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Cancer Research

Producción de virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título a partir de líquido alantoico

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/63817
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathobiology, University of Guelph

Summary

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción, purificación y cuantificación del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título. Este protocolo produce consistentemente > 6 × 109 unidades formadoras de placa/ml, proporcionando cantidades de virus apropiadas para estudios in vivo en animales. Se describen ensayos de control de calidad adicionales para garantizar la seguridad in vivo .

Abstract

El virus de la enfermedad de Newcastle (VEN), también conocido como serotipo 1 del ortoavulavirus aviar, es un virus de ARN monocatenario de sentido negativo que se ha desarrollado como un virus oncolítico y una vacuna vectorizada viralmente. El VEN es un agente terapéutico y profiláctico atractivo debido a su sistema genético inverso bien establecido, potentes propiedades inmunoestimulantes y excelente perfil de seguridad. Cuando se administra como un virus oncolítico o una vacuna vectorizada viralmente, el VEN provoca una respuesta inmune antitumoral o antígeno robusta, activando los brazos innato y adaptativo del sistema inmunitario.

Dadas estas características deseables, el VEN ha sido evaluado en numerosos ensayos clínicos y es uno de los virus oncolíticos mejor estudiados. Actualmente, hay dos ensayos clínicos registrados que involucran el VEN: uno que evalúa una vacuna recombinante vectorizada por el VEN para el SARS-CoV-2 (NCT04871737), y un segundo que evalúa un NDV recombinante que codifica la interleucina-12 en combinación con Durvalumab, un anticuerpo antiPD-L1 (NCT04613492). Para facilitar un mayor avance de este vector viral altamente prometedor, se necesitan métodos simplificados para generar UN VEN (rNDV) recombinante de alto título, de grado in vivo.

Este documento describe un procedimiento detallado para amplificar el rNDV en huevos de gallina embrionados libres de patógenos especificados (SPF) y purificar el rNDV a partir de líquido alantoico, con mejoras para reducir la pérdida durante la purificación. También se incluyen descripciones de los ensayos de control de calidad recomendados, que deben realizarse para confirmar la falta de contaminantes y la integridad del virus. En general, este procedimiento detallado permite la síntesis, purificación y almacenamiento de VEN de alto título, de grado in vivo, recombinante, lentogénico y mesogénico para su uso en estudios preclínicos.

Introduction

El virus de la enfermedad de Newcastle, también conocido como ortoavulavirus aviar-1, es un paramixovirus aviar envuelto con el potencial de ser utilizado como un virus oncolítico o una vacuna vectorizada viral 1,2,3,4,5,6,7. Más recientemente, el VEN diseñado para expresar la proteína espiga del SARS-CoV-2 se ha caracterizado como una vacuna intranasal efectiva en modelosde desafío de ratón y hámster 7,8,9. Cuando se usa como inmunoterapia contra el cáncer, resulta en el reclutamiento de células inmunes innatas, específicamente células asesinas naturales, producción de interferón tipo I y la generación de células T antitumorales específicas 10,11,12,13. Además de estas potentes propiedades inmunoestimulantes, el VEN tiene un fuerte perfil de seguridad y un sistema de genética inversa bien establecido14,15. Estas características deseables han impulsado la evaluación del VEN en numerosos ensayos clínicos preclínicos y humanos (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Para avanzar aún más en este vector viral inmunoestimulador altamente prometedor, se necesitan métodos detallados para producir y purificar el VEN ultrapuro de alto título que se puede administrar de manera segura in vivo.

Como el VEN es un paramixovirus aviar, se amplifica con mayor frecuencia en los huevos de gallina embrionados. Si bien existen sistemas basados en células disponibles para propagar el VEN, la mayoría no ha podido producir títulos similares a los logrados en los huevos de gallina embrionados18. Sin embargo, existen algunos inconvenientes en la producción de VEN en los huevos, incluido el hecho de que la producción a base de huevos es larga y no fácilmente escalable, el abastecimiento de grandes cantidades de huevos de gallina SPF puede ser problemático, y existe el potencial de contaminación con alérgenos de huevo 13,18,19,20 . Recientemente, un grupo ha demostrado que las células Vero cultivadas en suspensión en medio libre de suero pueden soportar la replicación del VEN a títulos comparables a los logrados en los óvulos, antes de la purificación21. Sin embargo, esto requirió el paso en serie del virus para adaptar el virus a las células Vero, y la optimización de un método para purificar el VEN de las células Vero en suspensión todavía se requiere21.

Como se destacó anteriormente, los métodos utilizados para purificar el virus de alto título e in vivo varían según el virus en cuestión22. Existe un sistema de genética inversa bien establecido disponible para la generación de VEN recombinante. Este proceso, que implica el uso de un clon de ADNc, plásmidos ayudantes y un virus ayudante que expresa ARN polimerasa T7, ha sido descrito previamente en detalle15,23. Este protocolo se puede aplicar al VEN lentogénico o mesogénico. El virus descrito en este protocolo es un NDV mesogénico recombinante que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) de la medusa Aequorea victoria insertada entre los genes virales P y M como una unidad de transcripción individual, ya que este ha sido descrito previamente como el sitio óptimo para la inserción de transgenes extraños24.

Los métodos cerrados describen la purificación del VEN en función de su tamaño, que varía de 100 a 500 nm, y su densidad15. Esto ha permitido la generación de existencias de VEN de alto título de grado in vivo en aproximadamente 3 semanas, desde que se reciben los huevos hasta que se tienen un título final. Se describen las técnicas utilizadas con frecuencia en la producción a gran escala de virus a base de huevos, como la filtración de flujo tangencial, la filtración de profundidad y la ultracentrifugación por gradiente de densidad, lo que permite la traducción de estos métodos a una producción a mayor escala. Las técnicas descritas anteriormente para la purificación del VEN se han mejorado mediante la incorporación de un tampón estabilizador de virus, el uso de iodixanol durante la ultracentrifugación del gradiente de densidad y la descripción de diversas medidas de control de calidad para garantizar la calidad de grado in vivo 15. Esto ha permitido que la purificación del VEN de grado in vivo alcance títulos tan altos como 3 × 1010 PFU / ml de 0.8 a 1.0 L de líquido alantoico.

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Protocol

Todo el trabajo que involucra el uso de animales fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Guelph de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Todo el trabajo se realiza en un laboratorio de Nivel 2 de Bioseguridad (BSL2) en Canadá, donde el VEN mesogénico es un patógeno del grupo de riesgo 2. Todos los pasos involucrados en la amplificación y purificación del VEN deben realizarse en un gabinete de seguridad biológica Tipo IIA para fines de seguridad y esterilidad.

1. Amplificación del VEN utilizando huevos de gallina embrionados libres de patógenos especificados

  1. Inoculación de huevos de gallina embrionados con SPF
    NOTA: Por lo general, ocho docenas de huevos de gallina embrionados con SPF se utilizan para generar un lote de NDV de grado in vivo. Ordene una o dos docenas de huevos adicionales para tener en cuenta los daños durante el envío, así como la variabilidad en la viabilidad. Los huevos de gallina embrionados son material biológico y deben manipularse de acuerdo con las directrices institucionales. Sin embargo, dado que los embriones no nacen, no se requiere la aprobación del Comité de Cuidado Animal institucional.
    1. Después de recibir huevos de gallina embrionados SPF, incubar en una incubadora de huevos a 37 ° C, 60% de humedad durante 9 días. Asegúrese de que la incubadora esté configurada para balancear / rotar automáticamente los huevos cada hora.
      NOTA: Los huevos se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta 24 h o 4 °C durante un máximo de 72 h; sin embargo, esto puede disminuir la viabilidad del embrión.
    2. Después de 8-11 días de incubación (idealmente el día 9), incite los huevos para determinar la viabilidad del embrión. Busque vasculatura similar a una red (Figura 1A) y movimiento embrionario como indicadores de embriones viables. Deseche los huevos que carezcan de estas características (Figura 1B).
    3. En los óvulos viables, marque la interfaz entre el saco de aire y el embrión a lápiz con una 'X' (Figura 1A). Asegúrese de que este sitio de inyección no cause perforación de la vasculatura. Devuelva los huevos marcados a la incubadora mientras se prepara el inóculo.
    4. Calcule la cantidad de virus requerida para inyectar todos los huevos de gallina embrionados SPF. Asegúrese de que cada óvulo reciba 100 PFU de virus en un volumen de 100 μL; diluir el virus en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 1 × 103 PFU/ml. Prepare un 20% adicional del inóculo para tener en cuenta las imprecisiones en la administración del virus.
    5. Usando una toallita antiestática, limpie la parte superior de los huevos marcados con una solución de yodo al 10%, diluida en etanol al 70%. Espere aproximadamente 1-2 minutos para que la solución se seque.
    6. Perfore cuidadosamente la cáscara con un par de pinzas afiladas estériles. Desinfectar las pinzas en etanol al 70% entre los huevos.
    7. Utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja de 25 G, inyectar 100 μL del inóculo preparado en el paso 1.1.4 en la cavidad corioalantoica (Figura 1C). Acércate con la aguja en un ángulo de casi 90° al huevo. Inserte la aguja justo en la parte superior de la membrana corioalantoica.
    8. Después de la inoculación, use esmalte de uñas para cubrir el sitio de punción y devuelva los huevos a la incubadora. Asegúrese de que el ajuste del balanceo esté ENCENDIDO hasta las 24 horas posteriores a la inoculación.
    9. Comprobar la viabilidad del huevo 24 h después de la inoculación. Descartar óvulos muertos que carezcan de vasculatura en la membrana corioalantoica y movimiento embrionario (Figura 1B).
      NOTA: Estos óvulos han muerto debido al proceso de inoculación y no por el VEN.
    10. Devuelva los huevos a la incubadora, con el balancín apagado para evitar la contaminación del líquido alantoico con proteínas de huevo.
    11. Compruebe los huevos cada 12-24 h como se describe en el paso 1.1.9 para identificar los huevos muertos. Mueva los óvulos que mueren después de 24 horas después de la inoculación a 4 ° C para minimizar la autólisis. Cosechar el líquido alantoico dentro de las 2-12 h posteriores al enfriamiento.
    12. Incubar los huevos durante al menos 72 h.
      NOTA: Si se propaga una cepa mesogénica de NDV, el tiempo óptimo de incubación es de 60-72 h, ya que los tiempos de incubación prolongados pueden afectar el proceso de purificación debido a la claridad reducida del líquido alantoico. Este problema no es tan importante cuando se propagan cepas lentogénicas del VEN, ya que tardan mucho más en matar al embrión.
    13. Después del período de incubación apropiado, mueva los huevos restantes a 4 ° C durante 2-12 h antes de cosechar el líquido alantoico.
  2. Recolección de líquido alantoico que contiene VEN
    1. Mueva los huevos refrigerados al gabinete de bioseguridad. Limpia la parte superior de los huevos con etanol al 70%.
    2. Use pinzas estériles y tijeras quirúrgicas para abrir el lado apical del huevo donde se encuentra el saco de aire.
    3. Retire la cáscara para revelar la membrana corioalantoica (Figura 1D).
    4. Perfore cuidadosamente la membrana y péguela hacia atrás para exponer la cavidad alantoica (Figura 1E). Asegúrese de que el saco vitelino no se perfore accidentalmente, ya que esto estropeará el huevo.
    5. Use fórceps contundentes para agarrar el embrión y abrir el saco embrionario.
      NOTA: El líquido dentro del saco embrionario también contiene VEN.
    6. Deprimir el embrión con los fórceps y recoger el líquido alantoico utilizando una pipeta serológica de 10 ml.
    7. Guarde el líquido alantoico en hielo en tubos cónicos de 15 ml hasta su clarificación.
      NOTA: Si el líquido alantoico es amarillo, el saco vitelino se ha visto comprometido y el líquido alantoico debe desecharse.
    8. Centrifugar los tubos cónicos que contienen el líquido alantoico a 1.500 × g durante 10 min a 4 °C.
    9. Punto de pausa: Alícuota el líquido alantoico clarificado en tubos cónicos de 50 ml y guárdelos a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo (por ejemplo, semanas o meses), complementando el líquido con sacarosa a una concentración final del 5% para proteger el virus de los duros efectos de la congelación-descongelación. Alternativamente, para el almacenamiento a corto plazo (por ejemplo, 1-3 días), complemente el líquido alantoico con sacarosa (5% final) o con 3 tampones de manitol-lisina (ML) (15% de manitol, 3% de lisina; consulte la Tabla suplementaria S1 para recetas de tampón) para obtener una concentración final de 1x (5% de manitol, 1% de lisina) antes del almacenamiento a 4 ° C.

2. Purificación del VEN a partir de líquido alantoico

  1. Filtración en profundidad del fluido alantoico
    1. Guarde el líquido alantoico clarificado a -80 °C y descongele a 4 °C la noche antes de purificarlo.
    2. En un gabinete de seguridad biológica, configure el tubo y la bomba peristáltica como se muestra en la Figura 2.
    3. Si aún no se ha realizado, combine el líquido alantoico con 3x ML tampón a una concentración final de 1x.
    4. Antes de conectar el filtro de profundidad, esterilize el tubo pasando 50 ml de 0,5 M de NaOH a través del sistema a un recipiente de desechos.
    5. Enjuague el tubo pasando 100 ml de agua estéril de grado molecular a través del sistema y hacia el recipiente de desechos.
      NOTA: Como el NaOH inactivará el VEN, es importante que las líneas se laven adecuadamente antes de introducir el líquido alantoico que contiene el virus.
    6. Cebar el sistema haciendo funcionar 50 ml de PBS a través de él, deteniendo la bomba cuando queden aproximadamente 5 ml de PBS en el tubo.
    7. Conecte el filtro de profundidad con una clasificación de retención de 1-3 μM al tubo y retire la segunda tapa en el lado apical del filtro de profundidad para ventilar el filtro. Comience a ejecutar 50 ml adicionales de PBS a través del sistema.
    8. Una vez que PBS comience a fluir a través de la ventilación en la parte superior del filtro, cierre el puerto y continúe fluyendo PBS a través de las líneas.
      NOTA: Las burbujas de aire menores son aceptables, pero la presencia de grandes cantidades de aire requerirá que el filtro se ventile nuevamente como se describe en los pasos 2.1.7 y 2.1.8.
    9. Detenga la bomba cuando queden aproximadamente 5 ml de PBS en el tubo.
    10. Reemplace el recipiente de desechos con un nuevo recipiente de recolección estéril y comience a pasar el líquido alantoico a través del filtro de profundidad.
      NOTA: La presión no debe exceder los 10 psi, ya que esto resulta en la cizalladura del virus. La presión se puede manipular disminuyendo o aumentando el caudal de la bomba. Si la presión comienza a exceder los 10 psi y el caudal no se puede disminuir más, se debe usar un nuevo filtro de profundidad. En este caso, los pasos 2.1.6-2.1.8 deben realizarse antes de reanudar el flujo de líquido alantoico.
    11. Una vez que todo el líquido alantoico haya pasado a través del filtro, ejecute 50 ml de búfer de 1 ml a través de las líneas para maximizar la recuperación del virus.
    12. Recoge el líquido hasta que las líneas se sequen. Conservar el virus durante la noche o hasta 36 h a 4 °C.
      NOTA: Una vez que el virus haya sido filtrado en profundidad, continúe el proceso de purificación dentro de las 36 h posteriores a la finalización de la filtración en profundidad.
    13. Desconecte el filtro de profundidad y desinfecte el tubo haciendo funcionar 100 mL de 0.5 M NaOH, 400 PPM de lejía precalentada a 42 °C a través del sistema antes de almacenarla en 0.5 M NaOH.
  2. Filtración de flujo tangencial para la concentración de NDV
    1. Ensamble los componentes del casete como se muestra en la Figura 3A (y como se muestra anteriormente25) en un gabinete de seguridad biológica.
      NOTA: El colector y la placa final deben lavarse en detergente y secarse antes de su uso. Las juntas de silicio son reutilizables y deben almacenarse en 0,5 M NaOH con el cassette.
    2. Configure el sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) (también conocido como filtración de flujo cruzado) en una conformación "abierta" (Figura 3B).
      1. Si usa un cassette por primera vez, ensamble el cassette TFF en la conformación de Elución y enjuague con 100 mL de agua estéril de grado molecular (Figura 3C).
      2. Una vez que solo queden 5 ml de agua en el tanque del depósito, detenga la bomba y cambie la configuración del sistema TFF a una conformación cerrada (Figura 3D).
      3. Agregue 100 ml de NaOH de 0,5 M de NaOH, 400 PPM de lejía precalentada a 42 °C al depósito y recorra el sistema durante 30-60 min.
      4. Pausar el flujo y devolver el sistema TFF a la configuración de elución, reanudando el flujo para eluir la solución de limpieza.
      5. Cuando queden aproximadamente 5 ml en el depósito, detenga la bomba y agregue 100 ml de agua estéril de grado molecular para enjuagar el sistema.
      6. Cuando queden aproximadamente 5 ml en el depósito, detenga la bomba y coloque el sistema TFF en la conformación abierta (Figura 3B). Continúe con el paso 2.2.3.
    3. Esterilizar el cassette y el tubo pasando 100 mL de 0,5 M de NaOH a través del sistema utilizando la bomba peristáltica. Asegúrese de que la presión no exceda los 30 psi para mantener la integridad del cassette.
    4. Pausar la bomba cuando queden aproximadamente 5 ml de 0,5 M de NaOH en el depósito.
    5. Agregue 100 ml de agua estéril de grado molecular al depósito y reanude el paso del fluido a través del cassette. Gire el reservorio para lavar todo el NaOH de los lados del reservorio para evitar la inactivación del virus. Repita el paso de lavado del depósito.
    6. Cuando queden aproximadamente 5 ml de agua estéril de grado molecular en el depósito, detenga la bomba.
    7. Agregue 100 ml de PBS al depósito, girando para garantizar que el agua estéril de grado molecular se lave desde los lados. Reanude el flujo de líquido a través del cassette.
    8. Cuando queden aproximadamente 5 ml en el depósito, detenga la bomba, agregue líquido alantoico filtrado en profundidad al depósito y reanude el flujo de la bomba.
    9. Monitoree el manómetro 1 (Figura 3B) para asegurarse de que no exceda los 10 psi para evitar el cizallamiento del virus. Utilice una combinación de la velocidad de la bomba peristáltica y el uso de abrazaderas C para aumentar la elución a los residuos.
      NOTA: La combinación de la velocidad de la bomba peristáltica y las abrazaderas C dará como resultado un aumento de la presión.
    10. Cuando queden 50-100 ml de líquido alantoico en el depósito, detenga la bomba para realizar un intercambio de búfer agregando 150-200 ml de búfer de 1x ML.
    11. Reanude el flujo de la bomba, nuevamente monitoreando el manómetro 1 (Figura 3B) para asegurarse de que no exceda los 10 psi.
    12. Cuando queden 5-10 ml en el depósito, detenga la bomba.
    13. Usando dos abrazaderas C, cierre las dos líneas de desecho como se muestra en la Figura 3C.
    14. Desacople la línea de retención que alimenta el depósito e insértela en un tubo cónico de 50 ml (Figura 3C).
    15. Reanude el flujo de la bomba, haciendo una pausa cuando queden unas gotas de líquido en el tanque del depósito.
    16. Retire las abrazaderas C de las líneas de residuos y vuelva a conectar la línea de alimentación de retención al tanque del depósito (Figura 3B).
    17. Agregue 20-25 ml de amortiguación de 1 ml y reanude el flujo de la bomba hasta que queden aproximadamente 5 ml en el tanque del depósito.
    18. Repita los pasos 2.2.13 a 2.2.16.
      NOTA: Se puede hacer una3ª elución repitiendo los pasos 2.2.17 y 2.2.13 a 2.2.16 para aumentar el rendimiento del virus. Sin embargo, la mayor parte del virus está presente en las dos primeras eluciones.
    19. Después de terminar las eluciones, coloque el virus sobre hielo o a 4 °C.
    20. Para limpiar las líneas, configure el sistema de tal manera que sea un formato de bucle cerrado (Figura 3D) con las líneas de desecho que se retroalimentan en el depósito como se muestra en la Figura 3D.
    21. Proceda a limpiar el sistema agregando 250 ml de NaOH de 0.5 M, 400 PPM de lejía precalentada a 42 ° C.
    22. Haga fluir la solución de limpieza a través del sistema durante la noche.
      NOTA: Al recircular la solución de limpieza, si la bomba funciona a una velocidad de 50 ml / min, se debe observar una presión de aproximadamente 5 psi. Si la presión excede esto, el cassette está sucio y la solución de limpieza debe reemplazarse y el proceso debe repetirse.
    23. Eluya la solución de limpieza dirigiendo tanto las líneas de residuos como la línea de retención a un contenedor de residuos.
    24. Agregue 400-500 ml de agua estéril al depósito y háblela fluir a través del sistema y hacia los recipientes de desechos.
    25. Cuando queden aproximadamente 5 ml en el depósito, detenga la bomba y agregue 100-200 ml de 0,5 M de NaOH al tanque del depósito, girando la solución para lavar el contenedor del depósito.
    26. Una vez que el depósito esté casi vacío, repita el paso 2.2.23 dos veces más.
    27. Desmonte la configuración de TFF, almacenando el cassette y las juntas de TFF en un pequeño volumen de 0,5 M de NaOH en una bolsa de plástico resellable a 4 °C.
      NOTA: Los tubos se pueden almacenar a temperatura ambiente sumergidos en 0,5 M de NaOH.
  3. Ultracentrifugación por gradiente de densidad de iodixanol
    1. Encienda la ultracentrífuga y configúrela para que se enfríe previamente a 4 °C. Preenfríe el rotor deseado a 4 °C también (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Los rotores deben almacenarse a 4 °C.
    2. Utilice la solución de iodixanol al 60% (concentración en el momento de la compra) para generar soluciones de iodixanol al 40%, 20% y 10% diluyéndolas con PBS y 3x ML Buffer a una concentración final de 1x de tampón de ML.
    3. En un tubo de ultracentrífuga de pared delgada de 13,2 ml, superponga 0,5 ml, 2,5 ml y 2,5 ml de las soluciones de iodixanol al 40%, 20% y 10 %, respectivamente (Figura 4A).
      NOTA: Inclinar el tubo de la ultracentrífuga de lado y expulsar lentamente la solución reducirá significativamente el riesgo de mezclar las dos capas de gradiente. La separación de cada capa debe ser evidente, con un "halo" visible entre cada capa del gradiente.
    4. Utilice un rotulador para marcar las interfaces de las distintas capas de degradado.
    5. Capa 6-6.5 mL del virus eluido del procedimiento TFF sobre el gradiente de densidad. Agregue el virus con cuidado como se describe en el paso 2.3.3 para evitar perturbar el gradiente de densidad.
    6. Cargue los tubos de la ultracentrífuga en los insertos para el rotor del cucharón oscilante (consulte la Tabla de materiales) utilizando una báscula abierta para equilibrar los insertos dentro de 0,01 g entre sí. Use PBS o eluyente de virus adicional para tener en cuenta las diferencias de peso.
    7. Una vez que los tubos estén equilibrados, tapa los tubos y cárgalos en el rotor.
    8. Centrifugadora durante 1,5 h a 125.000 × g a 4 °C.
      NOTA: Esto se puede realizar durante la noche si hay disponible una ultracentrífuga con capacidad de arranque retardado.
    9. Después de la ultracentrifugación, retire los tubos con un par de pinzas estériles. Busque la banda objetivo, una banda grande, entre los gradientes del 10% y el 20% (Figura 4B).
    10. Suspenda el tubo sobre la parte superior de un vaso de precipitados con un soporte de retorta.
    11. Conecte una aguja de 18 G x 1,5 pulgadas a una jeringa de 5 ml y perfore el lado del tubo de la ultracentrífuga.
      NOTA: El tubo debe perforarse ligeramente por debajo de la banda objetivo, con la aguja en un ángulo hacia arriba y bisel hacia arriba de tal manera que viaje hacia la banda objetivo.
    12. Extienda lentamente el émbolo para quitar la banda objetivo.
      NOTA: Mueva la aguja dentro de la banda objetivo para maximizar el virus extraído. Tenga cuidado de que otras bandas o desechos no se mezclen con la banda objetivo, y evite tomar un exceso de solución, ya que esto conducirá al uso de más casetes de diálisis.
    13. Una vez que se haya extraído la banda objetivo, retire la aguja y permita que la solución restante drene en el vaso de precipitados de desecho. Dispensar la banda objetivo en un tubo cónico de 50 ml hasta que se hayan extraído todas las bandas de todos los demás tubos de ultracentrífuga.
    14. Repita los pasos 2.3.10-2.3.13 hasta que se hayan extraído todas las bandas objetivo de todos los tubos de la ultracentrífuga.
    15. Enfoque alternativo para extraer las bandas objetivo como se describe en los pasos 2.3.10 a 2.3.13
      1. Retire lentamente el líquido que se superpone a la banda objetivo con una pipeta. Una vez en la banda objetivo, extraer con una pipeta y almacenar el virus en un tubo cónico de 50 ml.
        NOTA: Esto permite reutilizar los tubos de la ultracentrífuga.
  4. Eliminación de iodixanol de la solución de virus
    NOTA: La banda que contiene el VEN aparece en una densidad de iodixanol entre el 15% y el 16%. La concentración de iodixanol en la solución se puede determinar midiendo la absorbancia a 340 nm en referencia a una curva estándar (Figura suplementaria S1). Este paso puede omitirse ya que no se observaron efectos adversos ni toxicidad aguda cuando se administraron soluciones de iodixanol de esta concentración a ratones C57BL/6.
    1. Prewet un cassette de diálisis de corte de peso molecular de 0.5-3 mL 10 kDa sumergiéndolo en PBS durante 1 min.
      NOTA: La membrana de diálisis debe cambiar de lisa a tener una apariencia con volantes o baches. Si el volumen del virus extraído excede los 10 ml, se deben usar dos casetes de diálisis de 0,5-3 ml o un casete de diálisis de 5-12 ml.
    2. Según corresponda, use una jeringa de 5 o 10 ml y una aguja de relleno romo de 18 G x 1.5 pulgadas para recoger el virus del tubo cónico de 50 ml.
    3. Use la jeringa para ingresar al cassette de diálisis, teniendo cuidado de no perforar la membrana, e inyecte el virus.
      NOTA: El cassette de diálisis se puede girar para manipular el posicionamiento de la bolsa de aire en el cassette. La bolsa de aire debe retirarse antes de retirar la aguja del cassette.
    4. Llene un vaso de precipitados de 1 L con 1x PBS estéril, coloque una barra de agitación y el cassette de diálisis en el interior, y cubra. Incubar a 4 °C con agitación suave.
      NOTA: Use espuma de poliestireno extruido y una banda elástica para conectar el cassette de diálisis para que flote en el PBS. El cassette puede hincharse ligeramente debido al búfer ml.
    5. Después de 1-2 h, reemplace con 1x PBS fresco y continúe incubando a 4 ° C durante otras 8-10 h con una ligera agitación.
      NOTA: Esto también se puede hacer durante la noche.
    6. Reemplace con 1x PBS fresco una vez más, incubando a temperatura ambiente durante 1-2 h.
  5. Concentración de la solución de virus
    1. Retire el cassette de diálisis del tampón de diálisis (Figura 4C) y colóquelo en una bolsa de plástico pequeña y sellable. Agregue 15-25 ml de polietilenglicol al 40% de 20,000 MW para que el cassette de diálisis quede completamente sumergido.
    2. Incubar a temperatura ambiente con balanceo. Verifique el volumen de virus en el cassette periódicamente usando una jeringa de 5 o 10 ml y una aguja de relleno romo de 18 G x 1.5 pulgadas.
      NOTA: La cantidad de tiempo necesario para concentrar el virus variará según el volumen inicial y el volumen final deseado. Por lo general, el volumen final deseado está entre 1 y 1,5 ml, independientemente del volumen inicial del líquido alantoico. Al verificar el volumen, tenga cuidado de no usar el mismo puerto, ya que esto comprometerá la integridad del puerto y puede resultar en la mezcla de la solución de polietilenglicol y el virus.
    3. Antes de retirar el virus concentrado del cassette de diálisis, enjuague brevemente el cassette en 1x PBS y llene una aguja de relleno romo de 18 G x 1.5 pulgadas con aire.
    4. Inserte la jeringa llena de aire en el cassette de diálisis y presione el émbolo. Gire el aparato para que el virus concentrado pueda eliminarse sin eliminar el aire introducido.
    5. Dispensar el virus concentrado en un tubo cónico de 50 ml, anotando el volumen dispensado.
    6. Usando la misma jeringa y aguja, inyecte una cantidad adecuada de sacarosa al 60% en el cassette de diálisis para que, cuando se combine con el virus previamente eliminado, esté en una concentración final de sacarosa al 5%.
    7. Use dedos enguantados para masajear la membrana para desalojar el virus residual que puede haberse adherido a la membrana, teniendo cuidado de no dañarla. Retire parte del exceso de aire en el cassette de diálisis para facilitar el proceso de desalojo.
    8. Combine este lavado con el virus que ya está en el tubo cónico de 50 ml.
      NOTA: El virus ahora está en sacarosa al 5% y listo para ser dispensado en alícuotas de 20 μL, 50 μL, 100 μL o 200 μL y almacenado a -80 ° C. Alternativamente, para el almacenamiento a largo plazo, el VEN puede ser liofilizado y almacenado a 4 °C como se describe en la sección 2.6.
  6. Liofilización del VEN
    1. Liofilizar el virus alicitado en tubos centrífugos de 1,5 ml o tubos cónicos de 15 ml a 44 × 10-3 MBAR y -52 °C durante 16 h.
    2. Almacene las muestras liofilizadas a 4 °C sin una reducción significativa del título viral.

3. Ensayos de control de calidad

  1. Aislamiento de ARN viral y PCR de transcripción inversa para la confirmación del genoma
    1. Descongelar una alícuota de virus de 20 μL. Siga el protocolo de aislamiento de ARN viral proporcionado con el kit.
    2. Utilice inmediatamente el ARN aislado como plantilla para la PCR de transcripción inversa (RT-PCR) o guárdelo a -80 °C.
    3. Prepare las reacciones de transcripción inversa como se describe en el protocolo proporcionado por el fabricante.
    4. Utilice el ADNc resultante como plantilla para varias reacciones de PCR de control de calidad para confirmar el patotipo del VEN (Tabla 1, conjunto de cebadores de proteínas F) y la presencia de elementos de control de genes requeridos (Tabla 1, Conjunto de cebadores de transgenes).
      NOTA: Los cebadores deben diseñarse en función de la cepa del VEN que se propaga.
      1. Para secuenciar el sitio de escisión de la proteína F, el principal determinante del patotipo, utilice el conjunto de cebadores de proteínas F (Tabla 1). Busque un producto de PCR de 435 pares de bases de longitud.
        NOTA: Aquí, los cebadores se diseñaron en base a la cepa LaSota del VEN (genbank af077761.1). Está bien establecido que la expresión óptima de transgenes ocurre cuando se inserta un transgén extraño entre los genes P y M24.
      2. Utilice el conjunto de cebadores de transgenes para confirmar la integridad de los elementos de inicio y fin del gen del transgén. Secuenciar el producto de PCR para confirmar el inicio del gen y la integridad de la secuencia final del gen.
    5. Envíe los productos de PCR para la secuenciación del ADN y compárelos con la plantilla para homología.
  2. Tinción SDS PAGE y Coomassie para detectar proteínas contaminantes
    1. Funda un gel SDS PAGE de gradiente de densidad preparando primero soluciones de poliacrilamida al 6% y al 15% (Tabla suplementaria S1). Utilice una pipeta de 10 ml para extraer 5 ml de la solución al 15%, seguido de 5 ml de la solución al 6%.
    2. Retire la pipeta de la solución y genere una burbuja de aire extrayendo brevemente el aire.
      NOTA: A medida que la burbuja de aire viaja hacia arriba, esto mezcla la solución para crear el gradiente SDS PAGE.
    3. Dispense la solución en el aparato de fundición y deje que se solidifique durante 30 minutos.
    4. En un volumen final de 20 μL, combine una alícuota de virus con un tampón reductor 4x (Tabla suplementaria S1) para que la concentración final sea 1x, y hierva durante 10 min a 95 °C en un termociclador. Cargue al menos 1 × 107 PFU del virus.
    5. Sumerja SDS PAGE en el búfer en ejecución (Tabla suplementaria S1) y cargue los ejemplos.
    6. Haga funcionar el gel a 120 V durante 1-1,5 h.
    7. Retire el gel del tampón de funcionamiento y transfiéralo a un recipiente más pequeño.
    8. Agregue la solución de tinción de Coomassie (Tabla suplementaria S1) para cubrir el gel. Incubar a temperatura ambiente durante 4-5 h.
    9. Retire la solución de tinción y agregue la solución de destinción (Tabla suplementaria S1), incubando durante 4-8 h a temperatura ambiente con agitación. Cambie la solución de detención de tres a cuatro veces.
      NOTA: El gel debe ser transparente y su color debe ser como era antes de la tinción.
    10. Imagine el gel en un ajuste colorimétrico. Consulte la Figura 5 para obtener una imagen representativa de un gel SDS PAGE teñido con Coomassie que contiene muestras de líquido alantoico y virus purificado.
  3. Cuantificación del título viral infeccioso mediante la mediana de la dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID50) y el ensayo de inmunofluorescencia
    NOTA: Las celdas Vero se pueden usar como una alternativa a las celdas DF1; sin embargo, el efecto citopático (CPE) es menos pronunciado en las células Vero. El VEN que alberga la mutación L289A, que mejora la fusogenicidad, y expresa GFP entre los genes P y M se está utilizando en este ensayo.
    1. Sembrar una placa de 96 pocillos de células DF1 a 20,000 células / pozo en un volumen de 80 μL el día anterior usando DMEM suplementado con suero bovino fetal al 2% (FBS) y 125 μg / ml de tripsina. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2.
    2. Al día siguiente, descongele una alícuota de 20 μL de virus en hielo.
    3. Utilice tubos de 1,5 ml para preparar diluciones en serie. Comience diluyendo 10 μL del virus con 990 μL de PBS para preparar una dilución de 10-2 . Preparar todas las demás diluciones, hasta 10-10 como mínimo, hechas con 900 μL de PBS y la adición de 100 μL de la dilución anterior.
      NOTA: Use una nueva punta de pipeta cuando se mueva entre diluciones.
    4. Use 20 μL de cada dilución para infectar cada pocillo de la placa de 96 pocillos como se muestra en la Figura 6.
      NOTA: El volumen final en cada pozo será de 100 μL.
    5. Incubar la placa durante al menos 48 h a 37 °C y 5% de CO2, antes de examinar la presencia de CPE/GFP o realizar un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA).
      NOTA: En estas condiciones de cultivo, el CPE es evidente después de 10 h (Figura 7A-D), aumentando durante las próximas 24 h (Figura 7E-H). La placa se puede incubar más tiempo para mejorar la intensidad de CPE si se puntúa por GFP o CPE.
      1. Si puntúa por CPE o GFP y NO realiza IFA, vaya al paso 3.3.18.1.
    6. Si realiza IFA, enjuague las células dos veces con 100 μL de 1x PBS.
    7. Agregue 100 μL de paraformaldehído al 4% diluido en PBS a cada pozo e incube durante 15 min a temperatura ambiente.
    8. Lave las células 3x 5 min cada una con 100 μL de 1x PBS, 0.1% Tween 20 (0.1% PBS-T).
    9. Permeabilizar las células mediante la adición de 100 μL de NP-40 al 0,1% en PBS e incubarlas a temperatura ambiente durante 10 min.
    10. Lavar las células 3x 5 min con 100 μL de PBS-T al 0,1%.
    11. Añadir 100 μL de tampón de bloqueo compuesto por suero de cabra normal al 5% (V/V) diluido en PBS-T al 0,1% durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
    12. Añadir 100 μL por pocillo de anticuerpo primario anti-RIBonucleoproteína anti-VEN de ratón diluido en PBS-T al 0,1% a 1 μg/ml, incubando durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
    13. Lavar las células 3x durante 5 min en 100 μL de PBS-T al 0,1%.
    14. Añadir 100 μL de un anticuerpo secundario anti-ratón AlexaFluor 488 Goat diluido en PBS-T al 0,1% a 2 μg/mL. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
    15. Lavar las células 3x durante 5 min en 100 μL de PBS-T al 0,1%.
    16. Después del lavado final, deje las células en 100 μL de PBS-T al 0,1%.
    17. Tome imágenes de los pozos con un microscopio fluorescente invertido.
    18. Al realizar IFA, busque una fluorescencia mayor que la observada en los pozos de control negativos, lo que indica que el pozo es positivo para el VEN como se muestra en la Figura 8.
      1. Busque la presencia de sincitia y células grandes y redondeadas que caracterizan el CPE del VEN. Si puntúa los pozos infectados con un virus que expresa GFP, busque la presencia de GFP.
    19. Introduzca la información adecuada en la calculadora de títulos spearman-Karber26 para determinar la PFU/ml del virus (Tabla 2). Consulte la Figura 6 para ver un ejemplo de placa de título TCID50 .
  4. Cuantificación del título viral por PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
    NOTA: Se recomienda un kit de qRT-PCR de un solo paso para ahorrar tiempo y reducir la manipulación de las muestras. Se utiliza un ensayo basado en sonda para aumentar la especificidad de la detección de secuencias de virus.
    1. Cree una curva estándar de una cantidad conocida de las secuencias de virus (Figura suplementaria S2A, B).
      NOTA: Esto se puede hacer comprando un fragmento sintético de ADN de doble cadena de 500 pb del gen L del VEN. La secuencia de un fragmento de 500 pb del gen L del VEN se puede ver en la Figura Suplementaria S2C.
    2. Convierta la cantidad del fragmento de ADN del virus (generalmente proporcionado como nanogramos o femtomoles por los fabricantes) al número de moléculas o copias del fragmento de ADN utilizando el número de Avogadro y la fórmula de lunares a moléculas (Eq (1)).
      Equation 1 (1)
    3. Prepare las muestras de la curva estándar preparando una serie de dilución de diez veces de copias de fragmentos de ADN de virus conocidos, a partir de 1.00 ×10 10 copias hasta 1.00 × 100 copias.
    4. Para determinar la cantidad de ARN del VEN en muestras desconocidas, extraiga el ARN del VEN utilizando un kit de extracción de ARN. Siga el protocolo proporcionado con el kit. Una vez extraído el ARN, continúe con el protocolo recomendado proporcionado en el kit de qRT-PCR de un solo paso.
    5. Ejecute las reacciones en un instrumento de PCR en tiempo real con las siguientes condiciones de temperatura y ciclo: 1) un ciclo de transcripción inversa a 55 °C durante 10 min; 2) un ciclo de desnaturalización inicial a 95 °C durante 1 min; y 3) 40 ciclos de desnaturalización (95 °C durante 10 s), extensión (60 °C durante 30 s) y adquisición de señal fluorescente.
    6. Una vez completado el ensayo qRT-PCR, genere la curva estándar basada en las muestras de la curva estándar utilizando el software del instrumento pcr en tiempo real (Figura suplementaria S2A, B).
      NOTA: El software también calculará la cantidad de ARN del VEN en muestras desconocidas en función de la curva estándar.
  5. Ensayos de seguridad para toxicidad aguda en ratones
    1. Inyecte 1 × 108 PFU del virus por vía intravenosa a través de la vena de la cola en tres ratones BALB/C de 8 semanas de edad para evaluar la toxicidad aguda.
    2. Monitoree a los ratones para detectar eventos adversos como pérdida de peso (>20%), postura encorvada, pelajes con volantes, letargo y cambios en la respiración. Evaluar de tres a cuatro veces al día durante las primeras 48 h. Como los ratones deben comenzar a recuperarse después de 48 h, monitoréelos una o dos veces al día hasta que se recuperen por completo.
      1. Administrar solución salina por vía subcutánea y cuidados de apoyo según sea necesario. Por ejemplo, complemente con gel de dieta de recuperación, mantequilla de maní o use discos de calor. Sacrificar ratones que han alcanzado los criterios de punto final, según lo descrito por las pautas institucionales de cuidado animal, por sobredosis de isoflurano seguida de dislocación cervical.

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Representative Results

Recolección de líquido alantoico
Como el líquido alantoico se cosecha de huevos de gallina embrionados, debe parecer claro y transparente. Si el fluido aparece opaco y amarillo, esto indica la presencia de contaminantes. La inclusión de este fluido alantoico durante la purificación impedirá el proceso de purificación, ya que la presión aumentará rápidamente y superará los 10 psi, lo que resultará en el cizallamiento del virus y la pérdida del virus infeccioso. El líquido alantoico que parece sanguinolento sugiere que los huevos fueron inoculados con demasiadas PFU de virus. El rendimiento de este lote de huevos será significativamente menor de lo esperado y es poco probable que este virus pueda usarse in vivo. Los óvulos inoculados con VEN lentogénico aún deben tener vasculatura evidente después de 72 h y los embriones no deben haber muerto, como se visualiza en la Figura 1. Si lo han hecho, esto sugiere que el embrión ha sido dañado o contaminado de alguna manera.

Ultracentrifugación por gradiente de densidad de iodixanol
Después de la ultracentrifugación, una banda blanca de alto título que contenga NDV debe ubicarse entre los gradientes del 10% y el 20% (Figura 4B).

Tinción de coomassie de geles SDS-PAGE
La Figura 5 demuestra la diferencia entre un stock de virus no purificado (Carril 2) y purificado (Carril 3). Una comparación de los dos muestra una disminución significativa en la intensidad de las bandas de proteínas contaminantes y la aparición de bandas dominantes de VEN en el stock de virus purificados.

Cuantificación del título viral por TCID50
Si se utilizan las condiciones recomendadas al titular una cepa concentrada de VEN, el CPE debe ser evidente después de 24 h (Figura 6). En comparación con una cepa lentogénica NDV de título similar, el CPE es más pronunciado en la cepa mesogénica en el mismo punto de tiempo.

Análisis de toxicidad aguda en ratones BALB/C de 8 semanas de edad
Cuando se administró 1 × 108 PFU por vía intravenosa, los ratones deben ser monitoreados para detectar efectos adversos como pérdida de peso >20%, pelaje con volantes, postura encorvada y respiración anormal. Dentro de las primeras 24-36 h, los ratones comenzarán a perder peso y probablemente desarrollarán abrigos con volantes y una postura encorvada. Sin embargo, si el virus es lo suficientemente puro, los ratones comienzan a recuperarse, como se observa por el aumento de peso y la mejora en la postura y la condición del pelaje después de 36 h. Los ratones que no muestran estos signos de recuperación a las 36 h deben continuar siendo monitoreados de cerca para los criterios de punto final. Por lo general, esto ha sucedido debido a un título inexacto, potencialmente debido a la agregación de partículas de virus.

Figure 1
Figura 1: Infección y cosecha del VEN a partir de huevos de gallina embrionados libres de patógenos especificados. (A) Vasculatura en forma de red (flechas) que debe ser evidente después de 9 días de incubación, además del movimiento del embrión. 'X' denota la interfaz entre la membrana corioalantoica y la cavidad de aire, y donde se debe crear el orificio para la inoculación del óvulo. (B) Imagen que representa un embrión muerto. Nótese la ausencia de vasculatura en forma de red. También se observará una falta de movimiento embrionario. (C) Diagrama de los componentes de un huevo de gallina embrionado que muestra las ubicaciones de la cavidad de aire, el saco vitelino, el saco amniótico, la membrana corioalantoica y el líquido alantoico. (D) Extracción de la concha para exponer la membrana coriiallantoica. (E) Ilustra cómo deben verse el líquido alantoico y el embrión después de la apertura de la membrana corioalantoica. Abreviatura: NDV = virus de la enfermedad de Newcastle. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema que describe el conjunto general del aparato utilizado para la filtración en profundidad. Asegúrese de que el manómetro esté instalado aguas arriba del filtro de profundidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Configuración de filtración de flujo tangencial en sus diferentes configuraciones. Las flechas muestran la dirección del flujo de fluido. (A) Ilustración de cómo se ensambla el casete TFF. (B) Esquema del sistema TFF en su configuración "abierta" utilizado durante la purificación y concentración de fluido. (C) Esquema de la configuración de TFF cuando se está eluyendo fluido del sistema, tal como se usa durante la elución del virus y la solución de limpieza. (D) Esquema del sistema TFF en su configuración "cerrada", que se utiliza durante la limpieza del sistema TFF. Abreviatura: TFF = Filtración de flujo tangencial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Gradiente de densidad ultracentrifugación y diálisis del virus concentrado de TFF. (A) Esquema que muestra la composición del gradiente de densidad de iodixanol. (B) Patrón de bandas de virus después de la ultracentrifugación del virus producido utilizando tampón ML durante el proceso de purificación. La banda principal que contiene el virus se denota por un óvalo negro. (C) Tamaño típico de un casete de diálisis cargado con 10 ml de virus preparado a través de un gradiente de iodixanol al final del procedimiento de diálisis. Abreviatura: TFF = Filtración de flujo tangencial; ML = Manitol-Lisina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Gel SDS-PAGE teñido con coomassie. Gel compara la presencia de proteínas contaminantes entre las existencias de VEN mesogénico no purificadas (carril 2) y purificadas (carril 3) cuando se cargaron 1 × 105 PFU. Carriles 1 y 4 = escalera de peso molecular (MW). NDV HN, F0, y sus subunidades después de la escisión, F1 y F2, junto con sus respectivos pesos moleculares27 se muestran en fuente blanca. Abreviaturas: SDS-PAGE = electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida; VEN = virus de la enfermedad de Newcastle; PFU = unidades formadoras de placa; HN = hemaglutinina; F0 = Fusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Ejemplo de un diseño de placa de 96 pocillos utilizado para determinar el título del virus por TCID50. La placa se divide en 12 columnas, y cada columna representa una dilución en serie diferente. Los pocillos positivos (según lo determinado por CPE, expresión de transgenes o IFA) se indican en gris. Dado el número de pozos positivos en este ejemplo, el título esperado después de usar la calculadora de títulos Spearman-Karber (Tabla 2) se enumera tanto en TCID50/mL como en PFU/mL. Abreviaturas: TCID50 = dosis infecciosa mediana de cultivo de tejidos; CPE = efecto citopático; IFA = ensayo de inmunofluorescencia; PFU = unidades formadoras de placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Comparación del CPE después de la infección de células DF1 con VEN lentogénico o mesogénico. Se utilizó un MOI de 0,5 después de 10 h de incubación (A-D) o 24 h de incubación (E-H) bajo diferentes condiciones de cultivo de DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% líquido alantoico, o DMEM + 2% FBS + 125 μg/mL tripsina. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: CPE = efecto citopático; VEN = virus de la enfermedad de Newcastle; MOI = multiplicidad de la infección; FBS = suero fetal bovino; DMEM = Medio del águila modificada de Dulbecco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Un ejemplo de una situación en la que se necesita IFA para titular un VEN lentogénico que carece de un transgén GFP. Las células vero se cultivaron en DMEM que contenían 2% de FBS y 125 μg/ml de tripsina. Las imágenes fueron tomadas de la dilución en serie 10-7 . (A) Imagen de campo brillante de células infectadas. (B) Ilustra la apariencia típica de las células teñidas cuando se utiliza IFA para detectar virus. (C) Una imagen combinada de (A) y (B). Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: IFA = ensayo de inmunofluorescencia; VEN = virus de la enfermedad de Newcastle; GFP = proteína fluorescente verde; FBS = suero fetal bovino; DMEM = Medio del águila modificada de Dulbecco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Cebadores de PCR y RT-qPCR para la detección de segmentos genéticos del virus de la enfermedad de Newcastle. Conjuntos de cebadores utilizados para la amplificación específica de dos regiones del genoma del VEN. El conjunto de cebadores de proteína f da como resultado la amplificación de una región de la proteína F que abarca el sitio de escisión de la proteína F. El conjunto de cebadores de transgenes amplifica la región intergénica entre los genes fosfoproteína y matriz, el sitio óptimo de inserción de transgenes. Esta tabla también contiene las secuencias de cebadores que se dirigen al gen viral L21 y a la sonda del gen L utilizada en el ensayo qRT-PCR. Abreviaturas: PCR = reacción en cadena de la polimerasa; RT-qPCR = PCR cuantitativa de transcripción inversa; NDV = virus de la enfermedad de Newcastle. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Calculadora de títulos Spearmann-Karber. Esta hoja de cálculo interactiva contiene el flujo de trabajo y las ecuaciones adecuadas para determinar la concentración de virus utilizando los resultados de TCID50 basados en el inóculo del pozo en ml, el esquema de dilución y el número de réplicas por dilución. La concentración se informa como volumen en ml requerido para infectar el 50% del cultivo de tejidos (TCID50) y unidades formadoras de placa por ml de suspensión del virus. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura suplementaria S1: Determinación de las concentraciones de iodixanol. (A) Curva estándar generada a partir de la absorbancia de soluciones de concentración conocida de iodixanol a 340 nm. (B) La curva estándar y la ecuación de (A) se utilizaron para determinar la concentración de iodixanol en solución después de la ultracentrifugación del gradiente de densidad, diálisis y concentración de polietilenglicol. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Amplificación y curva estándar generada a partir del ensayo qRT-PCR de fragmento de ADN sintético de doble cadena de 500 pb del gen L del VEN. La amplificación (A) y la curva estándar (B) se crearon a partir de muestras que contenían una dilución en serie de diez veces (1,0 × 109 copias a 1,0 × 100 copias) del fragmento de ADN. Para la amplificación y la curva estándar, las muestras que contenían 1,0 × 101 copias y 1,0 copias × 100 copias estaban por debajo del umbral y no produjeron un valor de punto de cruce inferior a 35 Cp. La curva estándar final se generó en base a muestras que contenían 1,0 × 109 copias a 1,0 × 102 copias del fragmento de ADN. (C) Secuencia de ADN del fragmento del gen NDV L de 500 nucleótidos utilizado para generar la curva estándar en el protocolo qRT-PCR. Abreviaturas: PCR = reacción en cadena de la polimerasa; RT-qPCR = PCR cuantitativa de transcripción inversa; VEN = virus de la enfermedad de Newcastle; Cp = punto de cruce. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S3: Carga y extracción del VEN del casete de diálisis. (A) El tamaño típico de un casete de diálisis después de ser cargado con aproximadamente 10 ml de solución que contiene virus aislada de un gradiente de densidad de sacarosa y fotografiada al final de la etapa de diálisis. (B) Un ejemplo de los resultados obtenidos al utilizar la ultracentrifugación por gradiente de densidad de iodixanol sin suplementación con tampón ml. Rodeado es la banda de virus objetivo para la eliminación. Indicado por las flechas hay una banda adicional que puede contener viriones dañados. Tenga en cuenta que después de la incorporación del tampón ML en el proceso de purificación, esta banda ya no es evidente. Abreviaturas: NDV = virus de la enfermedad de Newcastle; ML = manitol-lisina. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S1: Proporciona los pasos necesarios para generar soluciones de western blot y tampón ml utilizados durante el proceso de purificación. Abreviaturas: SDS-PAGE = electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida; TEMED = tetrametilendiamina; ML = Manitol-lisina. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Los virus utilizados como agentes terapéuticos en estudios preclínicos deben ser altamente purificados para evitar toxicidad cuando se administran in vivo15. Si no se eliminan los agentes adventicios o contaminantes, esto puede conducir a reacciones adversas graves que nieguen el efecto terapéutico del agente viral28. Como el VEN se produce en huevos de gallina embrionados, existen varias proteínas contaminantes del huevo, como la ovoalbúmina, que deben eliminarse antes de su uso in vivo en modelos preclínicos o clínicos29. Incluso después de una purificación intensiva, la ovoalbúmina todavía se encuentra29. La eliminación de estas proteínas contaminantes es un proceso riguroso que requiere mucho tiempo y recursos15,22. Si el VEN pudiera producirse en un sistema basado en células a títulos suficientemente altos requeridos para aplicaciones in vivo, esto podría simplificar el proceso de purificación y mejorar la traducción del VEN a entornos clínicos. Sin embargo, la producción a base de huevo de NDV oncolítico se ha utilizado en numerosos ensayos clínicos en humanos30.

En cada paso del proceso de purificación, las muestras se pueden rayar en placas de agar sanguíneo como una medida de control de calidad adicional para garantizar la ausencia de contaminación bacteriana.

La presión durante la filtración en profundidad no debe acumularse rápidamente. Este es un signo de contaminación de proteínas y ralentizará significativamente el proceso de purificación y requerirá el uso de filtros de profundidad adicionales. La filtración en profundidad no debe completarse rápidamente; este paso suele tardar de 1 a 1,5 h. Por lo general, la finalización rápida del paso de filtración de profundidad da como resultado un título viral más bajo.

A medida que el virus se concentra, una "corriente nublada" debería estar emergiendo en el reservorio desde la línea de retentación. Esto sugiere que hay virus en el líquido alantoico que se concentra a medida que pasa a través del cassette.

Durante los pasos de filtración de profundidad y filtración de flujo tangencial, la presión nunca debe exceder los 10 psi. Exceder esta presión cortará el virus. La adición de tampón ml al líquido alantoico actúa como un agente estabilizador y se plantea la hipótesis de prevenir la agregación viral, lo que resulta en una mayor recuperación del virus infeccioso sin comprometer la capacidad de filtración.

El método anterior describe un procedimiento adecuado para producir cepas lentogénicas y mesogénicas del VEN en condiciones BSL-2, ya que el VEN mesogénico no es un agente selecto en Canadá. Esto da como resultado la generación de existencias de alto título adecuadas para su uso en modelos animales. Al igual que otros protocolos en la literatura que utilizan métodos de purificación de exclusión de tamaño, como la filtración de profundidad y TFF, estos métodos limitan el uso de técnicas de ultracentrifugación más duras donde la recuperación del virus se reduce en comparación con los métodos de purificación de exclusión de tamaño15.

El uso de TFF proporciona un elemento de escalabilidad, ya que TFF se puede utilizar para concentrar grandes volúmenes iniciales, en contraste con las técnicas de ultracentrifugación. Las técnicas de purificación del VEN existentes se mejoran en el protocolo anterior mediante la sustitución de sacarosa por iodixanol en la etapa de ultracentrifugación, lo que reduce en gran medida la posibilidad de perder el virus debido a la ruptura del cassette al final de la etapa de diálisis, y la adición de tampón ml, que mejora la filtración y aumenta el rendimiento.

Se prefiere el uso de gradientes de iodixanol a los gradientes de sacarosa, ya que el iodixanol es menos viscoso y no tóxico para las células y proporciona un producto final "más limpio"31,32. El iodixanol redujo significativamente los niveles de citoquinas proinflamatorias y quimiocinas presentes después de la ultracentrifugación del gradiente de densidad del virus purificado33. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que el iodixanol se ha utilizado en la purificación del VEN. La concentración de iodixanol en una solución se puede determinar cuantificando la absorbancia a 340 nm con referencia a una curva estándar. Esta característica se utilizó para determinar que las bandas de VEN a aproximadamente el 15% de iodixanol y para confirmar que se puede eliminar mediante diálisis (Figura suplementaria S1B). El iodixanol se desarrolló inicialmente como un agente de imagen de contraste, y no observamos eventos adversos cuando se administró una solución de iodixanol al 15% por vía intravenosa e intranasal a ratones C57BL/6. Esto sugiere que la diálisis para eliminar el iodixanol puede no ser necesaria, acortando el proceso de purificación en aproximadamente 16 h. Además, la sacarosa es higroscópica, lo que hace que el cassette de diálisis se hinche significativamente, limitando el volumen que se puede inyectar y aumentando el riesgo de ruptura del cassette y pérdida del virus34,35. Cuando se inyectaron volúmenes iguales de virus preparados con iodixanol y sacarosa en casetes de diálisis, se produjo una hinchazón significativamente menor en el virus preparado con iodixanol (compare la Figura 4C y la Figura Suplementaria S3A). Sin embargo, la sacarosa es un agente de estabilización más adecuado para el VEN que el iodixanol. Esto llevó a la suplementación del gradiente de iodixanol con tampón ML. Antes de la adición de tampón de ML al proceso de purificación, había una banda más intensa en el gradiente de iodixanol del 10% observado además de la banda objetivo al 15% (Figura suplementaria S3B). Esta banda probablemente contiene viriones dañados o incompletos generados durante el proceso de purificación. La adición de tampón ml permite una mejor filtración del VEN al tiempo que minimiza la naturaleza higroscópica del medio de gradiente de densidad, reduciendo el riesgo de ruptura del cassette de diálisis. La hinchazón del casete de diálisis se puede reducir aún más mediante la dialización en 1x PBS suplementado con sacarosa al 5%, ya que en última instancia esto es en lo que se almacenará el virus.

Como el VEN es un sentido negativo, el virus de ARN monocatenario, el aislamiento del ARN y la generación de ADNc utilizando cebadores aleatorios y conjuntos de cebadores específicos para PCR permite la secuenciación de varias regiones del genoma a partir de una reacción de ADNc (Tabla 1). Esto es importante ya que permite confirmar el patotipo y la integridad del transgén y sus elementos reguladores transcripcionales. El sitio de escisión de la proteína F del VEN lentogénico debe ser monobásico en lugar de polibásico, ya que los sitios de escisión polibásico que poseen venoes son típicamente patotipos mesogénicos o velogénicos, y se clasifican como agentes seleccionados36,37. Este protocolo también describe un método RT-qPCR confiable para la cuantificación de alto rendimiento de los genomas del VEN. Antes de su uso en modelos animales y después de la finalización de los otros ensayos de control de calidad, se debe evaluar la toxicidad aguda en ratones BALB/C de 8 semanas de edad. Esta cepa se caracteriza por ser más sensible a las toxicidades inducidas por el virus que otras cepas de ratones15. Además, esto dará alguna indicación de la precisión del título del virus. Por ejemplo, se observará la pérdida de peso, pero el peso debe comenzar a aumentar después de 36-48 h. Si este no es el caso, entonces es posible que el título del virus sea más alto de lo informado inicialmente, lo que puede deberse a la agregación de partículas virales. Este resultado inicial tras la purificación de un VEN recombinante condujo a la incorporación del tampón ML durante todo el proceso de purificación. Este tampón ha sido sugerido para mejorar la filtrabilidad y recuperación del virus durante los procesos de purificación38.

Al cuantificar la concentración de virus infecciosos por TCID50, el uso de IFA puede ser necesario para visualizar la infección por VEN, especialmente en diluciones más altas cuando CPE puede no ser obvio, o si el virus no expresa un gen reportero fluorescente (Figura 8). El anticuerpo primario utilizado para ifA es específico de la ribonucleoproteína del VEN, un complejo de proteínas que se asocia con el genoma del ARN durante la replicación del genoma. Como el VEN es un virus aviar, la línea celular de fibroblastos embrionario de pollo, DF1, es una línea celular óptima para evaluar el título del virus. Por lo general, el líquido alantoico negativo para virus se utiliza como un medio para proporcionar las proteasas similares a la tripsina requeridas por los VEN lentogénicos para la escisión de la proteína F39. El uso de líquido alantoico negativo para virus se puede evitar complementando con 125 μg / ml de tripsina mientras se reduce la concentración de FBS al 2%. Esto proporciona una alternativa simple y rentable al líquido alantoico negativo para virus, al tiempo que proporciona las proteasas similares a la tripsina requeridas. Al comparar estas dos condiciones de cultivo a un MOI de 0,5 durante un período de tiempo de 24 h, parece haber poca diferencia entre las dos, con el medio suplementado con tripsina que potencialmente resulta en más CPE (Figura 7). Otras líneas celulares como las células Vero se pueden utilizar con las mismas condiciones de cultivo; sin embargo, el CPE es menos pronunciado. Usando el protocolo anterior con células DF1, el CPE del VEN debe ser evidente dentro de las 24 h. Específicamente, se debe ver la formación de sincitios a las 24 h (Figura 7E-H). Utilizando el procedimiento de purificación descrito, purificamos consistentemente el VEN a títulos que van desde 1 × 109-3 × 1010 PFU / ml de un volumen inicial de 0.8-1.0 L de líquido alantoico.

En general, el protocolo descrito mejora los procedimientos de purificación del VEN publicados anteriormente mediante el uso de iodixanol como medio de gradiente de densidad en lugar de sacarosa y mediante la adición de tampón de ML para mejorar la filtración. Además, describimos un método complementario para la titulación del VEN, incluimos un método detallado de RT-qPCR para determinar el número de copias del VEN y definimos las condiciones óptimas para el uso de tripsina en lugar de líquido alantoico durante la titulación del virus. Aunque este proceso genera existencias de NDV de alto título que se pueden administrar sistémicamente a dosis altas, este procedimiento implica múltiples pasos, lo que puede aumentar la variabilidad entre los usuarios e introducir el potencial de contaminación. Una limitación adicional es el requisito de que el material de partida sea de alta calidad. Es fundamental que el fluido alantoico esté libre de yema contaminante, ya que esto reduce en gran medida la eficiencia de los pasos de filtración y exclusión de tamaño. En general, este proceso lleva mucho tiempo, pero puede acortarse omitiendo el paso de diálisis. Este procedimiento da como resultado un mayor rendimiento del virus de grado in vivo en comparación con otros métodos de purificación15,18. La capacidad de producir un VEN de mayor calidad y más concentrado amplía sus capacidades para ser utilizado como agente oncolítico o vector de vacunas en modelos animales de enfermedad tanto en entornos preclínicos como clínicos.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

J.G.E.Y recibió una beca de doctorado de la Facultad de Veterinaria de Ontario y una beca de posgrado de Ontario. Este trabajo fue financiado por Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants a SKW (subvención # 304737) y LS (subvención # 401127).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin HyClone SH30042.02
1 mL Slip-Tip Syringe BD 309659
10 mL Luer-Lok Syringe BD 302995
10% Povidone Iodine Solution LORIS 109-08
15 mL Conical Tubes Thermo-Fisher 14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle BD 305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle BD 305196
25 G x 5/8 in Needle BD 305122
2-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 BioRad 1610158
4% Paraformaldehyde-PBS Thermo-Fisher J19943-K2
5 mL Luer-Lok Syringe BD 309646
96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom Greiner Bio One 655180
Acetic Acid, Glacial Thermo-Fisher A38-212
Agarose Froggabio A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse Invitrogen A11001
Allegra X-14 Centrifuge Beckman Coulter B08861
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Bleach (5%) Thermo-Fisher 36-102-0599
Broad, unserrated tipped forceps Thermo-Fisher 09-753-50
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich 114405-25G
Centramate Cassette Holder PALL CM018V
ChemiDoc XRS+ BioRad 1708265
CO2 Incubator Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259 Thermo-Fisher BP101-50
DF1 Cells ATCC CRL-12203
Diet Gel Recovery ClearH2O, INC 72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator Berry Hill 1502W
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-500G
Egg Candler Berry Hill A46
Ethanol (70%) Thermo-Fisher BP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O Thermo-Fisher BP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) Cole-Parmer 06349-50
Fetal Bovine Serum Gibco 12483-020
Fine Point High Precision Forceps Thermo-Fisher 22-327379
Fluorescent Microscope ZEISS AXIO Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5 LABCONCO
GiBOX Gel Imager Syngene Imaging of Agarose Gels
Glycerol Thermo-Fisher G33-1
Glycine Thermo-Fisher BP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Thermo-Fisher 4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium Cytiva SH30022.01
Humidity Kit Berry Hill 3030
Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine Monohydrochloride Sigma-Aldrich 62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT Cole-Parmer 41507-44
Masterflex L/S Digital Drive Cole-Parmer RK-07522-20 Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing Cole-Parmer RK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 Cole-Parmer 96420-16 BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 Thermocycler Eppendorf EP950040025
Methanol Thermo-Fisher A412-4
Mini Protean Tetra Cell BioRad 1658000EDU SDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDV Novus Biologicals NBP2-11633 Clone 6H12
Normal Goat Serum Abcam AB7481
NP-40 Thermo-Fisher 85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K PALL OS100T02
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System Thermo-Fisher B1A
PBS 10X Solution Thermo-Fisher BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 Sigma-Aldrich 81300-1KG
PowePac 300 BioRad Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
RedSafe Thermo-Fisher 50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL Thermo-Fisher 66380
Sodium Dodecyl Sulfate Thermo-Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets) Thermo-Fisher S318-10
Specific pathogen free eggs CFIA NA Supplier will vary depending on location
Sucrose Thermo-Fisher S5-3
Supracap 50 Depth Filter PALL SC050V100P
Surgical Scissors Thermo-Fisher 08-951-5
Sw41Ti Rotor Beckman Coulter 331362 Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 Rotor Beckman Coulter 369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes Beckman Coulter 359472
TEMED Invitrogen 15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) Beckman Coulter 344059
Tris Base Thermo-Fisher BP152-5
Tubing Screw Clamp PALL 88216
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-1L
Utility Pressure Gauges Cole-Parmer 68355-06

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Investigación del cáncer número 183
Producción de virus de la enfermedad de Newcastle recombinante de alto título a partir de líquido alantoico
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