Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה מנוזל אלנטואי

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/63817
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathobiology, University of Guelph

Summary

כאן אנו מספקים הליך מפורט לייצור, טיהור וכימות של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה. פרוטוקול זה מניב באופן עקבי > 6 × 109 יחידות יוצרות פלאק/מ"ל, ומספק כמויות נגיפיות המתאימות למחקרים בבעלי חיים in vivo . מתוארים מבחני בקרת איכות נוספים להבטחת בטיחות in vivo .

Abstract

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), הידוע גם בשם אורתובולה עופות serotype-1, הוא נגיף RNA חד-גדילי בעל חוש שלילי שפותח הן כנגיף אונקוליטי והן כחיסון בעל וקטור נגיפי. NDV הוא סוכן טיפולי ומניעה אטרקטיבי בשל מערכת הגנטיקה ההפוכה המבוססת היטב שלו, תכונות אימונוסטימולטוריות חזקות ופרופיל בטיחות מעולה. כאשר הוא ניתן כנגיף אונקוליטי או כחיסון בעל וקטור נגיפי, NDV מעורר תגובה חיסונית חזקה של אנטיטומור או אנטיגן ספציפי, ומפעיל הן את הזרוע המולדת והן את הזרוע הנרכשת של מערכת החיסון.

בהתחשב במאפיינים רצויים אלה, NDV הוערך בניסויים קליניים רבים והוא אחד הנגיפים האונקוליטיים הנחקרים ביותר. נכון לעכשיו, ישנם שני ניסויים קליניים רשומים הכוללים NDV: אחד המעריך חיסון רקומביננטי בעל וקטור NDV עבור SARS-CoV-2 (NCT04871737), והשני מעריך קידוד NDV רקומביננטי אינטרלוקין-12 בשילוב עם Durvalumab, נוגדן antiPD-L1 (NCT04613492). כדי להקל על התקדמות נוספת של הווקטור הנגיפי המבטיח ביותר הזה, יש צורך בשיטות פשוטות ליצירת NDV רקומביננטי (rNDV) ברמה גבוהה, בדרגה in vivo.

מאמר זה מתאר הליך מפורט להגברת rNDV בביצי עוף עובריות ללא פתוגנים (SPF) וטיהור rNDV מנוזל אלנטואי, עם שיפורים להפחתת האובדן במהלך הטיהור. כמו כן נכללים תיאורים של מבחני בקרת האיכות המומלצים, אשר יש לבצע כדי לאשר חוסר מזהמים ושלמות הנגיף. באופן כללי, הליך מפורט זה מאפשר סינתזה, טיהור ואחסון של NDV ברמה גבוהה, בדרגה in vivo, רקומביננטית, לנטוגנית ומזוזנית לשימוש במחקרים פרה-קליניים.

Introduction

נגיף מחלת ניוקאסל, הידוע גם בשם Avian Orthoavulavirus-1, הוא עטוף פרמיקסווירוס עופות בעל פוטנציאל לשמש הן כנגיף אונקוליטי והן כחיסון בעל וקטור נגיפי 1,2,3,4,4,5,6,7. לאחרונה, NDV שתוכנן לבטא את חלבון הספייק של SARS-CoV-2 אופיין כחיסון תוך-ורידי יעיל במודלים של אתגר עכברים ואוגרים 7,8,9. כאשר משתמשים בה כאימונותרפיה של סרטן, היא גורמת לגיוס של תאי חיסון מולדים, במיוחד תאי הרג טבעיים, ייצור של אינטרפרון מסוג I, ויצירת תאי T ספציפיים לאנטי-סרטניים 10,11,12,13. בנוסף לתכונות אימונוסטימולטוריות חזקות אלה, ל- NDV יש פרופיל בטיחות חזק ומערכת גנטיקה הפוכה מבוססת היטב 14,15. מאפיינים רצויים אלה הניעו את הערכת NDV בניסויים קליניים פרה-קליניים ובני אדם רבים (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. כדי לקדם עוד יותר את הווקטור הנגיפי המבטיח והמעורר חיסון הזה, יש צורך בשיטות מפורטות לייצור וטיהור של NDV גבוה וטהור במיוחד, שניתן לתת בבטחה in vivo.

כמו NDV הוא paramyxovirus עופות, הוא מוגברת לעתים קרובות ביותר ביצי תרנגולת עוברי. אמנם קיימות מערכות מבוססות תאים להפצת NDV, אך רובן לא הצליחו לייצר טיטרים דומים לאלה שהושגו בביצי תרנגולת עובריות18. עם זאת, ישנם כמה חסרונות בייצור NDV בביצים, כולל העובדה כי הייצור מבוסס ביצים הוא ארוך ולא ניתן להרחבה בקלות, מיקור כמויות גדולות של ביצי עוף SPF יכול להיות בעייתי, וקיים פוטנציאל לזיהום עם אלרגנים ביצים 13,18,19,20 . לאחרונה, קבוצה אחת הראתה שתאי Vero שגדלו בתרחיף במדיום ללא סרום יכולים לתמוך בשכפול של NDV לטיטרים דומים לאלה שהושגו בביצים, לפני טיהור21. עם זאת, זה דרש העברה סדרתית של הנגיף כדי להתאים את הנגיף לתאי Vero, ואת האופטימיזציה של שיטה לטהר NDV מתאי Vero השעיה עדיין נדרש21.

כפי שהודגש קודם לכן, השיטות המשמשות לטיהור נגיף בדרגה גבוהה, בדרגה in vivo משתנות בהתאם לנגיף המדובר22. קיימת מערכת גנטיקה הפוכה מבוססת היטב הזמינה ליצירת NDV רקומביננטי. תהליך זה, הכולל שימוש בשיבוט cDNA, פלסמידים מסייעים ונגיף עוזר המבטא T7 RNA פולימראז, תואר בעבר בפירוט15,23. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על NDV לנטוגני או מזוגני. הנגיף המתואר בפרוטוקול זה הוא NDV מזוגני רקומביננטי המקודד את החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) מהמדוזה Aequorea victoria המוחדרת בין גנים נגיפיים P ו-M כיחידת שעתוק בודדת, שכן זה תואר בעבר כאתר האופטימלי להחדרת טרנסגנים זרים24.

שיטות סגורות מתארות את הטיהור של NDV על סמך גודלו, הנע בין 100 ל-500 ננומטר, וצפיפותו15. זה איפשר יצירת מלאי NDV בדרגה in vivo, עם טיטר גבוה, תוך כ-3 שבועות, החל מרגע קבלת הביצים ועד לקבלת טיטר סופי. מתוארות טכניקות המשמשות לעתים קרובות בייצור בקנה מידה גדול של וירוסים מבוססי ביצים כגון סינון זרימה משיק, סינון עומק ואולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, מה שמאפשר תרגום של שיטות אלה לייצור בקנה מידה גדול יותר. טכניקות שתוארו בעבר לטיהור NDV שופרו על ידי שילוב של מאגר מייצב וירוסים, שימוש ביודיקסנול במהלך אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, ותיאור של אמצעי בקרת איכות שונים כדי להבטיח איכות בדרגה in vivo 15. זה איפשר טיהור של NDV בדרגה in vivo המגיע לטיטרסים עד 3 × 1010 10 PFU/mL מ-0.8 ל-1.0 ליטר של נוזל אלנטואי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העבודות הכרוכות בשימוש בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת גואלף בהתאם למועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. כל העבודות מבוצעות במעבדה BioSafety Level 2 (BSL2) בקנדה שבה NDV מזוגני הוא פתוגן מקבוצת סיכון 2. כל השלבים הכרוכים בהגברה וטיהור של NDV צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי מסוג IIA למטרות בטיחות ועקרות.

1. הגברה של NDV באמצעות ביצי תרנגולת עובריות מוגדרות ללא פתוגנים

  1. חיסון ביצי עוף עובריות SPF
    הערה: בדרך כלל, שמונה תריסר ביצי עוף עובריות SPF משמשות ליצירת אצווה אחת בדרגה in vivo של NDV. הזמינו תריסר או שניים של ביצים נוספות כדי להסביר את הנזק במהלך המשלוח, כמו גם את השונות בכדאיות. ביצי תרנגולת עובריות הן חומר ביולוגי ויש לטפל בהן בהתאם להנחיות המוסדיות. עם זאת, מאחר שהעוברים אינם בקעו, אין צורך באישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים.
    1. לאחר קבלת ביצי עוף עובריות SPF, דגירה באינקובטור ביצים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 60% לחות במשך 9 ימים. ודאו שהאינקובטור מוגדר לנדנד/לסובב את הביצים באופן אוטומטי מדי שעה.
      הערה: ניתן לאחסן ביצים בטמפרטורת החדר עד 24 שעות או 4 מעלות צלזיוס למשך עד 72 שעות; עם זאת, הדבר עשוי להפחית את כדאיות העוברים.
    2. לאחר 8-11 ימי דגירה (באופן אידיאלי ביום 9), נרות את הביציות כדי לקבוע את כדאיות העובר. חפשו כלי דם דמויי רשת (איור 1A) ותנועת עוברים כאינדיקטורים לעוברים בני קיימא. השליכו ביצים חסרות תכונות אלה (איור 1B).
    3. על הביציות הקיימות, סמנו את הממשק בין שק האוויר לעובר בעיפרון באמצעות 'X' (איור 1A). ודא כי אתר הזרקה זה לא יגרום לניקוב של כלי הדם. מחזירים את הביצים המסומנות לאינקובטור בזמן הכנת האינוקולום.
    4. חשב את כמות הנגיף הנדרשת כדי להזריק את כל ביצי העוף העובריות עם SPF. ודא שכל ביצה מקבלת 100 PFU של הנגיף בנפח של 100 μL; דיללו את הנגיף במי מלח עם מאגר פוספט (PBS) לריכוז של 1 × 103 PFU/mL. הכינו 20% נוספים מהאינוקולום כדי להסביר אי דיוקים בניהול הנגיף.
    5. באמצעות מגבון נוגד סטטי, נקו את החלק העליון של הביצים המסומנות בתמיסת יוד של 10%, המדוללת ב-70% אתנול. המתן בערך 1-2 דקות עד שהתמיסה תתייבש.
    6. חודרים בזהירות את הקליפה באמצעות זוג פינצטה חדה סטרילית. לחטא את הפינצטה ב-70% אתנול בין הביצים.
    7. באמצעות מזרק של 1 מ"ל ומחט של 25 גרם, הזריקו 100 מיקרול של האינוקולום שהוכן בשלב 1.1.4 לתוך החלל הכוריואלנטואי (איור 1C). התקרבו עם המחט בזווית של כמעט 90° לביצה. הכנס את המחט רק לתוך החלק העליון של קרום chorioallantoic.
    8. לאחר החיסון, השתמשו בלק כדי לכסות את אתר הניקוב והחזירו את הביצים לחממה. ודא שהגדרת הנדנדה מופעלת עד 24 שעות לאחר החיסון.
    9. בדוק את כדאיות הביצה 24 שעות לאחר החיסון. השליכו ביצים מתות שחסרות בהן כלי דם בקרום הכוריואלנטואי ובתנועת העובר (איור 1B).
      הערה: ביצים אלה מתו עקב תהליך החיסון ולא מ- NDV.
    10. מחזירים את הביצים לאינקובטור, כאשר הנדנדה יוצאת לדרך כדי למנוע זיהום של הנוזל האלנטואי בחלבוני ביצה.
    11. בדוק את הביצים כל 12-24 שעות כמתואר בשלב 1.1.9 כדי לזהות ביצים מתות. הזיזו את הביצים שמתות לאחר 24 שעות לאחר החיסון ל-4 מעלות צלזיוס כדי למזער את האוטוליזה. קוצרים את הנוזל האלנטואי תוך 2-12 שעות מצינון.
    12. דגירה של הביצים למשך 72 שעות לפחות.
      הערה: אם מפיץ זן מזוגני של NDV, זמן הדגירה האופטימלי הוא 60-72 שעות, שכן זמני דגירה ממושכים עלולים לפגוע בתהליך הטיהור עקב בהירות מופחתת של הנוזל האלנטואי. נושא זה אינו חשוב כל כך בעת הפצת זני NDV לנטוגניים מכיוון שלוקח להם הרבה יותר זמן להרוג את העובר.
    13. לאחר תקופת הדגירה המתאימה, הזיזו את הביצים הנותרות ל-4 מעלות צלזיוס למשך 2-12 שעות לפני קצירת הנוזל האלנטואי.
  2. קצירת נוזל אלנטואי המכיל NDV
    1. העבירו את הביצים המצוננות לתוך ארון הבטיחות הביולוגית. נקו את החלק העליון של הביצים עם 70% אתנול.
    2. השתמשו בפינצטה סטרילית ובמספריים כירורגיים כדי לפתוח את הצד האפי של הביצה שבו נמצא שק האוויר.
    3. הסר את הקליפה כדי לחשוף את הממברנה הכוריו-אלנטואית (איור 1D).
    4. נקבו בזהירות את הממברנה וקלפו אותה בחזרה כדי לחשוף את החלל האלנטואי (איור 1E). ודא כי שק החלמון אינו מנוקב בטעות, כמו גם זה יקלקל את הביצה.
    5. השתמשו במלקחיים קהים כדי לתפוס את העובר ולפתוח את השק העוברי.
      הערה: הנוזל בתוך השק העוברי מכיל גם NDV.
    6. לדכא את העובר עם המלקחיים ולאסוף את הנוזל האלנטואי באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.
    7. אחסנו את הנוזל האלנטואי על קרח בצינורות חרוטיים של 15 מ"ל עד להבהרה.
      הערה: אם הנוזל האלנטואי הוא צהוב, שק החלמון נפגע ויש להשליך את הנוזל האלנטואי.
    8. צנטריפוגה הצינורות החרוטיים המכילים את הנוזל האלנטואי ב 1,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F).
    9. נקודת השהיה: אליקו את הנוזל האלנטואי המובהר לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך (למשל, שבועות עד חודשים), ותשלימו את הנוזל עם סוכרוז לריכוז סופי של 5% כדי להגן על הנגיף מפני ההשפעות הקשות של הפשרה בהקפאה. לחלופין, לאחסון לטווח קצר (למשל, 1-3 ימים), הוסיפו את הנוזל האלנטואי עם סוכרוז (5 סופיים%) או עם 3x חיץ מניטול-ליזין (ML) (15% מניטול, 3% ליזין; ראו טבלה משלימה S1 למתכוני חיץ) כדי להניב ריכוז סופי של פי 1 (5% מניטול, 1% ליזין) לפני האחסון ב-4 מעלות צלזיוס.

2. טיהור NDV מנוזל אלנטואי

  1. סינון עומק של נוזל אלנטואי
    1. אחסנו את הנוזל האלנטואי המובהק בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס והפשירו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בלילה שלפני הטיהור.
    2. בארון בטיחות ביולוגי, הגדירו את הצינורות ואת המשאבה הפריסטלטית כפי שניתן לראות באיור 2.
    3. אם עדיין לא בוצע, שלבו את הנוזל האלנטואי עם מאגר 3x ML לריכוז סופי של 1x.
    4. לפני חיבור מסנן העומק, יש לעקר את הצינורות על ידי מעבר של 50 מ"ל של 0.5 M NaOH דרך המערכת לתוך כלי פסולת.
    5. שטפו את הצינורות על ידי העברת 100 מ"ל של מים סטריליים ברמה מולקולרית דרך המערכת ולתוך כלי הפסולת.
      הערה: מכיוון ש- NaOH ישבית את NDV, חשוב שהקווים ישטפו כראוי לפני החדרת הנוזל האלנטואי המכיל את הנגיף.
    6. שפרם את המערכת על ידי הפעלת 50 מ"ל של PBS דרכה, עצירת המשאבה כאשר נותרו כ -5 מ"ל של PBS בצינור.
    7. חברו את מסנן העומק עם דירוג שמירה של 1-3 μM לצינור והסר את המכסה השני בצד האפי של מסנן העומק כדי לאוורר את המסנן. התחל להריץ 50 מ"ל נוספים של PBS דרך המערכת.
    8. ברגע ש-PBS מתחיל לזרום דרך פתח האוורור שבראש המסנן, סגרו את היציאה והמשיכו להזרים PBS דרך הקווים.
      הערה: בועות אוויר קלות מקובלות אך נוכחותן של כמויות גדולות של אוויר תחייב את המסנן להיות מאוורר שוב כמתואר בשלבים 2.1.7 ו- 2.1.8.
    9. עצור את המשאבה כאשר נותרו כ-5 מ"ל של PBS בצינור.
    10. החלף את כלי הפסולת בכלי איסוף סטרילי חדש והתחל להזרים נוזל אלנטואי דרך מסנן העומק.
      הערה: הלחץ לא צריך לעלות על 10 psi כמו זה גורם גזירה של הנגיף. ניתן לתמרן את הלחץ על ידי הקטנת או הגדלת קצב הזרימה של המשאבה. אם הלחץ מתחיל לעלות על 10 psi ולא ניתן להקטין עוד יותר את קצב הזרימה, יש להשתמש במסנן עומק חדש. במקרה זה, שלבים 2.1.6-2.1.8 צריכים להתבצע לפני חידוש זרימת הנוזל האלנטואי.
    11. לאחר שכל הנוזל האלנטואי עבר דרך המסנן, הפעל 50 מ"ל של מאגר 1x ML דרך הקווים כדי למקסם את התאוששות הנגיף.
    12. אספו את הנוזל עד שהקווים מתייבשים. אחסן את הנגיף למשך הלילה או עד 36 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: לאחר שהנגיף עבר סינון עומק, המשך בתהליך הטיהור תוך 36 שעות מהשלמת סינון העומק.
    13. נתקו את מסנן העומק וחיטוי הצינורות על ידי הפעלת 100 מ"ל של 0.5 M NaOH, אקונומיקה של 400 PPM שתוכננה מראש ל-42 מעלות צלזיוס דרך המערכת לפני האחסון ב-0.5 M NaOH.
  2. סינון זרימה משיק לריכוז NDV
    1. הרכיבו את הרכיבים של הקלטת כפי שהם מתוארים באיור 3A (וכפי שהוצג קודם לכן25) בארון בטיחות ביולוגי.
      הערה: יש לשטוף את הסעפת ואת לוחית הקצה בחומר ניקוי ולייבש אותה לפני השימוש. אטמי הסיליקון ניתנים לשימוש חוזר ויש לאחסן אותם ב- 0.5 M NaOH עם הקסטה.
    2. הגדר את מערכת סינון הזרימה המשיקה (TFF) (הידועה גם בשם סינון זרימה צולבת) בקונפורמציה 'פתוחה' (איור 3B).
      1. אם אתם משתמשים בקלטת בפעם הראשונה, הרכיבו את קלטת ה-TFF בקונפורמציה של Elution ושטפו 100 מ"ל של מים סטריליים ברמה מולקולרית (איור 3C).
      2. ברגע שנותרו רק 5 מ"ל של מים במיכל המאגר, השהו את המשאבה ושנו את מערך מערכת ה-TFF לקונפורמציה סגורה (איור 3D).
      3. הוסף 100 מ"ל של 0.5 M NaOH, 400 PPM אקונומיקה מתוכנן מראש ל 42 °C למאגר ומחזור דרך המערכת במשך 30-60 דקות.
      4. השהה את הזרימה והחזיר את מערכת ה- TFF להגדרת האלוטיון, וחידש את הזרימה כדי להרים את תמיסת הניקוי.
      5. כאשר נותרו כ-5 מ"ל במאגר, השהו את המשאבה והוסיפו 100 מ"ל של מים סטריליים ברמה מולקולרית כדי לשטוף את המערכת.
      6. כאשר נותרו כ-5 מ"ל במאגר, השהו את המשאבה והניחו את מערכת ה-TFF בקונפורמציה הפתוחה (איור 3B). המשך עם שלב 2.2.3.
    3. לעקר את הקלטת ואת צינורות על ידי העברת 100 מ"ל של 0.5 M NaOH דרך המערכת באמצעות משאבה peristaltic. ודא כי הלחץ אינו עולה על 30 psi כדי לשמור על שלמות הקלטת.
    4. השהה את המשאבה כאשר נותרו במאגר כ-5 מ"ל של 0.5 מ"ל NaOH.
    5. מוסיפים למאגר 100 מ"ל מים סטריליים ברמה מולקולרית וחוזרים להעביר את הנוזל דרך הקסטה. סובבו את המאגר כדי לשטוף את כל NaOH מצידי המאגר כדי למנוע השבתה של הנגיף. חזור על שלב שטיפת המאגר.
    6. כאשר נותרו במאגר כ-5 מ"ל מים סטריליים בדרגה מולקולרית, השהו את המשאבה.
    7. הוסיפו למאגר 100 מ"ל של PBS, תוך הסתחררות כדי להבטיח שהמים הסטריליים בדרגה מולקולרית נשטפים מהצדדים. לחדש את זרימת הנוזל דרך הקלטת.
    8. כאשר נותרו כ-5 מ"ל במאגר, השהו את המשאבה, הוסיפו למאגר נוזל אלנטואי מסונן לעומק וחידשו את זרימת המשאבה.
    9. עקוב אחר מד הלחץ 1 (איור 3B) כדי לוודא שהוא לא יעלה על 10 psi כדי למנוע גזירה של הנגיף. השתמש בשילוב של מהירות המשאבה הפריסטלטית ושימוש במהדקי C כדי להגביר את ההתרוממות לפסולת.
      הערה: שילוב של מהירות המשאבה הפריסטלטית ומהדקי C יגרום ללחץ מוגבר.
    10. כאשר נותרו 50-100 מ"ל של נוזל אלנטואי במאגר, השהה את המשאבה כדי לבצע חילופי חיץ על ידי הוספת 150-200 מ"ל של חיץ 1x ML.
    11. חזור לזרימת המשאבה, ושוב נטר את מד הלחץ 1 (איור 3B) כדי להבטיח שהוא לא יעלה על 10 psi.
    12. כאשר נותרו 5-10 מ"ל במאגר, השהה את המשאבה.
    13. באמצעות שני מהדקי C, סגור את שני קווי הפסולת כפי שמוצג באיור 3C.
    14. שחררו את הקו המחזיר המזין את המאגר והכניסו אותו לצינור חרוטי של 50 מ"ל (איור 3C).
    15. לחדש את זרימת המשאבה, ולהשתהות כאשר נותרו כמה טיפות של נוזל במיכל המאגר.
    16. הסר את מהדקי ה-C מקווי הפסולת וחבר מחדש את קו ההזנה החוזר למיכל המאגר (איור 3B).
    17. הוסיפו 20-25 מ"ל של מאגר 1x ML וחידשו את זרימת המשאבה עד שנותרו כ-5 מ"ל במיכל המאגר.
    18. חזור על שלבים 2.2.13 עד 2.2.16.
      הערה: ניתן לבצעהעלאה שלישית על ידי חזרה על שלבים 2.2.17 ו- 2.2.13 עד 2.2.16 כדי להגדיל את תפוקת הנגיף. עם זאת, רוב הנגיף נמצא בשני האלוטים הראשונים.
    19. לאחר סיום ההמלטות, הניחו את הנגיף על הקרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    20. כדי לנקות את הקווים, הגדירו את המערכת כך שתהיה תבנית לולאה סגורה (איור 3D) כאשר קווי הפסולת מזינים בחזרה למאגר כפי שמתואר באיור 3D.
    21. המשך לנקות את המערכת על ידי הוספת 250 מ"ל של 0.5 M NaOH, 400 PPM אקונומיקה מתוכנן מראש ל 42 °C (76 °F).
    22. הזרימו את תמיסת הניקוי דרך המערכת במהלך הלילה.
      הערה: בעת חישוב מחדש של תמיסת הניקוי, אם המשאבה מופעלת במהירות של 50 מ"ל לדקה, יש לצפות בלחץ של כ-5 psi. אם הלחץ עולה על זה, הקלטת מלוכלכת, ויש להחליף את תמיסת הניקוי, והתהליך יחזור על עצמו.
    23. הקפידו על תמיסת הניקוי על ידי הכוונת שני קווי הפסולת והקו הנסוג למיכל פסולת.
    24. מוסיפים 400-500 מ"ל מים סטריליים למאגר ומזרימים אותם דרך המערכת ולתוך כלי הפסולת.
    25. כאשר כ 5 מ"ל נשאר במאגר, להשהות את המשאבה ולהוסיף 100-200 מ"ל של 0.5 M NaOH למיכל המאגר, מערבל את התמיסה כדי לשטוף את מיכל המאגר.
    26. לאחר שהמאגר כמעט ריק, חזור על שלב 2.2.23 פעמיים נוספות.
    27. פרקו את מערך ה-TFF, ואחסנו את קלטת ה-TFF והאטמים בנפח קטן של 0.5 M NaOH בשקית ניילון הניתנת לסגירה חוזרת ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן צינורות בטמפרטורת החדר כשהם שקועים ב-0.5 M NaOH.
  3. צפיפות יודיקסנול הדרגתית אולטרה-צנטריפוגציה
    1. הפעילו את האולטרה-סנטריפוג' והגדירו אותו ל-4 מעלות צלזיוס. Precool את הרוטור הרצוי ב 4 ° C גם כן (ראה את טבלת החומרים).
      הערה: יש לאחסן רוטורים בטמפרטורה של 4 °C (75 °F).
    2. השתמש בתמיסת יודיקסנול במלאי של 60% (ריכוז בעת הרכישה) כדי לייצר פתרונות של 40%, 20% ו-10% יודיקסנול על ידי דילול עם PBS ו-3x ML Buffer לריכוז סופי של פי 1 של מאגר ML.
    3. ב-13.2 מ"ל, בצינור אולטרה-צנטריפוג' בעל ראש פתוח ודק, שכבת-על של 0.5 מ"ל, 2.5 מ"ל ו-2.5 מ"ל מתוך תמיסות ה-40%, 20% ו-10% יודיקסנול, בהתאמה (איור 4A).
      הערה: הטיית הצינור ultracentrifuge על צדו וסילוק איטי של הפתרון יפחיתו באופן משמעותי את הסיכון לערבוב שתי שכבות השיפוע. ההפרדה של כל שכבה צריכה להיות ברורה, כאשר "הילה" נראית בין כל שכבה של השיפוע.
    4. השתמש בעט סמן כדי לסמן את הממשקים של שכבות מעבר הצבע השונות.
    5. שכבה 6-6.5 מ"ל של הווירוס החמקמק מהליך TFF מעל שיפוע הצפיפות. הוסף את הווירוס בזהירות כמתואר בשלב 2.3.3 כדי למנוע הפרעה לשיפוע הצפיפות.
    6. טען את הצינורות האולטרה-צנטריפוגים לתוספות עבור רוטור הדלי המתנדנד (ראה טבלת החומרים) באמצעות סולם עליון פתוח כדי לאזן את התוספות בטווח של 0.01 גרם זו מזו. השתמש ב- PBS או ב- extra virus eluent כדי להסביר את הבדלי המשקל.
    7. ברגע שהצינורות מאוזנים, מכסים את הצינורות ומעמיסים אותם לתוך הרוטור.
    8. צנטריפוגה במשך 1.5 שעות ב 125,000 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לבצע זאת במהלך הלילה אם זמין ultracentrifuge עם יכולת השהייה-התחלה.
    9. לאחר ultracentrifugation, להסיר את הצינורות באמצעות זוג מלקחיים סטריליים. חפשו את רצועת היעד - רצועה גדולה - בין שיפועי ה-10% ל-20% (איור 4B).
    10. השהו את הצינור מעל החלק העליון של הכוס באמצעות מעמד רטורט.
    11. חברו מחט בגודל 18 גרם x 1.5 אינץ' למזרק של 5 מ"ל ונקבו את הצד של צינור האולטרה-סנטריפוג'.
      הערה: יש לנקב את הצינור מעט מתחת לרצועת המטרה, כאשר המחט נמצאת בזווית כלפי מעלה ומשתפלת כלפי מעלה כך שהיא תעבור לתוך רצועת המטרה.
    12. הרחיבו באיטיות את הבוכנה כדי להסיר את רצועת המטרה.
      הערה: הזז את המחט בתוך רצועת המטרה כדי למקסם את הנגיף שחולץ. היזהרו מכך שלהקות או פסולת אחרות לא יתערבבו עם רצועת המטרה, והימנעו מלקחת תמיסה עודפת מכיוון שהדבר יוביל לשימוש בקסטות דיאליזה נוספות.
    13. לאחר חילוץ רצועת המטרה, הסר את המחט, ואפשר לתמיסה הנותרת להתנקז לכוס הפסולת. מחלקים את רצועת המטרה לצינור חרוטי של 50 מ"ל עד שהוצאו כל הרצועות מכל שאר הצינורות האולטרה-צנטריפוגיים.
    14. חזור על שלבים 2.3.10-2.3.13 עד שכל רצועות המטרה הוצאו מכל צינורות האולטרה-סנטריפוג'.
    15. גישה חלופית לחילוץ רצועות המטרה כמתואר בשלבים 2.3.10 עד 2.3.13
      1. הסר באיטיות את הנוזל המכסה את רצועת המטרה באמצעות פיפטה. פעם אחת בפס המטרה, לחלץ באמצעות פיפטה ולאחסן את הנגיף בצינור חרוטי 50 מ"ל.
        הערה: הדבר מאפשר שימוש חוזר בצינורות ultracentrifuge.
  4. הסרת יודיקסנול מתמיסת וירוסים
    הערה: הרצועה המכילה NDV מופיעה בצפיפות יודיקסנול בין 15% ל-16%. ניתן לקבוע את ריכוז היודיקסנול בתמיסה על ידי מדידת הספיגה ב-340 ננומטר בהתייחס לעקומה סטנדרטית (איור משלים S1). ניתן להשמיט שלב זה מכיוון שלא נצפו תופעות לוואי או רעילות חריפה כאשר תמיסות יודיקסנול בריכוז זה ניתנו לעכברים C57BL/6.
    1. הקדים קלטת דיאליזה של 0.5-3 מ"ל 10 kDa במשקל מולקולרי של 10 kDa על ידי טבילתה ב-PBS למשך דקה אחת.
      הערה: קרום הדיאליזה צריך להשתנות ממראה חלק למראה מקופל או גבשושי. אם נפח הנגיף שחולץ עולה על 10 מ"ל, יש להשתמש בשתי קלטות דיאליזה של 0.5-3 מ"ל או קלטת דיאליזה של 5-12 מ"ל.
    2. לפי העניין, השתמש במזרק 5 או 10 מ"ל ובמחט מילוי קהה בגודל 18 G x 1.5 אינץ ' כדי לאסוף את הנגיף מהצינור החרוטי 50 מ"ל.
    3. השתמש במזרק כדי להיכנס לקלטת הדיאליזה, נזהר שלא לחדור את הממברנה, ולהזריק את הנגיף.
      הערה: ניתן לסובב את קלטת הדיאליזה כדי לתפעל את מיקום כיס האוויר בקלטת. יש להסיר את כיס האוויר לפני הסרת המחט מהקלטת.
    4. מלאו 1 ליטר עם PBS סטרילי 1x, הניחו מוט ערבוב ואת קלטת הדיאליזה בפנים, וכסו. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין.
      הערה: השתמש בקצף פוליסטירן מובלט וברצועה אלסטית כדי לחבר את קלטת הדיאליזה כך שהיא תצוף ב- PBS. הקלטת עשויה להתנפח מעט בגלל מאגר ה-ML.
    5. לאחר 1-2 שעות, החליפו ב-PBS 1x טרי והמשיכו לדגר ב-4 מעלות צלזיוס לעוד 8-10 שעות עם ערבוב קל.
      הערה: ניתן לעשות זאת גם בן לילה.
    6. החלף עם PBS 1x טרי פעם נוספת, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות.
  5. ריכוז תמיסת הנגיף
    1. הסירו את קלטת הדיאליזה ממאגר הדיאליזה (איור 4C) והכניסו אותה לשקית ניילון קטנה ואטומה. הוסף 15-25 מ"ל של 40% 20,000 MW פוליאתילן גליקול כך שקסטת הדיאליזה שקועה לחלוטין.
    2. דגירה בטמפרטורת החדר עם נדנדה. בדוק את נפח הנגיף בקלטת מעת לעת באמצעות מזרק 5 או 10 מ"ל ומחט מילוי קהה של 18 G x 1.5 אינץ '.
      הערה: משך הזמן הנדרש לריכוז הנגיף ישתנה בהתאם לנפח ההתחלה ולנפח הסיום הרצוי. בדרך כלל, הנפח הרצוי הסופי הוא בין 1 ל -1.5 מ"ל ללא קשר לנפח ההתחלתי של נוזל אלנטואי. בעת בדיקת הנפח, היזהר שלא להשתמש באותה יציאה שכן הדבר יפגע בשלמות היציאה ועלול לגרום לערבוב של תמיסת הפוליאתילן גליקול והנגיף.
    3. לפני הסרת הווירוס המרוכז מתוך קלטת הדיאליזה, שטפו לזמן קצר את הקלטת ב-1x PBS ומלאו מחט מילוי קהה בגודל 18 גרם x 1.5 אינץ' באוויר.
    4. הכנס את המזרק מלא האוויר לתוך קלטת הדיאליזה ולחץ על הבוכנה. סובב את המנגנון כך שניתן יהיה להסיר את הווירוס המרוכז מבלי להסיר אף אחד מהאוויר שהוכנס.
    5. מחלקים את הנגיף המרוכז לצינור חרוטי של 50 מ"ל, ומציינים את הנפח שחולק.
    6. באמצעות אותו מזרק ומחט, להזריק כמות מתאימה של 60% סוכרוז לתוך קלטת הדיאליזה, כך שכאשר בשילוב עם הנגיף שהוסר בעבר, הוא בריכוז סופי של 5% סוכרוז.
    7. השתמש באצבעות עם כפפות כדי לעסות את הממברנה כדי לעקור את שאריות הנגיף שאולי דבק בקרום, תוך הקפדה שלא לפגוע בו. הסר חלק מעודפי האוויר בקלטת הדיאליזה כדי להקל על תהליך הניתוק.
    8. שלבו את הכביסה הזו עם הנגיף כבר בצינור החרוטי 50 מ"ל.
      הערה: הנגיף נמצא כעת ב-5% סוכרוז ומוכן לחלוקה ל-20 μL, 50 μL, 100 μL או 200 μL aliquots ומאוחסן ב-80°C-. לחלופין, עבור אחסון לטווח ארוך, ניתן ליופיליזציה של NDV ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4 °C (6 °F), כמתואר בסעיף 2.6.
  6. ליופיליזציה של NDV
    1. Lyophilize את הנגיף aliquoted בצינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל או צינורות חרוטיים 15 מ"ל ב 44 × 10-3 MBAR ו -52 °C עבור 16 שעות.
    2. אחסנו את הדגימות הלופיליות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ללא הפחתה משמעותית בטיטר הנגיפי.

3. מבחני בקרת איכות

  1. בידוד RNA נגיפי ו-PCR של שעתוק הפוך לאישור גנום
    1. להפשיר 20 μL וירוס aliquot. עקוב אחר פרוטוקול בידוד הרנ"א הנגיפי המסופק עם הערכה.
    2. השתמש באופן מיידי ב- RNA המבודד כתבנית ל- PCR של שעתוק הפוך (RT-PCR) או אחסן אותו בטמפרטורה של -80 °C (80 °C).
    3. הכן את תגובות התמלול ההפוך כמתואר בפרוטוקול שסופק על ידי היצרן.
    4. השתמש ב-cDNA שנוצר כתבנית לתגובות PCR שונות לבקרת איכות כדי לאשר את הפתוטיפ של NDV (טבלה 1, ערכת פריימרים של חלבון F) ואת נוכחותם של רכיבי בקרת גנים נדרשים (טבלה 1, ערכת פריימרים טרנסג'נית).
      הערה: פריימרים צריכים להיות מתוכננים על סמך הזן של NDV המופץ.
      1. כדי לרצף את אתר הבקיעה של חלבון F, הדטרמיננטה העיקרית של הפתוטיפ, השתמש בערכת פריימרים של חלבון F (טבלה 1). חפשו מוצר PCR באורך של 435 זוגות בסיסים.
        הערה: כאן, פריימרים תוכננו על בסיס זן LaSota של NDV (הצטרפות Genbank AF077761.1). זה מבוסס היטב כי ביטוי טרנסג'ן אופטימלי מתרחש כאשר טרנסגן זר מוכנס בין הגנים P ו- M24.
      2. השתמש בערכת הפריימרים הטרנסגניים כדי לאשר את שלמותם של רכיבי התחלת הגן וסיום הגן של הטרנסגן. תרצף את מוצר ה-PCR כדי לאשר את שלמות ההתחלה של הגנים ושלמות רצף הגנים.
    5. שלח את מוצרי ה- PCR לריצוף DNA והשווה אותם לתבנית עבור הומולוגיה.
  2. צביעת SDS PAGE ו-Coomassie לאיתור חלבונים מזהמים
    1. יש ליצוק ג'ל SDS PAGE בעל שיפוע צפיפות על ידי הכנת תמיסות פוליאקרילאמיד של 6% ו-15% (טבלה משלימה S1). השתמש בפיפטה של 10 מ"ל כדי למשוך 5 מ"ל מתוך תמיסת 15%, ואחריה 5 מ"ל מתוך תמיסת 6%.
    2. הסר את הפיפטה מהתמיסה וצור בועת אוויר על ידי ציור קצר של אוויר.
      הערה: כאשר בועת האוויר נעה כלפי מעלה, פעולה זו מערבבת את הפתרון כדי ליצור את מעבר הצבע SDS PAGE.
    3. מחלקים את התמיסה למנגנון היציקה ומאפשרים לה להתמצק במשך 30 דקות.
    4. בנפח סופי של 20 μL, שלבו אליקוט של נגיף עם חיץ מפחית פי 4 (טבלה משלימה S1) כך שהריכוז הסופי הוא 1x, והרתיחו במשך 10 דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס בתרמוצילר. טען לפחות 1 × 107 PFU של הנגיף.
    5. הטביע את דף ה- SDS במאגר פועל (טבלה משלימה S1) וטען את הדגימות.
    6. הפעל את הג'ל ב- 120 V למשך 1-1.5 שעות.
    7. מוציאים את הג'ל ממאגר הריצה ומעבירים אותו למיכל קטן יותר.
    8. הוסיפו תמיסת צביעה של Coomassie (טבלה משלימה S1) לכיסוי הג'ל. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 4-5 שעות.
    9. הסר את תמיסת הכתם והוסף תמיסת destain (טבלה משלימה S1), דגירה במשך 4-8 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה. שנה את הפתרון של destain שלוש עד ארבע פעמים.
      הערה: הג'ל צריך להיות ברור וצבעו צריך להיות כפי שהיה לפני הכתם.
    10. צלם את הג'ל בהגדרה קולורימטרית. ראו איור 5 לתמונה מייצגת של ג'ל SDS PAGE מוכתם ב-Coomassie המכיל דגימות מנוזל אלנטואי ונגיף מטוהר.
  3. כימות של טיטר נגיפי מדבק על ידי מינון זיהומי של תרבית רקמה חציונית (TCID50) ובדיקת אימונופלואורסצנציה
    הערה: ניתן להשתמש בתאי Vero כחלופה לתאי DF1; עם זאת, האפקט הציטופתי (CPE) בולט פחות בתאי Vero. NDV המכיל את המוטציה L289A, המשפרת את הפוסוגניות, ומבטא GFP בין הגנים P ו-M משמש בבדיקה זו.
    1. זרעו צלחת של 96 טובות של תאי DF1 ב-20,000 תאים/באר בנפח של 80 מיקרול' יום לפני השימוש ב-DMEM בתוספת 2% סרום בקר עוברי (FBS) ו-125 מיקרוגרם/מ"ל טריפסין. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    2. למחרת, להפשיר 20 μL aliquot של וירוס על הקרח.
    3. השתמש בצינורות 1.5 מ"ל להכנת דילולים סדרתיים. התחל על ידי דילול 10 μL של הנגיף עם 990 μL של PBS כדי להכין דילול 10-2 . הכן את כל הדילולים האחרים, עד 10-10 לכל הפחות, שנעשו עם 900 μL של PBS ותוספת של 100 μL של הדילול הקודם.
      הערה: השתמש בקצה פיפטה חדש בעת מעבר בין דילולים.
    4. השתמשו ב-20 μL מכל דילול כדי להדביק כל באר של הלוחית בת 96 הקידוחים, כפי שמוצג באיור 6.
      הערה: הנפח הסופי בכל באר יהיה 100 μL.
    5. הדגירו את הצלחת למשך 48 שעות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, לפני שתבדקו נוכחות של CPE/GFP או תבצעו בדיקת אימונופלואורסצנציה עקיפה (IFA).
      הערה: בתנאי תרבית אלה, CPE ניכר לאחר 10 שעות (איור 7A-D), והוא גדל במהלך 24 השעות הבאות (איור 7E-H). ניתן לדוגר את הצלחת זמן רב יותר כדי לשפר את עוצמת ה- CPE אם מבקיעים על ידי GFP או CPE.
      1. אם אתם מקבלים ניקוד לפי CPE או GFP ואינם מבצעים IFA, דלגו לשלב 3.3.18.1.
    6. אם אתם מבצעים IFA, שטפו את התאים פעמיים עם 100 μL של 1x PBS.
    7. הוסיפו 100 μL של 4% paraformaldehyde מדולל ב-PBS לכל באר ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. לשטוף את התאים 3x 5 דקות כל אחד עם 100 μL של 1x PBS, 0.1% Tween 20 (0.1% PBS-T).
    9. חלחל את התאים על ידי תוספת של 100 μL של 0.1% NP-40 ב PBS ודגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות .
    10. לשטוף את התאים 3x 5 דקות עם 100 μL של 0.1% PBS-T.
    11. הוסיפו 100 μL של מאגר חוסם המורכב מ-5% (V/V) סרום עיזים רגיל מדולל ב-0.1% PBS-T למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    12. הוסיפו 100 μL לבאר של נוגדן ריבונוקלאופרוטאין ראשוני נגד עכברים מדולל ב-0.1% PBS-T ל-1 מיקרוגרם/מ"ל, תוך דגירה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או לילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    13. לשטוף את התאים 3x במשך 5 דקות ב 100 μL של 0.1% PBS-T.
    14. הוסף 100 μL של נוגדן משני נגד עכברים AlexaFluor 488 Goat המדולל ב-0.1% PBS-T ל-2 מיקרוגרם/מ"ל. דגירה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    15. לשטוף את התאים 3x במשך 5 דקות ב 100 μL של 0.1% PBS-T.
    16. לאחר הכביסה הסופית, להשאיר את התאים ב 100 μL של 0.1% PBS-T.
    17. דמיינו את הבארות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
    18. בעת ביצוע IFA, חפשו פלואורסצנציה גדולה מזו שנראית בבארות הבקרה השליליות, מה שמצביע על כך שהבאר חיובית עבור NDV כפי שמוצג באיור 8.
      1. חפשו נוכחות של סינקטיה ותאים גדולים ומעוגלים המאפיינים NDV CPE. אם ניקוד בארות נגועות בנגיף המבטא GFP, חפש את נוכחותו של GFP.
    19. הזן את המידע המתאים למחשבון Spearman-Karber titer26 כדי לקבוע את ה- PFU / mL של הנגיף (טבלה 2). ראה איור 6 לדוגמה לוחית TCID50 titer.
  4. כימות של טיטר ויראלי על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)
    הערה: מומלץ לבצע ערכת qRT-PCR חד-שלבית כדי לחסוך זמן ולהפחית את המניפולציה של הדגימות. בדיקה מבוססת בדיקה משמשת להגברת הספציפיות של זיהוי רצפי וירוסים.
    1. צור עקומה סטנדרטית של כמות ידועה של רצפי הנגיף (איור משלים S2A,B).
      הערה: ניתן לעשות זאת על ידי רכישת מקטע דנ"א דו-גדילי סינתטי של 500 bp של הגן NDV L. ניתן לראות את הרצף של מקטע של 500 bp של הגן NDV L באיור משלים S2C.
    2. המרת כמות מקטע הדנ"א של הנגיף (המסופקת בדרך כלל כננוגרמות או פמטומולים על ידי יצרנים) למספר המולקולות או העותקים של מקטע הדנ"א על ידי שימוש במספר של אבוגדרו ובשומות לנוסחת המולקולות (Eq (1)).
      Equation 1 (1)
    3. הכן את דגימות העקומה הסטנדרטיות על ידי הכנת סדרת דילול פי עשרה של עותקי מקטעי דנ"א ידועים של הנגיף, החל מ-1.00 × 1010 עותקים עד 1.00 × 100 עותקים.
    4. כדי לקבוע את כמות הרנ"א של NDV בדגימות לא ידועות, חלצו רנ"א NDV באמצעות ערכת מיצוי RNA. עקוב אחר הפרוטוקול שסופק עם הערכה. לאחר חילוץ ה- RNA, המשך עם הפרוטוקול המומלץ המסופק בערכת qRT-PCR של שלב אחד.
    5. הפעל את התגובות במכשיר PCR בזמן אמת עם תנאי הטמפרטורה והרכיבה על אופניים הבאים: 1) מחזור אחד של שעתוק הפוך בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 2) מחזור אחד של דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; ו-3) 40 מחזורים של דנטורציה (95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות), הרחבה (60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות) ורכישת אותות פלואורסצנטיים.
    6. לאחר השלמת בדיקת qRT-PCR, צור את העקומה הסטנדרטית בהתבסס על דגימות העקומה הסטנדרטיות באמצעות תוכנת מכשיר PCR בזמן אמת (איור משלים S2A,B).
      הערה: התוכנה גם תחשב את כמות ה-NDV RNA בדגימות לא ידועות בהתבסס על העקומה הסטנדרטית.
  5. בדיקות בטיחות לרעילות חריפה בעכברים
    1. הזריקו 1 × 108 PFU של נגיף תוך ורידי דרך וריד הזנב לשלושה עכברי BALB/C בני 8 שבועות כדי להעריך רעילות חריפה.
    2. עקוב אחר העכברים לאיתור תופעות לוואי כגון ירידה במשקל (>20%), יציבה מחוספסת, פרווה פרועה, עייפות ושינויים בנשימה. הערך שלוש עד ארבע פעמים ביום במהלך 48 השעות הראשונות. מכיוון שעכברים צריכים להתחיל להתאושש לאחר 48 שעות, עקוב אחריהם פעם עד פעמיים ביום עד להחלמה מלאה.
      1. מתן טיפול תת עורי ותת-עורי מלוח לפי הצורך. לדוגמה, תוספים עם ג'ל דיאטת התאוששות, חמאת בוטנים, או השתמשו בפאקים של חום. המתת חסד של עכברים שהגיעו לקריטריונים של נקודות קצה, כפי שמתווות על ידי ההנחיות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים, על ידי מנת יתר של איזופלורן ואחריה נקע צוואר הרחם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קצירת נוזל אלנטואי
מכיוון שנוזל אלנטואי נקטף מביצי תרנגולת עובריות, הוא צריך להיראות ברור ושקוף. אם הנוזל נראה אטום וצהוב, הדבר מצביע על נוכחות של מזהמים. הכללת נוזל אלנטואי זה במהלך הטיהור תעכב את תהליך הטיהור, שכן הלחץ יעלה במהירות ויעלה על 10 psi, וכתוצאה מכך גזירה של הנגיף ואובדן של וירוס זיהומיות. נוזל אלנטואי שנראה מדמם מצביע על כך שהביצים חוסנו עם יותר מדי PFU של הנגיף. התשואה מקבוצה זו של ביצים תהיה נמוכה משמעותית מהצפוי ואין זה סביר כי וירוס זה יוכל לשמש in vivo. ביציות שחוסנו ב-NDV לנטוגני עדיין צריכות להיות בעלות כלי דם ברורים לאחר 72 שעות, והעוברים לא היו צריכים למות, כפי שניתן לראות באיור 1. אם יש להם, זה מצביע על כך שהעובר נפגע או זוהם בדרך כלשהי.

צפיפות יודיקסנול הדרגתית אולטרה-צנטריפוגציה
לאחר ultracentrifugation, פס גבוה, לבן, המכיל NDV צריך להיות ממוקם בין שיפועים של 10% ל-20% (איור 4B).

כתם קומאסי של ג'לים SDS-PAGE
איור 5 מדגים את ההבדל בין מלאי וירוסים לא מטוהרים (נתיב 2) לבין מלאי וירוסים מטוהרים (נתיב 3). השוואה בין השניים מראה ירידה משמעותית בעוצמת רצועות החלבון המזהמות והופעתן של רצועות NDV דומיננטיות במלאי הנגיפים המטוהרים.

כימות של טיטר ויראלי על ידי TCID50
אם אתם משתמשים בתנאים המומלצים בעת צביעת מלאי מרוכז של NDV, CPE צריך להיות ברור לאחר 24 שעות (איור 6). בהשוואה לזן לנטוגני NDV בעל טיטר דומה, ה-CPE בולט יותר בזן המזוגני באותה נקודת זמן.

ניתוח רעילות חריפה בעכברי BALB/C בני 8 שבועות
כאשר 1 × 108 PFU ניתנו תוך ורידי, עכברים צריכים להיות במעקב אחר תופעות לוואי כגון ירידה במשקל >20%, פרווה מעוותת, יציבה מחוספסת ונשימה לא תקינה. בתוך 24-36 השעות הראשונות, עכברים יתחילו לרדת במשקל וככל הנראה יפתחו פרווה פרועה ותנוחה מחוספסת. עם זאת, אם הנגיף טהור מספיק, עכברים מתחילים להתאושש, כפי שנצפה על ידי עלייה במשקל ושיפור במצב היציבה והציפוי לאחר 36 שעות. עכברים שאינם מראים סימני התאוששות אלה ב-36 שעות צריכים להמשיך להיות במעקב צמוד אחר קריטריוני נקודות קצה. בדרך כלל, זה קרה בגלל התרסקות לא מדויקת, אולי בגלל צבירה של חלקיקי הנגיף.

Figure 1
איור 1: זיהום וקציר של NDV מביצי תרנגולת עובריות ללא פתוגנים שצוינו. 'X' מציין את הממשק בין הממברנה הכוריואלנטואית לחלל האוויר, והיכן יש ליצור את החור לחיסון הביצה. (ב) תמונה המתארת עובר מת. שים לב להיעדר כלי דם דמויי אינטרנט. כמו כן ייצפה חוסר תנועת העוברים. (C) דיאגרמה של מרכיבי ביצת תרנגולת עוברית המציגה את מיקומי חלל האוויר, שק החלמון, שק מי השפיר, קרום הכוריואלנטואי והנוזל האלנטואי. (ד) הסרת הקליפה כדי לחשוף את הממברנה המקהלתית. (E) ממחיש כיצד הנוזל האלנטואי והעובר צריכים להיראות לאחר פתיחת הממברנה הכוריואלנטואית. קיצור: NDV = וירוס מחלת ניוקאסל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: שרטוט המתאר את ההרכבה הכללית של המנגנון המשמש לסינון עומק. ודא שמד הלחץ מותקן במעלה הזרם של מסנן העומק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הגדרת סינון זרימה משיקה בתצורות השונות שלה. חצים מראים את כיוון זרימת הנוזל. (A) המחשה של אופן הרכבת קלטת TFF. (B) סכמות של מערכת ה-TFF בתצורתה ה"פתוחה" המשמשת במהלך טיהור וריכוז הנוזל. (C) סכמטית של הגדרת ה-TFF כאשר הנוזל מסולק מהמערכת, כפי שנעשה בו שימוש במהלך התפשטות נגיף ותמיסת ניקוי. (D) סכמות של מערכת ה-TFF בתצורתה ה"סגורה", המשמשת לניקוי מערכת ה-TFF. קיצור: TFF = סינון זרימה משיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות ודיאליזה של נגיף מרוכז מ-TFF. (A) סכמטית המציגה את הרכב השיפוע של צפיפות יודיקסנול. (B) תבנית פסים של וירוסים בעקבות אולטרה-צנטריפוגציה של וירוס המיוצר באמצעות מאגר ML במהלך תהליך הטיהור. הרצועה העיקרית המכילה וירוסים מסומנת על ידי אליפסה שחורה. (C) גודל אופייני של קלטת דיאליזה עמוסה ב-10 מ"ל של וירוס שהוכנה דרך גרדיאנט יודיקסנול בסוף הליך הדיאליזה. קיצור: TFF = סינון זרימה משיק; ML = מניטול-ליזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ג'ל SDS-PAGE מוכתם ב-Coomassie. ג'ל משווה את נוכחותם של חלבונים מזהמים בין מלאי NDV מזוגני לא מסוכר (נתיב 2) ומטוהר (נתיב 3) כאשר הועמסו 1 × 105 PFU. נתיבים 1 ו-4 = סולם משקל מולקולרי (MW). NDV HN, F0, ויחידות המשנה שלהן בעקבות המחשוף, F1 ו- F2, יחד עם המשקלים המולקולריים המתאימים שלהן27 מוצגות בגופן לבן. קיצורים: SDS-PAGE = נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה; NDV = נגיף מחלת ניוקאסל; PFU = יחידות יוצרות פלאק; HN = hemagglutinin; F0 = פיוז'ן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: דוגמה לפריסת לוחות של 96 בארות המשמשת לקביעת טיטר וירוסים על-ידי TCID50. הלוח מחולק ל-12 עמודות, כאשר כל עמודה מייצגת דילול סדרתי שונה. בארות חיוביות (כפי שנקבע על ידי CPE, ביטוי טרנסג'ן או IFA) מסומנות באפור. בהינתן מספר הבארות החיוביות בדוגמה זו, הטיטר הצפוי לאחר השימוש במחשבון הטיטר של ספירמן-קרבר (טבלה 2) מופיע הן ב- TCID50/mL והן ב- PFU/mL. קיצורים: TCID50 = מינון זיהומי של תרבית רקמה חציונית; CPE = השפעה ציטופתית; IFA = בדיקת אימונופלואורסצנציה; PFU = יחידות יוצרות פלאק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: השוואה של ה-CPE בעקבות זיהום של תאי DF1 עם NDV לנטוגני או מזוגני. MOI של 0.5 שימש לאחר 10 שעות של דגירה (A-D) או 24 שעות של דגירה (E-H) בתנאי תרבית שונים של DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% נוזל אלנטואי, או DMEM + 2% FBS + 125 מיקרוגרם / מ"ל טריפסין. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: CPE = אפקט ציטופתי; NDV = נגיף מחלת ניוקאסל; MOI = ריבוי זיהום; FBS = סרום בקר עוברי; DMEM = המדיום של הנשר המתוקן של דולבקו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: דוגמה למצב שבו יש צורך ב-IFA כדי לתמרן NDV לנטוגני חסר טרנסגן GFP. תאי Vero עברו תרבית ב-DMEM שהכילו 2% FBS ו-125 מיקרוגרם/מ"ל טריפסין. התמונות נלקחו מהדילול הסדרתי 10-7 . (A) תמונת ברייטפילד של תאים נגועים. (B) ממחיש את המראה האופייני של תאים מוכתמים כאשר IFA משמש לאיתור וירוסים. (C) תמונה ממוזגת של (A) ו-(B). סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: IFA = בדיקת אימונופלואורסצנציה; NDV = נגיף מחלת ניוקאסל; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; FBS = סרום בקר עוברי; DMEM = המדיום של הנשר המתוקן של דולבקו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: פריימרים PCR ו-RT-qPCR לזיהוי מקטעי גנים של נגיף מחלת ניוקאסל. ערכות פריימרים המשמשות להגברה ספציפית של שני אזורים בגנום NDV. ערכת פריימרים של חלבון F גורמת להגברה של אזור בחלבון F המשתרע על פני אתר הביקוע של חלבון F. קבוצת פריימרים טרנסג'נית מגבירה את האזור האינטרגני בין הגנים פוספופרוטאין ומטריקס, אתר ההחדרה האופטימלי לטרנסג'ן. טבלה זו מכילה גם את רצפי הפריימרים המכוונים לגן L נגיפי21 ואת בדיקת הגן L המשמשת בבדיקת qRT-PCR. קיצורים: PCR = תגובת שרשרת פולימראז; RT-qPCR = PCR כמותי של שעתוק הפוך; NDV = וירוס מחלת ניוקאסל. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: מחשבון ספירמן-קרבר טיטר. גיליון אלקטרוני אינטראקטיבי זה מכיל את זרימת העבודה והמשוואות המתאימות לקביעת ריכוז הנגיף באמצעות תוצאות TCID50 בהתבסס על אינוקולום טוב במ"ל, ערכת דילול ומספר השכפולים לכל דילול. הריכוז מדווח כנפח במ"ל הנדרש כדי להדביק 50% מתרבית הרקמה (TCID50) ויחידות יוצרות פלאק לכל מ"ל של תרחיף הנגיף. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

איור משלים S1: קביעת ריכוזי יודיקסנול. (A) עקומה סטנדרטית הנוצרת מספיגת תמיסות של ריכוז יודיקסנול ידוע ב-340 ננומטר. (B) העקומה והמשוואה הסטנדרטיות מ-(A) שימשו לקביעת הריכוז של יודיקסנול בתמיסה לאחר אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, דיאליזה וריכוז פוליאתילן גליקול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: הגברה ועקומה סטנדרטית שנוצרה מבדיקת qRT-PCR של מקטע DNA דו-גדילי סינתטי של 500 bp של הגן NDV L. ההגברה (A) והעקומה הסטנדרטית (B) נוצרו מדגימות שהכילו דילול סדרתי פי עשרה (1.0 × 109 עותקים עד 1.0 × 100 עותקים) של קטע הדנ"א. עבור ההגברה והעקומה הסטנדרטית, הדגימות שהכילו 1.0 ×10 1 עותקים ו-1.0 × 100 עותקים היו מתחת לסף ולא הפיקו ערך נקודת מעבר מתחת ל-35 Cp. העקומה הסטנדרטית הסופית נוצרה על סמך דגימות המכילות 1.0 × 109 עותקים עד 1.0 × 102 עותקים של מקטע הדנ"א. (C) רצף הדנ"א של מקטע הגן 500 נוקלאוטיד NDV L המשמש ליצירת העקומה הסטנדרטית בפרוטוקול qRT-PCR. קיצורים: PCR = תגובת שרשרת פולימראז; RT-qPCR = PCR כמותי של שעתוק הפוך; NDV = נגיף מחלת ניוקאסל; Cp = נקודת מעבר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: טעינה וחילוץ של NDV מתוך קלטת הדיאליזה. (A) הגודל הטיפוסי של קלטת דיאליזה לאחר שנטען בכ-10 מ"ל של תמיסה המכילה וירוסים מבודדת משיפוע צפיפות סוכרוז ומצטלמת בסוף שלב הדיאליזה. (B) דוגמה לתוצאות המתקבלות בעת שימוש בצפיפות יודיקסנול הדרגתית אולטרה-צנטריפוגציה ללא תוספת מאגר ML. מוקף הוא רצועת וירוס המטרה להסרה. מסומן על ידי החצים הוא רצועה נוספת שעשויה להכיל virions פגום. שים לב שבעקבות שילוב של מאגר ML בתהליך הטיהור, רצועה זו אינה נראית עוד לעין. קיצורים: NDV = וירוס מחלת ניוקאסל; ML = מניטול-ליזין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: מספקת את השלבים הנדרשים ליצירת פתרונות כתם מערביים וחיץ ML המשמשים במהלך תהליך הטיהור. קיצורים: SDS-PAGE = נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה; TEMED = טטרה-מתיל-אתילנדיאמין; ML = מניטול-ליזין. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

וירוסים המשמשים כחומרים טיפוליים במחקרים פרה-קליניים חייבים להיות מטוהרים מאוד כדי למנוע רעילות כאשר הם ניתנים in vivo15. אם סוכנים הרפתקנים או מזהמים אינם מוסרים, זה יכול להוביל לתגובות שליליות חמורות השוללות את ההשפעה הטיפולית של הסוכן הנגיפי28. מכיוון ש-NDV מיוצר בביצי תרנגולת עובריות, ישנם מספר חלבוני ביצה מזהמים, כגון אליפסה, שיש להסירם לפני השימוש בו in vivo במודלים פרה-קליניים או קליניים29. גם לאחר טיהור אינטנסיבי, ovalbumin עדיין נמצא29. הסרת החלבונים המזהמים הללו היא תהליך קפדני הדורש זמן ומשאבים משמעותיים15,22. אם ניתן לייצר NDV במערכת מבוססת תאים בשכבות גבוהות מספיק הנדרשות ליישומי in vivo, הדבר עשוי לפשט את תהליך הטיהור ולשפר את התרגום של NDV להגדרות קליניות. עם זאת, ייצור מבוסס ביצים של NDV אונקוליטי שימש בניסויים קליניים רבים בבני אדם30.

בכל שלב בתהליך הטיהור, ניתן לזרוק דגימות על צלחות אגר דם כאמצעי בקרת איכות נוסף כדי להבטיח את היעדר הזיהום החיידקי.

הלחץ במהלך סינון עומק לא צריך להצטבר במהירות. זהו סימן לזיהום חלבונים והוא יאט משמעותית את תהליך הטיהור וידרוש שימוש במסנני עומק נוספים. אין להשלים סינון עומק במהירות; שלב זה אורך בדרך כלל 1-1.5 שעות. בדרך כלל, השלמה מהירה של שלב סינון העומק גורמת לטיטר נגיפי נמוך יותר.

כאשר הנגיף מרוכז, "זרם מעונן" אמור לצאת לתוך המאגר מקו הכניסה החוזרת. זה מצביע על כך שיש וירוס בנוזל האלנטואי שמרוכז כשהוא עובר דרך הקלטת.

הן במהלך סינון עומק והן בשלבי סינון זרימה משיקים, הלחץ לעולם לא יעלה על 10 psi. חריגה מהלחץ הזה תזעזע את הנגיף. התוספת של חיץ ML לנוזל האלנטואי פועלת כסוכן מייצב וההשערה היא שהיא מונעת צבירה נגיפית, וכתוצאה מכך ההתאוששות המוגברת של נגיף מדבק מבלי להתפשר על יכולת הסינון.

השיטה לעיל מתווה הליך מתאים לייצור זנים לנטוגניים ומזוגניים של NDV בתנאי BSL-2, שכן NDV מזוגני אינו סוכן נבחר בקנדה. התוצאה היא יצירת מלאי טיטר גבוה המתאים לשימוש במודלים של בעלי חיים. בדומה לפרוטוקולים אחרים בספרות המשתמשים בשיטות טיהור של אי-הכללת גודל, כגון סינון עומק ו-TFF, שיטות אלה מגבילות את השימוש בטכניקות קשות יותר, אולטרה-צנטריפוגציה, שבהן התאוששות הנגיף מצטמצמת בהשוואה לשיטות טיהור החרגת גודל15.

השימוש ב- TFF מספק אלמנט של מדרגיות שכן ניתן להשתמש ב- TFF כדי לרכז נפחי התחלה גדולים, בניגוד לטכניקות ultracentrifugation. טכניקות טיהור NDV קיימות משופרות בפרוטוקול הנ"ל באמצעות החלפת סוכרוז ביודיקסנול בשלב האולטרה-צנטריפוגציה, מה שמקטין מאוד את הסיכוי לאבד את הנגיף עקב קרע קלטת בסוף שלב הדיאליזה, והוספת מאגר ML, מה שמשפר את הסינון ומגדיל את התפוקה.

השימוש בשיפוע יודיקסנול מועדף על פני גרדיאנטים של סוכרוז, שכן יודיקסנול הוא פחות צמיג ולא רעיל לתאים ומספק תוצר סופי "נקי"יותר 31,32. יודיקסנול הפחית באופן משמעותי את הרמות של ציטוקינים וכימוקינים פרו-דלקתיים הנמצאים לאחר צפיפות הדרגתית של אולטרה-צנטריפוגציה של נגיףמטוהר 33. למיטב ידיעתנו, זו הפעם הראשונה שיודיקסנול משמש בטיהור NDV. ניתן לקבוע את ריכוז היודיקנול בתמיסה על ידי כימות הספיגה ב-340 ננומטר תוך התייחסות לעקומה סטנדרטית. מאפיין זה שימש כדי לקבוע כי רצועות NDV נמצאות בכ-15% יודיקסנול וכדי לאשר שניתן להסירן על ידי דיאליזה (איור משלים S1B). יודיקסנול פותח בתחילה כחומר הדמיה ניגודי, ולא ראינו תופעות לוואי כאשר תמיסת יודיקסנול של 15% ניתנה תוך ורידית ותוך-ורידית לעכברי C57BL/6. זה מצביע על כך שייתכן שלא יהיה צורך בדיאליזה להסרת יודיקסנול, מה שמקצר את תהליך הטיהור בכ-16 שעות. בנוסף, סוכרוז הוא היגרוסקופי, מה שגורם לקלטת הדיאליזה להתנפח באופן משמעותי, מה שמגביל את הנפח שניתן להזריק ומגדיל את הסיכון לקרע קלטת ואובדן וירוס34,35. כאשר הוזרקו כמויות שוות של נגיף מוכן יודיקסנול וסוכרוז לתוך קלטות דיאליזה, התנפחות משמעותית התרחשה בנגיף שהוכן על ידי יודיקסנול (השווה איור 4C ואיור משלים S3A). עם זאת, סוכרוז הוא סוכן ייצוב מתאים יותר עבור NDV מאשר יודיקסנול. זה הוביל לתוספת של שיפוע יודיקסנול עם מאגר ML. לפני הוספת מאגר ML לתהליך הטיהור, היה פס אינטנסיבי יותר בשיפוע יודיקסנול של 10% שנצפה בנוסף לפס המטרה ב-15% (איור משלים S3B). סביר להניח שפס זה מכיל virions פגומים או לא שלמים שנוצרו במהלך תהליך הטיהור. הוספת מאגר ML מאפשרת סינון טוב יותר של NDV תוך מזעור האופי ההיגרוסקופי של מדיום שיפוע הצפיפות, ובכך מפחיתה את הסיכון לקרע בקלטת הדיאליזה. ניתן להפחית עוד יותר את הנפיחות של קלטת הדיאליזה על ידי דיאליזינג ב-1x PBS בתוספת 5% סוכרוז, שכן בסופו של דבר זה מה שהנגיף יאוחסן בו.

מכיוון ש-NDV הוא חוש שלילי, נגיף RNA חד-גדילי, בידוד RNA ויצירת cDNA באמצעות פריימרים אקראיים וערכות פריימר ספציפיות ל-PCR מאפשר ריצוף של אזורים שונים בגנום מתגובת cDNA אחת (טבלה 1). זה חשוב מכיוון שהוא מאפשר לאשר את הפתוטיפ והיושרה של הטרנסג'ין ואת האלמנטים הרגולטוריים השעתוקיים שלו. אתר הבקיעה של החלבון NDV F הלנטוגני צריך להיות מונובסי ולא פוליבאסי, שכן NDV בעל אתרי ביקוע פוליבאסיים הם בדרך כלל פתוטיפים מזוגניים או וולוגניים, ומסווגים כחומרים נבחרים36,37. פרוטוקול זה מתאר גם שיטת RT-qPCR אמינה לכימות התפוקה הגבוהה של גנומים של NDV. לפני השימוש בו במודלים של בעלי חיים ולאחר השלמת מבחני בקרת האיכות האחרים, יש להעריך רעילות חריפה בעכברי BALB/C בני 8 שבועות. זן זה מאופיין כרגיש יותר לרעילות הנגרמת על ידי הנגיף מאשר זנים אחרים של עכברים15. בנוסף, זה ייתן אינדיקציה מסוימת לדיוק של טיטר הנגיף. לדוגמה, ירידה במשקל תיראה, אבל המשקל צריך להתחיל להגדיל לאחר 36-48 שעות. אם זה לא המקרה, אז ייתכן כי titer הנגיף הוא גבוה יותר ממה שדווח בתחילה, אשר עשוי להיות בשל צבירה של חלקיקים ויראליים. תוצאה ראשונית זו בעקבות טיהור של NDV רקומביננטי הובילה לשילוב של מאגר ML לאורך כל תהליך הטיהור. מאגר זה הוצע כדי לשפר את יכולת הסינון וההתאוששות של הנגיף במהלך תהליכי הטיהור38.

כאשר מכמתים את ריכוז הנגיף המדבק על ידי TCID50, ייתכן שהשימוש ב-IFA נחוץ כדי לדמיין זיהום NDV, במיוחד בדילולים גבוהים יותר כאשר ייתכן ש-CPE אינו ברור, או אם הנגיף אינו מבטא גן מדווח פלואורסצנטי (איור 8). הנוגדן העיקרי המשמש ל-IFA הוא ספציפי לריבונוקלאופרוטאין של NDV, קומפלקס חלבונים המקשר לגנום הרנ"א במהלך שכפול הגנום. מכיוון ש-NDV הוא נגיף עופות, קו התאים הפיברובלסטים של עובר העוף, DF1, הוא קו תאים אופטימלי להערכת טיטר הנגיף. בדרך כלל, נוזל אלנטואי שלילי לנגיף משמש כאמצעי לספק את הפרוטאזות דמויות הטריפסין הנדרשות על ידי NDVs לנטוגניים עבור מחשוף חלבון F39. ניתן להימנע משימוש בנוזל אלנטואי שלילי לנגיף על ידי נטילת תוספת עם טריפסין של 125 מיקרוגרם/מ"ל תוך הפחתת ריכוז ה-FBS ל-2%. זה מספק חלופה פשוטה וחסכונית לנוזל אלנטואי שלילי לנגיף, תוך שהוא עדיין מספק את הפרוטאזות דמויות הטריפסין הנדרשות. כאשר משווים את שני תנאי התרבית האלה ב-MOI של 0.5 על פני טווח זמן של 24 שעות, נראה שיש הבדל קטן בין השניים, כאשר המדיום בתוספת טריפסין עשוי לגרום ליותר CPE (איור 7). ניתן להשתמש בקווי תאים אחרים כגון תאי Vero עם אותם תנאי תרבית; עם זאת, ה- CPE פחות בולט. באמצעות הפרוטוקול הנ"ל עם תאי DF1, NDV CPE צריך להיות ברור תוך 24 שעות. באופן ספציפי, ניתן לראות את היווצרות הסינקטיה ב-24 שעות (איור 7E-H). באמצעות הליך הטיהור המתואר, טיהרנו בעקביות את NDV לטיטרים הנעים בין 1 × 109-3 × 1010 10 PFU/mL מנפח התחלתי של 0.8-1.0 ליטר של נוזל אלנטואי.

בסך הכל, הפרוטוקול המתואר משתפר בהליכי טיהור NDV שפורסמו בעבר על ידי שימוש ב- iodixanol כמדיום שיפוע צפיפות במקום סוכרוז ועל ידי הוספת מאגר ML לשיפור הסינון. בנוסף, אנו מתארים שיטה משלימה לטייטרינג NDV, כוללים שיטת RT-qPCR מפורטת לקביעת מספר עותק NDV, ומגדירים תנאים אופטימליים לשימוש בטריפסין במקום בנוזל אלנטואי במהלך טיטרציה של וירוסים. למרות שתהליך זה מייצר מניות NDV גבוהות שניתן לנהל באופן שיטתי במינונים גבוהים, הליך זה כרוך בצעדים מרובים, אשר יכולים להגדיל את השונות בין המשתמשים ולהציג את הפוטנציאל לזיהום. מגבלה נוספת היא הדרישה שהחומר ההתחלתי יהיה באיכות גבוהה. זה קריטי שהנוזל האלנטואי יהיה נקי מזיהום חלמון מכיוון שזה מקטין מאוד את היעילות של שלבי הסינון וההחרגה של הגודל. באופן כללי, תהליך זה גוזל זמן רב אך ניתן לקצר אותו על ידי השמטת שלב הדיאליזה. הליך זה מביא לתפוקה גדולה יותר של נגיף בדרגה in vivo בהשוואה לשיטות טיהור אחרות15,18. היכולת לייצר NDV איכותי ומרוכז יותר מרחיבה את יכולותיו לשמש כחומר אונקוליטי או כווקטור חיסון במודלים של מחלות בבעלי חיים במסגרות פרה-קליניות וקליניות כאחד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

J.G.E.Y זכה במלגת דוקטורט של הקולג' הווטרינרי של אונטריו ובמלגת בוגרים של אונטריו. עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה מענקי תגלית ל- SKW (מענק #304737) ו- LS (מענק #401127).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin HyClone SH30042.02
1 mL Slip-Tip Syringe BD 309659
10 mL Luer-Lok Syringe BD 302995
10% Povidone Iodine Solution LORIS 109-08
15 mL Conical Tubes Thermo-Fisher 14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle BD 305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle BD 305196
25 G x 5/8 in Needle BD 305122
2-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 BioRad 1610158
4% Paraformaldehyde-PBS Thermo-Fisher J19943-K2
5 mL Luer-Lok Syringe BD 309646
96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom Greiner Bio One 655180
Acetic Acid, Glacial Thermo-Fisher A38-212
Agarose Froggabio A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse Invitrogen A11001
Allegra X-14 Centrifuge Beckman Coulter B08861
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Bleach (5%) Thermo-Fisher 36-102-0599
Broad, unserrated tipped forceps Thermo-Fisher 09-753-50
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich 114405-25G
Centramate Cassette Holder PALL CM018V
ChemiDoc XRS+ BioRad 1708265
CO2 Incubator Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259 Thermo-Fisher BP101-50
DF1 Cells ATCC CRL-12203
Diet Gel Recovery ClearH2O, INC 72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator Berry Hill 1502W
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-500G
Egg Candler Berry Hill A46
Ethanol (70%) Thermo-Fisher BP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O Thermo-Fisher BP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) Cole-Parmer 06349-50
Fetal Bovine Serum Gibco 12483-020
Fine Point High Precision Forceps Thermo-Fisher 22-327379
Fluorescent Microscope ZEISS AXIO Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5 LABCONCO
GiBOX Gel Imager Syngene Imaging of Agarose Gels
Glycerol Thermo-Fisher G33-1
Glycine Thermo-Fisher BP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Thermo-Fisher 4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium Cytiva SH30022.01
Humidity Kit Berry Hill 3030
Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine Monohydrochloride Sigma-Aldrich 62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT Cole-Parmer 41507-44
Masterflex L/S Digital Drive Cole-Parmer RK-07522-20 Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing Cole-Parmer RK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 Cole-Parmer 96420-16 BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 Thermocycler Eppendorf EP950040025
Methanol Thermo-Fisher A412-4
Mini Protean Tetra Cell BioRad 1658000EDU SDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDV Novus Biologicals NBP2-11633 Clone 6H12
Normal Goat Serum Abcam AB7481
NP-40 Thermo-Fisher 85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K PALL OS100T02
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System Thermo-Fisher B1A
PBS 10X Solution Thermo-Fisher BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 Sigma-Aldrich 81300-1KG
PowePac 300 BioRad Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
RedSafe Thermo-Fisher 50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL Thermo-Fisher 66380
Sodium Dodecyl Sulfate Thermo-Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets) Thermo-Fisher S318-10
Specific pathogen free eggs CFIA NA Supplier will vary depending on location
Sucrose Thermo-Fisher S5-3
Supracap 50 Depth Filter PALL SC050V100P
Surgical Scissors Thermo-Fisher 08-951-5
Sw41Ti Rotor Beckman Coulter 331362 Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 Rotor Beckman Coulter 369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes Beckman Coulter 359472
TEMED Invitrogen 15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) Beckman Coulter 344059
Tris Base Thermo-Fisher BP152-5
Tubing Screw Clamp PALL 88216
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-1L
Utility Pressure Gauges Cole-Parmer 68355-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
  2. Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
  3. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
  4. Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
  5. Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
  6. McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
  7. Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219 (2021).
  8. Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
  9. Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
  10. Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
  11. Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
  12. Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
  13. Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
  14. Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
  15. Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
  16. Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
  17. Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
  18. Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
  19. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  20. Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
  21. Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335 (2021).
  22. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018 (2016).
  23. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830 (2013).
  24. Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).
  25. van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
  26. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).
  27. Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
  28. Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
  29. Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50 (2014).
  30. Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
  31. Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
  32. Axis-Shield. Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
  33. Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
  34. Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
  35. Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
  36. Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
  37. Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
  38. Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).
  39. Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923 (2017).

Tags

חקר הסרטן גיליון 183
ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בעל טיטר גבוה מנוזל אלנטואי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. … More

Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. H., Zielinska, N., Tusnadi, E. A., Susta, L., Wootton, S. K. Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid. J. Vis. Exp. (183), e63817, doi:10.3791/63817 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter