Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van muizen hepatocyten van volwassen muis levers met behulp van een gemodificeerde Collagenase perfusie techniek. Ook beschreven is de lange termijn cultuur van hepatocyten in een 3D collageen sandwich setting evenals immunolabeling van de cytoskelet componenten om gal canaliculaire vorming en de respons op de behandeling te bestuderen.
Abstract
Hepatocyten zijn de centrale cellen van de lever die verantwoordelijk zijn voor de metabole functie. Als zodanig vormen ze een uniek gepolariseerd epitheel, waarbij twee of meer hepatocyten bijdragen aan apicale membranen om een gal canaliculaire netwerk te vormen waardoor gal wordt uitgescheiden. Hepatocyte polarisatie is essentieel voor de juiste canaliculaire vorming en is afhankelijk van interacties tussen de hepatocyte Cytoskeleton, celcelcontacten en de extracellulaire matrix. In vitro studies van hepatocyten cytoskelet betrokkenheid bij de vorming van canaliculi en de reactie op pathologische situaties worden gehandicapt door het gebrek aan celcultuur, die sterk zou lijken op de canaliculi netwerkstructuur in vivo. Hier beschreven is een protocol voor de isolatie van muizen hepatocyten van de volwassen muis lever met behulp van een gemodificeerde Collagenase perfusie techniek. Ook beschreven is de productie van cultuur in een 3D collageen sandwich instelling, die wordt gebruikt voor immunolabeling van cytoskelet componenten om gal canaliculaire vorming en de respons op behandelingen in vitro te bestuderen. Het is aangetoond dat hepatocyte 3D collageen sandwich culturen reageren op behandelingen met toxines (ethanol) of actine cytoskelet veranderen drugs (bv, blebbistatine) en dienen als een waardevol hulpmiddel voor in vitro studies van gal canaliculi vorming en functie.
Introduction
Hepatocyten, de centrale cellulaire structuren van de lever die verantwoordelijk zijn voor de metabole functies, zijn uniek gepolariseerde epitheelcellen. Hun polarisatie, die kort na de geboorte in zoogdieren voorkomt, resulteert in de vorming van het biliaire canaliculaire-netwerk en is essentieel voor een goede galsecretie. Apicale membranen van hepatocyten samen vormen gal canaliculi, overwegende dat de basale membranen blijven in contact met het endotheel van sinusoïden. Het verlies van hepatocyten polarisatie leidt tot herverdeling van gal transporteurs en resulteert in pathologische processen verbonden met Gal retentie in de lever (d.w.z. cholestase).
De oprichting en het onderhoud van hepatocyten polarisatie en de ontwikkeling van gal canaliculi leiden tot complexe mechanismen. De onderliggende processen zijn afhankelijk van het collectief samenspel tussen de hepatocyte Cytoskeleton, celcelcontacten en interacties met de extracellulaire matrix1. Het cytoskelet van hepatocyten bestaat uit alle drie de filament netwerken, het actine cytoskelet, microtubuli en intermediaire filamenten, die structurele ondersteuning bieden voor canaliculaire vorming. De differentiële rol van cytoskelet componenten in de regeneratie en het onderhoud van gal canaliculaire netwerken is eerder geïllustreerd in vitro in 3D collageen-sandwich hepatocyte culturen2.
Actin Microfilamenten en microtubuli zijn belangrijk tijdens de eerste stadia van de hepatocyte membraan polarisatie op de sites van canaliculus Generation2. De actine cytoskelet vestigt de structuur en functie van gal canaliculi, vorming van membraan-geassocieerde Microfilamenten en de omtrek ring, waardoor de canaliculaire architectuur te ondersteunen en het invoegen van de actine cytoskelet in strakke en hecht knooppunten3. De ring van keratine tussenliggende filamenten buiten de actine cytoskelet verder stabiliseert de canaliculaire structuur3.
Het belang van eiwitten in hepatocyte-junctieve complexen in de organisatie van de gal canaliculi-architectuur is goed gedocumenteerd in verschillende knock-out muismodellen, die een vervormde canaliculi vertonen bij muizen die geen strakke en/of hecht-junctieve eiwitten4,5,6hebben. Het verwijderen van het hecht kanaal eiwit α-bovenleiding heeft aangetoond dat het leidt tot disorganisatie van de hepatocyte actine cytoskelet, dilatatie van gal canaliculaire lumens, lekkend strak kruisingen, en effectief tot een cholestatisch fenotype4. Bovendien hebben in vitro-onderzoeken het belang aangetoond van heg-junctie componenten E-cadherin en β-bovenbuis bij de verbouwing van de hepatocellulaire apicale lumen en eiwit handel7.
Opvallend, ablatie van het cytoskelet crosslinking proteïne plectin, dat is de belangrijkste keratine organisator, heeft geopenbaard fenotypes vergelijkbaar met die gekoppeld aan de actine cytoskelet8. Dit suggereert een kritische rol van keratine Intermediaire filamenten bij de ondersteuning van de canaliculaire structuur. In vitro studies met behulp van 3D hepatocyte collageen sandwiches hebben ook aangetoond dat het belang van de AMP-geactiveerde proteïne kinase en de upstream Activator LKB1 in Gal canaliculaire netwerkvorming9. Deze bevindingen werden vervolgens verder bevestigd door latere in-vivo-studies10,11. Zo is het duidelijk geworden dat in vitro studies nodig zijn om het begrip van signalering van processen die betrokken zijn bij de oprichting van hepatocyte polarisatie, goede canaliculaire netwerkvorming en gal secretie verder te begrijpen.
Een belangrijke uitdaging bij het bestuderen van processen in verband met Gal canaliculaire formatie en de respons op pathologische situaties in vitro is het gebruik van een celkweek omstandigheden die nauw lijken op de situatie in vivo12. Vers geïsoleerde primaire hepatocyten zijn niet gepolariseerd; Zo verliezen ze hun functie, morfologie en functionele gal canaliculi in 2D cultuuromstandigheden (bijv. veranderingen in genregulatie, polarisatie en de-differentiatie13,14,15). Ondanks dit feit, vers geïsoleerde hepatocyten het meest overeenkomt met de aard van de lever in vivo, in tegenstelling tot lever-afgeleide cellijnen16. Hoewel ze zijn gebruikt in het verleden, vereeuwigd cellijnen niet de epitheliale-achtige karakteristieke morfologie van hepatocyten uitoefenen, en de gal canaliculaire lumen gevormd door deze cellen lijken op lever canaliculi slecht7. Onlangs zijn 3D-culturen van primaire hepatocyten, van zowel muizen als ratten, een nuttig hulpmiddel geworden om processen te onderzoeken die betrokken zijn bij de vorming van gal canaliculaire netwerken in vitro9. Primaire hepatocyten gekweekt tussen twee lagen collageen (aangeduid als een 3D-collageen sandwich cultuur) kunnen in meerdere dagen repolariseren. Vanwege de hoge technische eisen die nodig zijn bij het kweken van muizen hepatocyten in 3D collageen sandwiches, hier presenteren we een complex protocol te isoleren, te cultiveren, en immunolabel muis hepatocyten ingebed in 3D collageen sandwiches om de betrokkenheid van cytoskelet componenten te karakteriseren tijdens gal canaliculaire vorming.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63/EU en ze werden goedgekeurd door de Tsjechische Centrale Commissie voor dierenwelzijn.
1. materialen
- Huisdieren onder specifieke pathogeen-vrije voorwaarden volgens de richtlijnen van de Federatie voor laboratorium Dierenwetenschap verenigingen met vrije toegang tot reguliere Chow en drinkwater. Huisdieren onder een 12 h/12 h donker/licht cyclus. Voor hepatocyten isolatie en cultuur, gebruik 8 – 12 week-oude dieren.
- Stock oplossingen A en B
- Bereid voorraad oplossing A en Stock Solution B volgens respectievelijk tabel 1 en tabel 2vooraf. Los alle componenten op in 1 L gedistilleerd H2o (DH2o).
- Pas de pH van de oplossingen aan 7,2 en filter de oplossingen door middel van een 0,2 μm filter. Beide oplossingen kunnen maximaal 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.
- Stock oplossing C
- Bereid oplossing C op de dag van primaire hepatocyte-isolatie.
- Voeg alle componenten toe volgens tabel 3, vul aan tot een totaal volume van 50 ml met DH2O en los het op. Stel de pH in op 7,3.
- Aliquot 50 mL oplossing in buisjes van 50 mL. Gebruik één buis per dier. Plaats alle benodigde aliquots in een pre-warmed waterbad (37 °C).
- Stock oplossing D
- Bereid de oplossing D op de dag van de primaire isolatie van hepatocyte.
- Voeg alle componenten toe volgens tabel 4, vul aan tot een totaal volume van 30 ml met DH2O en los het op. Stel de pH in op 7,3.
- Aliquot 30 mL van de oplossing in buizen van 50 mL. Voeg Collagenase I (5 mg/30 mL) toe aan oplossing D. gebruik één aliquot per dier. Plaats alle aliquots in een pre-warmed waterbad (37 °C).
- Stock oplossing E
- Bereid oplossing E op de dag van primaire hepatocyte isolatie.
- Voeg alle componenten toe volgens tabel 5, vul aan tot een totaal volume van 50 ml met DH2O en los het op. Stel de pH in op 7,3.
- Aliquot 50 mL oplossing in buisjes van 50 mL. Voeg albumine V (0,65 g/50 mL) toe aan oplossing E. gebruik één aliquot per dier. Plaats alle aliquots in een pre-warmed waterbad (37 °C).
2. bereiding van collageen sandwiches
- Op een dag vóór primaire hepatocyten isolatie, bereid de eerste laag van de collageen I sandwich.
Opmerking: werk op ijs en gebruik voorgekoelde oplossingen, tips, platen en buizen om ongewenste gelatie van collageen I te minimaliseren. - Neutraliseer de benodigde hoeveelheid collageen I (van Rat tail) volgens het Protocol van de fabrikant. Een volume van 100 μL geneutraliseerde collageen (1,5 mg/mL) per experimenteel monster (schaal van 3,5 cm) is vereist. Om 1 mL geneutraliseerde collageen (1,5 mg/mL) te bereiden, voeg 100 μL 10x DMEM, 1,5 μL 1M NaOH en 48,5 μL dH2O toe aan 500 μl collageen (voorraad concentratie = 3 mg/ml). Controleer de pH van geneutraliseerde collageen met lakmoesproef papier (de pH moet ~ 7,5).
- Dispergeer 100 μL neutraliseerde collageen oplossing gelijkmatig met een voorgekoelde 200 μL tip over het oppervlak van een schaal van 3,5 cm op ijs.
- Incuberen 's nachts onder de standaard kweek condities (incubator met 5% CO2 bij 37 °c). Voeg op de dag van primaire hepatocyte isolatie 1 mL voorverwarmde (37 °C) PBS toe aan de eerste collageen laag. Laat het collageen rehydraat voor 2-3 h bij 37 °C.
3. uitrusting instellen
- Alle apparatuur zoals vermeld in de tabel van de materialen voorbereiden en instellen zoals weergegeven in Figuur 1.
4. chirurgische ingreep
- Anesthetiseer de muis door intramusculaire injectie van tiletamine (60 mg/kg lichaamsgewicht), zolazepam (60 mg/kg), en xylazine (4,5 mg/kg). Na enkele minuten, bevestig de juiste anesthetisering door de teen knijpen. Als het dier niet reageert op de Knijp, ga dan naar 4,2.
- Plaats de verdoofd Mouse op een dissectie mat en plak de onderste en bovenste extremiteiten om de muis in rugligging te bevestigen. Swab de buik met 70% ethanol en open de buik met een V-vorm incisie van de schaamstreek naar voorpoten. Vouw de huid over de borst om de buikholte te onthullen. Plaats de ontsnij mat onder een ontleed Microscoop.
- Buig een insulinespuit naald (30 G) in een hoek van 45 °. Stel de onderste vena cava (IVC) bloot door de darmen en de dikke darm in de caudale richting te bewegen.
- Vul 2,5 mL pre-warmed (37 °C) oplossing C in een 2 mL spuit met een canule. Zorg ervoor dat er geen luchtbelletjes in de canule of spuit zitten.
- Vóór de cannulatie van de IVC, herpositioneer de lever lobben door ze op te drukken tot het diafragma met een natte (PBS) wattenstaafje. Plaats een zijhechting rond de IVC net onder de lever (Figuur 2a, B).
- Injecteer 10 μL heparine (5000 U/mL) in de portaal ader met behulp van een insulinespuit met een 30 G naald gebogen in een hoek van 45 ° (Figuur 2C).
- Om de lever te cannuleren, maak een kleine incisie met microchirurgische schaar aan de IVC direct naast de lever (onder de hecht; Figuur 2D) die groot genoeg is om de canule in te steken. Bevestig de canule in de positie met behulp van hechtingen en twee chirurgische knopen (Figuur 2E).
- Snijd de portaal ader (Figuur 2F) om de perfusie buffers uit de lever te laten vloeien om expansie van de lever te voorkomen.
- Parfumeer de lever handmatig met 1,5 mL voorverwarmde oplossing C door langzaam op de spuit te drukken die is aangesloten op de canule (dit moet ~ 15 s duren). De verwijdering van bloed uit de lever door verkleuring van de lever kan nu worden waargenomen.
- Pre-Vul een peristaltische pomp met voorverwarmde (37 °C) oplossing C. Controleer het perfusie-apparaat en zorg ervoor dat er geen luchtbelletjes in het systeem zitten.
- Koppel voorzichtig de canule los van de spuit en sluit deze aan op de slang van de peristaltische pomp met een debiet van 2,5 mL/min. werk snel maar zorgvuldig en zorg ervoor dat de canule in positie blijft en dat er geen bubbels in de slang of canule komen.
- Parfumeer de lever met oplossing C gedurende 2 min (5 mL oplossing C). Verander naar oplossing D en ga verder met de perfusie voor nog 10 minuten (25 mL oplossing D).
- Zodra de lever is geperfectiongebruikt, verwijderen uit de buikholte. De lever zal nu zeer fragiel en bleke van kleur (Figuur 3).
5. isolatie van primaire hepatocyten
- Verwijder de lever van de muis. De canule zal nog steeds aan de lever worden gebonden, dus gebruik de tang om de canule met de lever op te tillen en alle fascia-verbindingen zorgvuldig af te snijden. Breng de lever over in een buis van 50 mL met 20 mL pre-warmed oplossing E.
- Houd de canule met de lever met behulp van een tang en ontkoppel het weefsel door de lever rond de wand van de buis te wrijven om de geïsoleerde hepatocyten in de buffer over te brengen. Houd de geïsoleerde cellen op ijs.
Opmerking: geïsoleerde primaire hepatocyten zijn gedurende enkele uren levensvatbaar terwijl ze op ijs worden gehouden. Gebruikers kunnen stappen 4,1 tot en met 5,2 het isoleren van primaire hepatocyten van een andere donor muis, indien nodig, of doorgaan met de volgende stap herhalen. - Plaats een 70 μm nylon celzeef bovenop een buis van 50 mL en filtreer de geïsoleerde cellen.
- Centrifugeer de buis bij 50 x g en 4 °c gedurende 5 min. aspireren de supernatant. Om dode cellen verwijderen en verhogen van het percentage van levensvatbare cellen, respenderen de pellet in 20 mL 40% percol in DMEM.
- Centrifugeer de buis bij 50 x g en 4 °c gedurende 5 min. Zuig de supernatant met dode cellen op en hervat de pellet in 20 ml oplossing E.
- Centrifuge buizen bij 50 x g en 4 °c gedurende 5 min. aspireren de supernatant en Redigeer de pellet in 10 ml oplossing E.
- Controleer de primaire opbrengst van hepatocyten en de levensvatbaarheid met behulp van trypan blauwe kleuring. Tel het celnummer met behulp van een Neubauer-celtelkamer en pas de celconcentratie aan 3,75 x 105 levensvatbare cellen/ml. Houd de cellen op ijs.
6. teelt van primaire hepatocyten in 3D collageen sandwiches
- Bereid hepatocyte Culture medium (HCM). Voeg 15 μL glucagon (1 mg/mL), 15 μL hydrocortison (50 mg/mL) en 40 μL insuline (10 mg/mL) toe aan 50 mL van het volledige medium (DMEM, hoge glucose, 10% FBS, 1% penicileen-streptomycine).
- Gelijkmatig dispergeren 2 mL (5 x 105 cellen/ml) van levensvatbare primaire hepatocyten in een voorgecoate 3,5 cm schotel. Incubeer de cellen met 5% CO2 bij 37 °c gedurende 3 uur. belangrijk: Verdeel de cellen gelijkmatig door de schaal in alle richtingen te kantelen vlak voordat u het gerecht in een incubator zet.
- Bereid geneutraliseerde collageen I (100 μL/3.5 cm schaal; d.w.z. een voldoende volume voor alle gerechten zoals hierboven beschreven [stap 2,1]). Blijf op ijs tot gebruik.
- Verwijder na 3 uur voorzichtig de medium en niet-bevestigde cellen en voeg 100 μL geneutraliseerde collageen I toe aan elk 3,5 cm-gerecht om de toplaag van collageen sandwich op cellen te vormen. Inbroed de collageen sandwich onder de standaard celkweek condities (5% CO2 bij 37 °c) gedurende 1 uur. Voeg na een incubatie van 1 uur voorzichtig 2 mL HCM toe.
- Verander na 24 uur van cultuur het HCM-medium voor een nieuwe.
- Cultuur voor 3 – 8 dagen, afhankelijk van de vorming van gal canaliculi. Controleer de cultuur elke dag onder een microscoop (Figuur 4). Verander de HCM elke tweede dag.
7. immunolabeling van primaire hepatocyten in 3D collageen sandwiches
- Verwijder de media uit de sandwiches van hepatocyte en was voorzichtig met voorverwarmde PBS. Bevestig de sandwich culturen met 1 mL 4% Paraformaldehyde in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Na fixatie, was de broodjes 3x voor 10 min in 2 mL PBS + 0,1% Tween 20 (PBS-T).
- Permeabilize cellen met 1 mL 0,1 M glycine, 0,2% Triton X-100 in PBS bij RT voor 1 h. was 3x voor 10 min in PBS-T.
- De bovenste laag van collageen zachtjes verstoren met een 10 μL laadpunt dat is aangesloten op een vacuüm aspiratie om voldoende antilichaam penetratie te garanderen.
- Blok met 1 mL 5% BSA in PBS-T (d.w.z. blokkerende oplossing) voor 2 h. inbroed met primaire antilichamen verdund in blokkerende oplossing 's nachts bij 37 °C. Was 3x gedurende 15 minuten in PBS-T.
- Na het wassen incuberen met secundair antilichaam bij 37 °C gedurende 5 uur. was 3x gedurende 15 minuten in PBS-T gevolgd door 1x wassen met gedistilleerd H2O.
- Monteer met anti-fade-bevestigingsmateriaal (Zie tabel met materialen) voor microscopie.
Representative Results
Muis primaire hepatocyten werden geïsoleerd en geënt in 3D collageen sandwiches. Gal canaliculi tussen twee aangrenzende cellen begon te vormen binnen enkele uren na seeding. Cellen vormden clusters en zelf georganiseerd in een ongeveer regulier netwerk van gal canaliculi binnen 1 dag (Figuur 4). Binnen 3 – 6 dagen werden clusters van 5 – 10 cellen meestal waargenomen, met volledig gepolariseerde hepatocyten die een canaliculaire-netwerk vormen (Figuur 4).
Behandeling van primaire muis hepatocyten in 3D collageen sandwiches met toxine (ethanol) of cytoskelet-veranderende geneesmiddelen (bijv. blebbistatine, dinophysistoxines acid) resulteerde in veranderingen in het cytoskelet van hepatocyte, canaliculi breedte, vorm, en het aantal gal canaliculi geïllustreerd door immunolabeling met een antilichaam aan keratine 8 (de meest overvloedige keratine in hepatocyten), phalloidine (visualisering van F-actin), en antilichaam aan nauwe Junction proteïne zonula occludens-1 (zo-1; Figuur 5).
De behandeling met ethanol had slechts een mild effect op de organisatie van keratine 8; echter, het verhoogde de kronosheid (zoals blijkt uit F-actin kleuring) en distributie van gal canaliculaire breedten (Figuur 5). De signaalintensiteit van ZO-1 kleuring werd verlaagd in ethanol-behandelde gal canaliculi in vergelijking met onbehandelde controles, wat duidt op een verlies van krappe knooppunten na de behandeling met ethanol. De remming van actomyosine contractiliteit met blebbistatine significant beïnvloed de vorm en het aantal gal canaliculi. Het reguliere canaliculaire-netwerk werd gereorganiseerd, vergeleken met onbehandelde hepatocyten, in een niet-ordelijke vorm van gal canaliculi met een verhoogde incidentie van dikke afgeronde gal canaliculi in plaats van dunne lange (zoals te zien in het histogram van canaliculaire breedtes).
Bovendien, behandeling met dinophysistoxines acid (OA) remming van fosfatasen sterk beïnvloed de fysische eigenschappen van keratinen, zoals eerder weergegeven8,17. OA verandert de oplosbaarheid van keratine filamenten; zo resulteerde de behandeling in een grondige reorganisatie van de keratine meshwork, die instortte in grote perinucleaire aggregaten. Zowel F-actin als nauwe junctie proteïne ZO-1 waren niet gelokaliseerd in een bepaalde structuur, wat suggereert dat de georganiseerde gal canaliculi bijna volledig verdwijnt en een volledig verlies van hepatocyte polariteit. De overgebleven gal canaliculi werden significant versmald vergeleken met onbehandelde controles, zoals te zien in de canaliculaire breedte histogram (Figuur 5).
Om microscopische waarnemingen van veranderingen in het cytoskelet van hepatocyten te correleren met de hepatocellulaire biochemische respons op de behandeling, het protocol ook gemeten niveaus van alanineaminotransferase (ALAT) en aspartaattransaminase (AST) (twee leverenzymen die vaak worden gebruikt als hepatocellulaire letsel markers) in supernatant van de 3D collageen sandwiches (Figuur 6)18. Ethanol behandeling aanzienlijk verhoogd de niveaus van zowel ALT en AST, suggereren ernstige hepatocellulaire letsel. De behandeling met blebbistatine leidde niet tot aanzienlijke veranderingen in zowel de ALAT-als de ASAT-niveaus in vergelijking met de behandeling met dinophysistoxines acid, die milde biochemische veranderingen veroorzaakte met verhoogde niveaus van Alt, maar geen verandering in de niveaus van AST. Zo, biochemische markers van hepatocellulaire letsel gemeten in vitro uit hepatocyte supernatant correleren met de cytoskelet veranderingen waargenomen door middel van immunokleuring.
Figuur 1: experimentele opstelling. A) de muis is in rugligging vastgezet en wordt vóór de operatie onder een ontleed Microscoop geplaatst. Alle benodigde chirurgische instrumenten worden op een bakje geplaatst. (B) de perfusie Suite tijdens muis lever perfusie met siliconen slang die het reservoir met warme buffer en de geperfundeerd muis verbindt. (C) Schematische weergave van B. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: opening van de buikholte en cannulatie van de IVC. De buik wordt geopend met een V-vorm incisie van de schaamstreek naar voorpoten. De huid wordt over de borst gevouwen om de buikholte bloot te leggen en te vergroten. Om de IVC bloot te leggen, worden de darmen en de dikke darm voorzichtig verplaatst. (a, B) Voorafgaand aan de cannulatie van de IVC, moeten lever lobben worden verplaatst door ze naar boven te drukken op het diafragma met een PBS-bevoafd wattenstaafje. De IVC wordt vervolgens zorgvuldig gescheiden van omringende weefsels, en een zijde hechtdraad wordt rond de IVC in de nabijheid van de lever geplaatst. Panel B staat voor schema's van de buikholte getoond in paneel A. De lever lobben, darmen, inferieure vena cava (IVC, rood) en hechtingen zijn geïndiceerd. C) heparines wordt in de portaal ader (PV, Arrow) geïnjecteerd met een insulinespuit (30 G naald gebogen bij een hoek van 45 °). (D) om de lever te cannuleren, wordt de IVC direct naast de lever ingesneden (onder de hecht). E) de canule wordt ingebracht en vastgezet met hechtingen door twee chirurgische knopen te binden. F) de portaal ader is volledig gesneden om een vrije buffer uitstroom mogelijk te maken, waardoor de lever expansie wordt voorkomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve lever afbeeldingen voor en na perfusie. (a, B) De gecanuleerde lever werd gedurende 12 minuten met een debiet van 2,5 mL/min. de significant verkleurde lever na perfusie (B) in vergelijking met de versbereide lever (A) door de Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4:3D collageen sandwich cultuur van primaire muis hepatocyten. Representatieve helder-veld beelden van primaire hepatocyten van muizen gekweekt voor 1, 2 en 3 dagen in 3D-condities. Opgemerkt moet worden dat grotere clusters van sterk georganiseerde cellen worden gevormd na 3 dagen in cultuur. In boxed gebieden worden ~ 3x vergrote afbeeldingen weergegeven. Pijlpunten geven de gal canaliculi aan. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: evaluatie van de morfologische respons op toxische stress door immunofluorescentie microscopie. Primaire muis hepatocyten gekweekt in 3D collageen sandwiches werden behandeld met toxines (ethanol, blebbistatine of dinophysistoxines acid) op dag 3 van cultuur. Vaste cellen werden gekleurd om cytoskelet componenten te visualiseren: keratine 8 (groen), F-actin (rood) en zonula occludens-1 (ZO-1, magenta) door immunofluorescentie. De toxische behandeling leidde tot een disorganisatie van gevisualiseerde cytoskelet componenten, en het verminderde het aantal en verhoogde de kronosheid van gal canaliculi. Canalicular breedtes werden gemeten in zowel onbehandeld als behandelde hepatocyten en worden afgebeeld als histogrammen van breedten verdeling. Pijlpunten geven de gal canaliculi aan. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: biochemische analyse van de reactie van 3D hepatocyte collageen broodjes aan giftig letsel in vitro. ALAT en AST, gevestigde markers van hepatocellulaire letsel, werden gemeten in supernatant van 3D hepatocyte collageen sandwiches behandeld met toxines (ethanol, blebbistatine en dinophysistoxines acid). ALAT en ASAT werden in behandelde cellen verheven in vergelijking met onbehandelde. Gegevens worden gerapporteerd als rekenkundig betekent ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Stock oplossing A (10x) | |
| Reagens | Eindconcentratie (g/liter) |
| Nacl | 80 |
| Kcl | 4 |
| MgSO4· 7h2O | 1,97 |
| Na2HPO4· 2H2O | 0,598 |
| KH2po4 | 0,6 |
Tabel 1: voorraad oplossing een recept.
| Stock oplossing B (10x) | |
| Reagens | Eindconcentratie (g/liter) |
| Nacl | 69 |
| Kcl | 3,6 |
| KH2po4 | 1,30 |
| MgSO4· 7h2O | 2,94 |
| CaCl2 | 2,772 |
Tabel 2: voorraad oplossing B recept.
| Oplossing C | |
| Reagens | |
| Stock oplossing A (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0,1094 g |
| EGTA | 0,0095 g |
| dH2O | tot 50 mL |
Tabel 3: voorraad oplossing C recept.
| Oplossing D | |
| Reagens | |
| Stock oplossing A (10x) | 3 mL |
| NaHCO3 | 0,065 g |
| CaCl2 | 0,0125 g |
| dH2O | tot 30 mL |
Tabel 4: recept voor stamoplossing D.
| Oplossing E | |
| Reagens | |
| Stock oplossing B (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0,1 g |
| Glucose | 0,045 g |
| dH2O | tot 50 mL |
Tabel 5: voorraad oplossing E recept.
Discussion
Het gebruik van muis primaire hepatocyten culturen is belangrijk voor in vitro studies om beter te begrijpen de signalering processen die betrokken zijn bij de oprichting van hepatocyte polarisatie, goede canaliculaire structuur vorming, en gal secretie. De uitdagingen in isolatie en lange termijn cultuur van muis primaire hepatocyten in 2D-cultuur hebben de uitvinding van verschillende technische benaderingen met verhoogde isolatie effectiviteit en levensduur van geïsoleerde cellen gedreven, elk met verschillende voordelen en Nadelen. Het is nu algemeen aanvaard dat 2D-culturen van primaire hepatocyten slechts beperkt aantal attributen van lever biologie nabootsen voor een korte periode van tijd. Dus, 3D-teelt in een collageen sandwich arrangement wordt op grote schaal vervangen door de 2D-condities, vooral wanneer gericht op de functie van het cytoskelet in de lever biologie (bv, toxische effecten van de drug of ruimtelijke ordening van gal transport).
Sinds de jaren 1980, verschillende protocollen voor isolatie van muizen hepatocyten met verschillende wijzigingen zijn beschreven. De twee-stap Collagenase perfusie aanpak is op grote schaal gebruikt in vele laboratoria. De toevoeging van gradiënt centrifugeren in het isolatie protocol maakt het verwijderen van dode cellen19,20 en aanzienlijk verhoogt het aantal levensvatbare cellen (hier, routinematig om ~ 93%). Hoewel deze stap de verwerkingstijd van de cellen uitbreidt en resulteert in gereduceerde celaantallen21, wordt deze stap zo nodig gezien in de sandwich cultuur van 3D-collageen voor een goede gal-canaliculaire netwerkvorming. Bovendien is het belangrijker om snel en nauwkeurig door te gaan tijdens perfusie stappen, waardoor de tijd wordt verkort waarop de cellen worden verwerkt.
Andere belangrijke factoren die de levensvatbaarheid van de cellen en hun vermogen om canaliculaire netwerken in 3D vormen te verhogen, zijn het gebruik van vers bereide oplossingen en het vermijden van bubbels tijdens perfusie. Daarom moeten oplossingen worden bereid op de dag van de muizen hepatocyte isolatie, en de peristaltische pomp en slangen moeten worden gecontroleerd bij het veranderen van oplossingen. Als het protocol op de voet wordt gevolgd, moet de isolatie van primaire hepatocyten succesvol zijn met een hoge opbrengst van levensvatbare cellen.
Een andere kritieke factor in de lange termijn 3D hepatocyten cultuur is de eerste bron van primaire hepatocyten die worden gebruikt. Het is belangrijk om dieren te gebruiken die 8 – 12 weken oud zijn, die als optimale donoren van hepatocyten dienen. Het gebruik van hepatocyten van oudere dieren was niet zo succesvol in lange-termijn cultuur, als deze hepatocyten veranderde hun morfologie vaker, gedepolariseerd, en opgehouden te vormen canaliculaire netwerken. Ook, plating hepatocyten op goed geneutraliseerde collageen gel gevormd uit relatief sterk geconcentreerde oplossing is een vitale stap. In de meeste protocollen worden concentraties van ongeveer 1 mg/mL gebruikt. Na vele optimalisaties, een concentratie van 1,5 mg/ml is optimaal voor de lange termijn hepatocyten teelt en biedt zeer georganiseerde hepatocyten met gevormde gal canaliculi.
Dit eenvoudig te volgen protocol maakt de teelt van primaire muizen hepatocyten op lange termijn mogelijk. Representatieve resultaten tonen een breed spectrum van gebruik voor 3D gekweekte primaire muis hepatocyten bij het bestuderen van de rol van cytoskelet componenten in Gal canaliculi vorming.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het subsidie Bureau van de Tsjechische Republiek (18-02699S); de subsidie-instantie van het ministerie van volksgezondheid van de Tsjechische Republiek (17-31538A); het institutioneel onderzoeksproject van de Tsjechische Academie van Wetenschappen (RVO 68378050) en MEYS CR Projects (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ. 1.05/2.1.00/19.0395, en OP RDE CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775); Charles University (Personal Stipendium aan K.K.), en een operationeel programma Praag – competitiviteit project (CZ. 2.16/3.1.00/21547). We erkennen de Lichtmicroscopie kern faciliteit, IMG CAS, Praag, Tsjechië (ondersteunde MEYS CR projecten LM2015062 en LO1419) voor ondersteuning met de microscopie Imaging gepresenteerd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
| Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
| Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
| Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
| microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
| microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
| microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Water bath | Nuve | NB 9 | |
| Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
References
- Gissen, P., Arias, I. M. Structural and functional hepatocyte polarity and liver disease. Journal of Hepatology. 63 (4), 1023-1037 (2015).
- LeCluyse, E. L., Fix, J. A., Audus, K. L., Hochman, J. H. Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes. Toxicology In Vitro. 14 (2), 117-132 (2000).
- Tsukada, N., Ackerley, C. A., Phillips, M. J. The structure and organization of the bile canalicular cytoskeleton with special reference to actin and actin-binding proteins. Hepatology. 21 (4), 1106-1113 (1995).
- Herr, K. J., et al. Loss of alpha-catenin elicits a cholestatic response and impairs liver regeneration. Scientific Reports. 4, 6835 (2014).
- Yeh, T. H., et al. Liver-specific beta-catenin knockout mice have bile canalicular abnormalities, bile secretory defect, and intrahepatic cholestasis. Hepatology. 52 (4), 1410-1419 (2010).
- Pradhan-Sundd, T., et al. Dual catenin loss in murine liver causes tight junctional deregulation and progressive intrahepatic cholestasis. Hepatology. 67 (6), 2320-2337 (2018).
- Theard, D., Steiner, M., Kalicharan, D., Hoekstra, D., van Ijzendoorn, S. C. Cell polarity development and protein trafficking in hepatocytes lacking E-cadherin/beta-catenin-based adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2313-2321 (2007).
- Jirouskova, M., et al. Plectin controls biliary tree architecture and stability in cholestasis. Journal of Hepatology. 68 (5), 1006-1017 (2018).
- Fu, D., Wakabayashi, Y., Ido, Y., Lippincott-Schwartz, J., Arias, I. M. Regulation of bile canalicular network formation and maintenance by AMP-activated protein kinase and LKB1. Journal of Cell Science. 123, Pt 19 3294-3302 (2010).
- Woods, A., et al. LKB1 is required for hepatic bile acid transport and canalicular membrane integrity in mice. Biochemical Journal. 434 (1), 49-60 (2011).
- Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
- Sarnova, L., Gregor, M. Biliary system architecture: experimental models and visualization techniques. Physiological Research. 66 (3), 383-390 (2017).
- Talamini, M. A., Kappus, B., Hubbard, A.
- Bhandari, R. N., et al. Liver tissue engineering: a role for co-culture systems in modifying hepatocyte function and viability. Tissue Engineering. 7 (3), 345-357 (2001).
- Godoy, P., et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Archives of Toxicology. 87 (8), 1315 (2013).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Strnad, P., Windoffer, R., Leube, R. E. In vivo detection of cytokeratin filament network breakdown in cells treated with the phosphatase inhibitor okadaic acid. Cell and Tissue Research. 306 (2), 277-293 (2001).
- Chalupsky, K., et al. ADAM10/17-Dependent Release of Soluble c-Met Correlates with Hepatocellular Damage. Folia Biologica. 59 (2), 76-86 (2013).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
