Name: Los Roles de las fuerzas físicas en principios Chick morfogénesis embrionaria de sondeo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a estudiar las fuerzas mecánicas en la morfogénesis cerebral embrionaria mediante experimentos ex ovo en pollos. Este protocolo permite caracterizar el papel de las señales mecánicas en el desarrollo tisular.

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Z.C. reconoce el apoyo del fondo de inicio de Dartmouth y el Branco Weiss - sociedad para la beca de ciencia, administrada por ETH Zurich. Los autores agradecen a los Drs. Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo y Yunfei Shi de discusiones útiles, así como los revisores anónimos por comentarios. Este material está basado en trabajo apoyado por la nacional ciencia Fundación graduados beca de investigación bajo la subvención no. DGE-1313911. Cualquier opinión, resultados y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores (s) y no reflejan necesariamente las opiniones de la National Science Foundation.

1. preparación de medios de cultivo de tejidos
<ol><li>Utilice una botella de 0,5 L de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L glucosa, bicarbonato de sodio y L-glutamina como la base para los medios de cultivo.</li>
	<li>En una campana de flujo laminar estéril, añadir 10 mL de antibióticos a lo 0,5 L de DMEM.</li>
	<li>Con una pipeta estéril, transferir 50 mL de la solución de antibióticos DMEM a un tubo cónico estéril 50 mL.</li>
	<li>Añadir 50 mL de suero de pollo a la solución de antibióticos DMEM restante en la botella de 0,5 L en la campana estéril.</li>
	<li>Almacenar la solución final (denominada en adelante medios de cultivo de garbanzos [CCM]) en alícuotas de tubo cónico de 50 mL a-20 ° C.</li>
</ol>2. incubación de los huevos
<ol><li>Toallitas de uso delicado con etanol al 70% para limpiar concreto libre de patógeno White Leghorn pollo huevos fertilizados. Arreglar huevos en una orientación longitudinal en los titulares.</li>
	<li>Encienda una incubadora de huevo para fijar una temperatura de 37.5 ° C y mantener la humedad en % de 48-55. La humedad se controla mediante la adición de una cantidad apropiada de agua a la incubadora.</li>
	<li>Incubar los huevos a HH11-13, aproximadamente de 40 a 44 h.</li>
	<li>Dejar que enfríen los huevos a temperatura ambiente durante aproximadamente 15-30 min antes de la fumigación y limpieza con etanol al 70%.</li>
</ol>3. Tire de Capillares de vidrio de
<ol><li>Montar un 10 tubos capilares de vidrio cm de largo con un diámetro externo de 1,0 mm y un diámetro interno de 0,5 mm en un tirador de la micropipeta.</li>
	<li>Ajuste el calor y tire parámetros a 750 y 400, respectivamente. Presione el botón de extracción para extraer el tubo capilar en finas agujas.</li>
</ol>4. papel de filtro portador método
<ol><li>Cortar círculos de aproximadamente 3 cm de diámetro de papel de filtro.</li>
	<li>Cortar un rectángulo de aproximadamente 1 cm por 2 cm del círculo utilizando una perforadora. Asegúrese de quitar cualquier salientes o esquinas.</li>
</ol>5. embrión cosecha y preparación
<ol><li>Romper huevos en la parte inferior, separe la cáscara con suavidad y con cuidado depositar contenidos en un plato de petri de 150 x 15 mm. Para asegurar que la parte del embrión es, mantenga los huevos en la misma orientación que se incubaron mientras se les agrieta.</li>
	<li>Eliminar la albúmina fina utilizando una pipeta de Pasteur desechable.</li>
	<li>Separar la albúmina gruesa de la yema de huevo con unas pinzas terminadas embotadas. Asegúrese de que la albúmina gruesa se ha quitado raspando suavemente la parte superior de la yema con el fórceps terminó contundente.</li>
	<li>Use pinzas de punta fina para centrar y colocar un anillo de papel de filtro sobre el embrión, que el eje largo del anillo con el eje longitudinal del embrión.</li>
	<li>Cortar la yema de huevo que rodea el anillo de filtro de papel con las tijeras.</li>
	<li>Tire el anillo y el embrión de la yema en una dirección oblicua hacia el sitio donde primero fue cortar la yema de huevo.</li>
	<li>Enjuague los embriones en dos platos de 100 mm secuenciales con temperatura 1 x de tampón fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Coloque primero un anillo de papel de filtro en un plato de petri de 35 mm. Luego coloque el lado dorsal del embrión hacia arriba sobre el papel de filtro ya en plato de petri de 35 mm.</li>
	<li>Coloque un anillo de acero inoxidable en la parte superior el sándwich de papel de filtro. Asegúrese de no dañar el embrión.</li>
	<li>Añadir 3 mL del CCM previamente preparado a cada caja Petri.</li>
	<li>Retirar la VM de cada embrión rozando ligeramente la aguja capilar tirada en la parte superior del embrión y la VM a la peladura, a partir del extremo anterior (sobre el forebrain) y proceder a la notocorda (figura 1A).</li>
	<li>Lugar ocho platos de Petri de 35 mm en un plato de 150 mm que fue alineado con agua saturada de tarea delicada toallitas (para mantener la humedad).</li>
	<li>Lugar el plato de petri de 150 mm en una bolsa de plástico sellable entonces llenar la bolsa con una mezcla de gas compuesta por 95% O2 y 5% CO2.</li>
	<li>Selle la bolsa y colocarlo en una incubadora de 37,5 ° C.</li>
	<li>Incubar los embriones para un adicional 27 h hasta HH15-HH16 (figura 1B).</li>
</ol>6. inducción de tensión superficial
<ol><li>Eliminar los embriones del incubador y utiliza un sistema de tomografía de coherencia óptica a los de la imagen. Usar OCT para determinar el ángulo de torsión del tubo neural (NT) (figura 2).</li>
	<li>Transfiera los embriones a un microscopio óptico y visualizar con 10 aumentos. Utilice una pipeta de 200 microlitros para quitar progresivamente 0,2 mL de medios de comunicación de la caja Petri.</li>
	<li>Tomar imágenes de brightfield en cada intervalo para observar los efectos de la interfaz de aire de los medios de comunicación sobre el embrión.</li>
	<li>Quitar los medios de comunicación hasta que la tensión superficial en el embrión induce torsión (figura 1).</li>
	<li>La imagen del embrión usando el sistema de OCT una vez más para establecer un ángulo de torsión final de comparación para el control de embriones.  Nota: Las imágenes del brillante-campo fueron adquiridas mediante el uso de un microscopio de disección. Un sistema de tomografía de coherencia óptica con un microscopio Unido fue utilizado para adquirir pilas de imágenes transversales de embriones vivos. Imágenes fueron obtenidas en un dominio de exploración de3 de 3 x 10 mm x 3 mm, luego procesadas en un software de proyección de imagen. Por último, las imágenes de modelo físico fueron tomadas con una cámara réflex digital de objetivo único.</li>
</ol>7. física modelo de fuerzas de tensión superficial/VM
<ol><li>Desarrollar una geometría 3D simplificada que se asemeja a un embrión entre HH14-17 en software de modelado comercial (Figura 3A).</li>
	<li>Diseñar el molde negativo de la geometría 3D de software de gráficos de computadora 3D comercial.</li>
	<li>Usar una impresora 3D cargada de 1,75 mm acrilo butadieno estireno del filamento a 3D imprimir el molde del diseño, en formato stereolithographic (.stl).</li>
	<li>Para realizar el molde, mezclar componentes de elastómero de caucho de silicona A y B en partes iguales y verter la mezcla en el molde rápidamente; Coloque el molde de fundición para curar a temperatura ambiente durante 12 horas (figura 3B).</li>
	<li>La marca el modelo físico del embrión a lo largo de el NT en el lado dorsal visualizar torsión.</li>
	<li>Utilizar un cubreobjetos para replicar la fuerza ejercida sobre el modelo físico 3D que imita el de la VM o tensión de superficie (figura 3D).</li>
	<li>Introducir una serie de cables rígidos de longitud igual al lado del modelo físico. Después de que el cubreobjetos ejerce una fuerza externa en el modelo de cerebro, los cables se convierten en inclinado en un ángulo que depende de la ubicacion. Determinar el ángulo de rotación por arctan de la longitud proyectada sobre la longitud original de cada cable (figura 3E).</li>
</ol>8. alteración de la dirección del bucle de corazón
<ol><li>Siga los pasos en 3.1 y 3.2 para obtener un tubo capilar tirado.</li>
	<li>Siga los pasos de 5.1 a través de 5.10 a preparar el embrión.</li>
	<li>Utilice un par de pinzas para voltear el papel de filtro para que el embrión se convierte en ventral lado hacia arriba.</li>
	<li>Utilizar el tubo capilar se corte una abertura en la membrana del splanchnopleure (SPL).</li>
	<li>Utilizar el tubo capilar para ejercer una fuerza mecánica para empujar el corazón de la derecha a la izquierda.</li>
	<li>Siga los pasos de 5.12 a 5.15 para observar la evolución de la torsión.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

Mientras que los fenómenos físicos juegan un papel integral en la morfogénesis26,27,28,29,30, los mecanismos mecánicos específicos, junto con la coordinación de mecánica y mecanismos moleculares, siguen siendo en gran parte inexplorado. Es sabido que la flexión ventral y la torsión hacia la derecha de cerebro primitivo son dos procesos centrales que contribuye...

Investigación de la biología moderna del desarrollo se centra en gran medida en el desarrollo de la comprensión desde la perspectiva de la genética molecular1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. se sabe que fenómenos físicos juegan un papel central en la morfogénesis, o la generación de biológico forma14,15,16,17; sin embargo, mecanismos mecánicos específicos de desarrollo siguen siendo en gran medida estudiados. Flexión ventral y la torsión hacia la derecha del tubo cerebro primitivo después de Hamburger-Hamilton etapa 11 (HH 11)18 son los dos principales procesos que contribuyen a la forma embrionaria de cambian19,20. En particular, el mecanismo físico subyacente el desarrollo torsional en el cerebro embrionario sigue incompleto entendido.
La torsión embrionaria en embrión de pollo es uno de los primeros eventos morfogenéticos de asimetría (L-R) de izquierda a derecha en desarrollo. Cuando es perturbado el proceso de la asimetría de izq. a der., defectos de nacimiento como situs inversus, isomerismoo heterotaxia ocurrirá21. Aquí presentamos un protocolo que combina ex ovo experimentos22,23 con modelado físico para caracterizar las fuerzas mecánicas durante el desarrollo temprano del cerebro embrionario. El objetivo del método presentado es identificar las fuerzas mecánicas responsables de torsión del cerebro y los factores que afectan el grado de torsión durante el temprano desarrollo12. Basado en la observación experimental de que la membrana vitelina (VM) limita el lado dorsal del embrión, presumimos que el VM proporciona la fuerza necesaria para inducir la torsión del cerebro en desarrollo. Por lo tanto, en este método, hemos eliminado la parte de la VM que cubre el área del cerebro para averiguar los efectos de torsión de cerebro. Además, el método de aplicación de fluidos tensión superficial fue utilizado para confirmar el papel mecánico de la máquina virtual y proporcionar una estimación de la fuerza necesaria por torsión del cerebro, que no se había hecha anteriormente. Medición de las fuerzas durante la morfogénesis embrionaria es una tarea difícil. En particular, en un estudio pionero, Campàs y colaboradores24 desarrolló un novedoso método para cuantificar el estrés celular utilizando inyección de microgotas. Sin embargo, este método se limita a medir fuerzas en el nivel celular, por lo tanto no aplicable para sondear las fuerzas en el nivel organismo o tejido. El protocolo presentado en este trabajo se desarrolló para llenar parcialmente este vacío.

<table><tbody><tr><td>Fertilizado Huevos de gallina Leghorn blancos específicos libres de patógenos</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de tomografía óptica coherente</td><td>Thorlabs GAN220C1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastómero de silicona</td><td>Smooth-On, Inc.</td><td>EcoFlex 00-50</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>Sigma</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>Suero de pollito</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>Modelo P-30</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>5202-110</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Comsol MultiPhysics</td><td>Comsol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D software de gráficos por computadora</td><td>Microscopio Rhino 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>conectado con OCT</td><td>Nikon &nbsp;</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>Cámara réflex digital de un solo objetivo</td><td>EOS&nbsp;</td><td>Rebelde T3i</td><td></td></tr></tbody></table>

los roles de las fuerzas físicas en principios chick morfogénesis embrionaria de sondeo

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Desarrollo embrionario tradicionalmente es estudiado desde la perspectiva de la genética biomolecular, pero la importancia fundamental de la mecánica en la morfogénesis se está reconociendo cada vez más. En particular, el tubo embrionario chick corazón y el cerebro, que sufren cambios morfológicos drásticos que se desarrollan, están entre los principales candidatos a estudiar el papel de las fuerzas físicas en la morfogénesis. Progresiva flexión ventral y la torsión hacia la derecha de la cerebro de pollo embrionario tubular ocurren en la etapa más temprana de órgano nivel de izquierda a derecha asimetría en el desarrollo embrionario del pollo. La membrana vitelina (VM) limita el lado dorsal del embrión y se ha implicado en la prestación de la fuerza necesaria para inducir la torsión del cerebro en desarrollo. Aquí presentamos una combinación de nuevas experiencias de ex ovo y modelado para identificar los mecanismos de torsión del cerebro físico. En etapa de Hamburger-Hamilton 11, embriones son cosechados y cultivados ex ovo (en los medios de comunicación). La VM se elimina posteriormente mediante un tubo capilar tirado. Controlar el nivel del líquido y someter al embrión a una interfaz de aire líquido, el líquido tensión superficial de los medios de comunicación puede utilizarse para reemplazar el papel mecánico de la máquina virtual. También se realizaron experimentos de microcirugía para alterar la posición del corazón para encontrar el cambio resultante en la quiralidad de la torsión del cerebro. Resultados de este protocolo ilustran las funciones fundamentales de la mecánica en la morfogénesis que conduce.

En este estudio, la VM del embrión en HH11 fue quitada desde el extremo anterior a la flexión torácica. Los embriones fueron reflejados por un sistema de OCT. En esta etapa, la torsión del tubo de cerebro no ha iniciado (figura 1A). Después de ser incubados a HH15-16, embriones con su VM quitados expuesto cerebro reducido tubo torsión, aproximadamente 35 grados (figura 1B) en comparación con el control de embriones, que exhiben l...

Aquí, presentamos un protocolo de introducción de un conjunto de nuevos experimentos ex ovo y enfoques de modelado físico para el estudio de la mecánica de la morfogénesis durante temprano chick cerebro embrionario la torsión.

Los Roles de las fuerzas físicas en principios Chick morfogénesis embrionaria de sondeo

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

El objetivo general de este protocolo experimental es estudiar el papel de las fuerzas mecánicas en el desarrollo temprano del cerebro embrionario a través de experimentos ex ovo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología del desarrollo y biomecánica, como el papel de las señales mecánicas en la morfogénesis, que es la generación de la forma biológica. La principal ventaja de esta técnica es que permite caracterizar el papel de las fuerzas mecánicas en la morfogénesis a nivel de tejidos y organismos.Para comenzar este procedimiento, use toallitas delicadas con 70% de etanol para limpiar los huevos de gallina White Leghorn fertilizados y libres de patógenos específicos. Luego, coloque los huevos en una orientación longitudinal en un soporte. Después de eso, configure la incubadora de huevos a una temperatura objetivo de 37.5 grados Celsius y mantenga la humedad entre 48 y 55%La humedad se controla agregando una cantidad adecuada de agua a la incubadora.Incubar los huevos durante aproximadamente 40 a 44 horas a HH11 a 13. Después, deje que los huevos se enfríen a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 a 30 minutos antes de limpiarlos con etanol al 70%.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este video muestra a 2 colores montar toda la hibridación in situ, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de dos genes diferentes se pueden visualizar en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por David Wilkinson, Henrique Domingos, Ingham Phil y David Ish-Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

En este artículo se describe el etiquetado y la...

El seguimiento de deformaciones morfogenética del tejido en el embrión de pollo temprano

Mediante el injerto de perlas empapadas en factores de crecimiento o inhibidores específicos de las vías de señalización en embriones en desarrollo, es posible probar directamente sus efectos in vivo. En este protocolo, las perlas se injertan en la yema de la extremidad para determinar los efectos de estas moléculas en la expresión génica y la transducción de señales.

Injerto de Cuentas en desarrollo Miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción Pathways afectan la Expresión Génica

Se describen los protocolos que utilizan barreras impermeables para bloquear los eventos de inducción entre los tejidos del eje principal del cuerpo y el flanco en el embrión de pollo necesarios para la formación de las extremidades. Las perlas empapadas en señales inductivas candidatas se utilizan para superar el efecto de la colocación de barreras y el análisis de la expresión génica lo confirma.

La aplicación de barreras impermeables combinadas con empapó las bolas Factor Candidato para el Estudio de señales inductivas en el polluelo

La falta de herramientas para medir las propiedades del material y parámetros tensional en vivo impide validar sus papeles durante el desarrollo. Se emplean microscopía de fuerza atómica (AFM) y nanopartículas de seguimiento para cuantificar características mecánicas en la célula de yema de embrión intacto de pez cebra durante epiboly. Estos métodos son fiables y ampliamente aplicables evitando intervenciones intrusivas.

AFM y Microrheology en la celda de yema de embrión de pez cebra

Presentamos una instalación de pinza óptica acoplada a un microscopio de la ficha técnica de iluminación y su aplicación a la punta de prueba mecánica de la célula sin cuentas en el embrión de Drosophila .

Sondeo de la célula mecánica con pinzas ópticas libres de grano en el embrión de Drosophila

Las extremidades recombinantes son un potente modelo experimental que permite estudiar el proceso de diferenciación celular y la generación de patrones bajo la influencia de señales embrionarias. Este protocolo presenta un método detallado para generar extremidades recombinantes con células mesodérmicas de extremidades de pollo, adaptables a otros tipos de células obtenidas de diferentes organismos.

Ensayo de extremidades recombinantes de pollo para comprender la morfogénesis, los patrones y los primeros pasos en la diferenciación celular

El ensayo de perla empapada implica la entrega dirigida de reactivo de prueba en cualquier punto de tiempo de desarrollo para estudiar la regulación de la diferenciación celular y la morfogénesis. Se presenta un protocolo detallado, aplicable a cualquier modelo animal experimental, para preparar tres tipos diferentes de perlas remojadas e implantarlas en el interdigito de un embrión de pollo.

Análisis de la diferenciación celular, la morfogénesis y el patrón durante la embriogénesis del pollo utilizando el ensayo de cuentas empapadas

Aquí describimos los protocolos para tres tipos de cultivos de explantes de piel embrionaria aviar que se pueden utilizar para examinar las interacciones de los tejidos, la película de lapso de tiempo de imágenes 4D (3D más tiempo), la perturbación global o local de la función molecular y la caracterización de la biología de sistemas.

Uso de explantes de piel de ave para estudiar el patrón de tejidos y la organogénesis

Este protocolo se desarrolló para monitorizar longitudinalmente las propiedades mecánicas del tejido de la placa neural durante la neurulación del embrión de pollo. Se basa en la integración de un microscopio Brillouin y un sistema de incubación en el escenario, lo que permite obtener imágenes mecánicas en vivo del tejido de la placa neural en embriones de pollo cultivados ex ovo .

Monitorización de la evolución mecánica del tejido durante el cierre del tubo neural de un embrión de pollo

Aprenda a estudiar las fuerzas mecánicas en la morfogénesis cerebral embrionaria mediante experimentos ex ovo en pollos. Este protocolo permite caracterizar el papel de las señales mecánicas en el desarrollo tisular.

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