Name: Un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Aprende a cultivar células endoteliales y musculares lisas para crear uniones mioendoteliales en arterias de resistencia. Este modelo permite aislar fracciones específicas y estudiar vías de señalización cardiovascular.

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Este trabajo fue financiado por el National Heart, Lung and Blood Institute otorga R01088554, T32HL007284 y American Heart Association 14PRE20420024 de beca predoctoral. Agradecemos especialmente el St. Jude celular imagen compartida investigación núcleo, incluyendo Randall Wakefield y Linda Horner para las imágenes de microscopía electrónica, Adam Straub ayuda con imágenes representativas de la inmunofluorescencia y Pooneh Bagher para ella valiosos comentarios sobre el protocolo de manuscrito.

1. células de la galjanoplastia para el VCCC <ol><li>grande 225 cm 2 frascos de cultivo de EC y SMC en condiciones estériles a 37 ° C, hasta 70-90% confluente. Garantizar que se utilizan más CE que SMC; Si se utiliza CE humano primario y SMC, típicamente 3 frascos grandes de CE a 1 frasco grande de SMC.
	<ol><li>Usar pilas en pasos inferiores y no use más allá del paso 10. Elegir los medios de cultivo basados en células para ser cultivadas conjuntamente. Para primaria humana coronaria CE, utilice EBM-2 EC media basal con factores de crecimiento EGM2 MV. Para SMC coronaria humana primaria, utilice medios basales SmBM SMC con factores de crecimiento 2 SmGM. Antes de su uso con células cultivadas, añadir factores de crecimiento a los medios de comunicación.</li>
	</ol></li> <li>Construcción del VCCC día 1: Spray de Petri grandes (150 mm) y tapas con desinfectante (por ejemplo, Cavicide) y limpie con una toalla de papel o trapos libres de pelusa. Luego rociar las cajas Petri con 70% de etanol (EtOH) y dejar en la capilla al aire libre.</li>
	<li>Abra la placa de insertos de filtro (véase la Tabla de materiales) bajo condiciones estériles y cubrir el lado SMC (parte inferior del filtro) del inserto con la solución de fibronectina. Teniendo el inserto en la placa de 6 pozos proporcionada, pipeta de la solución de la fibronectina a través de la raja en la parte inferior de la placa, asegúrese de que la parte inferior la mitad del filtro es cubierto (no más de 1 mL).</li>
	<li>Después de 30 min de tratamiento con solución de fibronectina en la temperatura en la campana de cultura celular, tener insertos de la placa, vacío cualquier exceso de solución y de invertir, colocar en la parte inferior de la mitad de la caja de Petri limpia. Ponga a un lado. Asegúrese de no molestar a la membrana del filtro del parte movible al aspirar el exceso de solución; Esto puede evitarse por inclinación de la placa y aspirar la solución fuera del borde de la inserción.</li>
	<li>Trypsinize 225 cm 2 frasco de SMC con 3 mL de solución de tripsina-EDTA X 2 precalentado, y una vez las células han levantado fuera del plato, agregar medios SMC de 9 mL para neutralizar la tripsina (3:1, medios de comunicación: tripsina). Transferir a un tubo cónico, mezclar bien y pipetee 10 μL en un hemocitómetro para determinar el numero de celular.
	<ol><li>Cuenta el número de celdas de 5 x 5 cajas (es decir, 18), multiplica esto por 10.000 para obtener el número de células en 1 mL (180.000). Luego multiplique por 12 mL (volumen total de la suspensión celular, SMC 2,16 millones). Asegurar que hay suficiente SMC para el número deseado de pocillos de la placa. 
		Nota: por ejemplo, 1 también deben tener 75.000 SMC y así 18 pozos tendría SMC total 1,35 millones. Dividir las células 1,35 millones necesitadas por 180.000 células por mL 1 y esto se traduce en 7,5 mL de la suspensión de células que se necesitan para la galjanoplastia. Luego calcular el volumen final necesario (18 pozos x 750 μl = 13,5 mL). Por lo tanto, tomar 7,5 mL de la suspensión celular, traer el volumen con precalentado media SMC y mezcla bien hasta 13,5 mL.</li>
	</ol></li> <li>Placa 750 μl de la suspensión de células que contienen aproximadamente 75.000 SMC en la parte inferior de cada filtro, teniendo cuidado de no derramar alguna de la solución de los medios de comunicación y de la célula. Coloque la tapa en la parte superior y transferir cuidadosamente la placa de Petri con los insertos en la incubadora a 37 ° C durante la noche. 
	Nota: La densidad celular óptima para otros tipos celulares debe determinarse empíricamente.</li>
	<li>En el día 2, llenar bien limpio 6 platos con 2 mL de medio SMC fresco, previamente calentado. Retire las placas de la incubadora. Tomar los insertos a uno a la vez y eliminar los medios de comunicación por succión, luego coloque en el plato de 6 bien con medios de comunicación SMC.</li>
	<li>Capa del lado opuesto del filtro (lado CE) con 1 mL de una solución de gelatina bovina 0.5% durante al menos 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Trypsinize el 225 cm 2 Deutsch de la CE con 3 mL de precalentado 2 X tripsina-EDTA (10 x diluido en estéril Dulbecco &#39; s PBS) solución, con suaves golpecitos del matraz para levantar las células de la placa de. 
	Nota: Puede ser necesario colocar el matraz en la incubadora a 37 ° C durante 1-3 minutos.
	<ol><li>Una vez las células han levantado fuera del plato, añadir la EC media de 9 mL para neutralizar la tripsina (3:1). Transferir a un tubo cónico, piscina juntos, mezclar bien y pipetee 10 μL en un hemocitómetro para determinar el número de células.
		<ol><li>Cuenta el número de celdas de 5 x 5 cajas (es decir, 60), multiplica esto por 10.000 para obtener el número de células en 1 mL (600.000). Luego multiplique por 12 mL (volumen total de la suspensión celular, CE 7,2 millones). Asegurar que hay suficiente CE para el número deseado de pocillos de la placa. 
			Nota: CE aproximadamente 360.000 son necesarios por pozo. Por ejemplo, 18 pozos requieren EC 6,48 millones Dividir las células 6,48 millones necesitadas por 600.000 CE por 1 mL y esto se traduce en 10,8 mL de la suspensión de células que se necesitan para la galjanoplastia. Luego calcular el volumen final necesario (18 pozos x 1 mL = 18 mL). Por lo tanto, tomar 10,8 mL de la suspensión celular, llevar el volumen hasta 18 mL con pre calentado EC media y resuspender suavemente.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>1 mL de 360.000 CE en la parte superior de cada filtro de inserción de la placa. Que las células Incube imperturbado a 37 ° C por medio de reemplazar 24 h. en el día 4. Cosecha el día 5.</li>
</ol> 2. Recolección de fracciones de la VCCC <ol><li>realizar el aislamiento en una habitación de 4 ° C y mantener todos los instrumentos en el ICE.</li>
	<li>Tener en cuenta el número de inserciones individuales ser aislado y añadir tampón de lisis a un tubo de 50 mL etiquetado MEJ (para los filtros aislados). Entonces la etiqueta dos platos de 10 mm; uno para EC y otro para SMC.</li>
	<li>Ajustar el volumen de tampón de lisis dependiendo de cómo concentran el lisado necesita ser; 15 insertos, 500 μl de tampón de lisis para el tubo MEJ y 250 μl de Petri recomienda.</li>
	<li>Trabajo con una placa de 6 pozos de insertos en un momento. Succión fuera el medio en la campana de cultivo celular y luego transporte a una cámara fría a hielo. 
	Nota: Las siguientes instrucciones son para 1 Inserte aislamiento.</li>
	<li>Pipetear 10 μl de PBS 1 x a la parte SMC de la inserción.</li>
	<li>Utilice el elevador de la célula para limpiar las células a un extremo de la inserción y la transferencia de las células el elevador a la SMC caja Petri con buffer de lisis en it.</li>
	<li>Una vez que el elevador de la célula ha tocado el tampón de lisis en el plato, no permita que toque el filtro insertar hasta que ha sido completamente limpiado y secado sobre toallas de papel. Repetir el raspado del filtro SMC por lo menos una o dos veces para remover completamente los restos de células restantes de SMC.</li>
	<li>Gire el inserto sobre y pipetee 10 μl de PBS 1 x en la parte superior/CE de la filtro de insertar. Repita los pasos del 2.6 y 2.7 con un raspador celular y el plato de Petri CE.</li>
	<li>Recoger la célula restante y la mezcla de PBS desde el lado del CE del filtro con una pipeta y transferencia a la CE caja Petri con buffer de lisis. Ser muy cuidadoso en raspar las células de ambos lados del filtro en cuanto a dejar la mínima contaminación CE/SMC en la fracción MEJ.</li>
	<li>Cuidadosamente con el bisturí para cortar el filtro de la tuerca de plástico. Para ello, corte 70-80% de plástico y utilizar pinzas para sacar el filtro completamente fuera de la estructura de plástico. Coloque el filtro en el tubo cónico de 50 mL etiquetado MEJ con tampón de lisis y garantizar que se encuentra en el buffer de lisis y permanece mojado.</li>
	<li>Repetir los pasos de aislamiento, en grupos de 6, hasta que todos los rellenos se han procesado.</li>
	<li>Asegurar que diversos grupos se mantienen en tubos separados y platos.</li>
	<li>Vortex el tubo cónico de 50 mL MEJ en toda su fuerza durante 15 s o hasta que se mezcle bien. Quite los filtros de la MEJ cónico con pinzas, arrastrando a lo largo de las paredes laterales del tubo que dejar la mayor cantidad de proteínas y líquido en el tubo. Después de este punto, deseche los filtros de.</li>
	<li>Una vez que se han quitado todos los filtros del tubo cónico del MEJ, hacer un vuelta rápida (10-15 s a velocidad máxima ~ 16.000 x g) en una centrífuga para sacar todo el líquido y proteínas en la parte inferior del tubo. Transferir el contenido del tubo MEJ y los platos de CE y SMC Petri a tubos de centrífuga separado, más pequeño.</li>
	<li>Opcional: el contenido de los tubos MEJ/SMC/CE someter a ultrasonidos en configuración 4 impulsos de tres 10 s en hielo u Homogeneizar suavemente con la mano.</li>
	<li>Centrifugar a máxima velocidad (~ 16.000 x g) 15 min a 4 ° C. pipeta hacia fuera el sobrenadante y ensayo lisado para contenido de proteína utilizando el método de ensayo de bicinchoninic.</li>
</ol> 3. Cosecha el VCCC para inmunofluorescencia En cara <ol><li>incubación el día 5 de VCCC, quite los insertos de la incubadora. Trabajar en la campana de la cultura de célula, succione los medios de comunicación SMC de cada uno de los pozos más bajos de la insertar filtro y enjuague dos veces con PBS 1 x. Repita con el lado CE.</li>
	<li>Mantener las inserciones intactos y en la placa, añadir 4% paraformaldehido (PFA) durante 10-20 min en baño vestidor 4 ° C en un agitador suave. Lavar ambos lados del filtro insertar con PBS 1 x durante 5 minutos y repita dos veces. 
	PRECAUCIÓN: PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado.</li>
	<li>Realizar las incubaciones de anticuerpos bloqueadores, primaria y secundaria en la placa, asegurando que se mantienen ambos lados del filtro en el anticuerpo + solución de bloqueo (9 mL PBS, 25 μl Tritón X100, 50 mg albúmina de suero bovino, suero normal de 500 μl)</li>
	<li>Para montar el filtro en un portaobjetos, el filtro de la inserción de plástico con un bisturí de corte montado sobre un mango y colóquelo en un portaobjetos de microscopio con medio de montaje.</li>
</ol> 4. Cosecha el VCCC para inmunofluorescencia transversal <ol><li>incubación el día 5 de VCCC, quite los insertos de la incubadora. La succión de los medios de comunicación de ambos lados del filtro inserto en la campana de la cultura de célula y enjuague ambos lados del filtro dos veces con PBS 1 x.</li>
	<li>Mantener las inserciones intactos y en la placa de la pozo 6, añadir 4% PFA e incubar durante una noche en una habitación vestidor 4 ° C en un agitador suave. 
	PRECAUCIÓN: PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado.</li>
</ol> 5. Incrustar la VCCC para inmunofluorescencia transversal <ol><li>después de filtro insertos se han resuelto aproximadamente durante 24 h en 4% PFA, traslado hasta el 70% EtOH durante al menos 24 h, sino hasta varias semanas.</li>
	<li>Proceso de los filtros en un largo plazo (durante la noche) en un procesador automatizado de tejido. Utilizar el programa como sigue: 70% EtOH por 30 min 85% EtOH 30 min 95% EtOH 30 min, 100% EtOH 30 min, 100% EtOH 45 min., 100% EtOH 45 min, xileno 30 min, xileno 30 min, xileno 45 min, 60 ° C parafina 30 min, 30 min de parafina 60 ° C , 45 min de parafina 60 ° C</li>
	<li>Después del procesamiento, traslado los filtros cosechados a la estación de inclusión en parafina líquida, manteniendo el filtro en el cassette.</li>
	<li>Retire el filtro de la cinta, cuidadosamente con unas pinzas para sostener justo en el borde. Con unas tijeras, cortadas el filtro por la mitad, formando dos semicircular en forma de mitades. Poner de las 2 mitades en la parte de la placa fría de la estación de empotrar apenas tiempo suficiente para llenar la incrustación molde con parafina líquida.</li>
	<li>Una vez lleno de parafina líquida, muy brevemente toque el molde de inclusión para la placa fría, luego incrustar cada mitad del filtro en incrustar el molde (parte cortada hacia abajo), esto asegura que durante el seccionamiento, uno estará cortando desde el centro del filtro hacia el borde .</li>
	<li>Durante la incrustación, usar pinzas para sujetar el filtro para evitar que las mitades caigan unos a otros hasta que la parafina esté lo suficientemente fría como para que independiente. Mover el molde de incrustación a una placa fría hasta que se solidificó completamente. 
	Nota: Refrigeración bloques en cubetas de hielo ayuda a prevenir arrugas secciones.</li>
</ol> 6. Seccionamiento y la coloración del VCCC para inmunofluorescencia transversal <ol><li>para los bloques de parafina de seccionamiento y deslice el montaje: cortar 5 μm secciones, colocar los elementos en un baño de agua de 42 ° C y recoger las secciones con carga positiva diapositivas. Luego guardar diapositivas durante la noche en un horno de 42 ° C para secar.</li>
	<li>Antes de comenzar las medidas de rehidratación, hornear las diapositivas a 60 ° C para derretir la parafina y ayudar a cumplir las secciones VCCC a la diapositiva. Enfriar brevemente y rehidratar las diapositivas a través de dos cambios de xileno, 100% EtOH, 95% EtOH, un cambio del 70% EtOH y dos cambios de agua destilación.</li>
	<li>Evitar métodos de recuperación de antígeno que involucran microondas o como secciones pueden caerse el carro.</li>
	<li>Realizar el bloqueo estándar por 1 h a temperatura ambiente, luego de la incubación durante la noche con el anticuerpo primario a 4 ° C, seguido de lavado pasos y anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Montaje con los medios de montaje y cubreobjetos de.</li>
</ol>

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<li>Heberlein, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+regulates+myoendothelial+junction+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation.</a> Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).</li>
<li>Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+protein+on+actin+bridges+between+endothelium+and+smooth+muscle+in+arterioles+demonstrates+heterogeneous+connexin+expression+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).</li>
<li>Biwer, L. A., Isakson, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mediated+signalling+in+cellular+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains.</a> Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El VCCC tiene una serie de ventajas en términos de Recapitulando MEJs en vitro, pero hay puntos de discusión para determinar si el VCCC puede ser utilizado para aplicaciones específicas. Por ejemplo, si diferentes tipos de células se utilizan con este modelo, tendrá que ser optimizado. Hemos utilizado células humanas primarias pero es posible aislar células de aortas bovinas24o ratones de tipo salvaje o el agujero ciego, y utilizarlos en el VCCC1,<sup cl...

En arterias de resistencia de diámetro pequeño, una delgada Lámina elástica interna (IEL) separa endotelial (CE) y células de músculo liso (SMC). Las células pueden proyectar a través de agujeros en esta matriz elástica y hacer conexiones citoplásmicas directas via gap junction canales1,2. Esta estructura única se denomina al cruce myoendothelial (MEJ). El MEJ es un pequeño (aproximadamente 0,5 μm x 0,5 μm, dependiendo de la cama vascular), proyección celular integrado predominante por las células endoteliales pero puede originar de músculo liso así como3,4. Un número de investigadores ha demostrado la inmensa complejidad de señalización a redes que ocurre selectivamente en el MEJ, haciéndola un lugar especialmente importante para facilitar la señalización bidireccional entre endotelio y músculo liso5 ,6,7,8,9,10.
Sin embargo, es difícil en una arteria intacta una disección mecanicista de vías de señalización en el MEJ. Porque lo MEJ es una proyección celular, no es actualmente posible aislar un en vivo MEJ de la pared vascular. Por esta razón, se desarrolló el VCCC modelo1 . Lo importante, el VCCC Replica fisiológica morfología endoteliales11 y polarización de la señalización entre el apical y MEJ porciones de la célula12. Fue este modelo único que facilitó el descubrimiento de que la hemoglobina alfa es en la célula endotelial, polarizó a la MEJ. Esto está en contraste con las células endoteliales cultivadas convencionalmente que no expresan alfa hemoglobina13. Para los investigadores interesados en el endotelio microvascular, puede ser más apropiado utilizar las células endoteliales que han sido cultivadas en el VCCC, particularmente si la intención de diseccionar las vías de señalización que ocurren en las arterias de resistencia de diámetro pequeño.
Mediante un inserto de plástico resistente que contiene un filtro con poros de diámetro pequeño (0,4 μm de diámetro) a tipos de células distintas de cultura Co dos impide que las células migran entre capas. Resulta en una distancia de 10 μm entre las células, que es significativamente mayor que en vivo, pero todavía muchas de las características en vivo de MEJs, incluyendo localización de la proteína y segundo mensajero señalización1 Replica , 14. Además, el VCCC permite la selección de células específicas del tipo de señalización mediante la adición de un agonista o antagonista del compartimiento celular específica. Por ejemplo, cargando la CE con BAPTA-AM quelar calcio y estimulando el SMC con fenilefrina14. En contraste con otras descripciones de co-cultivo modelos15,16,17,18,19,20,21, esto proporciona instrucciones de aislar las distintas fracciones de mRNA y proteína, incluyendo la fracción MEJ distinta dentro de los poros del filtro. La incorporación de esta técnica la VCCC permite la investigación específica de los cambios en la localización de mRNA transcripción22proteína phosphorylation12,23y proteínas actividad12. Este artículo describe una galjanoplastia de la CE en la parte superior del filtro y SMC en la parte inferior, aunque es posible cultivar los dos tipos celulares en diferentes conformaciones11,18,24.

<table><tbody><tr><td>24 mm de diámetro, 0,4 y micro; m Transwell Inserto de filtro de membrana de poliéster</td><td>Corning</td><td>3450</td><td>Se trata de una placa de 6 pocillos de insertos Matraz de</td></tr><tr><td>225 cm</td><td>Corning</td><td>431082</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos (sin insertos de filtro)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliales primarias de la arteria coronaria humana</td><td>Lonza</td><td>CC-2585</td><td></td></tr> Células primarias del <tr><td>músculo liso de la arteria coronaria humana</td><td>Lonza</td><td>CC-2583</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 EC Medios basales</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Factores de crecimiento EC (EGM2 MV Cuotas simples)</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>Añadir a los medios basales antes de usar</td></tr><tr><td>SmBM SMC medios basales</td><td>Lonza</td><td>CC-3181</td><td></td></tr><tr><td>Factores de crecimiento SMC (SmGM-2 SingleQuot)</td><td>Lonza</td><td>CC-4149</td><td>Añadir a los medios basales antes de usar</td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA 10X</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Diluir a 2X con hemocitómetro dPBS estéril</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri grandes para SMC Plating (150 mm)</td><td>Corning</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina bovina</td><td>Sigma</td><td>G-9382</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina humana</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>5&micro; g/ml de fibronectina y almacenar a -20</td></tr><tr><td>10x Solución salina tamponada de Hanks (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td>Diluir a 1x con agua estéril</td></tr><tr><td>10x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (dPBS)</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td>Diluir a 1x con agua estéril</td></tr><tr><td>Bisturí curvo desechable (filo de 30 mm) con mango</td><td>Pinzas de</td><td>MDS15210</td><td></td>Amazon</tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>17-467-201</td><td></td></tr><tr><td>Elevador de células</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Rascador de células</td><td>BD Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>tubo cónico de 50 mL</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 10 mm</td><td>Falcon</td><td>35-1008</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de lisis de ARN</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma 158127</td><td></td><td>Prepare una solución al 4% con dPBS</td></tr><tr><td>Etanol al 70%</td><td>Fisher</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Desinfectante de cavicidas</td><td>Fisher</td><td>131000</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de proteínas RIPA</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Desmembranador sónico</td><td>Fisher</td><td>Model 50</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS para la cosecha de EC/SMC y inmunocitoquímica</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>no necesita ser estéril</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Incrustación/Sección/Tinción</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Fisher</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Procesador de tisú automatizado</td><td>Excelsior</td><td>ES</td><td></td></tr><tr><td>Estación de inclusión + placa fría</td><td>Leica</td><td>HistoCore Arcadia</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek Accu-Edge Cuchilla de micrótomo</td><td>VWR</td><td>25608-961 o 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Prolong Gold</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Otras soluciones</td><td></td><td></td><td>**Realice todos los pasos en condiciones estériles si utiliza la solución en células vivas</td></tr><tr><td>Agua estéril de autoclave dPBS</td><td></td><td></td><td>para esterilizar. Usando el agua estéril, haga DPBS (450 ml de agua estéril: 50 ml 10X DPBS), mezcle y filtre la esterilización (0.2 y micro; m filtro). Concentración final: 1X</td></tr><tr>agua<td>estéril de autoclave HBSS</td><td></td><td></td><td>para esterilizar. Usando el agua estéril, haga HBSS (450 ml de agua estéril: 50 ml 10X HBSS), mezcle y filtre la esterilización (0.2 y micro; m filtro). Concentración final: 1X</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td> madre de<td>fibronectina</td><td>Utilice 50 ml de agua estéril para formar un caldo de alícuotas de 1 mL, luego congele hasta que sea necesario Concentración final: 100 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>de fibronectina para recubrir el lado de SMC de VCCC</td><td></td><td></td><td>, descongele una alícuota y agregue 1 mL de fibronectina (100&micro; g/mL) a 19mLs de HBSS 1X para alcanzar una concentración final de 5&micro; g/mL. Concentración final: 5&micro; g/mL</td></tr><tr>2x Solución <td></td><td></td> de<td>tripsina EDTA</td><td>Diluya el 10X 0.5% de Trypsin-EDTA a 2X con 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Concentración final: 2X</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td>de bloqueo/anticuerpo</td> <td>(9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg albúmina sérica bovina, 500mL suero normal)</td></tr><tr><td>Gelatina bovina para recubrir EC VCCC</td><td></td><td></td><td>Mezcle 0,5 g de gelatina bovina en 100 ml de agua destilada. Autoclave antes del primer uso y almacene a temperatura ambiente. Mantener en condiciones estériles. Concentración final: 0.50%</td></tr><tr><td>1x PBS para la recolección de células</td><td></td><td></td><td>no necesita ser estéril</td></tr></tbody></table>

un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia

A Cell Culture Model of Resistance Arteries 

La ensambladura de myoendothelial (MEJ), un único microdomain señalización en arterias de resistencia de pequeño diámetro, exhibe la localización de proteínas específicas y procesos de señalización que controlan el tono vascular y la presión arterial. Ya que es una proyección desde la célula endotelial o músculo liso y gracias a su pequeño tamaño (en promedio, un área de ~ 1 μm2), lo MEJ es difícil estudiar en aislamiento. Sin embargo, hemos desarrollado un modelo de cultura de célula llamado vascular co cultivo celular (VCCC) que permite en vitro formación MEJ, polarización de la célula endotelial y la disección de la señalización de las proteínas y los procesos de resistencia de la pared vascular arterias. El VCCC tiene multitud de aplicaciones y se pueden adaptar a diferentes tipos de células. El modelo consiste en dos tipos de células cultivados en lados opuestos de un filtro con poros de μm 0,4 en el que los de vitro MEJs puede formar. Aquí describimos cómo crear VCCC mediante placas de células y el aislamiento de endotelial, MEJ y fracciones de músculo liso, que pueden utilizarse para aislamiento de proteína o actividad ensayos. El filtro con capas de la célula intactas puede ser fijas, encajado y seccionado para análisis inmunofluorescente. Lo importante es que, muchos de los descubrimientos de este modelo han confirmado mediante las arterias de resistencia intacta, subrayando su importancia fisiológica.

Los insertos de filtro utilizados para la VCCC tienen pequeñas, 0,4 μm agujeros. Figura 1A, una cara en vista de la inserción del filtro VCCC, muestra los poros en los que puede formar el MEJ en vitro. El esquema representa las células de músculo liso plateadas en la parte inferior del filtro un día antes de las células endoteliales se platean en el lado opuesto (figura 1B). Una vez que las células son plateadas...

Se describe un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia, lo que permite la disección de la señalización de vías en el endotelio, músculo liso, o entre el endotelio y músculo liso (el cruce de myoendothelial). Puede utilizar la aplicación selectiva de agonistas o aislamiento de la proteína, microscopia electrónica o inmunofluorescencia usando este modelo de cultura de célula.

Un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

El objetivo general de esta técnica consiste en cultivar células endoteliales y musculares lisas juntas in vitro para crear uniones mioendoteliales que ocurren en arterias de pequeño calibre. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo cardiovascular, como la localización de proteínas y la activación de cascadas de señalización en la pared arterial. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden aislar específicamente fracciones de uniones mioendoteliales del endotelio y del músculo liso, lo cual es imposible de realizar utilizando una arteria real.La demostración visual de un encaje en parafina es particularmente fundamental, ya que los pasos del encaje pueden ser difíciles de aprender sin observar el proceso. Comience la construcción del cultivo celular vascular mixto o VCCC, rociando placas de Petri de 150 milímetros y sus tapas con desinfectante y luego secando con una toalla de papel o toallitas sin pelusa. A continuación, rocíe las placas de Petri con etanol al 70 % y colóquelas en la cabina de flujo laminar para que sequen al aire.Abra la placa de insertos de filtro en condiciones estériles. Recubra el lado inferior de los filtros con la solución

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De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

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