Un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia

El objetivo general de esta técnica es cultivar células endoteliales y musculares lisas juntas in vitro para crear uniones mioendoteliales que se producen en arterias de resistencia de pequeño diámetro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo cardiovascular, como la localización de proteínas y la activación de cascadas de señalización en la pared arterial. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden aislar específicamente las fracciones de la unión mioendotelial del endotelio y el músculo liso, lo que es imposible de hacer con una arteria real.

La demostración visual de una inclusión de parafina es particularmente crítica, ya que los pasos de inclusión pueden ser difíciles de aprender sin ver el proceso. Comience la construcción del cocultivo de células vasculares o VCCC, rociando placas y tapas de Petri de 150 milímetros con desinfectante y luego limpiando con una toalla de papel o toallitas sin pelusa. Luego, rocíe las placas de Petri con etanol al 70% y colóquelas en la campana para que se sequen al aire.

Abra la placa de los insertos de filtro en condiciones estériles. Cubra la parte inferior de los filtros con una solución de fibra pipeteando hasta un mililitro de solución de fibra actina a través de las ranuras laterales en la parte inferior de la placa. Asegúrese de que la mitad inferior del filtro esté cubierta y deje los insertos en la campana, manteniendo la cubierta de la placa.

Después de 30 minutos de tratamiento con solución de fibraacción, aspire el exceso de solución sin alterar los insertos del filtro. Luego, invierta la placa, colocando los filtros en la mitad inferior de la placa de Petri limpia. Tripsinizar un matraz de 225 centímetros cuadrados de células musculares lisas con tres mililitros de solución de tripsina EDTA precalentada.

Una vez que las células se hayan levantado, agregue nueve mililitros de medio SMC para neutralizar la tripsina. Transfiera a un tubo cónico y mezcle bien. Luego, pipetee 10 microlitros en un hemocitómetro para determinar el número de células.

Después de realizar un recuento de células, coloque cuidadosamente 750 microlitros de la suspensión celular que contiene aproximadamente 75,000 células de músculo liso en la parte inferior de cada filtro. Incube la placa a 37 grados centígrados durante la noche. El segundo día, llene cada pocillo de una placa limpia de seis pocillos con dos mililitros de medio SMC fresco precalentado.

Extraiga el medio de un inserto por succión y transfiéralo a la placa de seis pocillos con medio SMC. Agregue un mililitro de una solución de gelatina bovina al 0,5% en la parte superior de los insertos y colóquelos a 37 grados centígrados, durante al menos 30 minutos. Tripsinizar un matraz de 225 centímetros cuadrados de células endoteliales con tres mililitros de solución de tripsina EDTA precalentada.

Con un suave golpeteo del matraz para levantar las células de la placa. Después de volver a suspender las células en medio EC y realizar un recuento de células, retire la gelatina del filtro. A continuación, coloque 360.000 EC en un volumen de un mililitro en la parte superior de cada inserto de filtro.

Deje que las células se incuben sin perturbaciones a 37 grados centígrados durante 24 horas. Comience el fraccionamiento, succionando el medio de una placa de seis pocillos de insertos en la campana de cultivo celular y luego, transpórtelo a una cámara fría con hielo. En la cámara frigorífica, pipetee 10 microlitros de PBS en el lado SMC de los insertos.

Utilice el elevador de celdas para raspar los SMC. Luego, transfiera las células del raspador a una placa de Petri etiquetada que contenga tampón de lisis. Una vez que el raspador de células haya tocado el tampón de lisis, no permita que toque el filtro de inserción hasta que se haya limpiado por completo y se haya secado con toallas de papel.

Repita el desguace del filtro SMC una o dos veces más, para eliminar por completo los restos restantes de la celda SMC. A continuación, pipetee 10 microlitros de PBS en el lado de la célula endotelial del filtro de inserción. Raspe las células en una placa de Petri debidamente etiquetada con tampón de lisis, como se acaba de demostrar.

Recoja la suspensión de células del lado EC del filtro con la pipeta y transfiérala a una placa de Petri debidamente etiquetada. Sea muy meticuloso al raspar las células de ambos lados de los filtros para garantizar una contaminación celular mínima en la fracción de la unión mioendotelial. A continuación, utilice con cuidado el bisturí para cortar los filtros del inserto de plástico.

Para ello, corte entre el 70 y el 80% del plástico y utilice pinzas para retirar el filtro por completo de la estructura del inserto de plástico. Coloque cada filtro en un tubo cónico de 50 mililitros etiquetado que contenga tampón de lisis. Asegúrese de que los filtros estén sumergidos en el tampón y permanezcan húmedos.

Después de que todas las células se hayan recolectado de los filtros, agite el tubo MEJ de 50 mililitros con toda su fuerza durante 15 segundos o hasta que se mezclen bien. Retire los filtros del cónico MEJ con pinzas, arrastrándolos a lo largo de las paredes laterales del tubo para dejar la máxima cantidad de proteínas y líquidos en el tubo. Una vez que se hayan retirado todos los filtros del tubo cónico MEJ, haga un giro rápido en una centrífuga para llevar todo el líquido y las proteínas al fondo del tubo.

Después del centrifugado, transfiera el contenido del tubo MEJ y las placas de Petri SMC y EC a tubos de centrífuga más pequeños separados. A continuación, centrifuga los tubos a una temperatura cercana a 16.000 x G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Retire los sobrenadantes.

A continuación, ensaye el contenido de proteínas de las lisadas celulares mediante un ensayo bizincónico. En el quinto día de incubación de VCCC, agregue 4% de PFA a cada pocillo que contenga un inserto de filtro enjuagado e incube durante la noche agitando a cuatro grados centígrados. Después de aproximadamente 24 horas, transfiera los insertos a etanol al 70% durante al menos 24 horas.

Procese los filtros a largo plazo en un procesador de tejidos automatizado. Después de la ejecución, retire un filtro de su casete con pinzas para sujetar el filtro en el borde y luego, corte el filtro por la mitad con unas tijeras. Coloque cada una de las dos mitades en un plato frío y llene el molde de inclusión con parafina líquida.

Toque muy brevemente el molde de inclusión lleno con la placa fría, luego incruste cada mitad del filtro en el molde de inclusión con el lado cortado hacia abajo para asegurarse de que el filtro esté seccionado desde el centro. Use pinzas para mantener el filtro en su lugar para evitar que las mitades caigan entre sí hasta que la parafina esté lo suficientemente fría como para que puedan estar solas. Luego, mueva el molde de inclusión a una placa fría hasta que se solidifique por completo.

Incruste y seccione el inserto filtrado en una orientación vertical. Después de la sección, el VCCC se puede inmunoteñir para la inmunofluorescencia transversal. Esta imagen de microscopio electrónico de inmunotransmisión muestra una arteria de ratón con expresión de alfa globina en el MEJ marcada con cuentas de oro, que aparecen como puntos negros.

Este western blot demuestra que la expresión del inhibidor activador del plasminógeno uno está enriquecida en la fracción MEJ frente a las fracciones EC o SMC. Plastic EC indica ECs cultivadas en un plato de plástico que no forman MEJ. La inmunotinción revela la estrecha compartimentación del modelo VCCC.

El receptor alfa-1 adrenérgico uno se ve solo en la capa de células musculares lisas, el receptor de bradicinina se ve solo en la capa de células endoteliales. La tinción de F actina se produce en ambos tipos de células en la MEJ in vitro, como indica la flecha blanca. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todo estéril hasta el momento de la cosecha, colocar cuidadosamente las células en una placa y raspar bien los filtros.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el western blot o la inmunofluorescencia para responder a preguntas adicionales como la localización de proteínas, los niveles de expresión o la activación.