de immuunreactieve distributies van Dlg en Hts overlappen op het postsynaptische gebied van larvale NMJs, 2) Dlg en Hts vormen een complex op basis van co- immunoprecipitatie experimenten met hele volwassen vliegen lysaten, en 3) Dlg en Hts interactie in zowel epitheliale en synaptische knooppunten 8. PLA signaal op de postsynaptische gebied werd ook waargenomen tussen Dlg en Pak, een interactie eerder geïdentificeerd in andere studies, waardoor verdere credenvu van het gebruik van deze test bij de NMJ 15,20,21. Interessant, PLA tussen Pak en Wg resulteerde in geen waarneembare signaal, ook al zijn hun immunoreaktieve distributies overlapt aan de NMJ. Dit resultaat toont aan dat niet alle eiwitten die immunologisch vertonen overlappende verdelingen PLA signaal genereert, hetgeen wijst dat PLA heeft een hogere resolutie bij het detecteren van eiwit-eiwitinteracties dan traditionele co-localisatie studies.
Meerdere wijzigingen zijn aangebracht in de oorspronkelijke PLA-protocol om de test voor de larven NMJ optimaliseren (gegevens niet getoond) 9,25. Eerst werd vastgesteld dat 1% BSA is beter blokkeringsmiddel voor het lichaam wanden in plaats van de ontvangen Blocking Solution. Ten tweede, een sterk signaal-ruisverhouding, goede onderdompeling en mengen van het lichaam wanden produceren de reactieoplossingen kritisch. Een minimum van 200 ul gedurende 5-10 lichaamwanden in een 0,65 ml microcentrifugebuis werd geacht suitable bij incubatie met de PLA probes, ligase of polymerase, hoewel de omvang daarvan bij het verwerken voller wanden kan worden verhoogd. Signaalsterkte werd ook verbeterd door het verhogen van de reactietijden van 30 minuten in de aanbevolen tijden. Ten derde, een seriële verdunning test van de PLA probes werd uitgevoerd om het evenwicht tussen reagens instandhouding en signaalsterkte optimaliseren. Voor de experimenten in dit verslag een 1:25 verdunning - het aanbevolen 1: 5 verdunning - kan nog steeds een redelijke signaal-ruisverhouding. Merk op dat optimalisering van de ligatie en amplificatie reacties werden niet uitgevoerd. Ten slotte, zoals PLA gevoelig minute veranderingen kan zijn, is het sterk aanbevolen dat de verschillende genotypen van een enkel experiment worden geplaatst in een enkele buis, zodat de controles en experimenten even tijdens de test worden behandeld. Genotypen te onderscheiden door het snijden van de hoeken van het lichaam wanden verschillend.
Several methoden worden gebruikt om Drosophila eiwit-eiwit interacties van yeast two-hybrid screening, co-immunoprecipitatie en FRET detecteren. Maar hoe deze methoden vergelijken met PLA en de mogelijkheid om proteïne-proteïne interacties visualiseren in situ? Gist twee-hybride kunnen direct detecteren binding tussen Drosophila eiwitten tot expressie gebracht in gist, en het is gebruikt in high-throughput genoom-brede schermen. Hoewel veel van de geïdentificeerde interacties zijn biologisch relevant, de test produceert vaak vals-positieven. Bovendien kan valse negatieven optreden om verschillende redenen: de eiwitten gefuseerd aan transcriptiefactor domeinen die kunnen interfereren met binding vele interacties vereisen post-translationele modificaties die niet voorkomen in gist, en de nucleus (waar de test plaatsvindt) kan een geschikte omgeving voor een aantal interacties naar behoren te vormen niet. Dergelijke zaken worden niet ondervonden met PLA als het gaat over endogene eiwitten in hun eigen mililieu. Eén werkwijze die kan worden gebruikt om wisselwerkingen te detecteren tussen endogene eiwitten co-immunoprecipitatie. Experimenten met Drosophila lysaten kan het weefsel en de fase in de levenscyclus waarin een interactie plaatsvindt onthullen. Aangezien lysaat formatie omvat het verstoren van de cellen om het eiwit te extraheren, de cellen in het weefsel waarin de interactie plaatsvindt, evenals zijn subcellulaire lokalisatie, kan niet worden beoordeeld - anders dan in PLA. Bovendien co-immunoprecipitatie detecteert eiwitcomplex binding en kan niet onderscheiden welke eiwitten in het complex in dichte nabijheid van elkaar. Er zijn methoden zoals FRET waarover Drosophilists dat de visualisatie van eiwit-eiwit interacties in de cel toe. Echter, FRET omvat de overexpressie van transgene eiwitten gefuseerd met fluorescerende labels en kunnen endogeen eiwit gedrag in PLA niet weerspiegelen.
Ondanks de voordelen, zijn er enkele BEPERKINGENionen bij het gebruik van PLA. Een dergelijke beperking is de beschikbaarheid van primaire antilichamen tegen de eiwitten van belang die in verschillende species. Dit probleem kan eenvoudig worden omzeild met behulp van gelabeld transgene eiwitten, hoewel zij niet werkelijk representatief zijn voor het endogene interactie kan zijn. Een ander probleem is dat PLA vals negatieven kunnen veroorzaken, bijvoorbeeld wanneer de twee primaire antilichamen sterisch zijn of wanneer het epitoop van een van de primaire antilichamen omvat de eiwit-eiwit interacties plaats belemmeren. Bovendien, hoewel PLA detecteert eiwitten die in dichte nabijheid van elkaar, het maakt geen onderscheid tussen directe en indirecte eiwit-eiwit interacties, in tegenstelling tot pull-down assays en gist twee-hybride screening. Bovendien zal PLA tussen endogene eiwitten niet identificeren welke domeinen verantwoordelijk voor de interactie. Zo zullen andere eiwit-eiwit interactie assays nog nodig om de interactie volledig te karakteriseren molecularly.
Onderzoekers zijn begonnen met het gebruik van super-resolutie microscopie om de ruimtelijke architectuur van de Drosophila larven NMJ in kaart, met een resolutie van tientallen nanometers wordt bereikt 26. PLA, met vergelijkbare moleculaire resolutie dient een goedkope, technisch eenvoudig aanvulling op deze studies die helpen bij de opbouw van een gedetailleerde weergave van de organisatie van talrijke eiwitten in de NMS verschaffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de Bloomington Drosophila Stock Center voor het verstrekken vlieg voorraden. We danken ook de Developmental Studies Hybridoma Bank en Dr. Lynn Cooley (Yale University) voor het verstrekken van antilichamen. Een speciale dank gaat uit naar AhHyun Yoo voor haar hulp op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (Krieger), de William en Ada Isabelle Staal Fonds (Krieger), en de Canadese Institutes of Health Research (Harden).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps (fine #5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Precision Instruments | SYLG184 | Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60 x 15 mm Petri dish lid when dissecting. |
| Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection Scissors (ultra fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Platform Slides | Glue two 22 x 22 mm2 coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20 mm gap in between for sample mounting. | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal. |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1) | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS | PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787) | ||
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT | BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 °C. | ||
| mouse anti-Dlg (Discs large) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Use at a 1:10 dilution in 1% BSA. |
| rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) | Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA. | ||
| rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) | Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA. | ||
| mouse anti-Wg (Wingless) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | Use at a 1:5 dilution in 1% BSA. |
| goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| FITC-conjugated donkey anti-goat | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Wash Buffer A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337) |
| 1x Wash Buffer B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| 0.01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
References
- Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
- Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
- Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
- Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
- Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
- Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
- Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D.
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
- Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
- Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
- Bokoch, G. M.
- Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
- Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
- Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
- Wang, S., et al. Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).
