Los Roles de las fuerzas físicas en principios Chick morfogénesis embrionaria de sondeo

El objetivo general de este protocolo experimental es estudiar el papel de las fuerzas mecánicas en el desarrollo temprano del cerebro embrionario a través de experimentos ex ovo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología del desarrollo y biomecánica, como el papel de las señales mecánicas en la morfogénesis, que es la generación de la forma biológica. La principal ventaja de esta técnica es que permite caracterizar el papel de las fuerzas mecánicas en la morfogénesis a nivel de tejidos y organismos.

Para comenzar este procedimiento, use toallitas delicadas con 70% de etanol para limpiar los huevos de gallina White Leghorn fertilizados y libres de patógenos específicos. Luego, coloque los huevos en una orientación longitudinal en un soporte. Después de eso, configure la incubadora de huevos a una temperatura objetivo de 37.5 grados Celsius y mantenga la humedad entre 48 y 55%La humedad se controla agregando una cantidad adecuada de agua a la incubadora.

Incubar los huevos durante aproximadamente 40 a 44 horas a HH11 a 13. Después, deje que los huevos se enfríen a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 a 30 minutos antes de limpiarlos con etanol al 70%. En este paso, rompe los huevos desde el fondo, separa la cáscara suavemente y deposita con cuidado el contenido en una placa de Petri de 150 por 15 milímetros.

Para asegurarte de que el lado del embrión esté hacia arriba, mantén los huevos en la misma orientación en la que se incubaron mientras los rompes. Retire la albúmina fina con una pipeta Pasteur desechable. Separe la albúmina espesa de la yema con las pinzas de punta roma.

Asegúrese de que se haya eliminado la albúmina espesa raspando ligeramente la parte superior de la yema. Luego, con pinzas de punta fina, coloque un anillo de papel de filtro sobre el embrión y céntrelo, haciendo coincidir el eje largo del anillo con el eje largo del embrión. Posteriormente, corta la yema que rodea el aro de papel de filtro con unas tijeras.

A continuación, retira el anillo y el embrión de la yema en dirección oblicua hacia el sitio donde se cortó la yema por primera vez. Luego, enjuague el embrión en dos platos secuenciales de 100 milímetros con PBS a temperatura ambiente. A continuación, coloque un anillo de papel de filtro en una placa de Petri de 35 milímetros.

Coloque el embrión con el lado dorsal hacia arriba sobre el otro papel de filtro en la placa de Petri de 35 milímetros. Después de eso, coloque un anillo de acero inoxidable encima del sándwich de papel de filtro. Tenga cuidado de no dañar el embrión.

Ahora, agregue tres mililitros del CCM previamente preparado a cada placa de Petri. Retire la membrana vitelina de cada embrión deslizando ligeramente la aguja capilar tirada por la parte superior del embrión. A continuación, retire la membrana vitelina, empezando por el extremo anterior y procediendo hasta la notocorda.

Después de eso, coloque ocho placas de Petri de 35 milímetros en una placa de 150 milímetros forrada con toallitas saturadas de agua para mantener la humedad. Luego, coloque la placa de Petri de 150 milímetros en una bolsa de plástico hermética y llene la bolsa con una mezcla de gases compuesta por 95% de oxígeno y 5% de CO2. Selle la bolsa y colóquela en una incubadora a 37,5 grados Celsius.

Ahora, retira el embrión de la incubadora y utiliza un sistema OCT para obtener imágenes de ellos y determinar el ángulo de torsión del tubo neural. Transfiera los embriones a un microscopio óptico y visualícelos con un aumento de 10X. Utilice una pipeta de 200 microlitros para eliminar gradualmente 0,2 mililitros de medio de la placa de Petri.

Tome imágenes de campo claro después de cada ronda de extracción de medios para observar el efecto de la interfaz medio-aire en el embrión. Continúe retirando el medio hasta que la tensión superficial a través del embrión induzca la torsión. Visualice el embrión utilizando el sistema OCT una vez más para establecer un ángulo de torsión final para compararlo con los embriones de control.

Para alterar la dirección del asa del corazón, use un par de pinzas para voltear el papel de filtro de modo que el embrión quede con el lado ventral hacia arriba. A continuación, utilice el tubo capilar estirado para abrir una hendidura en la membrana de la esplácnopleura y ejercer una fuerza mecánica para empujar el corazón desde el lado derecho hacia el lado izquierdo. Aplique la tensión superficial del líquido para mantener el corazón en el lado izquierdo.

Luego, incubar el embrión durante otras 20 horas para ver el cambio en la quiralidad de la torsión. Aquí se muestra un embrión cosechado con VM extraído en HH11. El mismo embrión incubado durante 27 horas después de la extracción de VM mostró una torsión reducida.

Aquí está el mismo embrión que se sometió a una torsión cerebral tras la aplicación de la tensión superficial del fluido, y aquí está el embrión de control con una torsión cerebral normal en una etapa comparable. Al intentar este procedimiento, es importante tener cuidado de no dañar el embrión. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis de elementos finitos, para modelar computacionalmente cómo las fuerzas físicas pueden influir en la morfología.

Por lo tanto, esta técnica desarrollada aquí allanó el camino para futuros estudios sobre la mecánica de la morfogénesis en embriones de pollo. Después de ver este video, debe comprender cómo recolectar embriones de pollo para cultivo in vitro, extirpar microquirúrgicamente la membrana vitelina, recapitular la fuerza proporcionada por la membrana vitelina y monitorear la morfología embrionaria a través de OCT e imágenes de campo claro.