ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה מנוזל אלנטואי
Summary
כאן אנו מספקים הליך מפורט לייצור, טיהור וכימות של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה. פרוטוקול זה מניב באופן עקבי > 6 × 109 יחידות יוצרות פלאק/מ”ל, ומספק כמויות נגיפיות המתאימות למחקרים בבעלי חיים in vivo . מתוארים מבחני בקרת איכות נוספים להבטחת בטיחות in vivo .
Abstract
נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), הידוע גם בשם אורתובולה עופות serotype-1, הוא נגיף RNA חד-גדילי בעל חוש שלילי שפותח הן כנגיף אונקוליטי והן כחיסון בעל וקטור נגיפי. NDV הוא סוכן טיפולי ומניעה אטרקטיבי בשל מערכת הגנטיקה ההפוכה המבוססת היטב שלו, תכונות אימונוסטימולטוריות חזקות ופרופיל בטיחות מעולה. כאשר הוא ניתן כנגיף אונקוליטי או כחיסון בעל וקטור נגיפי, NDV מעורר תגובה חיסונית חזקה של אנטיטומור או אנטיגן ספציפי, ומפעיל הן את הזרוע המולדת והן את הזרוע הנרכשת של מערכת החיסון.
בהתחשב במאפיינים רצויים אלה, NDV הוערך בניסויים קליניים רבים והוא אחד הנגיפים האונקוליטיים הנחקרים ביותר. נכון לעכשיו, ישנם שני ניסויים קליניים רשומים הכוללים NDV: אחד המעריך חיסון רקומביננטי בעל וקטור NDV עבור SARS-CoV-2 (NCT04871737), והשני מעריך קידוד NDV רקומביננטי אינטרלוקין-12 בשילוב עם Durvalumab, נוגדן antiPD-L1 (NCT04613492). כדי להקל על התקדמות נוספת של הווקטור הנגיפי המבטיח ביותר הזה, יש צורך בשיטות פשוטות ליצירת NDV רקומביננטי (rNDV) ברמה גבוהה, בדרגה in vivo.
מאמר זה מתאר הליך מפורט להגברת rNDV בביצי עוף עובריות ללא פתוגנים (SPF) וטיהור rNDV מנוזל אלנטואי, עם שיפורים להפחתת האובדן במהלך הטיהור. כמו כן נכללים תיאורים של מבחני בקרת האיכות המומלצים, אשר יש לבצע כדי לאשר חוסר מזהמים ושלמות הנגיף. באופן כללי, הליך מפורט זה מאפשר סינתזה, טיהור ואחסון של NDV ברמה גבוהה, בדרגה in vivo, רקומביננטית, לנטוגנית ומזוזנית לשימוש במחקרים פרה-קליניים.
Introduction
נגיף מחלת ניוקאסל, הידוע גם בשם Avian Orthoavulavirus-1, הוא עטוף פרמיקסווירוס עופות בעל פוטנציאל לשמש הן כנגיף אונקוליטי והן כחיסון בעל וקטור נגיפי 1,2,3,4,4,5,6,7. לאחרונה, NDV שתוכנן לבטא את חלבון הספייק של SARS-CoV-2 אופיין כחיסון תוך-ורידי יעיל במודלים של אתגר עכברים ואוגרים 7,8,9. כאשר משתמשים בה כאימונותרפיה של סרטן, היא גורמת לגיוס של תאי חיסון מולדים, במיוחד תאי הרג טבעיים, ייצור של אינטרפרון מסוג I, ויצירת תאי T ספציפיים לאנטי-סרטניים 10,11,12,13. בנוסף לתכונות אימונוסטימולטוריות חזקות אלה, ל- NDV יש פרופיל בטיחות חזק ומערכת גנטיקה הפוכה מבוססת היטב 14,15. מאפיינים רצויים אלה הניעו את הערכת NDV בניסויים קליניים פרה-קליניים ובני אדם רבים (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. כדי לקדם עוד יותר את הווקטור הנגיפי המבטיח והמעורר חיסון הזה, יש צורך בשיטות מפורטות לייצור וטיהור של NDV גבוה וטהור במיוחד, שניתן לתת בבטחה in vivo.
כמו NDV הוא paramyxovirus עופות, הוא מוגברת לעתים קרובות ביותר ביצי תרנגולת עוברי. אמנם קיימות מערכות מבוססות תאים להפצת NDV, אך רובן לא הצליחו לייצר טיטרים דומים לאלה שהושגו בביצי תרנגולת עובריות18. עם זאת, ישנם כמה חסרונות בייצור NDV בביצים, כולל העובדה כי הייצור מבוסס ביצים הוא ארוך ולא ניתן להרחבה בקלות, מיקור כמויות גדולות של ביצי עוף SPF יכול להיות בעייתי, וקיים פוטנציאל לזיהום עם אלרגנים ביצים 13,18,19,20 . לאחרונה, קבוצה אחת הראתה שתאי Vero שגדלו בתרחיף במדיום ללא סרום יכולים לתמוך בשכפול של NDV לטיטרים דומים לאלה שהושגו בביצים, לפני טיהור21. עם זאת, זה דרש העברה סדרתית של הנגיף כדי להתאים את הנגיף לתאי Vero, ואת האופטימיזציה של שיטה לטהר NDV מתאי Vero השעיה עדיין נדרש21.
כפי שהודגש קודם לכן, השיטות המשמשות לטיהור נגיף בדרגה גבוהה, בדרגה in vivo משתנות בהתאם לנגיף המדובר22. קיימת מערכת גנטיקה הפוכה מבוססת היטב הזמינה ליצירת NDV רקומביננטי. תהליך זה, הכולל שימוש בשיבוט cDNA, פלסמידים מסייעים ונגיף עוזר המבטא T7 RNA פולימראז, תואר בעבר בפירוט15,23. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על NDV לנטוגני או מזוגני. הנגיף המתואר בפרוטוקול זה הוא NDV מזוגני רקומביננטי המקודד את החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) מהמדוזה Aequorea victoria המוחדרת בין גנים נגיפיים P ו-M כיחידת שעתוק בודדת, שכן זה תואר בעבר כאתר האופטימלי להחדרת טרנסגנים זרים24.
שיטות סגורות מתארות את הטיהור של NDV על סמך גודלו, הנע בין 100 ל-500 ננומטר, וצפיפותו15. זה איפשר יצירת מלאי NDV בדרגה in vivo, עם טיטר גבוה, תוך כ-3 שבועות, החל מרגע קבלת הביצים ועד לקבלת טיטר סופי. מתוארות טכניקות המשמשות לעתים קרובות בייצור בקנה מידה גדול של וירוסים מבוססי ביצים כגון סינון זרימה משיק, סינון עומק ואולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, מה שמאפשר תרגום של שיטות אלה לייצור בקנה מידה גדול יותר. טכניקות שתוארו בעבר לטיהור NDV שופרו על ידי שילוב של מאגר מייצב וירוסים, שימוש ביודיקסנול במהלך אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, ותיאור של אמצעי בקרת איכות שונים כדי להבטיח איכות בדרגה in vivo 15. זה איפשר טיהור של NDV בדרגה in vivo המגיע לטיטרסים עד 3 × 1010 10 PFU/mL מ-0.8 ל-1.0 ליטר של נוזל אלנטואי.
Protocol
Representative Results
Discussion
וירוסים המשמשים כחומרים טיפוליים במחקרים פרה-קליניים חייבים להיות מטוהרים מאוד כדי למנוע רעילות כאשר הם ניתנים in vivo15. אם סוכנים הרפתקנים או מזהמים אינם מוסרים, זה יכול להוביל לתגובות שליליות חמורות השוללות את ההשפעה הטיפולית של הסוכן הנגיפי28. מכיוון ש-NDV מי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.G.E.Y זכה במלגת דוקטורט של הקולג’ הווטרינרי של אונטריו ובמלגת בוגרים של אונטריו. עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה מענקי תגלית ל- SKW (מענק #304737) ו- LS (מענק #401127).
Materials
| 0.25% Trypsin | HyClone | SH30042.02 | |
| 1 mL Slip-Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 302995 | |
| 10% Povidone Iodine Solution | LORIS | 109-08 | |
| 15 mL Conical Tubes | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle | BD | 305196 | |
| 25 G x 5/8 in Needle | BD | 305122 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% Paraformaldehyde-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
| 96 Well Tissue Culture Plate – Flat Bottom | Greiner Bio One | 655180 | |
| Acetic Acid, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
| Agarose | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 Centrifuge | Beckman Coulter | B08861 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Bleach (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Broad, unserrated tipped forceps | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Centramate Cassette Holder | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Incubator | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
| Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Sportsman Egg Incubator | Berry Hill | 1502W | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Egg Candler | Berry Hill | A46 | |
| Ethanol (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fine Point High Precision Forceps | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| Fluorescent Microscope | ZEISS AXIO | Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein | |
| Freeze Dry System Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging of Agarose Gels | |
| Glycerol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
| Humidity Kit | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile) |
| L-Lysine Monohydrochloride | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Peristaltic Pump with digital display |
| Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Platinum-Cured Silicone |
| MC Pro 5 Thermocycler | Eppendorf | EP950040025 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast and running appartus |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
| Normal Goat Serum | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Model 1655050 – for Agarose gel electrophoresis | |
| Q5 High Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide (Pellets) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Specific pathogen free eggs | CFIA | NA | Supplier will vary depending on location |
| Sucrose | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 Depth Filter | PALL | SC050V100P | |
| Surgical Scissors | Thermo-Fisher | 08-951-5 | |
| Sw41Ti Rotor | Beckman Coulter | 331362 | Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
| SX4750 Rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes | Beckman Coulter | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| Tubing Screw Clamp | PALL | 88216 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| Utility Pressure Gauges | Cole-Parmer | 68355-06 |
References
- Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
- Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
- Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
- Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
- Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
- McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
- Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219 (2021).
- Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
- Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
- Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
- Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
- Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
- Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
- Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
- Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
- Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
- Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
- Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
- Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
- Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
- Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335 (2021).
- Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018 (2016).
- Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830 (2013).
- Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, 40-45 (2015).
- van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).
- Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
- Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
- Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50 (2014).
- Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
- Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
- Axis-Shield. . Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
- Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
- Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
- Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
- Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
- Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
- Chen, T. -. F., Jang, J. -. W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , 1-14 (2007).
- Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923 (2017).
