Summary
Rutinemæssig påvisningsmetoder udnytte viral genomet forstærkning er begrænset af deres manglende evne til at diskriminere smitsomme fra ikke-smitsomme partikler. Formålet med denne artikel er at give detaljerede protokoller for alternative metoder til at støtte i forskelsbehandling af smitsomme norovirus partikler ved hjælp af aptamer bindende, dynamisk lysspredning og transmissions elektronmikroskopi.
Abstract
Menneskelige norovirus exacts betydelige offentlige sundhedsmæssige og økonomiske tab på verdensplan. Dukker op i vitro endnu dyrkning fremskridt ikke er gældende for rutinemæssig påvisning af virus. Nuværende påvisning og kvantificering teknikker, der bygger primært på nukleinsyre amplifikation, diskriminerer ikke smitsomme fra ikke-infektiøse viruspartikler. Formålet med denne artikel er at fremlægge specifikke detaljer om de seneste fremskridt i teknikker, der anvendes sammen med henblik på at erhverve yderligere oplysninger om infektivitetsniveauet status af virale partikler. En teknik indebærer vurdering af bindingen af en norovirus ssDNA aptamer til capsids. Aptamers har fordelen at være let syntetiseret og ændret, og er billig og stabil. En anden teknik, dynamisk lys spredning (DLS), har fordelen, at observere kapsid adfærd i løsning. Elektronmikroskopi giver mulighed for visualisering af den strukturelle integritet af de virale capsids. Selv om lovende, er der nogle ulemper til hver teknik, som ikke-specifikke aptamer binding til positivt ladede molekyler fra prøven matricer, kravet om renset kapsid for DLS og ringe følsomhed for Elektron Mikroskopi. Ikke desto mindre, når disse teknikker anvendes i kombination, kroppen af data produceret giver mere omfattende information om norovirus kapsid integritet, der kan bruges til at udlede smitteevne, oplysninger, som er afgørende for korrekt evaluering af inaktivering metoder eller fortolkning af virus opdagelse. Denne artikel giver protokoller for at bruge disse metoder til at diskriminere smitsomme menneskelige norovirus partikler.
Introduction
Menneskelige norovirus er ansvarlig for en betydelig offentlig sundhedsbyrde globalt, forårsager omkring 685 millioner sygdomme og 212,000 dødsfald årligt1, til en pris i milliarder af dollars2,3. I dag, indebærer norovirus påvisning og kvantificering genom forstærkning og/eller ligand-baserede platforme. Førstnævnte er generelt foretrækkes, da det er mere følsom, giver kvantitative oplysninger og har generelt lavere risiko for falske positive resultater4. Den mest almindelige norovirus påvisning og kvantificering genom forstærkning teknik er reverse transkriptase kvantitative polymerase kædereaktion (RT-qPCR). Fordi det mål og forstærker et lille segment af menneskelige norovirus genom, RT-qPCR alene er ikke i stand til at diskriminere mellem smitsomme og ikke-smitsomme partikler, som gratis genomisk RNA, beskadiget capsids indeholdende genomer og capsids med fatalt muteret/afkortes genomer kan stadig blive forstærket af RT-qPCR. Mens to nye in vitro- dyrkningsmetoder for menneskelige norovirus5,6 er blevet rapporteret for nylig, begge stadig stole på RT-qPCR for virus kvantificering og er endnu ikke muligt metoder til rutinemæssig klinisk/miljømæssige testning for menneskelige norovira. Således, RT-qPCR fortsat guldstandarden for klinisk/miljømæssige test.
Andre in vitro- metoder er blevet udviklet i et forsøg på bedre anslå smitteevne status for norovirus partikler. Disse metoder kan generelt inddeles som dem, der vedrører integriteten af norovirus kapsid og evaluere genom integritet. Den tidligere tilgang er mere populære. En almindeligt anvendt metode er RNase forbehandling før udvinding af viral genomisk RNA, men det ikke tager højde for virale partikler, der forbliver intakt, men mangler evnen til at binde vært receptorer/co-faktorer, samt viruspartikler, som fatalt har muteret eller har afkortet eller marginalt beskadiget genomer7. Kapsid integritet kan også blive evalueret baseret på virus evne til at binde til menneskelige norovirus co-receptor/co-faktorer, som er kulhydrater kendt som Histò-blod gruppe antigener (HBGAs). HBGAs er til stede i vært intestinale epitel celler som en del af glykoproteiner eller glycolipider (blandt flere andre væv) og kan udskilles i kropsvæsker som spyt. Enteriske bakterier indeholdende HBGA-lignende stoffer på deres overflader har også vist sig at binde menneskelige norovirus8,9,10, og sådanne interaktioner kan fremme norovirus infektion5. Det grundlæggende koncept af at udnytte HBGA bindende er, at kun virale partikler kan bindende den formodede receptor/co-factor ville være i stand til at inficere celler. Flere undersøgelser tyder på, at perle-baserede HBGA bindende forud nukleinsyre amplifikation er en lovende metode for infektivitet forskelsbehandling11,12,13,14, 15,16. En stor udfordring med hensyn til HBGAs er, at ingen enkelt HBGA type kan binde alle menneskelige norovirus genotyper. For at løse dette, har svin gastrisk mucin, som indeholder HBGAs, været anvendt i stedet for renset HBGA kulhydrater i lethed syntese, konsistens og reducerede omkostninger.
En nylig publikation af Moore et al. 17 indført en række nye teknikker til estimering af menneskelige norovirus kapsid integritet. I stedet for HBGAs, Moore et al. 17 undersøgt binding af et bredt reaktive nukleinsyre aptamer (M6-2)18 og bredt reaktive monoklonalt antistof (NS14)19 til varmebehandlede GII.4 Sydney norovirus capsids (virus-lignende partikler eller VLPs) og sammenlignede dette til binding til syntetisk HBGAs. Nukleinsyre aptamers er korte (~ 20-80 nt) enkelt strandede nukleinsyrer (ssDNA eller RNA), fold i unikke tredimensionale strukturer som følge af deres sekvens og binde et mål. Fordi de er nukleinsyrer, er de billigere; let kemisk syntetiseret, renset og modificeret; og stabilt for varme. Flere rapporter om aptamers genereres mod norovira findes, med nogle af dem viser bred reaktivitet til en lang række stammer18,20,21,22. For eksempel, Moore et al. 17 demonstreret at aptamer M6-2 bundet til renset, samlet menneskelige norovirus capsids (VLPs) og opførte sig på samme måde til HBGA i afhængigheden af viral kapsid at opretholde højere orden (fx, sekundær og tertiær) protein struktur for bindende for at forekomme. På den anden side en betydelig del af norovirus VLP binding til antistof NS14 forblevet efter capsids var fuldstændig denatureret. Evaluering af norovirus bindende i undersøgelse af Moore et al. 17 blev gjort ved hjælp af en simpel, plade-baseret metode svarende til ELISA, med den undtagelse, at aptamers anvendes i stedet for antistoffer (derfor metoden blev kaldt ELASA). Denne høje overførselshastighed eksperimentelle metode blev brugt til at vurdere virkningerne af forskellige behandlinger på norovirus kapsid, arbejde, som er værdifulde for forståelsen af mekanismen for viral inaktivering ved udsættelse for fysiske eller kemiske stressfaktorer. Dog er en ulempe at denne metode den lavere følsomhed og manglende tolerance for matrix-associerede forureninger på højere niveauer, der forårsager non-specifik binding ved aptamers.
Moore et al. 17 bruges en anden metode, dynamiske lys spredning (DLS), til at overvåge sammenlægning af virale partikler i svar til varmebehandling. DLS er almindeligt anvendt til at vurdere størrelsen af nanopartikel suspensioner og er blevet udvidet til proteiner23,24 og vira25,26,27. Intensiteten af det lys spredt af partikler i løsning svinger som en funktion af partikelstørrelsen, den giver mulighed for beregning af diffusion koefficient og derefter partikel diameter ved hjælp af veletablerede formler. DLS teknik kan skelne de hydrodynamiske diameter af spredte partikler ned til nanoskala, der tillader detektering af spredte vira, individuelle kapsid proteiner eller dimere og virus aggregater baseret på størrelse27. Virus sammenlægning, repræsenteret ved en stigning i partikelstørrelse, er betegnende for tab af kapsid integritet. Som kapsid er denatureret og dens struktur forstyrres, hydrofobe restkoncentrationer blive udsat og forårsage partikler til at holde sammen og danne aggregater. DLS kan bruges til at måle partikelstørrelse efter en bestemt behandling eller kinetik af sammenlægning i realtid17,28. Denne metode har fordelen, at observation af kapsid adfærd i løsning men kræver høje koncentrationer af renset kapsid, som måske ikke er helt repræsentativt af virussen i sin naturlige tilstand.
Den endelige metode anvendes af Moore et al. 17 var transmissions elektronmikroskopi (TEM). Selv om denne metode mangler følsomhed og producerer ikke kvantitative data, det giver mulighed for visualisering af virkningerne af forskellige behandlinger på viral kapsid struktur. Selv om ikke endnu ideel til klinisk/miljømæssige indstillinger, er brugen af disse metoder i kombination værdifulde i at forstå menneskets norovirus inaktivering. Formålet med denne artikel er at give dybdegående protokoller for plade-baserede bindende assay (ELASA), DLS, og TEM præparationsmetoder bruges til at undersøge virkningerne af varme behandlinger på norovirus kapsid i forbindelse med behandlinger effekter på kapsid integritet som præsenteres i Moore et al. 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plade-baserede bindende Assay for evaluering af tab af højere orden Norovirus kapsid struktur
NOTE: en meget lignende ELASA protokol til den ene præsenteres her har været offentliggjort 29, og lignende ELASA assays er tidligere blevet rapporteret som en del af forskning artikler andre steder 17 , 18 , 22.
- Varmebehandling af menneskelige norovirus GII.4 Sydney capsids
- få renset menneskelige norovirus store kapsid proteiner (VP1) af GII.4 Sydney (tiltrædelse: JX459908) samlet i capsids.
NOTE: Capsids i undersøgelsen blev indhentet af R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX). - Dilute capsids til 50 µg/mL i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,2) til en maksimal mængde af 15 µL i individuelle udjævnede PCR rør. Sikre, at tuben indeholder mindst 600 ng af kapsid. Sikre, at der er 600 ng af kapsid pr. behandling-ligand kombination.
- Forvarm termisk cycler ønskede varmebehandling.
Bemærk: ved anvendelse af denne protokol, behandling på 68 ° C for forskellige tidspunkter (0 - 25 min) var valgt. - Forvarm en yderligere termisk cycler 4 ° c for øjeblikkelig afkøling. Føje rør med kapsid løsning til den termiske cycler til den ønskede tid. Straks overføre til pre Vandkølet 4 ° C cycler for 5 min efter opvarmning.
- Medtag 95 ° C i 5 min behandling som denatureret kapsid kontrol. Omfatte ubehandlet (23 ° C) kapsid løsning som positiv kontrol. Indeholder PBS med ingen kapsid som en yderligere negativ kontrol.
- Kort spin ned i en centrifuge at få alle droplets til bunden af glasset og fortynde behandlede kapsid løsninger i PBS til 3 µg/mL. Sikre, at der er mindst 200 µL fortyndet, behandlede kapsid (100 µL/brønd).
- få renset menneskelige norovirus store kapsid proteiner (VP1) af GII.4 Sydney (tiltrædelse: JX459908) samlet i capsids.
- Anvender 100 µL af kapsid løsning til hver brønd, at sikre, at der er mindst to brønde pr. behandling. Derudover omfatte 2 kontrolhullerne med 100 µL PBS for hver ligand; Dette giver baggrundsabsorbansen af analysen. Dække pladen med et låg, seal kanter med paraffin film for at reducere fordampning, og efterlade natten over på en rystende inkubator ved 4 ° C eller i 2 timer ved stuetemperatur.
- Forbereder den blokerende buffer ved 5% skummetmælk tørstof (w/v) i PBS med 0,05% Tween 20 (PBST).
- Fjerne de behandlede kapsid løsninger fra pladen. Tilføje 200 µL/brønd blokerende buffer. Der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over, forsegles ved 4 ° C.
- Forbered liganden bindende løsninger for biotinylated aptamer M6-2 18 , 29 og biotinylated syntetisk HBGA blod type A eller biotinylated type H.
- Dilute biotinylated aptamer til 1 µM i nukleasen-gratis vand. Sikre, at der er nok løsningen til 200 µL total for hver behandling. Fortynd den valgte biotinylated HBGA til 30 µg/mL i den blokerende buffer. Sikre, at der er nok løsningen til 200 µL samlede volumen for hver behandling.
Bemærk: Hvis du vil bruge mindre HBGA, 10 µg/mL af HBGA på 0,25% skummetmælk-PBST kan erstattes. Koncentrationer for både biotinylated M6-2 og HBGA har været tidligere optimeret og rapporteret.
- Dilute biotinylated aptamer til 1 µM i nukleasen-gratis vand. Sikre, at der er nok løsningen til 200 µL total for hver behandling. Fortynd den valgte biotinylated HBGA til 30 µg/mL i den blokerende buffer. Sikre, at der er nok løsningen til 200 µL samlede volumen for hver behandling.
- Fjerner blokerende buffer og vaske pladerne 3 gange med 200 µL/brønd PBST. Pat plade hovedet på sterile papirhåndklæder til at tørre den resterende fugt.
- Tilsættes 100 µL/brønd af liganden bindende løsninger, at sikre, at der er 2 boringer pr. varmebehandling-ligand kombination. Inkuber plade dækkes med låg på en orbitalryster på omkring 60 rpm i 1 time ved stuetemperatur.
Bemærk: Sørg for at medtage 2 brønde af ubehandlede capsids og fuldstændig denatureret capsids for hver ligand som positive og negative kontroller, henholdsvis. Derudover omfatter 2 " ingen kapsid " brønde for hver ligand som pladen baggrund kontrol. - Fjerne ligand løsninger og brøndene vaskes 3 gange med 200 µL/brønd PBST. Klappe pladen op og ned på sterile papirhåndklæder til at tørre resterende fugt.
- Tilsættes 100 µL/brønd af oploesning af 0,2 µg/mL streptavidin-peberrodsperoxidase i PBS. Inkuber i 15 min. ved stuetemperatur med blid ryster på en orbitalryster.
Bemærk: Forskellige streptavidin-peberrod peroxidase konjugater vil have forskellige koncentrationer. Kontakt brugeren ' s manual for den ideelle række koncentrationer for ELISA anvendelser af enzymet og være sikker på det er optimal. - Fjerne den konjugerede løsning. Vask 3 gange med 200 µL/brønd PBST. Klappe pladen op og ned på sterile papirhåndklæder til at tørre resterende fugt.
- Tilsættes 100 µL/brønd 3,3 ', 5,5 '-tetramethylbenzidine (TMB) substrat, og tillader farven til at udvikle for 5-15 min. observere negative kontrolhullerne for nogen farve og være sikker på at hele tiden udvikle til samme tid mellem Repliker plader. Være opmærksom på absorbans række pladelæseren bruges, samt.
Bemærk: De tredje gange kan variere baseret på kvaliteten af ligander/reagenser. - Stoppe udviklingen af reaktionen med 100 µL/brønd 1M fosforsyre. Straks læse plade ved 450 nm. Gemme data.
Bemærk: Indførelse af syren generelt bremser reaktionen drastisk men stoppe ikke det helt. Efterlad ikke stoppet pladen for et udvidet tidsrum før du læser absorbansen.
2. Analyse af plade-baseret analyse resultater
- gemme raw absorbans data i et regnearksprogram. Producere de gennemsnitlige absorptioner for hvert godt par med specifik behandling og ligand. Brug disse gennemsnit for alle efterfølgende analyser.
Bemærk: Sammenligne begge godt absorptioner for at være sikker på at ingen par af brønde har væsentligt forskellige værdier. - Til at analysere den absolutte kapsid integritet (alle bindende), Subtraher rå absorbansen af den " ingen kapsid " kontrol fra alle andre absorbans eksempelværdi.
Bemærk: Alternativt, tab af bindende på grund af tab af højere orden (sekundær, tertiær, kvaternære) struktur kan direkte analyseres. I stedet for at fratrække absorbansen af kontrolelementet negativ (ingen kapsid), trække værdien af kontrolelementet fuldstændig denatureret kapsid. Dette fjerner alle bindende signal på grund af uspecifik binding til apparatet samt bindende på grund af kapsid sekvens. HBGA og aptamer M6-2 viser lidt bindende fuldstændig denatureret kapsid, så begge metoder giver tilsvarende resultater. Falsk positivt signal tilskrives uspecifikke aptamer bindende skal tages i betragtning når du vælger hvilken analyse bruge. - Med de negative eller denatureret kontrol-justeret absorptioner, dividere behandling absorptioner af deres respektive positiv (uden behandling) styre absorptioner og formere sig med 100. Dette giver procentdelen af signal af behandlede kapsid i forhold til den ubehandlet kontrol.
- Til at vurdere graden af bindende signal for hver ligand kan henføres til kapsid sekvens, trække de " ingen kapsid " negativ kontrol fra de oprindelige absorptioner, og tage den justerede absorbans af denatureret kapsid. Divider dette med den justerede absorbansen af positive kontrol signalet, og ganger det med 100. Dette giver den tilsyneladende procentdel af signalet på grund af ligand binding til denatureret kapsid/kapsid sekvens.
3. DLS til påvisning af Virus sammenlægning efter varmebehandling
NOTE: Nedenstående trin kan være specifikke for softwaren og instrument bruges, men kan tilpasses og anvendes til lignende enheder.
- Opret en ny størrelse SOP i DLS instrument software bruger: materiale = Protein, Dispersant = PBS, temperatur = 25 ° C, ekvilibreringstid = 0 sec, celletype = engangs kuvette (lille volumen, ZEN0040), måling vinkel = 173° tilbagekastning, Måling varighed = automatisk, antal målinger = 3, forsinkelse mellem målinger = 0 sec, databehandling: analyse model = generelle formål (normal opløsning). Bruge standardindstillingerne for alle andre parametre.
- Vælg den grønne køre pil i softwaren, og navnet prøven.
- Følg trin 1.1.1 gennem 1.1.4 til varmebehandling af VLPs.
- Dilute varmen behandlet VLPs 1:10 i 1 x PBS til en endelig koncentration på 5 µg/mL. (Valgfrit) Filtrer prøve med en 1 µm porestørrelse fjerne støvpartikler; DLS er meget følsomme over for støv, som store partikler scatter meget mere lys end små partikler.
- Overføre 50 µL fortyndede VLPs ind i en lille mængde engangs kuvette. Indsæt kuvette ind i prøve salen instrumentets.
- Start Kør, og brug den ' Correlogram ', ' Cumulants Fit ', og ' ekspert rådgivning ' faner til at evaluere datakvaliteten.
- i tiden, kontrollere, at værdien polydispersity indeks er mindre end 0,3, der repræsenterer en kvalitet måling. I den ‘ multi-view ’ fanen, Sørg for korrelationskoefficienten er konstant og tæt på, men ikke mere end 1, på kort tid, og falder ned kraftigt til 0 på et senere tidspunkt, karakteristisk for partikelstørrelse. Brug den ‘ ekspert rådgivning ’ fanen feedback på datakvalitet under målingerne.
- Efter målingen er færdig, tjek igen at værdien polydispersity indeks er mindre end 0,3. Sikre, at cumulants linje følger datapunkter nøje i den ‘ Cumulants fit ’ tab.
- Tage gennemsnittet af Z-gennemsnit partikel diameter rapporterede for hver måling som partikelstørrelsen af hver prøve. Plot diameter i nm vs temperatur i ° C.
4. DLS til påvisning af Virus sammenlægning i realtid
Bemærk: nedenstående trin kan være specifikke for softwaren og instrument bruges, men kan tilpasses og anvendes til lignende enheder.
- Opret en ny størrelse SOP i DLS instrument software bruger: materiale = Protein, Dispersant = PBS, temperatur = som ønskede, ekvilibreringstid = 0 sec, celletype = kvarts kuvette, måling vinkel = 173° tilbagekastning, måling varighed = automatisk, Antallet af målinger = 50 (kan være øget eller nedsat afhængig sammenlægning sats), forsinkelse mellem målinger = 0 sec, databehandling: analyse model = flere smalle modes (høj opløsning). Bruge standardindstillingerne for alle andre parametre.
- Vælg Kør pilen inden for software til at åbne og navngive en ny prøve, og lad instrumentet til at nå temperaturligevægt.
- Suspendere VLPs i 1 X PBS i et microcentrifuge rør i en koncentration på mellem 5 µg/mL og en volumen mellem 200-500 µL. Vortex suspensionen.
- Spin ned VLP suspension for 5-10 s i en bordplade centrifuge til nedtrapning gas. Dette medvirker til at forhindre boble dannelse under varmebehandling, der forstyrrer størrelse målinger.
- Overførsel af VLP suspension til en lille mængde kvarts kuvette-undgå bobler og tilsæt langsomt mod væggen i kuvette. Når apparatet har nået temperaturligevægt, indsætte kuvette ind i prøve salen.
- Vente 10 s for temperaturen i prøven til Reagensglasset, start derefter Kør. Start en timer i begyndelsen af run. Stop tidtager i slutningen af den første måling. Tage denne gang som den første tid. Få efterfølgende tid point fra måling gange registreret af softwaren.
- Start Kør, og overvåge correlogram, distribution passer og ekspertrådgivning til at evaluere datakvaliteten.
Bemærk: PDI vil ikke nødvendigvis være mindre end 0,3 disse målinger som stikprøven forventes at blive polydisperse under sammenlægning.- Kontroller korrelationskoefficienten er konstant og tæt på, men ikke mere end 1 på kort tid, og falder ud skarpt på et eller flere senere tider, der er karakteristisk for partikelstørrelse.
- Sikre distributionen linje følger datapunkter nøje.
- Analysere størrelse data.
- Afgøre hver gang punkt fra forskellen i tid mellem hver måling og det oprindelige tidspunkt. Måling varigheder er ikke alle nøjagtig det samme.
- Ved hjælp af en intensitet distribution, registrere størrelsen af toppe med de største områder for hver måling/tidspunkt.
- Plot peak diametre i nm kontra tid i min.
5. TEM prøveforberedelse
- få carbon support film (nikkel) gitre designet til TEM.
Bemærk: Rådføre sig med core facilitet på anbefalede reagenser og deres håndtering til brug med facilitet mikroskop. Sørg for at gemme gitre i en kasse der indeholder tørremiddel eller en vakuumkammer at minimere eksponering for fugt. - Rive ca 5 cm x 5 cm stykker filtrerpapir. Få glas petriskåle og ordentlig selvlukkende reverse pincet beregnet til brug i mikroskopi.
- Skære ca 2,5 cm x 5 cm stykke af paraffin film. Sted på benchtop.
- Varmebehandling af norovirus GII.4 Sydney capsids
- følge proceduren varmebehandling præcis som beskrevet ovenfor i trin 1.1.1 - 1.1.5 undtagen: bruge 10 mM HEPES (pH 7,4) for behandling i stedet for PBS og ikke yderligere fortyndet capsids efter behandling (holde løsning på 50 µg/mL). Afpipetteres behandlede kapsid løsning på paraffin film hele ~ 15 µL dråbe.
- Grab gitter kant med pincet, at lade dem tæt på kanten at afholde gitter, og placere gitter carbon-side-down på dråbe af behandlede løsning. Lad inkuberes i 10 min at tillade kapsid vedhæftes til gitteret.
- Alt efter renhed af kapsid forberedelse, tilføje vasker af 10 mM HEPES løsning hvis det er nødvendigt i form af 10-15 µL dråber anbragt i linje efter behandlede kapsid droplet.
- Efter 10 min, afhente gitter med slipværktøjet. Placer gitteret næsten vinkelret på et stykke filtrerpapir til vægen væk slipværktøjet. Afhente dråbe af 10-15 µL HEPES buffer med gitter, hold for 30 s, så vægen væk med et stykke filtrerpapir til Wash
- Placere en 15 µL dråbe af 2% uranyl acetate løsning på paraffin filmen i et tomt område.
- Afhente dråbe af uranyl acetat med grid og hold 45 s. vægen væk uranyl acetat, Sørg for at fjerne det meste af løsningen. Læg gitter carbon-side op på et stykke filtrerpapir, være omhyggelig med at gitteret ikke " stick " for fugt på pincet. Placer filtrerpapir med gitter på det i et åbent glas petriskål.
Bemærk: Brug ikke plast petriskåle, da nettene bliver elektrostatisk tiltrukket af dem og bliver hængende til parabol.
- Afhente dråbe af uranyl acetat med grid og hold 45 s. vægen væk uranyl acetat, Sørg for at fjerne det meste af løsningen. Læg gitter carbon-side op på et stykke filtrerpapir, være omhyggelig med at gitteret ikke " stick " for fugt på pincet. Placer filtrerpapir med gitter på det i et åbent glas petriskål.
- Gentag for alle behandlinger. Placer petriskål halvdele med gitrene i en ekssikkator natten tørre før observere med TEM.
- Consult mikroskopi facilitet på den respektive institution med hensyn til observere de forberedte gitre. Nogle faciliteter tillader brugeren at blive uddannet om driften af deres anlæg ' s instrument. Specifikke detaljer om opsætningen og observation af en specifik mikroskop er beyond for denne artikels rammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den strukturelle integritet af menneskelige norovirus GII.4 Sydney capsids (VLPs) blev vurderet ved hjælp af flere nye metoder, som præsenteres af Moore et al. 17. for det første et eksperiment blev udført som integriteten af capsids som funktion af deres evne til at binde en formodede receptor/co-factor (HBGA) eller ssDNA aptamer (M6-2) blev sammenlignet (figur 1). De resultater, der vises er tidligere indgivet af Moore et al. 17, og påvise, at aptamer M6-2-kapsid bindende adfærd var svarer til virus-HBGA bindende for eksponering til 68 ° C varme behandling for forskellige eksponeringstider. Mens HBGA bindende signal var tabt lidt tidligere end at M6-2 af aptamer M6-2, vises en tilsvarende sats af signaltab beregnet efter VLPs blev udsat til 65 ° C og 68 ° C for forskellige gang punkter (tabel 1)17. Dette tyder på, at både HBGA og aptamer M6-2 bindende blev afskaffet i en lignende måde.
DLS målinger viste at aggregering på grund af protein denaturering sandsynligvis svarede med tab af ligand bindende signal (figur 2), som en hydrodynamiske diameter større end 100 nm blev observeret efter ca 18 min behandling på 68 ° C. Disse var betingelserne på hvilke fuldstændig tab af HBGA bindende og næsten alle tab af bindende signal for aptamer M6-2 (> 80%) opstod (figur 1)17. TEM resultater støttede disse observationer som morfologiske ændringer og sammenklumpning af capsids blev stadig mere klart, da temperaturen var steget gradvist mellem 60 ° og 80 ° C i 1 minut (figur 3a). Et lignende fænomen blev observeret efter opvarmning capsids på 68 ° C i op til 25 min, men opløsningen af TEM var mindre udtalt (figur 3b)17.
Figur 1: strukturafhængigt binding af to forskellige ligander til norovirus GII.4 Sydney capsids underkastes varmebehandling. Renset GII.4 Sydney capsids (VLPs) blev underkastet varmebehandling på 68 ° C for forskellige mængder af tid, og bindingen til blodtype A HBGA og aptamer M6-2 blev evalueret ved hjælp af en plade-baserede ELASA bindende assay. Y-aksen viser absorbans signalet observeret for en behandling (eksponeringstid) som procentdel af et ubehandlet kapsid kontrol. Dette tal har været tidligere præsenteret og dette tal er blevet ændret fra Moore et al. 17 fejllinjer udgør ± 1 standardafvigelse af % signal. Data er på mindst tre Repliker plader. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempel DLS data for varmebehandlet norovirus GII.4 Sydney capsids viser ideel og tvetydige/lav kvalitetsresultater. Capsids (VLPs) blev underkastet varmebehandling ved 65 ° og 68 ° C, og deres størrelse blev overvåget i realtid. Panel (en) svarer til en høj kvalitet, klart korrelationskoefficienten måling; og (b) til en lav kvalitet, tvetydige korrelationskoefficienten måling. Panelet (c) viser partikel størrelse data, viser en klar sammenlægning profil for capsids behandlet på 68 ° C; og (d) viser tvetydige partikel størrelse data for varmebehandlet capsids. Nogle af disse data præsenteres, og dermed dette billede er ændret fra Moore et al. 17 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: TEM af norovirus GII.4 Sydney capsids underkastes forskellige varmebehandlinger. Renset capsids (VLPs) blev udsat for forskellige varmebehandlinger og observeret ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi. Panel (en) viser data for capsids opvarmet ved forskellige temperaturer (60, 65, 70, 75 og 80 ° C) for 1 min. Panel (b) viser capsids udsat for 68 ° C behandling for 0 - 25 min. skala (bar) på højre billeder repræsenterer 100 nm. Disse billeder er præsenteret i Moore et al. 17 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Eksponentiel henfald sats (% signal/min) | |||
| Temperatur | 65 ° C | 68 ° C | |
| Ligand | |||
| HBGA Type A | 2,50 ± 0,24 | 13,30 ± 1,15 | |
| Aptamer M6-2 | 2.47 ± 0.66 | 13.18 ± 0,47 | |
Tabel 1: eksponentiel henfald satser for norovirus GII.4 Sydney capsids behandlet på 65 ° C og 68 ° C. Capsids blev udsat for varme behandlinger for forskellige tidspunkter på 65 ° C og 68 ° C, nedkølet ved 4 ° C, og deres evne til at binde syntetiske HBGA eller aptamer evalueret. Signal tab over tid (henfaldet) blev derefter beregnet med hver ligand for hver temperatur. Disse data er tidligere blevet præsenteret i Moore et al. 17 data præsenteres som % signal/min ± 1 standardafvigelse af % signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol og teknikker beskrevet her giver et middel til vurdering af menneskers norovirus kapsid integritet/funktionalitet. Disse metoder kan anvendes til at indhente mekanistiske indblik i virkningerne af inaktivering behandlinger mod virus og kan potentielt supplement til mere traditionelle inaktivering evalueringsmetoder som RT-qPCR eller plaque assay. For eksempel, giver evaluering af kemiske eller fysiske inaktivering af plaque assay alene et mål for graden af virus inaktivering, men ikke den underliggende mekanisme i denne inaktivering. Også, kan virus aggregering resultere i undervurdering af titer og derfor overvurderer behandling virkning30. Disse metoder kan yderligere oplyse sådan undersøgelse ved at levere oplysninger om effekten af en behandling på integriteten af norovirus kapsid. For nylig har to in vitro- (cellekultur) dyrkningsmetoder for menneskelige norovirus været rapporteret5,6; disse stadig påberåbt PCR virus opregning, selvom teoretisk enteroid model præsenteret kunne udnyttes til TCID50 ved hjælp af antistof farvning for relativ reduktion bestemmelse. De metoder, der præsenteres her kunne have nytte for at forstå komplet mekanismen for viral inaktivering af flere forskellige former for behandlinger ud over bare varmebehandling. For eksempel, blev plade-baserede ligand bindende og TEM brugt som redskaber for at supplere RT-qPCR og plaque assay data til at bestemme mekanismen af norovirus inaktivering på kobber overflader31,32, ved udsættelse for sølv dihydrogen citrat33, og høje hydrostatiske tryk behandling14.
Der er mange trin i disse protokoller, hvor opmærksom på metodiske detaljer er afgørende. Specifikt, for pladen assay, skal stor opmærksomhed betales til den buffer, der bruges til at fortynde ligand for bindende. Aptamer M6-2 og ssDNA aptamers i almindelighed, er følsomme over for salt koncentrationer og buffer betingelser. Ved hjælp af en ikke-optimal buffer med aptamer kan ablate bindende. Selvom aptamer M6-2 held har været anvendt i fortyndet menneskelig afføring, kan for meget afføring/matrix indblanding interferere med binding, der stemmer overens med observationer for andre menneskers norovirus aptamers18,22. Én vigtig faktor årsagen til dette er, at aptamers kan udviser en grad af uspecifik binding til positivt ladede molekyler. Således, dette kunne føre til en vis grad af falsk positivt signal i analysen beskrives her. Dette kan tages højde for ved at vælge en negativ kontrol, der er enten en kompleks matrix uden virus eller en ikke-forretningsmæssigt forbundne protein. Ligeledes HBGA koncentration og mængde for skummetmælk faste stoffer anvendes i binding buffer har væsentlig indflydelse på positive og baggrunden signaler. Bemærk, at forskellige HBGAs har forskellige grader af affinitet til forskellige stammer af menneskelige norovirus, så bindende buffere kan skal optimeres afhængigt af HBGA type14,31,33. Lignende overvejelser bør tillægges den buffer, der bruges til streptavidin-peberrod peroxidase konjugat, som koncentrationer fra forskellige producenter kan variere; imidlertid forventes langt mindre variabilitet givet høj affinitet af streptavidin-biotin interaktion34. På grund af den høje grad af tilpasningsevne af denne plade-baserede metode er fejlfinding suboptimale resultater relativt ligetil. For eksempel, i tilfælde af høje baggrund signal, optimering af stigende skummetmælk koncentration og faldende ligand koncentration kan blive undersøgt, og vice versa for plader med lav positive signaler. For TEM, en af de mest kritiske overvejelser er brugen af ikke-statisk materiale (som glas) når opbevaring/håndtering gitre, som gitrene er yderst vanskeligt at håndtere omkring materialer såsom engangs petriskåle. Hvis der anvendes sådanne materialer, gitre vil tendens til at "hoppe" og holde sig til materialet. Derudover bør meget omhu tages til at sikre, at der er ingen resterende fugt på Grid-net. En vakuum ekssikkator bør ideelt set anvendes, hvis tilgængelig.
Når du udfører eksperimenter ved hjælp af DLS, er renheden af prøven en meget vigtig overvejelse. De funktioner, der bruges til at korrelere ændringer i lysspredning intensitet til diameter er afhængige af at have monomodal eller smalle multimodale partikel distributioner. Urenheder ned til nanoskala, herunder proteiner, indføre polydispersity og ændre størrelse beregninger. Også, intensiteten af lys spredt er proportionalt med diameteren opløftet til en potens af 6, så store partikler såsom støv væsentligt forstyrre målinger. Boble dannelse under real-time varmebehandlinger resultater i meningsløse resultater på grund af lysspredningen af de fluktuerende bobler. Kapsid (VLP) koncentration skal også overvejes, når du bruger DLS. Prøven koncentrationer skal være høj nok til at producere tilstrækkeligt signal og lav nok til at undgå flere spredning. Det er også af vital betydning at indtaste den korrekte materiale og dispergens egenskaber, som disse værdier bruges af softwaren til størrelse beregninger. Især dispergens viskositet er en funktion af temperatur og skal justeres under varme behandlinger (den anvendte software er temperatur afhængige viskositet vand bygget).
Selv om metoderne, der beskrives her flere muligheder for bedre måder at vurdere kapsid integritet, de er ikke perfekte. Fordi disse metoder kræver meget høje koncentrationer af virus, skal de bruges med renset, samlet capsids i stedet for indfødte smitsomme virus. VLPs bruges her består af store kapsid proteiner af menneskelige norovirus (VP1), som samler til norovirus kapsid uden viral nukleinsyre. Selv om disse VLPs udviser antigent lignende adfærd at smitsomme virus capsids, kan de være mere modtagelige for inaktivering. Yderligere, VLPs er vanskelige at producere og rense og er ikke let tilgængelige for mange efterforskere. Brugen af renset menneskelige norovirus (f.eks.ved hjælp af ultracentrifugering) er muligt men tilgængeligheden af norovirus positive menneskelige fækal prøver er begrænset og endda med rensning, virus titers kan ikke være høj nok til at rumme metoderne beskrevet her. Fremtidige arbejde på at optimere assays til brug af semi-renset smitsomme virus i fæces er i øjeblikket undervejs. I virkeligheden, dette allerede er blevet demonstreret for plade assay18,22, men vil utvivlsomt være mere kompliceret for DLS. Det skal også bemærkes, at disse metoder kun blev anvendt til at vurdere kapsid integritet efter anvendelsen af en fysisk (varme) inaktivering tilgang, som er kendt for at direkte påvirke kapsid. Resultater kan være mere tvetydigt var disse teknikker, der anvendes til at evaluere kapsid integritet ved hjælp af andre inaktivering tilgange, såsom kemiske agenser eller metoder, der er for det meste rettet mod ødelæggelse af det virale genom. Nogle rapporter udviser dog positivt udførelsen af HBGA binding til evaluering af kemiske inaktivering31,33,35,36,37. På nuværende tidspunkt bruges de protokoller, der er rapporteret her bedst i koncert med traditionelle technique(s) som RT-qPCR og plakvadukt assays med surrogat vira.
Disse protokoller giver en enkel alternativ betyder at forstå virkningerne af en fysisk virus inaktivering metode (varme) på menneskelige norovirus. Disse metoder kunne sandsynligvis blive udvidet til brug med andre ikke-kappebærende virus (f.eks.hepatitis A og E-virus), som det overordnede princip om at opdage tab af højere orden protein struktur er den samme. Derudover bør adfærd og potentielle anvendelse af andre ligander til som angiver tab af kapsid integritet evalueres. Tilpasse protokoller til mere komplekse prøve matricer, og forbedre deres analytiske følsomhed (påvisningsgrænserne) er også en logisk fremtidige retning. Samlet set giver de metoder beskrevet her et mere tilgængeligt middel til bestemmelse af menneskelige norovirus kapsid integritet og vinder mekanistiske indblik i virkningerne af inaktivering behandlinger mod dette vigtige patogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af landbrug og fødevare forskning initiativ konkurrencedygtige tilskud nr. 2011-68003-30395 fra United States Department of Agriculture, nationale Institut for fødevarer og landbrug gennem NoroCORE-projektet. Finansiering for åben adgang gebyr blev leveret af United States Department of Agriculture. Vi vil gerne takke Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) venligst give os renset capsids og Valerie Lapham for hendes hjælp med TEM billeder. Vi vil også gerne takke Frank N. Barry for at hjælpe os start eksperimenterne præsenteret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
References
- Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920 (2015).
- Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
- Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
- Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770 (2015).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
- Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124 (2017).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586 (2014).
- Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
- Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
- Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
- Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
- Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
- Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
- Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
- Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
- Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087 (2013).
- Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
- Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805 (2014).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
- Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
- Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
- Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
- Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
- Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
- Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
- Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
- Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
- Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
- Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
- Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).
