Summary
일상적인 탐지 방법 바이러스 성 게놈 증폭을 이용 하는 비 전염 성 입자에서 전염 성 차별을 그들의 무 능력에 의해 제한 됩니다. 이 문서의 목적은 aptamer 바인딩, 동적 산란, 및 전송 전자 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 노로바이러스 입자의 차별에 도움이 다른 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 것입니다.
Abstract
인간의 노로바이러스 exacts 상당한 공중 보건 및 경제적 손실을 전세계. 생체 외에서 신흥 재배 발전 적용 되지 않습니다 아직 일상적인 바이러스의 검출에 대 한. 현재 탐지 및 정량화 기술, 핵 산 증폭에 주로 의존 하는 비 전염 성 바이러스 성 입자에서 전염 성 차별을 하지 않습니다. 이 문서의 목적은 최근 바이러스 성 입자의 infectivity 상태에 대 한 정보를 더 얻기 위해서는 함께 사용 되는 기술 발전에 구체적인 내용을 제시 하. 1 개의 기술은 capsids에 노로바이러스 ssDNA aptamer의 바인딩을 평가 포함 됩니다. Aptamers 쉽게 합성 하 고, 수정 되 고의 이점이 있고 저렴 하 고 안정적 이다. 또 다른 기술, 동적 빛 산란 (DL) 솔루션에서 capsid 행동 관찰의 이점이 있다. 전자 현미경 검사 법은 바이러스 성 capsids의 구조적 무결성의 시각화에 대 한 수 있습니다. 비록 유망한, 각 기술, 일반적인 aptamer 바인딩 같은 긍정적으로 위탁 한 분자를 샘플 행렬에서 DL에 대 한 정화 capsid의 요구와 가난한 감도 전자 현미경 검사 법에 대 한 몇 가지 단점이 있다. 그럼에도 불구 하 고, 조합에서 이러한 기술을 사용 하는 생산 데이터의 본문 보다 포괄적인 정보를를 제공 합니다 노로바이러스 capsid 무결성 infectivity의 정확한 평가 위해 필수적인 정보를 유추 하는 데 사용할 수 있습니다. 비활성화 방법 또는 바이러스 탐지의 해석입니다. 이 문서는 이러한 방법을 사용 하 여 인간의 노로바이러스 감염 입자를 차별에 대 한 프로토콜을 제공 합니다.
Introduction
인간의 노로바이러스는 상당한 공중 보건 부담에 대 한 세계적으로, 대략 685 백만 질병 및 212,000의 죽음을 일으키는 매년1, 수십억 달러2,3의 비용에. 오늘, 노로바이러스 검출 및 정량화 게놈 증폭 및 리간드 기반 플랫폼 포함 됩니다. 이전은 일반적으로 선호 더 민감한, 양적 정보를 제공 하는 거짓 긍정적인 결과4의 일반적으로 낮은 위험이 있다. 가장 일반적인 노로바이러스 검출 및 정량화 게놈 증폭 기술은 역전사 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량) 이다. 때문에 대상 인간의 노로바이러스 게놈의 작은 세그먼트를 증폭, RT-정량 혼자는 감염 사이 차별의 수와 비 전염 성 입자, 무료 게놈 RNA로 손상 capsids 게놈를 포함 하 고와 capsids 치명적 유전자 돌연변이 잘립니다 여전히 실시간 정량 Pcr에 의해 증폭 될 수 있습니다. 두 가지 새로운 체 외에서 재배 방법을 인간 노로바이러스5,6 최근에 보고 되었다, 그러나 둘 다 여전히 바이러스 정량화에 대 한 실시간 정량에 의존 하 고는 아직 일상적인 임상/환경에 대 한 실현 방법 인간의 noroviruses에 대 한 테스트. 따라서, 실시간 정량 임상/환경 테스트에 대 한 황금 표준 남아 있습니다.
다른 시험관에 방법 더 나은 노로바이러스 입자의 infectivity 상태를 추정 하기 위해에서 개발 되었습니다. 이러한 메서드는 일반적으로 노로바이러스 capsid의 무결성 및 게놈 무결성 평가로 분류할 수 있습니다. 전 방식은 더 많은 인기입니다. 일반적으로 사용 되는 방법은 이전 바이러스 성 게놈 RNA의 추출 RNase 전처리 인데이 바이러스 성 입자를 그대로 유지 하지만 호스트 수용 체/공동-요인, 바인딩할 능력 부족 뿐만 아니라가지고 심각 하 게 변이 된 바이러스 성 입자에 대 한 고려 하지 않습니다 또는 잘린 또는 소폭 손상 유전자7. Capsid 무결성 또한 평가 될 수 있습니다 인간의 노로바이러스 공동-receptor/공동-요인, 탄수화물에 바인딩할 바이러스의 능력에 따라 histo 혈액 그룹 항 원 (HBGAs)로 알려진. HBGAs는 glycoproteins 또는 glycolipids (중 여러 다른 조직)의 일환으로 호스트 장 상피 세포에 존재 하 고 타 액 같은 체액에 분 비 될 수 있습니다. 그들의 표면에 HBGA 같은 물질을 포함 하는 장 박테리아도 인간의 노로바이러스8,,910, 바인딩할 표시 되었습니다 그리고 그런 상호 작용 노로바이러스 감염5를 홍보 수 있습니다. HBGA 바인딩을 활용의 기본 개념은 세포를 감염 바이러스 성 입자는 상 상속 수용 체/공동-factor를 바인딩 수만 가능할. 여러 연구 제안 구슬 기반 HBGA 바인딩 선행 하는 핵 산 증폭 infectivity 차별11,12,,1314, 유망한 방법입니다. 15,16. HBGAs에 대 한 주요 도전이 이다 단일 HBGA 형식이 없으므로 모든 인간의 노로바이러스 genotypes을 바인딩할 수 있습니다. 이 해결 하기 위해 돼지 위 mucin, HBGAs를 포함 하는 합성, 일관성, 그리고 비용 절감된의 용이성을 위하여 순화 HBGA 탄수화물 대신 사용 되었습니다.
무어 그 외 여러분 에 의해 최근 간행물 17 인간 노로바이러스 capsid 무결성을 추정 하기 위한 새로운 기술 세트를 소개 했다. HBGAs, 무어 외. 대신 17 광범위 하 게 반응 핵 산 aptamer (M6-2)18 및 열 처리 GII.4 시드니 노로바이러스 capsids 바이러스 같은 입자 (VLPs)를 광범위 하 게 반응 단일 클론 항 체 (NS14)19 바인딩을 조사 하 고이 비교 합성 HBGAs binding입니다. 핵 산 aptamers는 짧은 (20 ~ 80 nt) 단일 좌초 핵 산 (ssDNA 또는 RNA) 순서 결과로 고유한 3 차원 구조로 이동 하 고 바인딩 대상. 왜냐하면 그들은 핵 산, 그들은 더 적은 비용; 쉽게 화학적 합성, 정제, 수정; 고 열에 안정. Aptamers noroviruses에 대 한 생성의 몇 가지 보고서 존재, 그들 중 일부와 함께 다양 한 변종18,20,,2122광범위 한 반응성을 보여주는. 예를 들어, 무어 외. 17 그 aptamer M6 2 순화, 조립 인간의 노로바이러스 capsids (VLPs)에 바인딩된와 마찬가지로 HBGA에 대 한 더 높은 순서 (예를 들어, 2 차 및 3 차) 단백질 구조를 유지 하기 위해 바이러스 성 capsid에 대 한 의존도에 행동 시연 발생 하는 바인딩. 다른 한편으로, 노로바이러스 VLP 바인딩 항 체의 상당한 비율이 NS14 후 남아 capsids 변성 완전히 했다. 노로바이러스 바인딩 무어 외에 의해 연구에서의 평가 17 이루어졌다 aptamers 항 체 대신 사용 하는 예외와 유사한 ELISA, 간단 하 고, 플레이트 기반 메서드를 사용 하 (따라서 메서드가 호출 ELASA). 이 높은 처리량 실험적인 방법 노로바이러스 capsid, 물리적 또는 화학적 스트레스에 노출 되 면 바이러스 성 비활성화의 메커니즘을 이해 하기 위한 귀중 한 작품에 다른 처리의 효과 평가 하기 위해 사용 되었다. 그러나,이 방법은 하나의 단점은 낮은 감도 일반적인 바인딩 aptamers에 의해 일으키는 원인이 되는 높은 수준에서 매트릭스 관련 오염 물질에 대 한 참을성의 부족입니다.
무어 외. 17 열 처리에 대 한 응답에서 바이러스 성 입자의 집계 모니터링 하 다른 방법, 동적 빛 산란 (DL)을 사용. DL은 일반적으로 나노 정지의 크기를 평가 하 고 단백질23,24 및 바이러스25,,2627확장 되었습니다. 솔루션에서 입자에 의해 뿌려 진 빛의 강도 확산 계수 그리고 확고 공식을 사용 하 여 입자 직경의 계산을 허용 하는 입자 크기의 기능으로 변동. DLS 기술은 분산 된 바이러스, 개별 capsid 단백질 또는 이합체, 크기27에 따라 바이러스 집계의 검출을 허용 하는 나노 스케일으로 분산 된 입자의 유체역학 직경을 구분할 수 있습니다. 바이러스 집계, 입자 크기의 증가 의해 표시 나타내는 capsid 무결성의 손실입니다. capsid 변성 및 구조 중단, 소수 성 잔류물 노출 되 고 함께 집계를 형성 하는 입자를 일으킬. DL은 지정된 치료 또는 실시간으로17,28집계의 활동 후 입자 크기를 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 방법은 솔루션에서 capsid 행동의 관측을 허용의 이점이 있다 하지만 필요한 정화 capsid의 높은 농도 자연 상태에서 바이러스의 완전히 대표 하지 않을 수 있습니다.
마지막 방법은 무어 외 활용 17 전송 전자 현미경 (TEM) 했다. 이 방법은 감도 부족 하 고 양적 데이터를 생성 하지 않습니다, 하지만 그것은 바이러스 성 capsid 구조에 다른 처리의 효과의 시각화 수 있습니다. 비록 아직 임상/환경 설정에 대 한 좋지 않은, 조합에서 이러한 방법의 사용은 인간의 노로바이러스 비활성화 이해에 중요 합니다. 이 문서의 목적은 플레이트 기반 바인딩 분석 결과 (ELASA), DL에 대 한 깊이 있는 프로토콜을 제공 하 고 가장 준비 방법 하는 데 사용 capsid에 치료 효과의 맥락에서 노로바이러스 capsid에 열 치료의 효과 조사 무결성 무어 외 에 제시 17.
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Protocol
1. 구조에 대 한 평가 손실의 더 높은 순서 노로바이러스 Capsid 바인딩 분석 결과 플레이트 기반
참고: 여기에 매우 비슷한 ELASA 프로토콜 게시 29 되었습니다 그리고 유사한 ELASA 분석 이전 연구의 일부 기사 17 , , 18 22 다른 곳으로 보고 되었습니다.
- 인간의 노로바이러스 GII.4 시드니 capsids의 열 처리
- 얻을 순화 인간의 노로바이러스 GII.4 시드니의 주요 capsid 단백질 (VP1) (가입: JX459908) 조립 capsids.
참고: 연구에서 Capsids R. Atmar (베일 러 대학의과 대학, 휴스턴, 텍사스)의 입수 했다. - Dilute capsids 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.2) 개인 15 µ L의 최대 볼륨을 x 1에 50 µ g/mL를 PCR 튜브 출장. 적어도 600 튜브에 포함 되어 있는지 확인 capsid의 ng. 600는 확인 치료 ligand 조합 당 capsid의 ng.
- 예 열 원하는 열 처리에 열 cycler.
참고:이 프로토콜을 서로 다른 시간에 대 한 68 ° C에서 치료의 목적을 위해 (0-25 분) 선정 되었다. - 즉시 냉각 4 ° C에 추가 열 cycler 예 열. 원하는 시간에 대 한 열 cycler에 capsid 솔루션 튜브를 추가 합니다. 가 열 후 5 분에 대 한 사전 냉각된 4 ° C cycler 즉시 전송.
변성된 capsid 컨트롤로
- 포함 95 ° C 5 분에 대 한 치료. 긍정적인 통제로 치료 (23 ° C) capsid 솔루션을 포함 합니다. 추가 부정적인 컨트롤로 아무 capsid PBS 포함.
- 짧게 스핀 다운 튜브의 하단에 모든 방울 고 3 µ g/ml PBS에 치료 capsid 솔루션을 희석을 원심 분리기에서. 희석, 대우 capsid (100 µ L/잘)의 적어도 200 µ L 확인 하십시오.
- 얻을 순화 인간의 노로바이러스 GII.4 시드니의 주요 capsid 단백질 (VP1) (가입: JX459908) 조립 capsids.
- 적용 100 µ L 처리 당 적어도 2 개의 우물 보장 각 잘 capsid 솔루션의. 또한, 각 ligand;에 대 한 100 µ L PBS 가진 2 제어 우물을 포함 이 분석 결과의 배경 흡 광도를 제공 한다. 커버 뚜껑 접시, 4 ° C에서 또는 실내 온도에서 2 h 떨고 인큐베이터에 인감 파라핀으로 가장자리를 줄이기 위해 증발, 영화와 떠나 하룻밤.
- 블로킹 버퍼 PBS에 0.05%와 5% 탈지 우유 고체 (w/v)를 함으로써 준비 트윈 20 (PBST).
- 접시에서 치료 capsid 솔루션을 제거합니다. 블로킹 버퍼의 200 µ L/잘 추가 합니다. 실 온에서 2 h에 대 한 품 어 또는 하룻밤, 4에서 봉인 ° c.
- 준비는 ligand 바인딩 biotinylated aptamer M6-2 18 , 29에 대 한 솔루션 및 biotinylated 합성 HBGA 혈액형 A 또는 biotinylated 유형 헤
- Dilute nuclease 무료 물에서 1 µ m biotinylated aptamer
- . 각 치료에 대 한 총 200 µ L에 대 한 충분 한 솔루션 인지 확인 합니다. 선택한 biotinylated HBGA 블로킹 버퍼에서 30 µ g/mL를 희석. 각 치료에 대 한 200 µ L 전체 볼륨에 대 한 충분 한 솔루션 인지 확인.
참고: 사용 하려면 적은 HBGA, 10 µ g/mL HBGA의 0.25% 탈지 우유-PBST에 교체하실 수 있습니다. Biotinylated M6 2를 HBGA 농도 이전 최적화 되었고 보고.
참고: 각각 2 웰 스 각 치료 capsids 그리고 각 리간드에 대 한 완전 하 게 변성된 capsids의 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 포함 해야 합니다. 또한, 2는 " 아무 capsid " 웰 스는 격판덮개로 각 리간드에 대 한 배경 컨트롤.
참고: 다른 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 어원이 같은 말 다른 농도 있을 것 이다. 사용자 문의 ' 효소의 ELISA 응용 프로그램에 대 한 농도의 이상적인 범위에 대 한 s 설명서 그리고 그것은 최적의.
참고: 개발 시간 ligands/시 약 사용의 품질에 따라 달라질 수 있습니다.
참고: 산의 소개 일반적으로 크게 반응 속도가 느려집니다 하지만 완전히 그것을 중지 하지 않습니다. 흡수도 읽기 전에 시간의 연장된 금액에 대 한 중지 접시를 두지 마십시오.
2. 플레이트 기반 분석 결과의 분석
- 스프레드시트 프로그램에서 원시 흡 광도 데이터 저장. 특정 치료와 리간드 잘 각 쌍에 대 한 평균 absorbances를 생성 합니다. 이 평균을 사용 하 여 모든 후속 분석.
참고: 비교 아무 쌍 우물의 크게 이질적인 값은 다는 것을 반드시 하 두 잘 absorbances. - 의 원시 흡 광도, 절대 capsid 무결성 (모든 바인딩)을 분석 하는 " 아무 capsid " 다른 모든 샘플 흡 광도 값에서 제어.
참고: 또는, 더 높은 순서 (2 차, 3 차, 4 급) 구조의 손실로 인해 바인딩의 손실 직접 분석할 수 있습니다. 네거티브 (capsid) 제어의 흡 광도 빼기 대신 완전히 변성된 capsid 컨트롤의 값을 뺍니다. 모든 바인딩 일반적인 장치에 바인딩 수 있으므로 capsid 시퀀스 인해 바인딩 신호이 제거 합니다. HBGA 및 aptamer M6 2 비슷한 결과 생성 하는 방법 중 하나 그래서 완전히 변성된 capsid 작은 바인딩을 표시 합니다. 일반적인 aptamer 바인딩에 거짓 긍정적인 신호는 분석 사용을 선택할 때 고려해 야 합니다. - 는 음수 또는 변성 제어 조정 absorbances, 함께 나누어 그들의 각각 긍정적인 (치료)에 의해 absorbances absorbances 제어 및 증식 치료 100. 이 치료 컨트롤에 상대적인 치료 capsid의 신호 비율을 제공 합니다.
- Capsid 시퀀스에 기인 각 ligand 바인딩 신호의 정도 예측 하려면 빼기는 " 아무 capsid " 초기 absorbances에서 제어를 제외 하 고 변성된 capsid의 조정된 흡 광도. 긍정적인 제어 신호의 조정된 흡 광도 의해 이것을 분할 하 고 100을 곱하십시오. 이 때문에 변성된 capsid/capsid 시퀀스에 ligand 바인딩 신호의 명백한 비율 제공.
3. 열 처리 후 바이러스 집계 감지에 대 한 DL
참고: 다음 단계는 소프트웨어와 관련 있을 수 있습니다 및 악기 사용, 하지만 적응 하 고 수 유사한 장치에 적용.
- 만들기는 DL에 새로운 크기 SOP 악기 소프트웨어 사용: 자료 = 단백질, Dispersant PBS, 온도 = = 25 ° C, 평형 시간 = 0 초, 셀 일회용 베트 (작은 볼륨, ZEN0040), 측정 각도 = = 173 ° 후방 산란 측정 기간 = 자동 측정의 수 = 3, 측정 간격 = 0 초, 데이터 처리: 분석 모델 = 범용 (일반 해상도). 다른 모든 매개 변수에 대 한 기본 설정을 사용 하 여.
- 소프트웨어, 녹색 실행된 화살표를 선택 하 고 이름을 샘플.
- 단계 VLPs의 열 처리에 대 한 1.1.4 통해 1.1.1.
- Dilute 열 처리 VLPs 1시 10분 5 µ g/mL의 최종 농도 대 한 1 x PBS. (선택 사항) 먼지 입자;를 제거 하는 1 µ m 기 공 크기와 샘플 필터링 DL은 매우 민감한 먼지, 큰 입자는 작은 입자 보다 훨씬 더 많은 빛을 흩어.
- 일회용 작은 볼륨으로 희석된 VLPs의 전송 50 µ L 베트. 악기의 샘플 챔버에는 멧 삽입.
- 실행을 시작 하 고 사용는 ' Correlogram ', ' Cumulants 맞춤 ', 및 ' 전문가 조언을 ' 데이터 품질 평가를 탭.
- 실행 하는 동안 확인 증가할수록 인덱스 값이 0.3, 대표는 품질 측정.에서 보다는 ‘ 분할 ’ 탭, 상관 계수는 상수와 가까이, 그러나 이상의 1, 짧은 시간에 다는 것을 확인 그리고 나중에, 입자 크기의 특성 0 급격히 떨어져 상품. 사용은 ‘ 전문가 조언을 ’를 측정 하는 동안 데이터 품질에 대 한 피드백에 대 한 탭.
- 측정 완료 후 증가할수록 인덱스 값이 0.3 보다 작은 다시 확인 합니다. cumulants 라인 다음과 데이터 포인트에 밀접 하 게 맞는 다는 것을 확인은 ‘ Cumulants에 맞는 ’ 탭
- 걸릴 각 샘플의 입자 크기 각 측정에 대 한 Z-평균 입자 직경의 평균 보고. ° C.에에서 온도 대 nm의 직경을 플롯
4. 실시간에서 감지 바이러스 집계에 대 한 DL
참고: 다음 단계는 소프트웨어와 관련 있을 수 있습니다 및 악기 사용, 하지만 적응 하 고 수 유사한 장치에 적용.
- 만들기는 DL에 새로운 크기 SOP 악기 소프트웨어 사용 하 여: 소재 단백질, Dispersant = = PBS, 온도, 평형 시간 = = 0 초, 셀 석 영 cuvette, 측정 각도 = = 173 ° 후방 산란 측정 기간 자동, = 측정의 수 = 50 (증가 또는 감소에 따라 집계 속도 수 있습니다), 측정 간격 = 0 초, 데이터 처리: 분석 모델 = 여러 좁은 모드 (높은 해상도). 다른 모든 매개 변수에 대 한 기본 설정을 사용 하 여.
- 이름을 새로운 샘플을 열고 소프트웨어 실행된 화살표를 선택 하 고 허용 온도 평형에 도달 하는 악기.
- 사이 200-500 µ L. 볼륨과 5 µ g/mL의 농도에서 microcentrifuge 튜브에 1 X PBS에는 VLPs를 중단 소용돌이 정지.
- 드 가스 탁상 원심 분리기에 5-10 s VLP 정지 아래로 회전 합니다. 이 크기 측정을 방해 하는 열 처리 중 거품 형성을 방지 하는 데 도움이.
- 전송은 VLP 서 스 펜 션 작은 볼륨 석 영 cuvette 방지 거품 하 고는 베트의 벽에 천천히 플라스틱. 악기 온도 평형에 도달 하면, 샘플 챔버에는 베트를 삽입.
- 기다려 10 s equilibrate, 샘플 온도 대 한 실행을 시작 합니다. 실행의 시작에 타이머를 시작 합니다. 첫 번째 측정의 끝에 타이머를 중지 합니다. 첫 번째 시간으로이 시간이 걸릴. 소프트웨어에 의해 기록 측정 시간에서 후속 시간 포인트 얻기.
- 실행을 시작 하 고 correlogram, 맞는, 배포 및 데이터 품질을 평가 하기 위해 전문가 조언을 모니터링.
참고:는 PDI 반드시 되지 않습니다 이러한 측정 샘플으로 0.3 보다는 더 적은 polydisperse 집계 될 것으로 예상 된다.- 상관 계수 상수와 가까이, 하지만 짧은 시간에, 이상의 1 하 고 하나 이상의 최신 시간, 입자 크기의 특성에서 크게 떨어져 상품.
- 분포 선 다음과 같이 데이터 포인트 밀접 하 게 맞는 있는지 확인 하십시오.
- 크기 데이터를 분석.
각 측정 및 초기 시간 포인트 사이의 시간 차이에서
- 결정 때마다 포인트. 측정 기간 모두 정확 하 게 동일 않습니다.
- 강도 분포를 사용 하 여 각 측정/시간 지점에 대 한 가장 큰 지역으로 봉우리의 크기 기록.
- 대 분에 시간 nm에서 최대 직경 플롯
5. TEM 샘플 준비
가장을 위한- 얻기 탄소 지원 영화 (니켈) 격자.
참고: 시설 현미경으로 권장된 시 약 및 사용에 대 한 그들의 처리에 핵심 시설 문의. 방 습 제 나 습기에 노출을 최소화 하기 위해 진공 챔버를 포함 하는 상자에서 격자를 저장 하십시오. - 필터 종이 약 5 c m x 5 cm 조각 눈물. 유리 접시를 가져오고 핀셋 현미경 검사 법에 사용 하기 위해 설계 된 반전 적절 한 자기-폐쇄.
- 는 파라핀 필름의 약 2.5 c m x 5 cm 조각 잘라. 벤치탑에.
- 노로바이러스 GII.4 시드니 capsids의 열 처리
- 단계 1.1.1-1.1.5 제외 하 고 위에서 설명한 대로 정확 하 게 열 처리 절차에 따라: PBS 대신 치료를 위해 10 mM HEPES (pH 7.4)을 사용 하 고 더 capsids 희석 하지 않습니다 치료 (50 µ g/mL에서 유지 솔루션) 후. 파라핀 필름에 대우 capsid 솔루션의 전체 ~ 15 µ L 드롭 플라스틱.
- 그리드 가장자리는 그리드를 가장자리에를 핀셋으로 잡아 및 치료 솔루션 방울 위에 그리드 탄소-사이드-아래로 놓습니다. Capsid는 격자에 연결할 수 있도록 10 분 동안 품 어 보자.
- Capsid 준비의 순도 따라 추가 10 mM HEPES 솔루션의 세척 처리 capsid 방울 후 라인에 배치 하는 10-15 µ L 방울의 형태로 필요한 경우.
- 후 10 분은 물방울과 그리드를 선택 합니다. 장소 필터 종이에 거의 수직 그리드는 물방울을 멀리 심지. 그리드와 10-15 µ L HEPES 버퍼의 방울을 데리, 워시 필터 종이의 또 다른 조각으로 30 s, 다음 심지 멀리 잡아
- 빈 영역에서 파라핀 영화에 2 %uranyl 아세테이트 솔루션의 15 µ L 드롭릿 장소.
- 그리드와 uranyl 아세테이트의 방울을 데리 누르고 45 s. 윅 거리에 대 한 uranyl 아세테이트, 솔루션의 대부분을 제거 해야 되 고. 필터 종이, 표 하지 않는 주의에 그리드 탄소-측면 장소 " 스틱 " 핀셋에 습기. 오픈 유리 페 트리 접시에에서 그것에 그리드와 필터 종이 놓습니다.
참고: 사용 하지 마십시오 플라스틱 접시, 격자 정전 그들에 게 매력 있을 것입니다 하 고 붙어 될 요리.
- 그리드와 uranyl 아세테이트의 방울을 데리 누르고 45 s. 윅 거리에 대 한 uranyl 아세테이트, 솔루션의 대부분을 제거 해야 되 고. 필터 종이, 표 하지 않는 주의에 그리드 탄소-측면 장소 " 스틱 " 핀셋에 습기. 오픈 유리 페 트리 접시에에서 그것에 그리드와 필터 종이 놓습니다.
- 모든 치료에 대 한 반복. TEM으로 관찰 하기 전에 건조 하룻밤 desiccator 격자와 페 트리 접시 반쪽 장소.
- 상담 각 기관에서 현미경 시설 준비 격자 관찰에 관한. 일부 시설 허용 그들의 시설의 운영에 관한 훈련을 사용자 ' s 악기. 설치 및 특정 현미경의 관찰에 대 한 특정 세부 정보는 beyond이이 글의 범위.
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Representative Results
인간의 노로바이러스 GII.4 시드니 capsids (VLPs)의 구조적 무결성 무어 외 에 의해 발표로 여러 가지 새로운 방법을 사용 하 여 평가 했다 17. 먼저, 실험에서 행 해졌다는 상 상속 수용 체/공동 factor (HBGA) 또는 바인딩 ssDNA aptamer (M6-2)을 그들의 능력의 기능으로는 capsids의 무결성 비교 (그림 1). 표시 되는 결과 이전 무어 외. 에 의해 제시 된 17, aptamer M6-2-capsid 바인딩 동작의 다양 한 노출 시간에 대 한 68 ° C 열 처리에 노출 시 바이러스 HBGA 바인딩 비슷 했다 입증 하 고. 동안 HBGA 바인딩 신호 손실 약간 이전 보다 aptamer M6-2의 m 6-2 VLPs 65 ° C에 드러낸 후에 다양 한 시간에 대 한 68 ° C (표 1)17포인트를 계산 하는 신호 손실의 비슷한 속도 표시. 이 HBGA 및 aptamer M6 2 바인딩 모두 비슷한 방식으로 폐지 되었다 건의 한다.
DLS 측정 시연 가능성이 단백질 변성으로 인해 집계 ligand 바인딩 신호 (그림 2)의 손실 대응 유체역학 직경 100으로 nm에서 68 ° c.의 약 18 분 후 관찰 되었다 이들은 HBGA 바인딩 및 바인딩 신호 aptamer M6-2에 대 한 거의 모든 손실의는 완전 한 손실에 조건 (> 80%) 발생 (그림 1)17. 가장 결과 형태 변경으로이 관측을 지원 하 고 점점 온도가 60 ° C와 1 분 (그림 3a) 80 ° C 사이의 증분 증가 했다 명백 하 게 되었다는 capsids의 응집. 비슷한 현상 capsids 최대 25 분, 68 ° C에가 열 후 관찰 되었다 하지만 해상도 가장 덜 발음 (그림 3b)17.
그림 1: 노로바이러스 GII.4 시드니 capsids에 두 개의 다른 ligands의 구조-종속 바인딩 대상이 열 처리. 순화 GII.4 시드니 capsids (VLPs) 다른 양의 시간, 68 ° C에서 열 처리를 복종 되었다 그리고 혈액형 A HBGA 및 aptamer M6-2에 바인딩 접시 기반 ELASA 바인딩 분석 결과 사용 하 여 평가 되었다. Y 치료 capsid 컨트롤의 백분율로 처리 (노출 시간)에 대 한 관찰 흡 광도 신호를 표시 합니다. 이 수치는 이전 제시 하 고이 그림 무어 외 에서 수정 되었습니다. 17% 신호의 ± 1 표준 편차를 나타내는 오류 막대입니다. 데이터는 적어도 3 개의 복제 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 예제 DL 열 처리 노로바이러스 GII.4 시드니 capsids 고 모호한/낮은 품질의 결과 보여주는 대 한 데이터. Capsids (VLPs) 65 ° C 68 ° C에서 열 처리를 복종 되었다 그리고 그들의 크기를 실시간으로 모니터링 했습니다. 패널 (a) 높은 품질, 분명 상관 계수 측정;에 해당 그리고 (b) 낮은 품질, 모호한 상관 계수 측정. 패널 (c) 입자 크기 데이터를 보여주는 capsids 68 ° C에서 치료에 대 한 명확한 집계 프로필 표시 그리고 (d) 열 처리 capsids에 대 한 모호한 입자 크기 데이터를 보여줍니다. 일부는 이러한 데이터의 제공 됩니다, 그리고 따라서이 이미지는 무어 외 에서 수정 17 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 노로바이러스 GII.4 시드니 capsids의 가장 다른 열 치료를 받게. 순화 capsids (VLPs) 다양 한 열 치료를 받게 하 고 전송 전자 현미경 검사 법을 사용 하 여 관찰 했다. Capsids 다른 온도에 열에 대 한 데이터를 표시 하는 패널 (a) (60, 65, 70, 75, 및 80 ° C)에 대 일 분 패널 (b) 오른쪽 사진 나타냅니다 100 nm에 68 ° C 0-25 분 규모 (바)에 대 한 치료를 받게 capsids 보여줍니다. 이러한 이미지는 무어 외 에 제시 17 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 지 수 감퇴 율 (% 신호/분) | |||
| 온도 | 65 ° C | 68 ° C | |
| Ligand | |||
| HBGA 타입 A | 2.50 ± 0.24 | 13.30 ± 1.15 | |
| Aptamer M6-2 | 2.47 ± 0.66 | 13.18 ± 0.47 | |
표 1: 노로바이러스 GII.4 시드니 capsids 지 수 감소율 치료 65 ° C에서 68 ° C. 65 ° C에서 다양 한 시간 및 68 ° C, 4 ° C, 그리고 합성 HBGA 또는 평가 aptamer 바인딩할 그들의 능력에서 냉각 capsids 열 치료를 받게 했다. 시간 (감퇴 율) 동안 신호 손실의 비율은 다음 각 온도 대 한 각 ligand와 계산 되었다. 이러한 데이터 이전 무어 외 에 제시 되어 17 데이터 % % 신호의 신호/분 ± 1 표준 편차로 표시 됩니다.
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Discussion
프로토콜 및 여기에 설명 된 기술을 인간의 노로바이러스 capsid 무결성/기능을 평가 하는 수단을 제공 합니다. 이러한 방법은 기계적 통찰력 비활성화는 바이러스에 대 한 치료의 효과 얻기 위해 사용할 수 있습니다 그리고 잠재적으로 더 전통적인 비활성화 평가 방법 RT 정량 또는 상 패 분석 결과 등을 보충할 수 있다. 예를 들어, 혼자 패 분석 실험에 의해 화학적 또는 물리적 비활성화의 평가 바이러스 비활성화의 정도의 측정만 하지 그 비활성화의 기본 메커니즘을 제공합니다. 또한, 바이러스 집계 titer의 과소 발생 하 고 따라서 치료 효능30을 대 평가 수 있습니다. 이러한 방법을 더 노로바이러스 capsid의 무결성에 대 한 치료의 효과 대 한 정보를 제공 하 여 이러한 연구를 알릴 수 있습니다. 최근, 두 생체 외에서 (세포 배양) 경작 방법 인간의 노로바이러스에 대 한 보고5,6; 되었습니다. 이들은 여전히 의존 PCR 바이러스 열거형에 대 한 이론적으로 제시 하는 enteroid 모델 TCID50 활용할 수 있지만 상대적으로 감소 위한 얼룩이 지는 항 체를 사용 하 여. 여기에 제시 된 방법을 넘어 그냥 열 처리 치료의 여러 종류에 대 한 바이러스 비활성화의 완전 한 메커니즘을 이해 하기 위한 유틸리티를 가질 수 있습니다. 예를 들어 플레이트 기반 ligand 바인딩 및 가장 사용한 도구로 구리 표면31,32, 디 실버에 노출 시에 노로바이러스 비활성화 메커니즘 결정 실시간 정량 및 상 패 분석 결과 데이터를 보완 하기 위해 시트르산33, 그리고 높은 압 처리14.
이러한 프로토콜 방법론 세부 사항에 주의 중요 한 여러 단계가 있습니다. 특히, 접시 분석 결과 대 한 큰 관심은 바인딩에 ligand를 희석 하는 데 사용 하는 버퍼에 지불 되어야 합니다. Aptamer M6-2, 그리고 ssDNA aptamers 소금 농도 및 버퍼 조건에 민감합니다 일반적으로. aptamer와 최적화 되지 않은 버퍼를 사용 하 여 바인딩을 ablate 수 있습니다. Aptamer M6-2에서 성공적으로 사용 되는 인간의 대변 희석, 하지만 너무 많은 자/매트릭스 간섭 바인딩, 다른 인간의 노로바이러스 aptamers18,22에 대 한 관찰과 일치를 방해할 수 있습니다. 이 발생 한 주요 요소는 aptamers 충전 된 분자에 일반적인 바인딩의 정도 전시할 수 있습니다. 따라서,이 거짓 긍정적인 신호 여기에서 설명 하는 분석 결과에 어느 정도 발생할 수 있습니다. 이것은 바이러스 없이 복잡 한 매트릭스 또는 없는 단백질 부정적인 컨트롤을 선택 하 여 차지 될 수 있습니다. 마찬가지로, 바인딩 버퍼에 사용 되는 탈지 우유 고체의 양과 HBGA 농도 크게 영향을 미칠 수 긍정적인와 배경 신호. Note 바인딩 버퍼 HBGA 유형14,,3133에 따라 최적화 되어야 할 수 있습니다 그래서 다른 HBGAs 인간의 노로바이러스의 다른 긴장에 선호도의 다양 한 학위를가지고. 유사한 고려해 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 켤레 사용 되는 버퍼에 농도 다른 제조자에서 다 수; 그러나, 훨씬 덜 변화 것으로 예상 될 streptavidin biotin 상호 작용34의 높은 선호도 주어진. 이 접시-기반 방법의 적응성의 높은 학위 때문에 차선의 결과 문제 해결은 상대적으로 간단 합니다. 예를 들어의 경우 높은 배경 신호, 탈지 우유 농도 및 감소 ligand 농도 조사 수, 증가와 반대로 낮은 긍정적인 신호와 번호판에 대 한 최적화. 가장, 가장 중요 한 고려 사항 중 하나는 (유리) 같은 정적 자료를 사용 하 여 때 저장/처리 격자, 격자는 일회용 접시 같은 물질 주위 처리 하기 매우 어려운. 이러한 자료를 사용 하는 경우 격자 "점프" 재료에 충실 하는 경향이 됩니다. 또한, 많은 배려는 격자에 아무 잔여 수 분을 취해야 한다. 이상적으로, 진공 desiccator 사용 가능한 경우 사용 되어야 한다.
DL을 사용 하 여 실험을 수행할 때 샘플의 순도 매우 중요 한 고려 사항입니다. 직경을 산란 강도에 변화를 연결 하는 데 사용 하는 함수 monomodal에 의존 하거나 복합 입자 분포를 좁은. 단백질를 포함 하 여 나노 스케일으로 불순물 증가할수록 소개 하 고 크기 계산을 변경. 또한,의 강도 거듭제곱 한 6, 큰 입자 먼지 등 실질적으로 측정을 방해 하는 직경에 비례 이다 빛 흩어져. 실시간 열 치료 중 거품 형성 무의미 한 결과 변동 거품으로 흩어져 빛 때문에 발생 합니다. Capsid (VLP) 농도 또한 DL을 사용 하는 경우에 고려 되어야 한다. 샘플 농도 충분 한 신호를 생산 하기 위해 충분히 높은 여러 분산을 피하기 위해 충분히 낮은 해야 합니다. 그것은 또한의 중요 한 정확한 자료를 입력 하 고 분산 속성을이 값으로 사용 됩니다 소프트웨어에 의해 크기 계산. 특히, 분산 제 점도 온도 적절 하 게 조정 해야 합니다 (사용 하는 소프트웨어는 내장 물 온도 따른 점도) 열 치료 중.
비록 여기에 설명 된 방법을 capsid 무결성을 평가 하는 향상 된 방법을 여러 기회를 제공, 그들은 완벽 하지 않다. 이러한 방법을 사용 하려면 바이러스의 매우 높은 농도, 때문에 그들은 순화, 조립 capsids 네이티브 전염 성 바이러스 대신 사용 되어야 한다. 인간의 노로바이러스 (VP1), 바이러스 성 핵 산 없이 노로바이러스 capsid로 조립의 주요 capsid 단백질 여기 사용 하는 VLPs에 의하여 이루어져 있다. 이러한 VLPs 전염 성 바이러스 capsids에 antigenically 비슷한 행동을 전시, 비록 그들은 비활성화에 더 취약 있을 수 있습니다. 또한, VLPs 생산 고 정화 하기 어려운 고 많은 조사자를 쉽게 사용할 수 있습니다. 순화 된 인간의 노로바이러스 (예를 들어, ultracentrifugation를 사용 하 여)의 사용은 가능 하지만 노로바이러스 양성 인간의 배설물 표본의 가용성은 제한 하 고도 정화, 바이러스 titers 방법에 맞게 충분히 높은 되지 않을 수 있습니다. 여기 설명합니다. 최적화의 자에 반 정화 전염 성 바이러스의 사용에 대 한 분석에서 미래 작업 현재 진행 중 이다. 사실,이 이미 플레이트 분석 결과18,22에 대 한 증명 되었습니다 하지만 의심할 여 지 없이 DL에 대 한 더 복잡 한 것. 또한 주목 해야 한다 이러한 방법을 capsid 무결성을 평가 하는 물리적 (열)의 신청 후에 적용 했다는 capsid를 직접 영향을 미치는 알려져 비활성화 접근. 결과 더 애매 했다이 기술을 다른 비활성화 방법, 화학 약품 등 주로 대상으로 하는 바이러스 성 게놈의 파괴 방법 capsid 무결성을 평가 하는 데 사용 될 수 있습니다. 그러나, 일부 보고서 호의 HBGA 바인딩 화학 비활성화31,,3335,36,37를 평가 하기 위한 성능 시연. 현재 시간에서 여기에서 보고 된 프로토콜에서에서 잘 사용 된다 RT 정량 및 pl 같은 전통적인 technique(s) 콘서트aque 대리 바이러스 분석 실험입니다.
이러한 프로토콜 인간의 노로바이러스에 실제 바이러스 비활성화 방법 (열)의 효과 이해 하는 간단한 대체 수단을 제공 합니다. 같은 더 높은 순서 단백질 구조의 손실 감지의 전반적인 원칙으로 이러한 방법은 가능성이 다른 비 싸여 바이러스 (예를들면, A 형 간염, E 바이러스)와 함께 사용 하기 위해 확장 될 수 있습니다. 또한, 나타내는 capsid 무결성의 손실에 대 한 다른 ligands의 동작 및 잠재적인 사용을 평가 한다. 더 복잡 한 샘플 매트릭스를 프로토콜을 적응 하 고 그들의 분석 감도 (탐지 한계)를 향상은 또한 논리적 미래 방향입니다. 전반적으로, 여기에 설명 된 방법을 인간의 노로바이러스 capsid 무결성을 확인 하 고 비활성화가 중요 한 병원 체에 대 한 치료의 효과에 대 한 기계적 통찰력을 얻고 더 접근 수단을 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NoroCORE 프로젝트를 통해 농업 및 식품 연구 주도권 경쟁 부여 번호 2011-68003-30395 미국 농 무부, 식품 및 농업에 의해 지원 되었다. 오픈 액세스 비용 자금 미국 농 무부에 의해 제공 했다. 우리는 로버트 Atmar (베일 러 대학의과 대학, 휴스턴, TX) 친절 하 게 우리가 제공 하 고 순화 capsids 발레리 라 팜 가장 이미지와 함께 그녀의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 제시 하는 실험을 시작 하는 데 도움에 대 한 프랭크 N. 배리 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
References
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