Summary
Métodos de deteção de rotina utilizando a amplificação do genoma viral são limitados pela sua incapacidade de discriminar infecciosas de partículas não-infecciosas. O objetivo deste artigo é fornecer protocolos detalhados para métodos alternativos ajudar na discriminação de partículas infecciosas norovírus usando vinculação aptamer, espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão.
Abstract
Norovirus humano exige considerável da saúde pública e prejuízos econômicos em todo o mundo. Emergentes em vitro avanços de cultivo não são ainda aplicáveis para rotina detecção do vírus. A atual detecção e técnicas de quantificação, que dependem principalmente de amplificação de ácidos nucleicos, não discriminamos infecciosas de partículas virais não infecciosas. O objetivo deste artigo é apresentar detalhes específicos sobre recentes avanços em técnicas usadas em conjunto a fim de adquirir mais informações sobre o status de infecciosidade de partículas virais. Uma técnica envolve avaliar a vinculação de um norovírus ssDNA aptamer para capsids. Aptamers tem a vantagem de ser facilmente sintetizado e modificado e são baratos e estável. Outra técnica, dinâmica, espalhando luz (DLS), tem a vantagem de observar o comportamento do capsídeo em solução. Microscopia eletrônica permite a visualização da integridade estrutural dos capsids do virais. Apesar de promissor, existem alguns inconvenientes para cada técnica, tais como específico aptamer ligação às moléculas de carga positiva de matrizes de amostra, exigência de capsídeo purificada por DLS e sensibilidade pobre para microscopia eletrônica. No entanto, quando estas técnicas são usadas em combinação, o corpo de dados produzidos fornece informações mais abrangentes na integridade de capsídeo norovírus, que pode ser usada para inferir a infecciosidade, informação que é essencial para a avaliação exata do métodos de inativação ou interpretação de detecção de vírus. Este artigo fornece protocolos para usar esses métodos para discriminar partículas infecciosas norovírus humano.
Introduction
Norovirus humano é responsável por um peso considerável da saúde pública globalmente, causando doenças aproximadamente 685 milhões e 212.000 mortes anualmente1, com um custo de bilhões de dólares,2,3. Hoje, quantificação e deteção de norovírus envolve a amplificação do genoma e/ou plataformas baseadas em ligante. O primeiro é geralmente preferido, pois é mais sensível, fornece informações quantitativas e tem geralmente menor risco de resultados falso-positivos4. A técnica mais comum norovírus deteção e quantificação do genoma amplificação é reação em cadeia da polimerase quantitativa transcriptase reversa (RT-qPCR). Porque metas e amplifica um pequeno segmento do genoma humano norovírus, RT-qPCR sozinho não é capaz de discriminar entre infecciosas e partículas não-infecciosas, como a enciclopédia do RNA genômico, danificaram capsids contendo genomas e capsids com fatalmente uma mutação/truncado genomas ainda podem ser amplificadas por RT-qPCR. Enquanto dois novos em vitro técnicas de cultivo para o norovírus humano5,6 têm sido relatadas recentemente, ambos ainda contam com o RT-qPCR para quantificação de vírus e ainda não são métodos viáveis para rotina clínica e ambiental testando os norovírus humanos. Assim, RT-qPCR continua a ser o padrão ouro para testes clínicos/ambientais.
Outros métodos em vitro foram desenvolvidos na tentativa de melhor estimar o status de infecciosidade das partículas norovírus. Esses métodos geralmente podem ser categorizados como aqueles que abordam a integridade do capsídeo norovírus e os avaliar a integridade do genoma. A primeira abordagem é mais popular. Um método comumente usado é pré-tratamento de RNase antes da extração do RNA genômico viral, no entanto, isso não conta para partículas virais que permanecem intactos, mas faltam a capacidade de se ligar a receptores/co-fatores do hospedeiro, bem como partículas virais que fatalmente se transformaram ou tem truncado ou marginalmente danificado genomas7. Integridade do capsídeo também pode ser avaliada com base na capacidade do vírus para vincular a norovírus humano co-receptor/co-fatores, que é carboidratos conhecidos como antígenos de grupo do histo-sangue (HBGAs). HBGAs estão presentes em células epiteliais intestinais do hospedeiro, como parte de glicoproteínas ou glicolipídios (entre vários outros tecidos) e podem ser secretadas em fluidos corporais como saliva. Bactérias entéricas contendo substâncias HBGA, como em suas superfícies também foram mostradas para vincular o norovírus humano8,9,10, e tais interações podem promover norovírus infecção5. O conceito básico de utilizando a ligação de HBGA é que apenas partículas virais capazes de ligação para o putativo do receptor/co-factor seria capazes de infectar as células. Vários estudos sugerem que o grânulo HBGA vinculação anterior a amplificação do ácido nucleico é um método promissor para infecciosidade discriminação11,12,13,14, 15,16. Um grande desafio em matéria de HBGAs é que nenhum tipo HBGA pode ligar todos os genótipos de norovírus humano. Para resolver isso, porcina mucina gástrica, que contém HBGAs, tem sido utilizada em substituição de carboidratos HBGA purificados por razões de facilidade de síntese, coerência e custo reduzido.
Uma recente publicação pela Moore et al . 17 introduziu um conjunto de novas técnicas para estimar a integridade do capsídeo norovírus humano. No lugar de HBGAs, Moore et al . 17 investigou a ligação de um amplamente reativo ácido nucleico aptamer (M6-2)18 e amplamente reativa anticorpo monoclonal (NS14)19 ao tratado termicamente capsids de norovírus Sydney GII.4 (vírus-como partículas ou VIPs) e comparou-o para a ligação de HBGAs sintéticos. Aptamers de ácidos nucleicos são curtos (~ 20-80 nt) único encalhado ácidos nucleicos (ssDNA ou RNA) que dobre em estruturas tridimensionais únicas como consequência de sua sequência e vincular um alvo. Porque eles são ácidos nucleicos, eles são menos onerosos; facilmente quimicamente sintetizado, purificado e modificado; e estável ao calor. Existem vários relatos de aptamers gerados contra norovírus, com alguns deles mostrando ampla reatividade para uma variedade de cepas18,20,21,22. A título de exemplo, Moore et al . 17 demonstrou que aptamer M6-2 acoplado a capsids norovírus humano purificado, montado (VLP) e se comportou da mesma forma para HBGA na dependência de capsídeo viral para manter a estrutura de proteína mais elevada ordem (por exemplo, secundária e terciária) para ligação para ocorrer. Por outro lado, uma proporção significativa de vinculação de norovírus VIP ao anticorpo NS14 permaneceu depois que capsids foram totalmente desnaturados. Avaliação da vinculação de norovírus no estudo de Moore et al . 17 foi feito usando um método simples, baseado em placa, semelhante ao ELISA, com a exceção de que aptamers são usados no lugar de anticorpos (portanto, o método foi chamado ELASA). Esse método experimental de alta taxa de transferência foi utilizado para avaliar os efeitos de diferentes tratamentos na capsídeo norovírus, trabalho que é valioso para a compreensão do mecanismo de inactivação viral após a exposição a estressores físicos ou químicos. No entanto, uma desvantagem para esse método é a baixa sensibilidade e falta de tolerância para contaminantes matriz associada a níveis mais elevados que causam inespecificas por aptamers.
Moore et al. 17 usado outro método, luz dinâmica espalhamento (DLS), para monitorar a agregação de partículas virais em resposta a um tratamento térmico. DLS é comumente usado para avaliar o tamanho de suspensões de nanopartículas e foi estendido para proteínas23,vírus e24 25,26,27. A intensidade da luz espalhada por partículas em solução varia em função do tamanho da partícula, permitindo o cálculo do coeficiente de difusão e, em seguida, diâmetro de partículas utilizando fórmulas bem estabelecidas. A técnica DLS pode distinguir o diâmetro hidrodinâmico de partículas dispersas até à escala nanométrica, que permite a detecção de vírus dispersos, proteínas do capsídeo individuais ou dímeros e agregados de vírus com base no tamanho27. Agregação de vírus, representada por um aumento no tamanho da partícula, é indicativa de perda de integridade do capsídeo. Como capsídeo é desnaturado e atrapalha a sua estrutura, resíduos hidrofóbicos se tornam expostos e fazer com que as partículas que nos juntar e formar agregados. DLS pode ser usado para medir o tamanho de partícula após um tratamento especificado ou a cinética de agregação em tempo real17,28. Este método tem a vantagem de permitir a observação do comportamento do capsídeo em solução, mas requer altas concentrações de capsídeo purificado, que pode não ser inteiramente representativo do vírus em seu estado natural.
O método final utilizado por Moore et al . 17 foi a microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Embora este método não tem sensibilidade e não gerar dados quantitativos, permite a visualização dos efeitos de diferentes tratamentos sobre a estrutura do capsídeo viral. Embora não ainda ideal para configurações clínicas/ambiental, a utilização desses métodos em combinação é valiosa na compreensão humana norovírus inactivação. O objetivo deste artigo é fornecer protocolos em profundidade para o ensaio de vinculação baseada em placa (ELASA), DLS, e métodos de preparação TEM usado para investigar os efeitos de tratamentos térmicos no capsídeo norovírus no contexto dos efeitos dos tratamentos no capsídeo integridade, tal como apresentado no Moore et al . 17.
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Protocol
1. baseados em placa de ensaio de vinculação para avaliar perda de maior ordem norovírus capsídeo estrutura
Nota: um protocolo ELASA muito semelhante ao que aqui apresentado tem sido publicado 29, e ensaios ELASA semelhantes anteriormente foram relatados como parte da pesquisa em outro lugar artigos 17 , 18 , 22.
- Tratamento térmico de norovírus humano capsids de Sydney GII.4
- obter norovírus humano purificado da proteína de capsídeo maior (VP1) de Sydney GII.4 (adesão: JX459908) montado em capsids.
Nota: Capsids no estudo foram obtidas cortesia Atmar R. (Baylor College of Medicine, Houston, TX).
Capsids - diluir 50 µ g/ml em 1 x fosfato salino (PBS, pH 7,2) para um volume máximo de 15 µ l no indivíduo tampado da polimerase. Certifique-se de que o tubo contém pelo menos 600 ng de capsídeo. Certifique-se de que há 600 ng do capsídeo por combinação de tratamento-ligand.
- Pré-aqueça o termociclador para tratamento de calor desejado.
Nota: para efeitos do presente protocolo, o tratamento a 68 ° C por vezes diferentes (0 - 25 min) foi escolhido. - Pré-aqueça um cycler térmico adicional a 4 ° C para refrigeração imediata. Adicione os tubos com solução de capsídeo para o termociclador para o tempo desejado. Imediatamente transferi para o reciclador de pre-refrigeração a 4 ° C por 5 min após o aquecimento.
- Incluir 95 ° C por 5 min de tratamento como um controle de capsídeo desnaturado. Incluem solução de capsídeo não tratada (23 ° C) como controle positivo. Incluem o PBS com nenhum capsídeo como um controle negativo adicional.
- Brevemente spin para baixo em uma centrífuga para obter todas as gotas para a parte inferior do tubo e diluir as soluções de capsídeo tratados em PBS a 3 µ g/mL. Certifique-se de que há pelo menos 200 µ l de capsídeo diluído, Tratado (100 µ l/poço).
- obter norovírus humano purificado da proteína de capsídeo maior (VP1) de Sydney GII.4 (adesão: JX459908) montado em capsids.
- Aplicar 100 µ l de solução de capsídeo para cada poço, garantindo que existem pelo menos dois poços por tratamento. Além disso, incluir 2 poços de controle com 100 µ l PBS para cada ligante; Isto fornece a absorvância de plano de fundo do ensaio. Cubra o prato com uma tampa, foca as extremidades com parafina de cinema para reduzir a evaporação e deixam durante a noite em uma incubadora agitando a 4 ° C ou por 2 h à temperatura ambiente.
- Preparar o tampão de bloqueio tornando sólidos de leite desnatado 5% (p/v) em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST).
- Remover as soluções do capsídeo tratados da placa. Adicione 200 µ l/poço de tampão de bloqueio. Incubar durante 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite, selado em 4 ° C.
- Preparar o ligante vinculando soluções para o aptamer biotinilado M6-2 18 , 29 e biotinilado sintético HBGA sangue tipo A ou tipo biotinilado H.
- Dilua o aptamer biotinilado de 1 µM em água livre de nuclease. Certifique-se de que há suficiente solução para 200 µ l total para cada tratamento. Dilua o escolhido biotinilado HBGA a 30 µ g/mL no buffer de bloqueio. Certifique-se de que há suficiente solução para o volume total de 200 µ l de cada tratamento.
Nota: Para usar menos HBGA, 10 µ g/mL de HBGA em 0,25% de leite desnatado-PBST pode ser substituído. Concentrações para biotinilado M6-2 e HBGA foram otimizadas e relatadas anteriormente.
- Dilua o aptamer biotinilado de 1 µM em água livre de nuclease. Certifique-se de que há suficiente solução para 200 µ l total para cada tratamento. Dilua o escolhido biotinilado HBGA a 30 µ g/mL no buffer de bloqueio. Certifique-se de que há suficiente solução para o volume total de 200 µ l de cada tratamento.
- Remover o tampão de bloqueio e lavar as placa 3 vezes com 200 µ l/poço PBST. Pat o prato de cabeça para baixo em estéril papel toalha para secar a humidade residual. Soluções de ligação
- Adicione 100 µ l/poço do ligante, garantindo que existem 2 poços por combinação de tratamento térmico-ligante. Incubar a placa coberta com uma tampa em um agitador orbital em cerca de 60 rpm por 1h à temperatura ambiente.
Nota: Certifique-se de incluir 2 poços dos capsids não tratadas e totalmente desnaturadas capsids para cada ligante como controles positivos e negativos, respectivamente. Além disso, incluir 2 " sem capsídeo " fundo de poços para cada ligante como a placa de controle. - Remover as soluções de ligante e lavar os poços 3 vezes com 200 µ l/poço PBST. Tapinha de cabeça para baixo a placa estéril papel toalha para secar a humidade residual.
- Adicione 100 µ l/poço de solução de 0,2 µ g/mL streptavidin-peroxidase de rábano silvestre em PBS. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente com agitação suave em um agitador orbital.
Nota: O cojugado peroxidase de rábano-streptavidin diferentes terão diferentes concentrações. Consultar o usuário ' manual de s para a faixa ideal de concentrações para aplicações de ELISA de enzima e certifique-se de que é optimal. - Remover a solução de conjugado. Lavar 3 vezes com PBST de 200 µ l/poço. Tapinha de cabeça para baixo a placa estéril papel toalha para secar a humidade residual.
- Adicione 100 µ l/poço 3,3 ', 5,5 '-substrato tetrametilbenzidina (TMB) e que a cor de desenvolver para poços de controlo negativo observar 5-15 min. para qualquer cor e certifique-se de desenvolver consistentemente para o mesmo tempo entre placas de replicar. Lembre-se de faixa de absorbância do leitor de placa usada, bem como.
Nota: Os tempos de desenvolvimento podem diferir com base na qualidade dos ligantes/reagentes usados. - Parar o desenvolvimento da reação com ácido fosfórico 1M a 100 µ l/poço. Imediatamente ler a placa a 450 nm. Salvar os dados.
Nota: A introdução do ácido geralmente retarda a reação drástica mas não para completamente isso. Não deixe o prato parou por um tempo antes de ler a absorvância estendida.
2. Análise dos resultados de ensaio baseado em placa
- salvar os dados de absorbância cru em um programa de planilha. Produzir as absorvâncias médias para cada par de bem com o tratamento específico e o ligante. Use estas médias para todas as análises subsequentes.
Nota: Comparar ambas as absorvâncias bem para ter certeza de que não há pares de poços têm valores significativamente díspares. - Para analisar a integridade absoluta do capsídeo (vinculação de todos), subtrair a absorvância cru da " sem capsídeo " controle de cada outro valor de absorvância amostra.
Nota: Como alternativa, perda de ligação devido a perda da mais alta ordem (secundária, terciária, quaternária) estrutura pode diretamente ser analisada. Em vez de subtrair a absorbância do controle negativo (sem capsídeo), subtrai o valor do controle totalmente desnaturado capsídeo. Este remove toda ligação sinal devido inespecífica ligação ao aparelho, bem como ligação devido a sequência de capsídeo. HBGA e aptamer M6-2 exibem pouca ligação ao capsídeo totalmente desnaturado, então qualquer método produz resultados semelhantes. Sinal positivo falso atribuído a ligação inespecífica aptamer deve ser considerado ao escolher qual análise usar. - Com as absorvâncias negativas ou desnaturadas controle ajustado, dividir o tratamento absorvâncias por seu respectivo positivo (sem tratamento) controlam absorvâncias e multiplicam por 100. Isto fornece a porcentagem de sinal do capsídeo Tratado em relação ao tratamento controle.
- Para estimar o nível de sinal de vinculação para cada ligante atribuível à sequência de capsídeo, subtrair o " sem capsídeo " controle das absorvâncias iniciais negativo e levar a absorvância ajustada do capsídeo desnaturado. Divida isso pela absorvância ajustada do sinal de controle positivo e multiplique-o por 100. Isto dá a porcentagem aparente de sinal devido a vinculação de ligante para sequência de capsídeo desnaturado/capsídeo.
3. DLS para detectar vírus agregação após o tratamento térmico
Nota: As etapas a seguir podem ser específicas para o software e o instrumento utilizado, mas pode ser adaptado e aplicado a dispositivos similares.
- Criar um novo tamanho de SOP no DLS instrumento software usando: Material = proteína, Dispersant = PBS, temperatura = 25 ° C, tempo da equilibração = 0 seg, tipo de célula = cubeta descartável (volume pequeno, ZEN0040), ângulo de medição = 173° Backscatter, Duração da medição = automático, número de medições = 3, atraso entre medições = 0 s, processamento de dados: modelo de análise = propósito geral (resolução normal). Use as configurações padrão para todos os outros parâmetros.
- Selecione a seta verde execução dentro do software e o nome da amostra.
- Siga os passos 1.1.1 com 1.1.4 para tratamento térmico de VIPs.
- Dilua o calor tratado VIPs 01:10 em 1X PBS para uma concentração final de 5 µ g/mL. (Opcional) Filtrar a amostra com um tamanho de poro 1 µm para remover partículas de poeira; DLS é muito sensível ao pó, como grandes partículas dispersam a luz muito mais do que pequenas partículas. Cubeta do
- transferir 50 µ l de VIPs diluídos em um volume pequeno descartável. Inserir a cubeta na câmara de amostra do instrumento.
- Começar a correr e usar o ' Correlogram ', ' cumulantes Fit ', e ' o conselho perito ' guias para avaliar a qualidade dos dados.
- Durante a execução, verificar que o valor do índice de polidispersividade é menor que 0,3, representando uma qualidade medição. no ‘ multi-view ’ guia, certifique-se que o coeficiente de correlação é constante e perto, mas não superior a 1, em um curto período de tempo, e cai fora agudamente para 0 em um momento posterior, característico do tamanho de partícula. Uso o ‘ conselho perito ’ guia para feedback sobre a qualidade dos dados durante as medições.
- Quando a medição estiver concluída, verifique novamente que o valor do índice de polidispersividade é menor que 0,3. Certifique-se que os cumulantes segue linha os dados apontam estreitamente no ‘ cumulantes caber ’ Tab
- Tomar a média do diâmetro da partícula Z-média relatada para cada medição, como o tamanho de partícula de cada amostra. Traçar o diâmetro em nm vs temperatura em ° C.
4. DLS para detecção de agregação de vírus em tempo Real
Nota: as etapas a seguir podem ser específicas para o software e o instrumento utilizado, mas pode ser adaptado e aplicado a dispositivos similares.
- Criar um novo tamanho de SOP no DLS instrumento software usando: Material = proteína, Dispersant = PBS, temperatura = como desejado, tempo da equilibração = 0 seg, tipo de célula = cubeta de quartzo, ângulo de medição = 173° Backscatter, duração da medição = automático, Número de medições = 50 (pode ser aumentada ou diminuída dependendo de agregação taxa), intervalo entre medições = 0 s, processamento de dados: modelo de análise = múltiplos modos de estreitos (alta resolução). Use as configurações padrão para todos os outros parâmetros.
- Selecione a seta de execução dentro do software aberto e nomear uma nova amostra e permitir que o instrumento alcançar o equilíbrio da temperatura.
- Suspender os VIPs em 1X PBS em um tubo de microcentrifugadora na concentração de 5 µ g/mL e um volume entre 200-500 µ l. levar a suspensão.
- Spin para baixo a suspensão de VIP por 5-10 s em uma centrífuga de mesa a gás de. Isto ajuda a prevenir a formação de bolhas durante o tratamento térmico que interfere com as medições do tamanho. Suspensão
- transferência do VIP para um quartzo de pequeno volume cubeta-evitar bolhas e pipetar lentamente contra a parede da cubeta. Após o instrumento ter atingido o equilíbrio da temperatura, inserir a cubeta na câmara de amostra.
- Esperar 10 s para a temperatura da amostra equilibrar, então comece a correr. Inicie um timer no início da corrida. Pare o temporizador no final da primeira medição. Aproveitar este momento como o primeiro ponto de tempo. Obter pontos de tempo subsequente desde os tempos de medição gravados pelo software.
- Começar a correr e monitorar o correlogram, distribuição caber e conselhos de especialistas para avaliar a qualidade de dados.
Nota: O PDI não necessariamente será que menor do que 0,3 para as medições que a amostra deverá ser polydisperse durante a agregação.- Certifique-se que o coeficiente de correlação é constante e perto, mas não mais de 1 em curto espaço de tempo e cai acentuadamente em uma ou mais vezes mais tarde, característicos do tamanho de partícula.
- Certifique-se a distribuição segue linha os dados apontam estreitamente.
- Analisar os dados de tamanho.
- Determine cada vez ponto da diferença de tempo entre cada medição e ponto de tempo inicial. Durações de medição não são exatamente as mesmas.
- Usando uma distribuição de intensidade, gravar o tamanho dos picos com maiores áreas para cada ponto de medição/hora.
- Plotar os diâmetros de pico em nm vs tempo em min.
5. Preparação da amostra TEM
- obter suporte de carbono grades de filme (níquel) projetados para dez.
Nota: Consulte com a facilidade do núcleo em reagentes recomendados e sua manipulação para uso com o microscópio de instalação. Certifique-se de armazenar grades em uma caixa contendo dessecante ou uma câmara de vácuo para minimizar a exposição à umidade. - Corte aproximadamente 5 cm x 5 cm pedaços de papel de filtro. Obter pratos de Petri de vidro e fecho automático adequado inverter pinças projetadas para uso em microscopia.
- Cortar aproximadamente 2,5 cm x 5 cm pedaço de filme de parafina. Lugar na bancada a.
- Tratamento térmico de norovírus capsids de Sydney GII.4
- siga o procedimento de tratamento térmico, exatamente como descrito acima em etapas 1.1.1 - 1.1.5 exceto: usar 10 mM HEPES (pH 7,4) para tratamento em vez de PBS e não diluir ainda mais capsids após o tratamento (Mantenha a 50 µ g/mL de solução). Pipete a inteira µ l ~ 15 gota de solução de capsídeo tratados sobre filme de parafina.
- Agarrar a borda de grade com uma pinça, permitindo-lhes fechar na borda para segurar a grade e coloque o grade carbono lado-para baixo em cima da gota de solução tratada. Deixe incubar durante 10 minutos permitir que o capsídeo anexar à grade.
- Dependendo da pureza da preparação do capsídeo, adicionar lavagens da solução 10 mM HEPES se necessário sob a forma de gotículas de 10-15 µ l colocadas na linha depois da gota do capsídeo tratados.
- Após 10 min, pegar a grade com a gota. Coloque a grade quase perpendicular a um pedaço de papel de filtro para pavio fora da gota. Pegar o droplet de tampão HEPES 10-15 µ l com grade, segure por 30 s, em seguida, pavio fora com outro pedaço de papel de filtro para Wash.
- Coloque uma gota de 15 µ l de solução de acetato de uranilo 2% sobre o filme de parafina em uma área vazia.
- Pegar as gotas de acetato de uranilo com a grade e segure por 45 s. pavio embora o acetato de uranilo, certificando-se de remover a maior parte da solução. Coloque o lado do carbono grade em um pedaço de papel de filtro, tendo o cuidado de que a grade não " vara " à humidade sobre a pinça. Coloque o papel de filtro com a grade nele em uma placa de Petri de vidro aberto.
Nota: Não utilize pratos de Petri de plástico, como as grades serão atraídas eletrostaticamente a eles e tornar-se presa ao prato.
- Pegar as gotas de acetato de uranilo com a grade e segure por 45 s. pavio embora o acetato de uranilo, certificando-se de remover a maior parte da solução. Coloque o lado do carbono grade em um pedaço de papel de filtro, tendo o cuidado de que a grade não " vara " à humidade sobre a pinça. Coloque o papel de filtro com a grade nele em uma placa de Petri de vidro aberto.
- Repita para todos os tratamentos. Colocar as metades da placa de Petri com as grades num exsicador durante a noite para secar antes de observar com TEM.
- Consultar o centro de microscopia na respectiva instituição observando as grades preparadas a respeito. Algumas facilidades permitem que o utilizador a ser treinados sobre o funcionamento da sua instalação ' instrumento s. Detalhes específicos sobre a configuração e a observação de um microscópio específico é beyond o escopo deste artigo.
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Representative Results
A integridade estrutural do norovírus humano capsids de Sydney GII.4 (VIPs) foi avaliada usando vários métodos de romance, tal como apresentado por Moore et al 17. em primeiro lugar, uma experiência foi feita que a integridade dos capsids em função da sua capacidade de se ligar um putativo do receptor/co-factor (HBGA) ou aptamer ssDNA (M6-2) foram comparados (Figura 1). Os resultados exibidos anteriormente apresentados por Moore et al . 17e demonstrar que o comportamento de vinculação aptamer M6-2-capsídeo era semelhante da ligação do vírus-HBGA após a exposição a um tratamento térmico de 68 ° C para vários tempos de exposição. Enquanto o sinal de ligação HBGA foi perder um pouco mais cedo do que do aptamer M6-2, 2-M6 exibido uma taxa semelhante de perda de sinal calculada após os VIPs foram expostos a 65 ° C e 68 ° C por tempo vários pontos (tabela 1)17. Isto sugere que ambos HBGA e aptamer M6-2 ligação foi abolido em uma maneira similar.
Medições de DLS demonstraram que agregação devido a desnaturação da proteína provavelmente correspondeu com perda de sinal de ligação do ligante (Figura 2), como um hidrodinâmico diâmetro maior que 100 nm foi observada após cerca de 18 min de tratamento a 68 ° C. Estas foram as condições em que perda completa da ligação HBGA e quase toda perda de sinal de ligação para aptamer M6-2 (> 80%) ocorreu (Figura 1)17. Resultados TEM apoiado estas observações como mudanças morfológicas e aglutinação dos capsids tornou-se cada vez mais aparente, como a temperatura foi aumentada incrementalmente entre 60 ° C e 80 ° C, durante 1 min (Figura 3a). Um fenômeno similar foi observado após os capsids a 68 ° C por até 25 min de aquecimento, mas a resolução do TEM foi que menos pronunciada (Figura 3b)17.
Figura 1: vinculação dependente da conformação de dois ligantes diferentes aos norovírus capsids de Sydney GII.4 submetidos a tratamento térmico. Purificada capsids Sydney GII.4 (VLP) foram submetidos a tratamento térmico a 68 ° C por diferentes quantidades de tempo, e a ligação de sangue tipo A HBGA e aptamer M6-2 foi avaliada usando um ensaio baseado em placa de ligação ELASA. O eixo y exibe o sinal de absorbância observado para um tratamento (tempo de exposição) como a porcentagem de um controle de capsídeo não tratada. Esta figura foi apresentada anteriormente e esta figura foi modificada de Moore et al . 17 barras de erro representam o desvio padrão de ± 1% sinal. Dados são para pelo menos três placas de replicar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: exemplo de DLS dados por norovírus tratado termicamente capsids de Sydney GII.4 mostrando resultados ideal e ambígua/baixa qualidade. Capsids (VLP) foram submetidos a tratamento térmico a 65 ° C e 68 ° C, e seu tamanho foi monitorado em tempo real. Painel (um) corresponde a uma alta qualidade, a medição do coeficiente de correlação clara; e (b) para uma baixa qualidade, medição do coeficiente de correlação ambíguo. Painel (c) exibe dados de tamanho de partícula, mostrando um perfil claro de agregação para capsids tratados a 68 ° C; e (d) mostra dados de tamanho de partícula ambígua para capsids tratado termicamente. Alguns destes dados são apresentados, e assim, esta imagem é modificada de Moore et al . 17 , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: TEM de norovírus capsids de Sydney GII.4 submetido a diferentes tratamentos térmicos. Capsids purificados (VLP) foram submetidos a diferentes tratamentos térmicos e observadas usando microscopia eletrônica de transmissão. Painel (um) mostra dados para capsids aquecidos a diferentes temperaturas (60, 65, 70, 75 e 80 ° C) para 1 min. painel (b) mostra capsids submetidos a um tratamento de 68 ° C para 0 - 25 min. escala (bar) em fotos à direita representa a 100 nm. Essas imagens são apresentadas em Moore et al . 17 , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Taxa de decaimento exponencial (% sinal/min) | |||
| Temperatura | 65 ° C | 68 ° C | |
| Ligante | |||
| Tipo HBGA A | 2,50 ± 0,24 | 13,30 ± 1,15 | |
| Aptamer M6-2 | 2.47 ± 0,66 | 13.18 ± 0,47 | |
Tabela 1: taxas de decaimento exponencial para norovírus capsids de Sydney GII.4 trataram a 65 ° C e 68 ° C. Capsids foram submetidos a tratamentos térmicos para várias vezes a 65 ° C e 68 ° C, de refrigeração a 4 ° C e sua capacidade de se ligar sintético HBGA ou aptamer avaliados. A taxa de perda de sinal ao longo do tempo (taxa de decaimento) calculou-se então com cada ligante para cada temperatura. Estes dados foram apresentados anteriormente na Moore et al . 17 os dados são apresentados como % sinal/min ± 1 desvio padrão do sinal %.
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Discussion
O protocolo e as técnicas descritas aqui fornecem um meio de avaliar o norovírus humano capsídeo integridade/funcionalidade. Esses métodos podem ser usados para obtenção de uma visão mecanicista sobre os efeitos dos tratamentos de inactivação contra o vírus e potencialmente podem complementar mais tradicionais métodos de avaliação de inactivação como RT-qPCR ou placa de ensaio. Por exemplo, a avaliação de inativação química ou física por ensaio de placa sozinho fornece uma medida do grau de inativação de vírus, mas não o mecanismo subjacente de que inactivação. Também, agregação de vírus pode resultar na subestimação do título e, portanto, superestimar a eficácia de tratamento30. Esses métodos ainda mais podem informar tal estudo, fornecendo informação sobre os efeitos de um tratamento sobre a integridade do capsídeo norovírus. Recentemente, dois em vitro (cultura celular) métodos de cultivo para o norovírus humano têm sido relatados5,6; Estas ainda dependiam do PCR para enumeração de vírus, embora teoricamente o modelo enteroid apresentado poderia ser utilizado para TCID50 usando anticorpo que mancha para determinação de redução relativa. Os métodos apresentados aqui poderiam ter utilidade para entender o mecanismo completo de inativação viral para vários tipos diferentes de tratamentos além apenas de tratamento térmico. Por exemplo, ligação ligante baseado na placa e TEM foram usados como ferramentas para complementar os dados de ensaio de RT-qPCR e placa na determinação do mecanismo de inactivação de norovírus em31,superfícies cobre32, após exposição à prata dihydrogen citrato de33e de tratamento de alta pressão hidrostática14.
Há inúmeras etapas para esses protocolos em que a atenção ao detalhe metodológico é crucial. Especificamente, para o ensaio de placa, grande atenção deve ser pago para o buffer usado para diluir o ligante para vinculação. Aptamer M6-2 e aptamers ssDNA em geral, são sensíveis ao sal concentrações e condições de reserva. Usando um buffer não ideal com o aptamer pode ablate vinculação. Embora aptamer em que M6-2 tem sido utilizado com sucesso diluído fezes humana, demasiada interferência do tamborete/matriz pode interferir com a ligação, que é consistente com as observações de outros norovirus humano aptamers18,22. Um factor principal causando isso é o que aptamers pode apresentar um grau de ligação não específica a moléculas carregadas positivamente. Assim, isso poderia levar a algum grau de sinal positivo falso no ensaio descrito aqui. Isto pode ser contabilizado, selecionando um controle negativo que é uma matriz complexa sem vírus ou uma proteína não relacionada. Da mesma forma, a concentração de HBGA e a quantidade de sólidos de leite desnatado utilizado no buffer de vinculação podem afetar significativamente positiva e sinais de fundo. Observe que o HBGAs diferentes têm vários graus de afinidade com diferentes cepas de norovírus humano, assim os buffers de vinculação podem precisar de ser otimizada dependendo do tipo HBGA a14,31,33. Semelhante consideração deve ser dada para o buffer usado para o conjugado de peroxidase de rábano-estreptavidina, como concentrações de diferentes fabricantes podem diferir; no entanto, muito menos variabilidade seria esperada dada a alta afinidade da estreptavidina-biotina interação34. Por causa do alto grau de adaptabilidade desse método baseado em placa, resolução de problemas resultados suboptimal é relativamente simples. Por exemplo, no caso do sinal de fundo elevado, otimização, aumentando que a concentração de leite desnatado e menor concentração de ligante podem ser investigados, e vice-versa para placas com baixas sinais positivos. Para TEM, uma das considerações mais importantes é o uso de materiais não-estático (como o vidro) quando armazenar/manipulação de grades, como as redes são extremamente difíceis de tratar em torno de materiais, tais como placas de Petri descartáveis. Se tais materiais são utilizados, grades tendem a "pular" e ficar com o material. Além disso, muito cuidado para garantir que não há nenhuma umidade residual nas grades. Idealmente, deve ser usado num exsicador de vácuo, se disponível.
Ao realizar experimentos usando DLS, a pureza da amostra é uma consideração muito importante. As funções usadas para correlacionar as alterações na intensidade de espalhamento de luz de diâmetro contam com monomodal ou estreitas distribuições de partícula multimodal. Impurezas, até a escala nanométrica, incluindo proteínas, introduzir polidispersividade e alteram os cálculos de tamanho. Também, a intensidade de luz dispersa é proporcional ao diâmetro elevado a uma potência de 6, para que grandes partículas, como poeira substancialmente interfiram com as medições. Formação de bolhas durante tratamentos de calor em tempo real resulta em resultados sem sentido devido a luz espalhada pelas bolhas flutuantes. Concentração do capsídeo (VIP) também deve ser considerada ao usar DLS. Concentrações de amostra devem ser alto o suficiente para produzir suficiente sinal e baixa o suficiente para evitar a dispersão de vários. É também de importância vital para o correto material de entrada e propriedades dispersantes, como esses valores são usadas pelo software para cálculos de tamanho. Em particular, dispersante viscosidade é uma função da temperatura e deve ser ajustada em conformidade durante tratamentos térmicos (o software utilizado tem viscosidade dependente da temperatura de água construído em).
Embora os métodos descritos aqui oferecem múltiplas oportunidades para melhores maneiras avaliar a integridade do capsídeo, eles não são perfeitos. Porque esses métodos exigem muito altas concentrações de vírus, eles devem ser usados com capsids purificados, montados em vez de vírus infecciosos nativos. Os VIPs usados aqui consistem na proteína de capsídeo maior de norovírus humano (VP1), que reúne em norovírus capsídeo sem o ácido nucleico viral. Embora estes VIPs exibem comportamento antigenicamente similar para capsids do vírus infeccioso, podem ser mais suscetíveis à inactivação. Além disso, os VIPs são difíceis de produzir e purificar e não estão prontamente disponíveis para muitos investigadores. Uso de norovírus humano purificada (por exemplo, usando a ultracentrifugação) é possível mas disponibilidade de espécimes fecais humanos norovirus-positivo é limitado e até mesmo com purificação, concentração de vírus pode não ser alta o suficiente para acomodar os métodos descritos aqui. Trabalho futuro na otimização de ensaios para o uso de semi purificada vírus infecciosos nas fezes está em andamento. Na verdade, isto já foi demonstrado para a placa de ensaio18,22, mas, sem dúvida, seria mais complicado para DLS. Também deve ser notado que estes métodos só foram aplicados para avaliar a integridade do capsídeo após a aplicação de um exame físico (calor) abordagem de inactivação, que é conhecida por afetar diretamente o capsídeo. Resultados podem ser mais ambíguos destas técnicas utilizadas para avaliar a integridade do capsídeo usando outras abordagens de inactivação, como agentes químicos ou métodos que se destinam principalmente a destruição do genoma viral. No entanto, alguns relatos demonstraram favoravelmente o desempenho da ligação HBGA para avaliar inativação química31,33,35,36,37. No momento atual, os protocolos aqui apresentados são mais utilizados em conjunto com a técnica tradicional (s) como RT-qPCR e plaque ensaios com vírus de substituto.
Esses protocolos fornecem que uma alternativa simples, através da qual a entender os efeitos de um método de inativação do vírus físicos (calor) sobre norovírus humano. Esses métodos provavelmente poderiam ser expandidos para uso com outros vírus não-envelopado (por exemplo, hepatite A e E vírus), como o princípio geral de detecção de perda de mais alta ordem da estrutura das proteínas é o mesmo. Além disso, o comportamento e potencial uso de outros ligantes para indicar a perda da integridade do capsídeo deve ser avaliado. Adaptar os protocolos para matrizes de amostra mais complexas e melhorar sua sensibilidade analítica (limites de detecção) é também um rumo lógico. Em geral, os métodos descritos aqui fornecem um meio mais acessível de determinar a integridade do capsídeo norovírus humano e ganhando uma visão mecanicista sobre os efeitos dos tratamentos de inactivação contra este importante patógeno.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela agricultura e comida pesquisa iniciativa competitiva Grant no. 2011-68003-30395 do departamento de agricultura dos Estados Unidos, Instituto Nacional de alimentação e agricultura, através do projeto NoroCORE. Financiamento para carga de acesso aberto foi fornecido pelo departamento de agricultura dos Estados Unidos. Gostaríamos de agradecer a Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) gentilmente fornecendo-no capsids purificados e Valerie Lapham pela sua assistência com as imagens de temperatura. Também gostaríamos de agradecer Frank N. Barry por nos ajudar a começar as experiências apresentadas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
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