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Biology

विट्रो में पित्त कैनेलिकुलर गठन में साइटोस्केलेटन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स की अलगाव और 3 डी कोलेजन सैंडविच संस्कृति

Published: December 20, 2019 doi: 10.3791/60507
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Integrative Biology, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

Summary

यहां प्रस्तुत एक संशोधित कोलेजेनेज़ परफ्यूजन तकनीक का उपयोग करके वयस्क माउस यकृत से माउस हेपेटोसाइट्स के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल है। इसके अलावा वर्णित एक 3 डी कोलेजन सैंडविच सेटिंग में हेपेटोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति के साथ-साथ पित्त कैनालिकुलर गठन और उपचार के प्रति इसकी प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए साइटोस्केलेटल घटकों की इम्यूनोलेबलिंग है।

Abstract

हेपेटोसाइट्स अपने मेटाबोलिक फ़ंक्शन के लिए जिम्मेदार यकृत की केंद्रीय कोशिकाएं हैं। जैसे, वे एक विशिष्ट ध्रुवीकृत एपिथेलियम बनाते हैं, जिसमें दो या अधिक हेपेटोसाइट्स एक पित्त कैनालिकुलर नेटवर्क बनाने के लिए एपिकल झिल्ली का योगदान करते हैं जिसके माध्यम से पित्त को स्रावित किया जाता है। हेपेटोसाइट ध्रुवीकरण सही कनभ्युलर गठन के लिए आवश्यक है और हेपेटोसाइट साइटोस्केलेटन, सेल-सेल संपर्कों और बाह्युलर मैट्रिक्स के बीच बातचीत पर निर्भर करता है। कैनालकुली गठन में हेपेटोसाइट साइटोस्केलेटन की भागीदारी के विट्रो अध्ययन और रोग स्थितियों के प्रति इसकी प्रतिक्रिया सेल संस्कृति की कमी से विकलांग हैं, जो वीवो में कैनालकुली नेटवर्क संरचना के समान होगी। यहां वर्णित एक संशोधित कोलेजेनेस परफ्यूजन तकनीक का उपयोग करके वयस्क माउस जिगर से माउस हेपेटोसाइट्स के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल है। इसके अलावा वर्णित एक 3 डी कोलेजन सैंडविच सेटिंग में संस्कृति का उत्पादन है, जिसका उपयोग पित्त कैनेलिकुलर गठन और विट्रो में उपचार के प्रति इसकी प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए साइटोस्केलेटल घटकों के इम्यूनोलेबलिंग के लिए किया जाता है। यह दिखाया गया है कि हेपेटोसाइट 3 डी कोलेजन सैंडविच संस्कृतियां विषाक्त पदार्थों (इथेनॉल) या ऐक्टिन साइटोस्केलेटन बदलने वाली दवाओं (जैसे, ब्लेबिस्टिन) के उपचार ों का जवाब देती हैं और पित्त कैनालकुली गठन और कार्य के इन विट्रो अध्ययनों के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में काम करती हैं।

Introduction

हेपेटोसाइट्स, जिगर की केंद्रीय सेलुलर संरचनाएं जो इसके मेटाबोलिक कार्यों के लिए जिम्मेदार हैं, विशिष्ट ध्रुवीकृत एपिथेलियल कोशिकाएं हैं। उनके ध्रुवीकरण, जन्म के तुरंत बाद स्तनधारियों में प्रदर्शित होने, पित्त कनालिकुलर नेटवर्क के गठन में परिणाम है और उचित पित्त स्राव के लिए आवश्यक है । हेपेटोसाइट्स की एपिकल झिल्ली सामूहिक रूप से पित्त कैनालकुली बनाती है, जबकि बेसल झिल्ली साइनसॉइड के एंडोथेलियम के संपर्क में रहती हैं। हेपेटोसाइट ध्रुवीकरण के नुकसान से पित्त ट्रांसपोर्टरों का पुनर्वितरण होता है और इसके परिणामस्वरूप जिगर (यानी, कोलेस्टेसिस) में पित्त प्रतिधारण से जुड़ी रोग प्रक्रियाएं होती हैं।

हेपेटोसाइट ध्रुवीकरण की स्थापना और रखरखाव और पित्त कैनालकुली के विकास के लिए जटिल तंत्र की आवश्यकता होती है। अंतर्निहित प्रक्रियाएं हेपेटोसाइट साइटोस्केलेटन, सेल-सेल संपर्कों और बाह्युलर मैट्रिक्स1के साथ बातचीत के बीच सामूहिक परस्पर क्रिया पर निर्भर करती हैं। हेपेटोसाइट साइटोस्केलेटन में सभी तीन फिलामेंट नेटवर्क, ऐक्टिन साइटोस्केलेटन, माइक्रोट्यूबबुल और इंटरमीडिएट फिलामेंट्स होते हैं, जो कैनालिकुलर गठन के लिए संरचनात्मक समर्थन प्रदान करते हैं। पित्त कैनालिकुलर नेटवर्क के उत्थान और रखरखाव में साइटोस्केलेटल घटकों की अंतर भूमिका पहले 3 डी कोलेजन-सैंडविच हेपेटोसाइट संस्कृतियों2में विट्रो में सचित्र की गई है।

कैनेलीकुलस जनरेशन2के स्थलों पर हेपेटोसाइट झिल्ली ध्रुवीकरण के प्रारंभिक चरणों के दौरान ऐक्टिन माइक्रोफिलामेंट्स और माइक्रोट्यूबबुल महत्वपूर्ण होते हैं । ऐक्टिन साइटोस्केलेटन पित्त कैनालकुली की संरचना और कार्य को स्थापित करता है, झिल्ली से जुड़े माइक्रोफिलामेंट्स और परिस्थितिजन्य अंगूठी बनाता है, इस प्रकार कैनालिकुलर वास्तुकला का समर्थन करता है और ऐक्टिन साइटोस्केलेटन को तंग में डालता है और जंक्शनों का पालन करता है3। ऐक्टिन साइटोस्केलेटन के बाहर केराटिन इंटरमीडिएट फिलामेंट्स की अंगूठी और कनवंकुलर संरचना3को स्थिर करती है ।

पित्त कैनालकुली वास्तुकला के संगठन में हेपेटोसाइट जंक्शनल परिसरों में प्रोटीन का महत्व कई नॉक-आउट माउस मॉडल में अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, जो चूहों में विकृत कैनालकुली दिखाते हैं, जो तंग और/या अनुयायियों जंक्शनल प्रोटीन4,5,6की कमी है । पालन जंक्शन प्रोटीन α-catenin के विलोपन हेपेटोसाइट ऐक्टिन साइटोस्केलेटन के विघटन के लिए नेतृत्व करने के लिए दिखाया गया है, पित्त कैनाकुलर ल्यूमेंस के फैलाव, टपका हुआ तंग जंक्शनों, और प्रभावी ढंग से एक कोलेस्टैटिक फेनोटाइप4के लिए । इसके अलावा, इन विट्रो अध्ययनों ने हेपेटोसेलुलर एपिकल ल्यूमेन और प्रोटीन तस्करी7के पुनर्मॉडलिंग में जंक्शन घटकों ई-कैथेरिन और ए-कैटेनिन के पालन के महत्व को दर्शाया है।

हड़ताली रूप से, साइटोस्केलेटन क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन प्लेक्टिन का एब्लेशन, जो प्रमुख केराटिन आयोजक है, ने ऐक्टिन साइटोस्केलेटन8से जुड़े लोगों के बराबर फेनोटाइप का खुलासा किया है। यह कनालिकुलर संरचना के समर्थन में केराटिन मध्यवर्ती तंतुओं की एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव देता है। 3 डी हेपेटोसाइट कोलेजन सैंडविच का उपयोग करने वाले इन विट्रो अध्ययनों में पित्त कैनालिकुलर नेटवर्क गठन9में एएमपी-सक्रिय प्रोटीन किनेज और इसके अपस्ट्रीम एक्टिवेटर एलकेबी 1 के महत्व को भी दर्शाया गया है। इसके बाद वीवो स्टडीज10,11तक इन निष्कर्षों की पुष्टि हुई . इस प्रकार, यह स्पष्ट हो गया है कि हेपेटोसाइट ध्रुवीकरण, उचित कंकैलिकुलर नेटवर्क गठन और पित्त स्राव की स्थापना में शामिल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं की समझ को आगे बढ़ाने के लिए इन विट्रो अध्ययन आवश्यक हैं।

पित्त कैनाकुलर गठन से जुड़ी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में एक बड़ी चुनौती और विट्रो में रोग स्थितियों के प्रति इसकी प्रतिक्रिया एक कोशिका संस्कृति की स्थितियों का उपयोग कर रही है जो वीवो12की स्थिति के समान है । हौसले से अलग प्राथमिक हेपेटोसाइट्स ध्रुवीकृत नहीं हैं; इस प्रकार, वे 2डी संस्कृति स्थितियों में अपने कार्य, आकृति विज्ञान और कार्यात्मक पित्त कैनालकुली खो देते हैं (उदाहरण के लिए, जीन विनियमन, ध्रुवीकरण और डी-विभेदन13,14,15)में परिवर्तन। इस तथ्य के बावजूद, ताजा अलग हेपेटोसाइट्स सबसे बारीकी से वीवो में जिगर की प्रकृति कोप्रतिबिंबित, जिगर से व्युत्पन्न सेल लाइनों16के विपरीत । यद्यपि उनका उपयोग अतीत में किया गया है, फिर भी अमर कोशिका रेखाएं हेपेटोसाइट्स की एपिथेलियाल जैसी विशेषता आकृति विज्ञान नहीं करती हैं, और इन कोशिकाओं द्वारा गठित पित्त कैनेलिकुलर ल्यूमेंस लिवर कैनालकुली खराब7के समान होते हैं। हाल ही में, चूहों और चूहों दोनों से प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की 3 डी संस्कृतियां विट्रो9में पित्त कैनालिकुलर नेटवर्क गठन में शामिल प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक उपयोगी उपकरण बन गई हैं। कोलेजन की दो परतों के बीच सुसंस्कृत प्राथमिक हेपेटोसाइट्स (जिसे 3 डी कोलेजन सैंडविच संस्कृति के रूप में जाना जाता है) कई दिनों में फिर से ध्रुवीकरण कर सकता है। 3 डी कोलेजन सैंडविच में माउस हेपेटोसाइट्स को संचरित करते समय आवश्यक उच्च तकनीकी मांगों के कारण, यहां हम पित्त कैनेलिकुलर गठन के दौरान साइटोस्केलेटल घटकों की भागीदारी की विशेषता के लिए 3डी कोलेजन सैंडविच में एम्बेडेड माउस हेपेटोसाइट्स को अलग करने, खेती करने और इम्यूनोलेबल माउस हेपेटोसाइट्स को इम्मुनोलेबल माउस हेपेटोसाइट्स करने के लिए एक जटिल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों यूरोपीय निर्देश 2010/63/ईयू के अनुसार किया गया था और उन्हें चेक केंद्रीय पशु कल्याण आयोग द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. सामग्री

  1. विशिष्ट रोगजनक मुक्त परिस्थितियों के तहत घर जानवरों नियमित रूप से चाउ और पीने के पानी के लिए मुफ्त पहुंच के साथ प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघों के लिए फेडरेशन के दिशा निर्देशों के अनुसार । एक 12 h/12 h अंधेरे/प्रकाश चक्र के तहत घर जानवरों । हेपेटोसाइट अलगाव और संस्कृति के लिए 8-12 सप्ताह पुराने जानवरों का उपयोग करें।
  2. स्टॉक समाधान ए और बी
    1. टेबल 1 और टेबल 2के अनुसार स्टॉक सॉल्यूशन ए और स्टॉक सॉल्यूशन बी क्रमशः पहले से तैयार करें। आसुत एच2ओ (डीएच2ओ) के 1 एल में सभी घटकों को भंग करें।
    2. समाधान के पीएच को 7.2 में समायोजित करें और 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें। दोनों समाधान 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
  3. स्टॉक सॉल्यूशन सी
    1. प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के दिन समाधान सी तैयार करें।
    2. तालिका 3 के अनुसार सभी घटकजोड़ें, डीएच2ओ के साथ 50 मीटर कुल मात्रा में भरें, और भंग करें। पीएच को 7.3 पर समायोजित करें।
    3. अलीकोट 50 मीटर ट्यूब में समाधान का 50 एमएल। प्रति पशु एक ट्यूब का प्रयोग करें। सभी आवश्यक एलिकोट्स को पूर्व-गर्म पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में रखें।
  4. स्टॉक सॉल्यूशन डी
    1. प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के दिन समाधान डी तैयार करें।
    2. तालिका 4के अनुसार सभी घटकजोड़ें, डीएच2ओ के साथ 30 मीटर कुल मात्रा में भरें, और भंग करें। पीएच को 7.3 पर समायोजित करें।
    3. अलीकोट 50 मीटर ट्यूबों में समाधान का 30 mL। समाधान डी में कोलेजेनेस I (5 मिलीग्राम/30 mL) जोड़ें । प्रति जानवर एक aliquot का उपयोग करें । सभी एलिकोट्स को पहले से गर्म पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में रखें।
  5. स्टॉक सॉल्यूशन ई
    1. प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के दिन समाधान ई तैयार करें।
    2. तालिका 5 के अनुसार सभी घटकजोड़ें, डीएच2ओ के साथ 50 मीटर कुल मात्रा में भरें, और भंग करें। पीएच को 7.3 पर समायोजित करें।
    3. अलीकोट 50 मीटर ट्यूब में समाधान का 50 एमएल। समाधान ई में एल्बुमिन वी (0.65 ग्राम/50 मीटर) जोड़ें। प्रति पशु एक एलिकोट का उपयोग करें। सभी एलिकोट्स को पहले से गर्म पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में रखें।

2. कोलेजन सैंडविच की तैयारी

  1. प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव से एक दिन पहले, कोलेजन I सैंडविच की पहली परत तैयार करें।
    नोट: बर्फ पर काम करते हैं और कोलेजन I के अवांछित जेलेशन को कम करने के लिए पूर्व-ठंडा समाधान, सुझाव, प्लेटें और ट्यूब का उपयोग करें।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कोलेजन I (चूहे की पूंछ से) की आवश्यक मात्रा को बेअसर करें। प्रति प्रायोगिक नमूना (3.5 सेमी डिश) के प्रति निष्प्रभावी कोलेजन (1.5 मिलीग्राम/mL) के 100 माइक्रोन की मात्रा आवश्यक है। बेअसर कोलेजन (1.5 मिलीग्राम/mL) के 1 mL तैयार करने के लिए, 10x DMEM के 100 μL, 1M NaOH के 1.5 μL, और डीएच2ओ के 48.5 μL कोलेजन के 500 μL में जोड़ें (स्टॉक एकाग्रता = 3 मिलीग्राम/mL)। लिटमस पेपर के साथ बेअसर कोलेजन के पीएच की जांच करें (पीएच ~ 7.5 होना चाहिए)।
  3. बर्फ पर सेट 3.5 सेमी पकवान की सतह पर एक पूर्व ठंडा 200 μL टिप का उपयोग कर के बेअसर कोलेजन समाधान के 100 μL तितर-बितर।
  4. मानक संस्कृति की स्थिति के तहत रातोंरात इनक्यूबेट (37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ इनक्यूबेटर)। प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के दिन, पहले कोलेजन परत में पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस का 1 मिलील जोड़ें। कोलेजन को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए फिर से हाइड्रेट करने की अनुमति दें।

3. उपकरण स्थापित

  1. सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध सभी उपकरण तैयार करें और चित्र ा 1में दिखाए गए अनुसार स्थापित करें।

4. सर्जिकल प्रक्रिया

  1. तिल्टामाइन (शरीर का वजन 60 मिलीग्राम/किलो), ज़ोलाज़ेपम (60 मिलीग्राम/किलो), और जाइलाज़ीन (4.5 मिलीग्राम/किलो) के इंट्रामस्कुलर इंजेक्शन द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज़ करें। कई मिनट के बाद, अंगूठे चुटकी द्वारा उचित एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें। यदि जानवर चुटकी का जवाब नहीं देता है, तो 4.2 पर आगे बढ़ें।
  2. एक विच्छेदन चटाई पर एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें और माउस को एक असुंकी स्थिति में ठीक करने के लिए निचले और ऊपरी हिस्सों को टेप करें। 70% इथेनॉल के साथ पेट को झाड़ू दें और जघन क्षेत्र से सामने पैरों तक वी-आकार चीरा के साथ पेट खोलें। पेट की गुहा को उजागर करने के लिए त्वचा को छाती के ऊपर मोड़ें। विच्छेदन वाली चटाई को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
  3. इंसुलिन सिरिंज सुई (30 जी) को 45 डिग्री कोण पर मोड़ें। कौंडल दिशा में आंतों और कोलन को स्थानांतरित करके अवर वेना कावा (आईवीसी) को बेनकाब करें।
  4. कैनुला के साथ 2 मिलीएल सिरिंज में प्री-वार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) समाधान सी के 2.5 मिलील भरें। सुनिश्चित करें कि कैनुला या सिरिंज में कोई हवा बुलबुले नहीं हैं।
  5. आईवीसी के कैनुलेशन से पहले, जिगर के पालि को गीले (पीबीएस) सूती झाड़ू के साथ डायाफ्राम तक दबाकर फिर से स्थान दें। जिगर के ठीक नीचे आईवीसी के चारों ओर एक रेशम सीवन रखें(चित्रा 2ए, बी)।
  6. एक 45 डिग्री कोण पर झुका 30 जी सुई(चित्रा 2सी)के साथ एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर पोर्टल नस में हेपरिन (5000 यू/एमएल) के 10 μL इंजेक्ट करें।
  7. जिगर को कैन्युलेट करने के लिए, सीधे यकृत के बगल में आईवीसी (सीवन के नीचे) के लिए माइक्रोसर्जिकल कैंची के साथ एक छोटा सा चीरा बनाएं; चित्रा 2डी)जो कैनुला डालने के लिए काफी बड़ा है। टांके और दो सर्जिकल समुद्री मील(चित्रा 2ई)का उपयोग कर स्थिति में cannula सुरक्षित ।
  8. लिवर के विस्तार को रोकने के लिए परफ्यूजन बफ़र्स को लिवर से बाहर बहने की अनुमति देने के लिए पोर्टल नस(चित्रा 2एफ)को काट लें।
  9. मैन्युअल रूप से कैनुला से जुड़ी सिरिंज को धीरे-धीरे दबाकर पूर्व-गर्म समाधान सी के 1.5 एमएल के साथ यकृत को पर्फ्यूज करें (इसमें ~ 15 एस लेना चाहिए)। लिवर के मलिन होने से लिवर से खून निकालना अब देखा जा सकता है।
  10. प्री-वार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) समाधान सी के साथ एक पेरिस्टेलिट पंप को प्री-फिल करें। परफ्यूजन उपकरण की जांच करें और सुनिश्चित करें कि सिस्टम में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
  11. सावधानी से सिरिंज से कैनुला डिस्कनेक्ट करें और इसे 2.5 mL/min की प्रवाह दर पर चल रहे पेरिस्टेटिक पंप के ट्यूबिंग से जोड़ें। 2.5 mL/min की प्रवाह दर पर चल रहे पेरिस्टेलिटिक पंप के ट्यूबिंग से कनेक्ट करें। 2.5 mL/min की प्रवाह दर पर चल रहे पेरिस्टेलिटिक पंप के ट्यूबिंग से कनेक्ट करें। जल्दी लेकिन ध्यान से काम करें और यह सुनिश्चित करें कि कैनुला स्थिति में रहे और कोई बुलबुले ट्यूबिंग या कैनुला में प्रवेश न करें ।
  12. 2 मिन (समाधान सी के 5 एमएल) के लिए समाधान सी के साथ जिगर को पर्क्यूब। समाधान डी में बदलें और अतिरिक्त 10 मिन (समाधान डी के 25 mL) के लिए परफ्यूजन जारी रखें।
  13. एक बार लिवर को पर्फस करने के बाद उसे पेट की गुहा से निकाल दें। जिगर अब बहुत नाजुक और पीला रंग(चित्रा 3)होगा ।

5. प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का अलगाव

  1. माउस से जिगर निकालें। कैनुला अभी भी जिगर से बंधा होगा, इसलिए जिगर के साथ कैनुला उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें, और ध्यान से सभी प्रावरणी कनेक्शन काट दिया। जिगर को 50 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें जिसमें पूर्व-गर्म समाधान ई का 20 एमएल हो।
  2. संदंश का उपयोग कर जिगर के साथ कैनुला पकड़ो और ट्यूब की दीवार के चारों ओर जिगर रगड़ द्वारा ऊतक असंबद्ध बफर में अलग हेपेटोसाइट्स हस्तांतरण करने के लिए । इक्का-दुक्का कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
    नोट: अलग प्राथमिक हेपेटोसाइट्स बर्फ पर रखा, जबकि कई घंटे के लिए व्यवहार्य हैं । उपयोगकर्ता आवश्यक होने पर, या अगले चरण में आगे बढ़ते हुए, किसी अन्य दाता माउस से प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को अलग करने वाले 5.2 के माध्यम से चरण 4.1 दोहरा सकते हैं।
  3. 50 मिलीआर ट्यूब के ऊपर 70 माइक्रोन नायलॉन सेल छलनी रखें और अलग-अलग कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।
  4. 50 x ग्राम और 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। मृत कोशिकाओं को हटाने और व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि करने के लिए, DMEM में 40% percol के 20 mL में गोली को फिर से निलंबित करें।
  5. 5 0 x ग्राम और 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। 20 मीटर में गोली को मृत कोशिकाओं वाले अधिएत्पाय और समाधान ई के 20 मीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. 50 x ग्राम और 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। 10 मीटर समाधान ई में पैलेट को फिर से निलंबित करें।
  7. ट्राइपैन ब्लू धुंधला का उपयोग करके प्राथमिक हेपेटोसाइट उपज और व्यवहार्यता की जांच करें। एक Neubauer सेल गिनती कक्ष का उपयोग कर सेल संख्या गिनती और ३.७५ x १०५ व्यवहार्य कोशिकाओं/mL करने के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें । कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।

6. 3डी कोलेजन सैंडविच में प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की खेती

  1. हेपेटोसाइट कल्चर मीडियम (एचसीएम) तैयार करें। ग्लूकागन (1 मिलीग्राम/एमएल), हाइड्रोकॉर्टिसोन के 15 माइक्रोन (50 मिलीग्राम/mL) के 15 माइक्रोन और 40 माइक्रोन इंसुलिन (10 मिलीग्राम/mL) को पूर्ण माध्यम (डीएमईएम, उच्च ग्लूकोज, 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन) के 50 मिलीएल में जोड़ें।
  2. समान रूप से एक पूर्व लेपित ३.५ सेमी पकवान में व्यवहार्य प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के 2 mL (5 x १०५ कोशिकाओं/mL) तितर-बितर । 3 घंटे महत्वपूर्ण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें: समान रूप से इनक्यूबेटर में पकवान डालने से पहले सभी दिशाओं में पकवान झुकाव द्वारा कोशिकाओं को वितरित करें।
  3. बेअसर कोलेजन I (100 μL/3.5 सेमी डिश; यानी, ऊपर वर्णित सभी व्यंजनों के लिए पर्याप्त मात्रा [चरण 2.1]) तैयार करें। उपयोग तक बर्फ पर रखें।
  4. 3 घंटे के बाद, ध्यान से मध्यम और असंबद्ध कोशिकाओं को हटा दें और कोशिकाओं पर कोलेजन सैंडविच की शीर्ष परत बनाने के लिए प्रत्येक 3.5 सेमी पकवान में बेअसर कोलेजन I के 100 माइक्रोन जोड़ें। 1 घंटे के लिए मानक सेल-संस्कृति स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2) के तहत कोलेजन सैंडविच को इनक्यूबेट करें। 1 घंटे के ऊष्मायन के बाद, ध्यान से एचसीएम का 2 एलएल जोड़ें।
  5. संस्कृति के 24 घंटे के बाद, एक नए सिरे से एक के लिए HCM माध्यम बदल जाते हैं ।
  6. पित्त कैनालकुली के गठन के आधार पर 3-8 दिनों के लिए संस्कृति। माइक्रोस्कोप(चित्रा 4)के तहत हर दिन संस्कृति की जांच करें। हर दूसरे दिन एचसीएम बदलें।

7. 3डी कोलेजन सैंडविच में प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की इम्यूनोलेबलिंग

  1. हेपेटोसाइट सैंडविच से मीडिया को हटा दें, फिर पूर्व-गरम पीबीएस के साथ ध्यान से धोएं। कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 न्यूनतम के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 1 मिलील के साथ सैंडविच संस्कृतियों को ठीक करें।
  2. निर्धारण के बाद, पीबीएस + 0.1% ट्वीन 20 (पीबीएस-टी) के 2 एमएल में 10 मिन के लिए सैंडविच 3x धोएं।
  3. 0.1 एम ग्लाइसिन के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं परमीबिलाइज, 0.2% ट्राइटन एक्स-100 पीबीएस में 1 घंटे के लिए आरटी पर पीबीएस में 3x पीबीएस-टी में 10 min के लिए धोएं।
  4. पर्याप्त एंटीबॉडी प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए वैक्यूम आकांक्षा से जुड़े 10 माइक्रोन लोडिंग टिप का उपयोग करके कोलेजन की शीर्ष परत को धीरे से परेशान करें।
  5. पीबीएस-टी में 5% बीएसए के 1 mL के साथ ब्लॉक (यानी, अवरुद्ध समाधान) 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर समाधान अवरुद्ध करने में पतला। पीबीएस-टी में 15 मिन के लिए 3x धोएं ।
  6. धोने के बाद, पीबीएस-टी में 15 मीटर के लिए 3x धोने के लिए 3x धोने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट और आसुत एच2ओ के साथ 1x धोने के बाद ।
  7. माइक्रोस्कोपी के लिए एंटी-फीका बढ़ते मीडिया (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ माउंट करें।

Representative Results

माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को अलग-थलग कर दिया गया था और 3 डी कोलेजन सैंडविच में वरीयता प्राप्त थी। दो आसन्न कोशिकाओं के बीच पित्त कैनालिकली सीडिंग के बाद कई घंटों के भीतर बनने लगे। कोशिकाओं ने 1 दिन के भीतर पित्त कैनालकुली के लगभग नियमित नेटवर्क में समूहों और स्वयं-संगठित समूहों का गठन किया(चित्र4)। 3-6 दिनों के भीतर, 5-10 कोशिकाओं के समूहआमतौर पर देखे जाते थे, जिसमें पूरी तरह से ध्रुवीकृत हेपेटोसाइट्स एक कंएलिकुलर नेटवर्क बनाते थे(चित्र4)।

3डी कोलेजन सैंडविच में प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स का उपचार या तो टॉक्सिन (इथेनॉल) या साइटोस्केलेटन-फेरबदल दवाओं (जैसे, ब्लेबिस्टटिन, ओकाडिक एसिड) के परिणामस्वरूप हेपेटोसाइट साइटोस्केलेटन, कैनालकुली चौड़ाई, आकार और पित्त कैनालकुली की संख्या में परिवर्तन हुआ, जो एंटीबॉडी के साथ केराटिन 8 (हेपेटोसाइट्स में सबसे प्रचुर मात्रा में केराटिन), फलोलाइडिन (एफ-ऐक्टिन की कल्पना करना), और एंटीबॉडी से तंग जंक्शन प्रोटीन ज़ोनुला ऑक्सीलेन्स-1 (जेडओबी-1; चित्रा 5)।

इथेनॉल उपचार का केराटिन 8 के संगठन पर केवल हल्का प्रभाव पड़ा; हालांकि, इसने कष्टकोसता में वृद्धि की (जैसा कि एफ-ऐक्टिन धुंधला से देखा गया है) और पित्त कैनालिकुलर चौड़ाई(चित्रा 5)का वितरण। एनएएलएएल उपचार के बाद तंग जंक्शनों के नुकसान का सुझाव देते हुए, अनुपचारित नियंत्रणों की तुलना में इथेनॉल-इलाज पित्त कैनालकुली में ZO-1 धुंधला की संकेत तीव्रता में कमी आई थी। ब्लेबिस्टिन के साथ एटोमाइओसिन संकुचन के अवरोध ने पित्त कैनालकुली के आकार और संख्या को काफी प्रभावित किया। नियमित कैनालिकुलर नेटवर्क को अनुपचारित हेपेटोसाइट्स की तुलना में पुनर्गठित किया गया था, अव्यवस्थित आकार के पित्त कैनालकुली में पतली लंबे लोगों के बजाय मोटी गोल पित्त कैनालकुली की बढ़ी हुई घटनाओं के साथ (जैसा कि कैनेकुलर चौड़ाई के हिस्टोग्राम में देखा गया है)।

इसके अतिरिक्त, ओकाडिक एसिड (ओए) के साथ उपचार फॉस्फेटानेस को बाधित करने से केराटिन के भौतिक गुणों को दृढ़ता से प्रभावित किया गया, जैसा कि पहले8,17दिखाया गया था। ओए केराटिन फिलामेंट्स की घुलनशीलता को बदलता है; इस प्रकार, उपचार के परिणामस्वरूप केराटिन मेश्वर्क का गहरा पुनर्गठन हुआ, जो बड़े पेरिन्यूक्लियर समुचेश में ढह गया। एफ-ऐक्टिन और टाइट जंक्शन प्रोटीन जेडओ-1 दोनों को किसी विशेष संरचनाओं में स्थानीयकृत नहीं किया गया था, जिसमें संगठित पित्त कैनालकुली के लगभग पूर्ण गायब होने और हेपेटोसाइट ध्रुवीकरण का पूरा नुकसान होने का सुझाव दिया गया था। शेष पित्त कैनालकुली को अनुपचारित नियंत्रणों की तुलना में काफी संकुचित किया गया था, जैसा कि कैनाकुलर चौड़ाई हिस्टोग्राम(चित्रा 5)में देखा गया था।

उपचार के लिए हेपेटोशिलर बायोकेमिकल प्रतिक्रिया के साथ हेपेटोसाइट साइटोस्केलेटन में परिवर्तनों की सूक्ष्म टिप्पणियों को सहसंबंधित करने के लिए, प्रोटोकॉल ने 3डी कोलेजन सैंडविच(चित्र6)से अधिनेत में एलेनिन अमीनोट्रांसफर (एएलटी) और एस्पार्टेट ट्रांसमिनेस (एसीटी) (दो यकृत एंजाइमों के स्तर को भी मापा जो आमतौर पर हेपेटोसेलुलर इंजरी मार्कर के रूप में उपयोग किए जाते हैं) इथेनॉल उपचार ने एएलटी और एसीटी दोनों के स्तर को काफी ऊंचा किया, जिससे गंभीर हेपेटोसेलुलर चोट का सुझाव दिया गया। ब्लेबिस्टिन उपचार ने ओकाडिक एसिड उपचार की तुलना में एएलटी और एएसटी दोनों स्तरों में कोई महत्वता परिवर्तन नहीं किया, जिससे एएलटी के बढ़े हुए स्तरों के साथ हल्के जैव रासायनिक परिवर्तन शुरू हुए, लेकिन एएसटी के स्तर में कोई परिवर्तन नहीं हुआ। इस प्रकार, हेपेटोसाइट सुपरनाटेंट से विट्रो में मापी गई हेपेटोसेलुलर चोट के जैव रासायनिक मार्कर इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा देखे गए साइटोस्केलेटल परिवर्तनों से संबंधित हैं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक सेट अप। (क)माउस एक असुप स्थिति में तय, सर्जरी से पहले एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत रखा गया है । आवश्यक सभी सर्जिकल उपकरणों को एक ट्रे पर रखा जाता है। (ख)माउस लिवर परफ्यूजन के दौरान परफ्यूजन सुइट जिसमें जलाशय को गर्म बफर और परफ्यूज ्डमाउस से जोड़ने वाले सिलिकॉन ट्यूबिंग को दिखाया गया है । (ग)बी का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आईवीसी के पेट गुहा और कैनुलेशन का उद्घाटन। पेट को जघन क्षेत्र से सामने पैरों तक वी-आकार चीरा के साथ खोला जाता है। पेट की गुहा को बेनकाब करने और बड़ा करने के लिए त्वचा छाती पर मुड़ी हुई है। आईवीसी को बेनकाब करने के लिए, आंतों और पेट को ध्यान से स्थानांतरित कर दिया जाता है। (ए, बी) आईवीसी के कैनुलेशन से पहले, जिगर के पालि को पीबीएस-गीले कपास झाड़ू के साथ डायाफ्राम के ऊपर की ओर दबाकर फिर से तैनात किया जाना चाहिए। आईवीसी तो ध्यान से आसपास के ऊतकों से अलग है, और एक रेशम सीवन जिगर के करीब निकटता में आईवीसी के आसपास रखा गया है । पैनल बी पैनल ए में दिखाए गए पेट गुहा की योजनाबद्ध का प्रतिनिधित्व करता है। जिगर की पालि, आंत, अवर वेना कावा (आईवीसी, लाल), और टांके इंगित किए जाते हैं। (C)हेपरिन को पोर्टल नस (पीवी, तीर) में इंसुलिन सिरिंज (30 जी सुई 45 डिग्री कोण पर झुका हुआ) के साथ इंजेक्ट किया जाता है। (D)जिगर को कैन्युलेट करने के लिए, आईवीसी सीधे जिगर के बगल में (सीवन के नीचे) छेदित किया जाता है। (ई)कैनुला डाला जाता है और दो सर्जिकल समुद्री मील बांधने से टांके के साथ सुरक्षित है। (एफ)मुक्त बफर बहिर्वाह की अनुमति देने के लिए पोर्टल नस पूरी तरह से कट जाती है, जिससे जिगर के विस्तार को रोका जा सके । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिेध जिगर छवियों से पहले और perfusion के बाद । (ए, बी) कैन्नुलेटेड जिगर को 2.5 एमएल/मिन की प्रवाह दर पर 12 मिन के लिए पुन: काट दिया गया था और इसका उपयोग किया गया था। ताजा पुनर्काशिक यकृत (ए) की तुलना में परफ्यूजन (बी) के बाद काफी फीका जिगर नोट करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स की 3 डी कोलेजन सैंडविच संस्कृति। माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां 1, 2 और 3 डी स्थितियों में 3 दिनों के लिए सुसंस्कृत हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अत्यधिक संगठित कोशिकाओं के बड़े समूह संस्कृति में 3 दिनों के बाद बनते हैं। बॉक्स्ड क्षेत्र ~ 3x बढ़ाया छवियां दिखाते हैं। एरोहेड ्सीकैनेली का संकेत देते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: इम्यूनोफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा विषाक्त तनाव के लिए रूपात्मक प्रतिक्रिया का मूल्यांकन। 3 डी कोलेजन सैंडविच में सुसंस्कृत प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स को संस्कृति के तीसरे दिन विषाक्त पदार्थों (इथेनॉल, ब्लेबिस्टिन, या ओकाडिक एसिड) के साथ इलाज किया गया था। फिक्स्ड कोशिकाओं को साइटोस्केलेटल घटकों की कल्पना करने के लिए दाग दिया गया था: केराटिन 8 (हरा), एफ-ऐक्टिन (लाल), और ज़ोनुला ऑक्लुडेन्स-1 (जेडओ-1, मजेंटा) प्रतिकार द्वारा। विषाक्त उपचार ने दृश्य साइटोस्केलेटल घटकों के विघटन का नेतृत्व किया, और इसने संख्या को कम कर दिया और पित्त कैनालकुली की कछुआ वृद्धि की। कैनाकुलर चौड़ाई दोनों अनुपचारित और इलाज हेपेटोसाइट्स में मापा गया था और चौड़ाई वितरण के हिस्टोग्राम के रूप में चित्रित किया गया है। एरोहेड ्सीकैनेली का संकेत देते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: विट्रो में विषाक्त चोट के लिए 3 डी हेपेटोसाइट कोलेजन सैंडविच की प्रतिक्रिया का जैव रासायनिक विश्लेषण। एएलटी और एएसटी, हेपेटोसेलुलर चोट के अच्छी तरह से स्थापित मार्कर, विषाक्त पदार्थों (इथेनॉल, ब्लेबिस्टिन, और ओकाडिक एसिड) के साथ इलाज किए गए 3डी हेपेटोसाइट कोलेजन सैंडविच से सुपरनेटेंट में मापा गया था। एएलटी और एएसटी को अनुपचारित लोगों की तुलना में इलाज कोशिकाओं में ऊंचा किया गया था। डेटा अंकगणित का मतलब ± SEM के रूप में सूचित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

स्टॉक सॉल्यूशन ए (10x)
अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता (जी/लीटर)
Nacl 80
केसीएल 4
एमजीएसओ4·7H2O 1.97
ना2एचबीओ4·2H2O 0.598
KH2पीओ4 0.6

तालिका 1: स्टॉक समाधान एक नुस्खा।

स्टॉक सॉल्यूशन बी (10x)
अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता (जी/लीटर)
Nacl 69
केसीएल 3.6
KH2पीओ4 1.30
एमजीएसओ4·7H2O 2.94
सीएसीएल2 2.772

तालिका 2: स्टॉक सॉल्यूशन बी नुस्खा।

समाधान सी
अभिकर्मक
स्टॉक सॉल्यूशन ए (10x) 5 लाख
नाहको3 0.1094 ग्राम
ईटीए 0.0095 ग्राम
डीएच2ओ 50 लाख तक

तालिका 3: स्टॉक समाधान सी नुस्खा।

समाधान डी
अभिकर्मक
स्टॉक सॉल्यूशन ए (10x) 3 एल
नाहको3 0.065 ग्राम
सीएसीएल2 0.0125 ग्राम
डीएच2ओ 30 मीटर तक

तालिका 4: स्टॉक समाधान डी नुस्खा।

समाधान ई
अभिकर्मक
स्टॉक सॉल्यूशन बी (10x) 5 लाख
नाहको3 0.1 ग्राम
ग्लूकोज 0.045 ग्राम
डीएच2ओ 50 लाख तक

तालिका 5: स्टॉक समाधान ई नुस्खा।

Discussion

माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट संस्कृतियों का उपयोग इन विट्रो अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण है ताकि हेपेटोसाइट ध्रुवीकरण, उचित कंकैलिकुलर संरचना गठन और पित्त स्राव की स्थापना में शामिल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझा जा सके। 2 डी संस्कृति में माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की अलगाव और दीर्घकालिक संस्कृति में चुनौतियों ने कई तकनीकी दृष्टिकोणों के आविष्कार को प्रेरित किया है, जिसमें अलगाव की प्रभावऔर अलग-थलग कोशिकाओं की दीर्घायु होती है, प्रत्येक कई फायदे के साथ और नुकसान. अब यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की 2डी संस्कृतियां थोड़े समय के लिए यकृत जीव विज्ञान के गुणों की केवल सीमित संख्या की नकल करती हैं। इस प्रकार, कोलेजन सैंडविच व्यवस्था में 3 डी की खेती व्यापक रूप से 2डी स्थितियों की जगह ले रही है, खासकर जब यकृत जीव विज्ञान में साइटोस्केलेटन के कार्य पर ध्यान केंद्रित किया जाता है (उदाहरण के लिए, विषाक्त दवा प्रभाव या पित्त परिवहन का स्थानिक संगठन)।

1 9 80 के दशक से, विभिन्न संशोधनों के साथ माउस हेपेटोसाइट्स के अलगाव के लिए कई प्रोटोकॉल वर्णित किए गए हैं। दो कदम कोलेजेनेज़ परफ्यूजन दृष्टिकोण व्यापक रूप से कई प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है । आइसोलेशन प्रोटोकॉल में ढाल केंद्रीकरण के अलावा मृत कोशिकाओं को हटाने की अनुमति देताहै 19,20 और काफी व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है (यहां, नियमित रूप से ~93%)। हालांकि यह कदम कोशिकाओं के हैंडलिंग समय और कम सेल संख्या21में परिणाम बढ़ाता है, इस कदम को उचित पित्त कैनालिकुलर नेटवर्क गठन के लिए 3 डी कोलेजन सैंडविच संस्कृति में आवश्यक के रूप में देखा जाता है। इसके अतिरिक्त, परफ्यूजन चरणों के दौरान जल्दी और सटीक रूप से आगे बढ़ना अधिक महत्वपूर्ण है, जो कोशिकाओं को संभालने के समय को छोटा करता है।

कोशिकाओं की व्यवहार्यता बढ़ाने वाले अन्य महत्वपूर्ण कारक और 3 डी में कंएलिकुलर नेटवर्क बनाने की उनकी क्षमता ताजा तैयार समाधानों और परफ्यूजन के दौरान बुलबुले से बचने का उपयोग है। इसलिए, माउस हेपेटोसाइट अलगाव के दिन समाधान तैयार किए जाने चाहिए, और समाधान बदलते समय पेरिस्टैटिक पंप और ट्यूबिंग की जांच की जानी चाहिए। यदि प्रोटोकॉल का बारीकी से पालन किया जाता है, तो प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का अलगाव व्यवहार्य कोशिकाओं की उच्च उपज के साथ सफल होना चाहिए।

दीर्घकालिक 3 डी हेपेटोसाइट संस्कृति में एक और महत्वपूर्ण कारक प्राथमिक हेपेटोसाइट का प्रारंभिक स्रोत है जिसका उपयोग किया जाता है। 8-12 सप्ताह पुराने जानवरों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, जो हेपेटोसाइट्स के इष्टतम दानदाताओं के रूप में काम करते हैं। पुराने जानवरों से हेपेटोसाइट्स का उपयोग दीर्घकालिक संस्कृति में उतना सफल नहीं था, क्योंकि इन हेपेटोसाइट्स ने अपनी आकृति विज्ञान को अधिक बार बदल दिया, ध्रुवीकृत किया, और कैनालिकुलर नेटवर्क बनाना बंद कर दिया। इसके अलावा, अपेक्षाकृत अत्यधिक केंद्रित समाधान से गठित ठीक से निष्प्रभावी कोलेजन जेल पर हेपेटोसाइट्स चढ़ाना एक महत्वपूर्ण कदम है। अधिकांश प्रोटोकॉल में, लगभग 1 मिलीग्राम/mL की सांद्रता का उपयोग किया जाता है। कई अनुकूलन के बाद, 1.5 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता दीर्घकालिक हेपेटोसाइट खेती के लिए इष्टतम है और गठित पित्त कैनिकुली के साथ अत्यधिक संगठित हेपेटोसाइट प्रदान करती है।

यह आसान-से-पालन प्रोटोकॉल प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स की दीर्घकालिक खेती की अनुमति देता है। प्रतिनिधि परिणाम पित्त कैनालकुली गठन में साइटोस्केलेटल घटकों की भूमिका का अध्ययन करते समय 3डी सुसंस्कृत प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स के लिए उपयोग का एक व्यापक स्पेक्ट्रम प्रदर्शित करते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को चेक गणराज्य की ग्रांट एजेंसी (18-02699S) ने समर्थन दिया; चेक गणराज्य के स्वास्थ्य मंत्रालय की अनुदान एजेंसी (17-31538A); चेक एकेडमी ऑफ साइंसेज (आरवीओ 68378050) और एमवाईएस सीआर परियोजनाओं (LQ1604 एनपीयू II) की संस्थागत अनुसंधान परियोजना, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395, और OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/0.0/0.0.0/16_013/0001775); चार्ल्स विश्वविद्यालय (के.के. को व्यक्तिगत वजीफा), और एक परिचालन कार्यक्रम प्राग-प्रतिस्पर्धा परियोजना (CZ.2.16/3.1.00/21547) । हम प्रस्तुत माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ समर्थन के लिए लाइट माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा, आईएमजी कैस, प्राग, चेक गणराज्य (समर्थित एमवाईएस सीआर परियोजनाओं LM2015062 और LO1419) को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm TC-treated culture dish Corning 430165
50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance VWR 525-0156
70 µm nylon cell strainer Biologix 15-1070
Albumin Fraction V ROTH 8076.4
Arteriotomy Cannula (1mm) Medtronic 31001
Calcium Chloride Sigma-Aldrich P5655
Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) Corning 354249
Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) Sigma-Aldrich C5138
D(+) glucose monohydrate ROTH 6780.1
Dissecting microscope Zeiss Stemi 508
DMEM, high glucose Sigma-Aldrich D6429
EGTA ROTH 3054.2
FBS Gibco 10270-106
Glucagon Sigma-Aldrich G-2044
Glycine Pufferan G 05104
Heparin (5000 U/mL) Zentiva 8594739026131
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888
Insulin Sigma-Aldrich I9278
Insulin syringe (30G) BD Medical 320829
Magnesium Sulphate Heptahydrate ROTH T888.1
microsurgical forceps FST 11252-20
microsurgical forceps FST 11251-35
microsurgical scissor FST 15025-10
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Percoll Sigma-Aldrich P1644
Peristaltic Pump Minipuls Evolution Gilson F110701, F110705
Potassium Chloride ROTH 6781.1
Potassium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fischer Scientific P10144
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5810 R
Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 VWR 630-2124
Silk braided black Chirmax EP 0.5 – USP 7/0
Sodium Chloride ROTH 3957.1
Sodium Hydrogen Carbonate Sigma-Aldrich 30435
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate Sigma-Aldrich 30435
Syringe 2 ml Chirana CH002L
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Water bath Nuve NB 9
Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm Sigma-Aldrich WHA7402004
Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 GE Healthcare Life Sciences 2629-990
Zoletil Vibrac VET00083

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References

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जीव विज्ञान अंक 154 प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव 3 डी कोलेजन सैंडविच संस्कृति पित्त कैनालिकुलस साइटोस्केलेटन इम्यूनोलेबलिंग हेपेटोसेलुलर चोट
विट्रो में पित्त कैनेलिकुलर गठन में साइटोस्केलेटन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स की अलगाव और 3 डी कोलेजन सैंडविच संस्कृति
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Korelova, K., Jirouskova, M.,… More

Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro. J. Vis. Exp. (154), e60507, doi:10.3791/60507 (2019).

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