Summary
نقدم بروتوكولا لتوصيف الصبغات الضوئية ثنائية الاستقرار من الناحية الكهروفسيولوجية: (i) استغلال إزاحات الشحنة داخل جزيئات التصبغ الضوئي بعد امتصاص الفوتون وكميتها الضخمة في المستقبلات الضوئية ، و (ii) استغلال اختلافات أطياف الامتصاص في حالات الصبغ الضوئي للرودوبسين والميتارودوبسين. هذه البروتوكولات مفيدة للكشف عن الطفرات التي تؤثر على أنظمة التصبغ الضوئي ثنائية الاستقرار.
Abstract
يتكون الرودوبسين (R) من بروتين ذبابة الفاكهة G-protein (R) من بروتين (opsin) وكروموفور. تبدأ عملية تنشيط رودوبسين عن طريق أيزومرات الكروموفور المحرض على امتصاص الفوتون ، مما يعزز التغيرات التوافقية للأوبسين وينتج عنه حالة صبغية ضوئية ثانية مظلمة مستقرة (metarhodopsin، M). يتطلب التحقيق في هذا الصباغ الضوئي ثنائي الاستقرار باستخدام الطفرات العشوائية طرقا بسيطة وقوية لفحص الذباب المتحور. لذلك ، تم تصميم عدة طرق لقياس التخفيضات في مستويات الصباغ الضوئي الوظيفية. إحدى هذه الطرق تستغل إزاحات الشحنة داخل الصبغة الضوئية بعد امتصاص الفوتون والكميات الهائلة من جزيئات الصباغ الضوئي المعبر عنها في المستقبلات الضوئية. يتم قياس هذه الإشارة الكهربائية ، التي تسمى جهد المستقبل المبكر (أو تيار المستقبل المبكر) ، من خلال مجموعة متنوعة من الطرق الكهروفسيولوجية (على سبيل المثال ، مخطط كهربية الشبكية وتسجيلات الخلية بأكملها) وهي تتناسب خطيا مع مستويات التصبغ الضوئي الوظيفية. مزايا هذه الطريقة هي نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية ، والقياس الخطي المباشر لمستويات الصباغ الضوئي ، واستقلال آليات النقل الضوئي في اتجاه مجرى النهر إلى تنشيط رودوبسين أو ميتارودوبسين. وهناك طريقة كهروفسيولوجية إضافية تسمى الجهد اللاحق لإزالة الاستقطاب لفترات طويلة (PDA) تستغل الاستقرار الثنائي لصبغة ذبابة الفاكهة الضوئية والاختلافات الطيفية في الامتصاص الطيفي لحالات الصباغ R و M الذبابة. يتم تحفيز PDA بواسطة الضوء الأزرق المكثف ، وتحويل كميات مشبعة من رودوبسين إلى metarhodopsin ، مما يؤدي إلى فشل إنهاء استجابة الضوء لفترة طويلة في الظلام ، ولكن يمكن إنهاؤه عن طريق تحويل metarhodopsin إلى rhodopsin باستخدام الضوء البرتقالي المكثف. نظرا لأن PDA عبارة عن إشارة قوية تتطلب تحويلا ضوئيا هائلا ، حتى العيوب الصغيرة في التكوين الحيوي للصبغة الضوئية تؤدي إلى PDA غير طبيعي يمكن اكتشافه بسهولة. في الواقع ، أدت طفرات PDA المعيبة إلى تحديد بروتينات إشارات جديدة مهمة للنقل الضوئي.
Introduction
يتكون رودوبسين المنشط بالضوء (R) ، وهو مستقبل مقترن ببروتين G (GPCR) ، من 7 بروتين عبر الغشاء (opsin) وكروموفور. في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر (ذبابة الفاكهة) ، يحفز امتصاص الفوتون أيزومرات كروموفور الشبكية 11-cis-3-OH-إلى الشبكية 1-trans-3-OH-1 ، مما يعزز التغيير التوافقي للرودوبسين إلى metarhodopsin (M ، الشكل 1A). على عكس رودوبسين الفقاريات ، فإن الجزء السائد من كروموفور اللافقاريات لا ينفصل عن الأوبسين ، مما يؤدي إلى حالة الصباغ المستقرة المظلمة النشطة من الناحية الفسيولوجية M. في المقابل ، يؤدي امتصاص الفوتون الإضافي بواسطة كروموفور الشبكية عبر 3-OH-retinal بالكامل إلى تحفيز أيزومرات الكروموفور 2,3 ، مما يولد حالة الصباغ R مع كروموفور 11-cis-3-OH-retinal . الحالة R هي صبغة ضوئية مظلمة ومستقرة وغير نشطة من الناحية الفسيولوجية. بالإضافة إلى مسار تجديد الفوتون السريع للغاية للكروموفور4 ، مثل الكثير من الصبغات الضوئية الفقارية ، يوجد طريق بطيء إنزيمي بديل لتجديد الكروموفور في اللافقاريات ، حيث يتم تنفيذ بعض المراحل في خلايا الشبكية المحيطة بخلايا المستقبلات الضوئية 5,6.
تستلزم ذبابة الفاكهة مزايا كبيرة ككائن حي نموذجي لدراسة المستقبلات الضوئية لللافقاريات. على وجه الخصوص ، جعلت إمكانية الوصول إلى التحضير والقدرة على تطبيق علم الوراثة الجزيئية ذبابة الفاكهة نظاما نموذجيا قويا7. وبالتالي ، تم إنشاء العديد من الطرق التجريبية في الجسم الحي وخارج الجسم الحي لدراسة النقل الضوئي بشكل عام ومستويات الصباغ الضوئي ، على وجه الخصوص. تستغل أبسط طريقة في الجسم الحي استجابة الجهد الكبيرة نسبيا المسجلة خارج الخلية لضوء عين ذبابة الفاكهة. وفقا لذلك ، يثير التحفيز الضوئي استجابة الجهد الكهربائي في العين بأكملها والتي يمكن قياسها باستخدام تسجيل مخطط كهربية الشبكية خارج الخلية (ERG) ، وهو أكبر ب 3 أوامر من استجابة ERG لضوء عيون الفقاريات 8,9. استجابة ذبابة الفاكهة ERG قوية ويمكن الحصول عليها بسهولة ، مما يجعلها طريقة ملائمة لتحديد التشوهات في الاستجابة الخفيفة بسبب الطفرات. تنشأ استجابة ERG للضوء بشكل رئيسي من المستقبلات الضوئية والخلايا الصبغية (الدبقية) والخلايا العصبية الثانوية للصفيحة (انظر الشكل 1B). المكونات الرئيسية ل ERG هي (i) استجابة الجهد خارج الخلية للمستقبلات الضوئية ، (ii) العابرات "on" و "off" في بداية ونهاية التحفيز الضوئي الذي ينشأ من الخلايا العصبية الصفيحية (الشكل 2A ، inset ، ON ، OFF) ، (iii) الاستجابة البطيئة للخلايا الدبقية (الشكل 2A ، inset ، الأسهم) ، و (iv) الاستجابة القصيرة والعابرة ، الناتجة عن إزاحة الشحنة أثناء تنشيط الصباغ الضوئي الذي يسبق ON العابر10 (الشكل 2C [inset] ، D ، E). تتكون هذه الاستجابة الموجزة من مرحلتين (M1 و M2 ، الشكل 2C [inset]) ولا يمكن تحفيزها إلا عن طريق تحفيز الضوء القوي للغاية ، والذي ينشط في وقت واحد ملايين جزيئات الصباغ الضوئي. لا يلاحظ تحت التحفيز الأزرق (الشكل 2D ، التتبع الأزرق) ولا في الطفرات ذات مستويات التصبغ الضوئي المنخفضة للغاية (الشكل 2E ، التتبع الأحمر) ، ولكن يتم تعزيز سعته بشكل معتدل في المتحور الذي يلغي نشاط PLC (الشكل 2E ، التتبع البرتقالي). مرحلة M1 هي تخطيط موارد المؤسسات النموذجي للذبابة الناشئة عن تنشيط M في المستقبلات الضوئية. المرحلة M1 ، التي لها قطبية إيجابية (داخل الخلايا) ، تطلق ناقلا عصبيا بالطريقة العادية في مشبك مقلوب للعلامة وينشط الخلايا العصبية الصفيحية ، التي تستجيب لإزالة الاستقطاب من المستقبلات الضوئية عن طريق توليد مرحلة M2 المضخمة بشكل متشابك. وبالتالي ، تعكس كل من مرحلتي M1 و M2 تنشيط M10,11.
يولد إزالة الاستقطاب للمستقبلات الضوئية المرحلة العابرة "على" إيجابية القرنية ، الناشئة عن المشبك المقلوب للعلامة بين محور المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية أحادية القطب للصفيحة 10,11 (الشكل 1B). ينشأ الارتفاع البطيء والاضمحلال ل ERG من إزالة الاستقطاب من الخلايا الصبغية (الشكل 2A ، الجزء الداخلي ، الأسهم) ويرجع ذلك أساسا إلى تدفق K + من خلايا المستقبلات الضوئية12 عبر القنوات المحتملة للمستقبلات العابرة (TRP) والقنوات الشبيهة ب TRP (TRPL) 13،14،15. هذه المكونات الحركية البطيئة تخفي إلى حد كبير وتشوه الشكل الموجي لاستجابة المستقبلات الضوئية عند مقارنتها بالتسجيلات داخل الخلايا أو الخلايا الكاملة لاستجابة المستقبلات الضوئية للضوء 9,10. بالإضافة إلى ذلك ، في الإضاءات القوية جدا ، يمكن ملاحظة استجابة عابرة إضافية ، تسبق وتندمج جزئيا مع العابر "على" (الشكل 2C [inset] ، D ، E). تنشأ هذه الإشارة مباشرة من التنشيط الهائل للصبغة الضوئية10.
تم تطوير العديد من بروتوكولات نظام الضوء باستخدام الكثافة المحايدة (ND) ومرشحات الألوان ، بالإضافة إلى ومضات الإضاءة القوية ، للتحقيق في العين بشكل عام وشلال النقل الضوئي بشكل خاص. كما تم استخدام هذه البروتوكولات للتحقيق في خصائص الصباغ الضوئي.
يقيس بروتوكول الاستجابة للشدة سعة الذروة لاستجابة جهد ERG للعين بأكملها لزيادة شدة الضوء (الشكل 2A ، B). يساعد هذا البروتوكول في الكشف عن التغيرات في حساسية خلايا المستقبلات الضوئية للضوء9.
يستغل بروتوكول الجهد اللاحق لإزالة الاستقطاب لفترات طويلة (PDA) الاختلافات في أطياف امتصاص رودوبسين وميتارودوبسين التي تسمح ، في ذبابة الفاكهة ، بتحويل صبغي ضوئي هائل ل R إلى حالتها المتوسطة M2 النشطة فسيولوجيا والمستقرة في الظلام. في استجابة الجهد ERG ، يتم إعطاء نبضة قصيرة نسبيا من الضوء المشبع ، ويتم تسجيل استجابة الجهد الناتجة. في ظل هذه الحالة ، يتم الوصول إلى السقف (إمكانات الانعكاس) بواسطة إشارة إزالة الاستقطاب لأن تنشيط جزء من النسبة المئوية من الكمية الضخمة من جزيئات رودوبسين (~ 1 × 108) يكفي للوصول إلى السقف. يضمن وجود مكونات النقل الضوئي بوفرة كبيرة الوصول إلى هذا السقف حتى في الطفرات مع انخفاض كبير في التركيز أو خلل دقيق في مكونات النقل الضوئي. هذا الوضع يحول دون عزل هذه المتحورات. قدم باك وآخرون فحص PDA7 بحثا عن اختبار موثوق به وكاشف لعزل الطفرات البصرية. في ذبابة الفاكهة ، يتم تحقيق استجابة PDA عن طريق إزالة صبغة الفحص الحمراء وراثيا ، والتي تسمح بتحويل التصبغ الضوئي ، وتطبيق الضوء الأزرق ، الذي يتم امتصاصه بشكل تفضيلي بواسطة رودوبسين (الشكل 3A) ، وبالتالي ، يؤدي إلى تحويل صافي كبير من R إلى حالة الصباغ الضوئي M. يتم تعطيل إنهاء النقل الضوئي على مستوى الصباغ الضوئي عن طريق تحويل صافي كبير من R إلى M ، مما يؤدي بدوره إلى إثارة مستمرة بعد فترة طويلة من إطفاء الضوء (الشكل 2C ، الشكل 4A [أعلى]). خلال فترة PDA ، تكون المستقبلات الضوئية أقل حساسية لأضواء الاختبار اللاحقة ويتم إلغاء حساسيتها جزئيا (تعطيلها). يكتشف PDA حتى العيوب الطفيفة في التكوين الحيوي للرودوبسين ويختبر القدرة القصوى لخلية المستقبلات الضوئية للحفاظ على الإثارة لفترة طويلة. نظرا لأنه يعتمد بشكل صارم على وجود تركيزات عالية من رودوبسين ، فإنه يسجل بسهولة لتجديد نقص مكونات النقل الضوئي. ومن اللافت للنظر أن شاشة المساعد الشخصي الرقمي قد أسفرت عن العديد من الطفرات البصرية الجديدة والمهمة جدا (تمت مراجعتها في Pak et al.7). وبالتالي ، فإن طفرات PDA المعزولة بواسطة Pak et al.7 لا تزال مفيدة للغاية لتحليل النظام البصري ذبابة الفاكهة.
يتم تحفيز PDA في ذبابة الفاكهة عن طريق تشبع الضوء الأزرق ، مما يؤدي إلى إزالة الاستقطاب المستمر لفترة طويلة بعد إزاحة الضوء (الشكل 4A [أعلى]). بعد تشبع الضوء الأزرق المسبب للمساعد الشخصي الرقمي ، تظل المستقبلات الضوئية الطرفية (R1-6) نشطة باستمرار في الظلام بأقصى طاقتها ، وتصل إلى التشبع. لا تنتج الأضواء الزرقاء المشبعة الإضافية أثناء PDA أي استجابة إضافية في خلايا R1-6 لعدة ثوان ولكنها تحفز استجابة في خلايا R7-8 التي يتم تركيبها على PDA. يتم تفسير الاستجابات المتراكبة من خلال أطياف الامتصاص المختلفة للأصباغ الضوئية المعبر عنها في هذه الخلايا (R7-8)16. يمكن قمع المساعد الرقمي الشخصي عن طريق التحويل الضوئي ل M مرة أخرى إلى R مع ضوء برتقالي مشبع (الشكل 4A [أعلى]). إن قدرة المساعد الشخصي الرقمي على جلب خلايا المستقبلات الضوئية إلى أقصى قدرة نشطة لها ، وهو وضع لا يمكن تحقيقه بواسطة الضوء الأبيض المكثف ، يفسر لماذا كان أداة رئيسية لفحص الطفرات البصرية لذبابة الفاكهة. هذا لأنه يسمح بالكشف عن حتى العيوب الطفيفة في البروتينات المشاركة في التكوين الحيوي لمستويات التصبغ الضوئي الطبيعية17,18. تم عزل مجموعتين من الطفرات المعيبة PDA: لا التعطيل ولا الطفرات اللاحقة (nina) والتعطيل ولكن ليس الطفرات اللاحقة (in). النمط الظاهري للأول هو نقص في المساعد الشخصي الرقمي وما يرتبط به من تعطيل ناشئ عن انخفاض كبير في مستويات الصباغ الضوئي (الشكل 4A [في الوسط]). يظهر النمط الظاهري لهذا الأخير تعطيلا ولكن لا يوجد إزالة استقطاب مظلمة بعد الضوء الأزرق بسبب آلية لا تزال غير معروفة في المتحور مع مستويات رودوبسين طبيعية ولكنها تفتقر إلى البروتينات التي تتفاعل مع قنوات TRP (الشكل 4A [أسفل]).
ينشأ PDA من الاختلاف في كمية الصباغ الضوئي بالنسبة إلى الاعتقالين (ARR2) ، والذي يربط وينهي نشاط M 19,20,21 (الشكل 1A). في المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة ، تكون كمية الصباغ الضوئي أكبر بحوالي خمسة أضعاف من كمية ARR219. وبالتالي ، فإن مستويات ARR2 غير كافية لتعطيل جميع جزيئات M الناتجة عن تحويل ضوئي صافي كبير من R إلى M ، مما يترك فائضا من M نشطا باستمرار في الظلام17،19،20،22،23. تفسر هذه الآلية القضاء على استجابة PDA عن طريق الطفرات أو عن طريق الحرمان من الكاروتينويد24,25 ، مما يسبب انخفاضا في مستوى التصبغ الضوئي ، ولكنه لا يؤثر على مستويات الاعتقال. علاوة على ذلك ، يفسر هذا التفسير أيضا الأنماط الظاهرية للأليل الطافر ARR2 (arr23) 21 ، حيث يمكن تحقيق PDA عند كثافة الضوء الأزرق الباهت ~ 10 أضعاف 19,20,21 (الشكل 4B ، C). المساعد الشخصي الرقمي ليس ميزة فريدة من نوعها للمستقبلات الضوئية الذبابة ، ويظهر في كل الأنواع المختبرة التي لديها M مستقرة داكنة مع طيف امتصاص مختلف عن حالة R ، مما يسمح بالتحويل الضوئي الكافي للصبغة الضوئية من R إلى الحالة M. من الأنواع التي تم التحقيق فيها بدقة والتي تم اكتشاف ظواهر PDA فيها مستقبلات الضوء barnacle (Balanus) ، حيث يكون طيف الامتصاص لحالة R في طول موجي أطول من الحالة M2 (الشكل 3B). وفقا لذلك ، على عكس الوضع في الذبابة ، في البارناكل ، يحفز الضوء البرتقالي الأحمر المساعد الشخصي الرقمي ، بينما يقمع الضوء الأزرق PDA2.
يستغل بروتوكول إمكانات المستقبلات المبكرة (ERP) إزاحة الشحنة التي تحدث أثناء تنشيط R أو M. الصباغ البصري هو جزء لا يتجزأ من الغشاء السطحي لحجرة الإشارات لكل من الأغشية الفقارية واللافقارية3. وفقا لذلك ، فإن عملية التنشيط التي تتغير فيها جزيئات الصباغ الضوئي من حالة وسيطة إلى أخرى مصحوبة بإزاحة شحنة 4,26. نظرا لأن جزيئات الصباغ الضوئي محاذاة كهربائيا بالتوازي مع سعة الغشاء4 ، فإن التغيير التوافقي المتزامن السريع يولد تغييرا سريعا في الاستقطاب للغشاء السطحي ، والذي يحدث ، في الذباب ، في حجرة الإشارات المكونة من كومة من ~ 30،000-50،000 من الزغابات الدقيقة تسمى rhabdomere. ثم يصب هذا الاستقطاب بشكل سلبي من خلال سعة الغشاء لجسم الخلية حتى يتم استقطاب غشاء الخلية بالتساوي. ERP هو التسجيل خارج الخلية لإزاحة الشحنة. يظهر ERP المسجل داخل الخلايا ERP ERP خارج الخلية المتكامل بواسطة ثابت الوقت لغشاء الخلية 4,27,28. يمكن أيضا قياس التيار الذي يتم تنشيطه بواسطة إزاحة شحنة الصباغ البصري في تسجيلات مشبك الجهد الكهربائي للخلية الكاملة29,30 (الشكل 5A-D) ، مع الميزة الرئيسية (في تسجيلات تيار المستقبلات المبكرة (ERC) لتقليل تأثير سعة الغشاء على حركية الإشارة.
يصف قسم البروتوكول كيفية إجراء قياسات ERG من قياسات ذبابة الفاكهة9 و ERC بواسطة تسجيلات الخلايا الكاملة من ذبابة الفاكهة المعزولة ommatidia31,32. كما نصف بروتوكولات محددة تستخدم للتحقيق في النقل الضوئي بشكل عام والأصباغ الضوئية بشكل خاص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. قياس علاقة استجابة الشدة ، والجهد اللاحق لإزالة الاستقطاب لفترات طويلة (PDA) ، وجهد المستقبل المبكر (ERP) باستخدام مخطط كهربية الشبكية
- ظروف تربية مناسبة لإعداد D. melanogaster
- رفع D. melanogaster يطير في زجاجات تحتوي على الذرة الصفراء القياسية التي تحتوي على الطعام في حاضنة يتم الحفاظ عليها عند درجة حرارة 24 درجة مئوية وفي دورة مظلمة / ضوئية لمدة 12 ساعة
- احتفظ بزجاجات الذباب في الظلام قبل 24 ساعة على الأقل من التجربة.
- الإعداد العام
- قم بإعداد ماصات التسجيل عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكية المملوءة بالألياف 1 مم × 0.58 مم (O.D × I.D) المملوءة بالألياف (الشكل 6L ، O). يجب أن تكون مقاومة الماصات 5-10 MΩ ؛ يمكن استخدام أي مجتذب مناسب.
- قم بتغطية سلكين فضيين ب AgCl2 ، مع إدخال سلك فضي 0.25 مم في حل 3M KCl المتصل بمصدر طاقة 5 فولت مصنوع خصيصا.
- أدخل كل سلك فضي مطلي في حاملات الأقطاب الكهربائية (الشكل 6N).
- املأ الشعيرات الدموية الزجاجية بمحلول رينجر المصفى (انظر الجدول 1) باستخدام حقنة طرف ممدودة (الشكل 6M).
- أدخل القطب الكهربائي السلكي في الشعيرات الدموية الزجاجية. تأكد من أن المحلول داخل الشعيرات الدموية على اتصال بالسلك الفضي.
- أدخل حاملات الأقطاب الكهربائية (الشكل 7P ، N) في اثنين من المتلاعبين بالقطب الكهربائي (الشكل 7G).
- إجراءات إعداد الذبابة للتسجيلات الكهربائية
ملاحظة: للحفاظ على الذبابة في ظل ظروف مظلمة، استخدم إضاءة الضوء الأحمر الخافت فقط خلال الخطوات التالية.- تخدير الذباب في الزجاجة بغاز CO2 باستخدام نظام النوم الذبابة (الشكل 6A ، B) وصبه في حاوية النوم.
- اختر ذبابة واحدة وأمسكها بعناية من جناحها باستخدام ملقط حاد. غطي بقية الذباب بطبق بتري.
- ضع الذبابة على حامل الذبابة في الاتجاه الصحيح على جانبها ، مع ظهرها نحو اليد (الشكل 6P).
- قم بتشغيل مصدر الطاقة الخاص بمكواة اللحام. اضبط التيار على ~ 2.25 A. يجب أن يسخن هذا التيار خيوط البلاتين والإيريديوم 0.25 مم إلى ~ 55-56 درجة مئوية (انظر الملف التكميلي).
- ضع قطرة من الشمع مع درجة حرارة انصهار منخفضة (~ 55-56 درجة مئوية) على حديد اللحام (الشكل 6F).
- باستخدام ملاقط ، ارفع الذبابة من أجنحتها وثبت أجنحتها على حامل الذبابة (الشكل 6I) باستخدام مكواة اللحام.
- باستخدام مكواة اللحام ، قم بتوصيل ظهر الذبابة بسطح الحامل بالشمع (الشكل 6P).
- اخفض طرف حديد اللحام على نقطة الالتصاق بالساقين وقم بإذابة الشمع لتغطية جميع الأرجل معا (الشكل 6P).
- ضع قطرة صغيرة من الشمع بين الرأس والظهر في منطقة الرقبة (الشكل 6P).
ملاحظة: انتبه بشكل خاص لتجنب ارتفاع درجة حرارة رأس الذبابة. التأكد من أن الذبابة ثابتة بشكل صحيح وغير قادرة على التحرك أثناء التجربة ؛ قد تؤدي الحركات البسيطة إلى إنشاء قطع أثرية في التسجيلات. تأكد من أن فتحات القصبة الهوائية (مداخل التنفس) في الصدر والبطن غير مغطاة بالشمع. - ضع حامل الذبابة (الشكل 7Q) في قفص فاراداي مظلم على كتلة مغناطيسية (الشكل 7I) وتأكد من أن الذبابة ~ 5 مم من نهاية دليل الضوء (الشكل 7L).
- ضع قطب التسجيل (الشكل 7P) فوق عين الذبابة والقطب الأرضي (الشكل 7N) فوق الجزء العلوي الخلفي من الذبابة باستخدام المتلاعبين الدقيقين.
- أدخل القطب الأرضي في الجزء الخلفي من الذبابة باستخدام المتلاعبين الدقيقين.
- أدخل قطب التسجيل في المحيط الخارجي لعين الذبابة ، ويفضل أن يكون ذلك باستخدام المتلاعبين الدقيقين.
ملاحظة: بعد إدخال القطب الكهربائي في العين ، سيتم ملاحظة غمازة صغيرة ؛ اسحب القطب الكهربائي لأعلى دون إزالته من العين حتى تختفي الدمل. يمكن أيضا غمر الأقطاب الكهربائية في قطرات صغيرة من هلام القطب الكهربائي المطبق على الجذع والعين.
- بروتوكول الاستجابة للكثافة
- ضع مرشحا برتقاليا (مرشح حافة 590) أمام مصباح زينون عالي الضغط. استخدم مرشحا كبيرا (ستة أوامر من الحجم) مخففا للكثافة المحايدة (ND).
- انتظر 60 ثانية في الظلام وأعط نبضة ضوء 5 ثانية.
- استبدل مرشح ND بمرشح ND أقل تخفيفا بترتيب واحد من زيادات الحجم.
- انتظر 60 ثانية في الظلام وإعطاء نبضة ضوء ثانية 5 ثانية.
- كرر الخطوات 1.4.1.-1.4.4 ، مما يزيد تدريجيا من شدة الضوء باستخدام مرشحات ND أقل تخفيفا (يجب إنشاء النبضة الأخيرة بدون مرشح ND على الإطلاق). تأكد من استخدام سلسلة مرشحات ND في الاتجاه الصحيح ، بدءا من التوهين الكبير والوصول إلى التوهين المنخفض.
- بروتوكول المساعد الشخصي الرقمي (لا يمكن تنفيذ هذا البروتوكول إلا على الذباب الأبيض العينين)
- أعط نبضة ضوئية 5 ثانية ذات كثافة قصوى باستخدام مرشح برتقالي (مرشح حافة 590 ، لتحويل الصباغ الضوئي الأقصى إلى حالة R).
- استبدل الفلتر البرتقالي بمرشح أزرق عريض النطاق (BP450/40 nm) وامنح ثلاث نبضات ضوئية بزاوية 5 ثوان بأقصى كثافة.
ملاحظة: من الممكن أيضا إعطاء نبضة ضوء أزرق طويلة مستمرة بأقصى كثافة حتى يتم الوصول إلى استجابة جهد الحالة الثابتة. - انتظر 60 ثانية في الظلام ، واستبدل المرشح الأزرق بالمرشح البرتقالي السابق ، وأعط نبضتين ضوئيتين 5 ثانية مع فترات 60 ثانية.
- بروتوكول ERP / M لقياس طيف التوازن الضوئي ل M (لا يمكن تنفيذ هذا البروتوكول إلا على الذباب الأبيض العينين10,25)
- أعط نبضة ضوئية زرقاء مستمرة (ممر النطاق الترددي (BP) 450/40 نانومتر) حتى تصل إلى استجابة جهد الحالة الثابتة ، والتي تحول الحد الأقصى لكمية الصباغ الضوئي من الحالة R إلى الحالة M لخلايا R1-6.
- أعط وميضا ضوئيا مكثفا قصيرا (<3 مللي ثانية) بطول موجي يتراوح بين 350-700 نانومتر (طيف الامتصاص المعروف للصبغة الضوئية لخلايا R1-6) باستخدام مرشحات ممر النطاق الترددي الضيق (~ 20 نانومتر) وقياس سعة الذروة لمرحلة M1 من الاستجابة المحتملة M (التي تعكس امتصاص الميتارودوبسين عند هذا الطول الموجي المحدد عند التوازن الضوئي10,25).
ملاحظة: للتنشيط المتزامن لمجموعة كبيرة من جزيئات الصباغ الضوئي ، يلزم وميض ضوء قصير ومكثف حتى يتم تعبئة محتوى الفوتون في فترة قصيرة. يتكون جهد M من مكونين: M1 (الطور السلبي للقرنية) ، والذي يعكس إزاحة الشحنة لل metarhodopsin في المستقبلات الضوئية ، و M2 (المرحلة الإيجابية القرنية 11,33) ، والتي تعكس استجابة M1 المضخمة للمستقبلات الضوئية في الصفيحة 9,10,11 . ويمكن تحديد كل مكون من هذه المكونات وقياسه. ومع ذلك ، فمن الأفضل قياس إمكانات M1 لأنها مظهر خطي مباشر لمستويات M. إذا تم استخدام M2 ، فتأكد من أن سعته في النطاق الخطي باستخدام الحرمان الخفيف من الكاروتينويد24,25. - قم بإعطاء نبضة ضوئية زرقاء مستمرة (BP450/40 nm) مرة أخرى ، متبوعة بوميض ضوئي مكثف قصير (<1 مللي ثانية) بطول موجي مختلف.
- كرر هذا البروتوكول حتى يتم تغطية طيف الامتصاص الكامل ل M عند توازن الصورة.
2. بروتوكول ERC لقياس طيف عمل حالات R و M لخلايا R1-6 باستخدام تسجيلات الجهد المشبك للخلية بأكملها
ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصل لاستخدام تسجيلات مشبك الجهد الكهربي للخلية الكاملة، انظر Katz et al.34. يستخدم الجهد M ERG لقياس تنشيط الحالة M فقط لأن مساهمة الحالة R يتم قمعها بواسطة سعة الغشاء. في المقابل ، يقيس ERC تنشيط كل من R (ERC الموجب) و M (ERC السالب) لأن تسجيلات الجهد المشبك تزيل تأثير سعة الغشاء (انظر المقدمة).
- قم بتحويل الصبغة الضوئية إلى الحالة المطلوبة (R أو M). بالنسبة للتحويل من R إلى M ، أولا ، قم بتكييف الذباب بواسطة فلاش أزرق تكيفي قصير (<1 مللي ثانية) (BP450/40 nm). لتحويل M إلى R ، قم بإعطاء فلاش برتقالي تكيفي قصير (مرشح حافة OG590).
- أعط وميضا ضوئيا قصيرا (<1 مللي ثانية) بطول موجي يتراوح بين 350-700 نانومتر وقم بقياس أقصى سعة سالبة أو إيجابية لاستجابة ERC ، والتي تعكس امتصاص M / R عند هذا الطول الموجي المحدد.
ملاحظة: للتنشيط المتزامن لمجموعة كبيرة من جزيئات الصباغ الضوئي ، يلزم وميض ضوء قصير ومكثف لتعبئة محتوى الفوتون في فترة قصيرة. يمكن أن يصل الحد الأقصى لتحويل الصباغ الضوئي من R إلى M بواسطة الفلاش الأزرق إلى ~ 80٪ من إجمالي جزيئات الصباغ الضوئي بسبب التداخل في طيف الامتصاص R و M (الشكل 3A). لذلك ، عند الأطوال الموجية أقل من ~ 550 نانومتر ، يحتوي ERC على مكونين: مرحلة سلبية تعكس استجابة metarhodopsin، ومرحلة إيجابية تعكس استجابة الرودوبسين المتبقي. يعتمد ERC خطيا على شدة الضوء (الشكل 5D). وبناء على ذلك، ولاشتقاق الحساسية الطيفية لحالتي R وM، يلزم تطبيع كل مرحلة من مراحل ERC عند الأطوال الموجية المختلفة للحصول على طاقة متساوية29. - كرر الخطوات 2.1.-2.2. باستخدام ومضات ذات أطوال موجية مختلفة.
- ارسم ERC الإيجابي والسالب الطبيعي كدالة للطول الموجي.
ملاحظة: يحفز وميض الضوء القوي تيارا هائلا عبر القنوات الحساسة للضوء مما يؤدي إلى إجهاد التمثيل الغذائي على المستقبلات الضوئية ، مما يؤدي بدوره إلى فتح قناة مستقلة عن الضوء. يتم فرض ERC على هذا التيار التأسيسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 2 متانة وسهولة استخدام تقنية ERG. إنه قوي لأنه يتم تسجيله في الذبابة السليمة تقريبا بواسطة تقنية بسيطة من تسجيلات الجهد خارج الخلية التي تتطلب إعدادا كهروفسيولوجيا بسيطا. تتجلى المتانة من خلال الحصول على تسجيلات لاستجابات الضوء ذات السعات الكبيرة نسبيا (في نطاق المللي فولت) حتى عندما تقلل الطفرات بشدة من استجابة الضوء أو تشوهها. لذلك ، حتى المجرب عديم الخبرة يمكنه استخدام الإعداد التجريبي البسيط للغاية وتعلم كيفية الحصول على نتائج ذات مغزى في غضون أيام قليلة. يتم تحقيق الهدف الرئيسي من التقنية المصممة لقياس مستويات الصباغ الضوئي بطرق مبسطة للغاية من PDA (الشكل 2C) و ERP (الشكل 2C-E). ويتطلب البديل، أي القياس الطيفي المجهري، معدات بصرية باهظة الثمن وقدرا كبيرا من التدريب والمهارة (الشكل 3 باء). وعلى الرغم من أن ERC (الشكل 5A-D) يمثل تحديا تقنيا، إلا أنه أقل حساسية للحفاظ على الخلايا؛ يتميز بنسبة إشارة عالية إلى الضوضاء والقضاء على سعة الغشاء.
الشكل 1: الدورة الكيميائية الضوئية: تنشيط وتعطيل الصباغ الضوئي. (أ) الإضاءة الزرقاء المشبعة (السهم الأزرق المتموج) تحول الرودوبسين (R) إلى ميتارودوبسين (M). الفسفرة المتعددة ل M بواسطة رودوبسين كيناز والربط اللاحق للاعتقالين 2 (ARR2) يعطل M. الضوء البرتقالي (السهم الأحمر المتموج) يحول الضوء الضوئي M غير المفسفرة إلى R. ينشط M غير المفسفرة بروتين G غير المتجانس (Gqαβγ) ، مما يتسبب في انفصالGq α عن Gqβγ وتبادل الناتج المحلي الإجمالي المرتبط مع GTP السيتوبلازمي. ثم يقوم Gqα-GTP بتنشيط الفوسفوليباز C (PLC) ، الذي يقوم بتحلل PIP2 إلى diacylglycerol (DAG) و inositol trisphosphate (IP3) ، وبالتالي تنشيط قنوات TRP / TRPL بطريقة لا تزال غير واضحة. يقوم كيناز Ca2+ المعتمد على الكالمودولين (CaMKII) بفسفرة مركب M pp-ARR2 ويخضع لكثرة الخلايا الداخلية المعتمدة على الكلاثرين والتدهور. تعمل الإضاءة ذات الضوء البرتقالي (السهم الأحمر المتموج) على تحويل مركب M pp-ARR2 إلى R (Rpp) المفسفر، مما يؤدي إلى إطلاق ARR2 إلى السيتوسول. يخضع R المفسفرة (Rpp) لإزالة الفسفرة بواسطة فوسفاتيز رودوبسين (rdgC) ، مما ينتج R جاهزا لدورة أخرى من الصباغ الضوئي. (ب) ملف تعريف عمق ERG للذبابة ذات العيون البيضاء إلى حافز أبيض 1 ثانية (عمود مركزي) أو وميض قوي أبيض (عمود أيمن). يشار إلى المحفزات بواسطة أشرطة أو نقاط تحت الآثار. يتم ترتيب الآثار عموديا بترتيب العمق ، مع تسجيل التتبع العلوي ~ 10 ميكرومتر تحت القرنية ، مع تسجيل كل تسجيل لاحق 25 ميكرومتر أعمق من الأخير. على اليسار توجد كاميرا لوسيدا ترسم قسما مقابلا من خلال عين أخرى ، تشير إلى شبكية العين ، والغشاء السفلي (BM) ، والقشرة الصفائحية ، والخراطيش الصفائحية (المجزأة بشكل غير مباشر) ، والقشرة النخاعية. تم تعديل هذا الرقم من ستيفنسون وباك11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تسجيلات مخطط كهربية الشبكية (ERG) للاستجابات الضوئية للنوع البري الأبيض العينين (w1118) وذبابة الفاكهة المتحولة التي تظهر العلاقة بين الشدة والاستجابة ، والجهد اللاحق لإزالة الاستقطاب لفترات طويلة (PDA) ، وإمكانات metarhodopsin (M-potential). (أ) علاقة الشدة والاستجابة لذبابة WT (w1118) التي تم الحصول عليها بواسطة سلسلة من الأضواء البرتقالية (مرشح حافة OG590 ، كانت الطاقة الإجمالية المنبعثة من حافة دليل الضوء باستخدام المرشح البرتقالي 4 mW) مع زيادة شدة الضوء المشار إليها في مقياس -log. يعرض الجزء الداخلي الاستجابة المشار إليها على نطاق زمني أسرع. Inset: المكونات الرئيسية ل ERG هي استجابة الجهد خارج الخلية للمستقبلات الضوئية (جهد المستقبل) ، والعابرات "on" و "off" (استجابة ON ، OFF) في بداية ونهاية التحفيز الضوئي ، والاستجابة البطيئة للخلايا الدبقية (الأسهم). (ب) يرسم متوسط سعة الذروة لاستجابات ERG كدالة لشدة الضوء النسبية. (ج) تم الحصول على ERP لذبابة WT (w1118) عن طريق تطبيق الضوء الأزرق المشبع (BP450/4 nm ، والطاقة الإجمالية المنبعثة من حافة دليل الضوء باستخدام المرشح الأزرق كانت 1 mW) الضوء الذي يحفز في البداية PDA. تم الحصول على ERP (inset) بواسطة فلاش أخضر مكثف (~ 70 J ، 2 مللي ثانية) (سهم ، مرشح تداخل النطاق العريض 550 نانومتر) ، والذي قمع المساعد الشخصي الرقمي. Inset: تشمل المكونات المختلفة ل ERP إمكانات M1 سالبة القرنية وإمكانات M2 الإيجابية ، كما هو موضح. ويشار أيضا إلى بقايا على الاستجابة العابرة ("ON"). (مد إلى هاء) مطلوب تحويل الصباغ الضوئي لتحريض إمكانات M: (D) تم الحصول على إمكانات M بواسطة فلاش أخضر (مرشح تداخل واسع النطاق 550 نانومتر) بعد التكيف الأزرق ولكن ليس بواسطة وميض أزرق (BP450/4 nm) بعد التكيف الأزرق في ذبابة WT (w1118). (ه) تكرر بروتوكول D في WT (w 1118 ، التتبع الأسود) واثنين من الذباب المتحور (PLC null mutant ، norpAP24 ، التتبع البرتقالي ، ومتحور رودوبسين hypomorphic ، ninaEP318 ، التتبع الأحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أطياف امتصاص الذبابة والأصباغ الضوئية البارناكل. (أ) أطياف الامتصاص النسبية لذبابة رودوبسين (R) وميتارودوبسين (M) محسوبة من القياسات الضوئية لطيف الفرق وطيف التوازن الضوئي. تم تعديل هذا الرقم من Selinger و Minke35. (ب) اثنين من التسميات الشعاعية دارتنال مع ذروة الأطوال الموجية عند 492 نانومتر و 532 نانومتر، مع نسبة ذروة امتصاص 1.63: 1، على التوالي. يعطي الفرق بين هذه المنحنيات أفضل ملاءمة لطيف الفرق المقاس من ocelli من barnacle Balanus eborneus ، الذي تم الحصول عليه عن طريق قياسات الإرسال في نطاق 400-650 نانومتر بعد تشبع التكيف الأزرق أحادي اللون (442 نانومتر) والبرتقالي (596 نانومتر). تم تعديل هذا الرقم من Minke و Kirschfeld36. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النمط الظاهري PDA للطفرات nina و ina و Arr2 . (أ) بروتوكول تحريض وقمع المساعد الشخصي الرقمي في ذبابة الفاكهة. يتكون بروتوكول تحريض PDA من إضاءة أولية باستخدام نبضة الضوء البرتقالي القصوى الكثافة (مرشح حافة 590 ، كانت الطاقة الإجمالية المنبعثة من حافة دليل الضوء باستخدام المرشح البرتقالي 4ميجاوات ، شريط برتقالي) متبوعا بتطبيق ثلاث نبضات من الضوء الأزرق الأقصى الكثافة (النبضات 2 و 3الثالثة هي للتحقق من الوصول إلى الحد الأقصى من المساعد الشخصي الرقمي ، مرشح BP450/40 nm ، كان إجمالي الطاقة المنبعثة من حافة دليل الضوء باستخدام المرشح الأزرق 1 ميجاوات ، ثلاثة أشرطة زرقاء). تم الحصول على قمع PDA عن طريق تطبيق نبضة الضوء البرتقالي تليها تطبيق ضوء برتقالي إضافي (شريطان برتقاليان). تم تكرار بروتوكول تحريض وقمع PDA في المتحور أبيض العينين للجين الهيكلي للتصبغ الضوئي R1-6 ، ninaEP318 7 (الوسط). كما تكرر بروتوكول تحريض وقمع PDA في المتحور الصفري ذو العيون البيضاء لبروتين كيناز C الخاص بالعين (PKC32) inaCP209 (أسفل). (ب) مقارنة بين كمية الضوء الأزرق المطلوبة لتحريض المساعد الرقمي الشخصي بين WT أبيض العينين (W1118) ومتحور Arr2 الفارغ (Arr23). قطار من البرتقالي المتناوب (تشبع 590 مرشحا للحافة) والأزرق (BP450/40 نانومتر) نبضات ضوئية متزايدة (ND في مقياس سجل نسبي). عند الضوء الأزرق لكثافة -log 1 ، يتم تحفيز PDA (أعلى). تم تكرار نموذج التتبع العلوي في المتحور Arr23 مما يدل على أن PDA تم تحريضه عند الضوء الأزرق لشدة الضوء الخافت ~ 10 أضعاف (-log 2) (أسفل). (ج) فشل قطار من نبضات الضوء الأزرق الخافتة (-log 2) ذات الكثافة الثابتة في تحفيز PDA في ذبابة W1118 (يسار) ، في حين أن نفس قطار الأضواء الزرقاء الخافتة تسبب في PDA بواسطة نبضة الضوء1st في المتحور Arr23 (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تسجيلات خلية كاملة الرقعة المشبك للاستجابات الضوئية للأوماتيديا المعزولة، المسجلة من WT أبيض العينين (w1118)، والتي تظهر توليد تيار المستقبلات المبكر (ERC) وعلاقة شدته واستجابته. (أ) تسجيلات الخلية الكاملة المشبك بالتصحيح من الأوماتيديوم المعزول لذبابة WT (w1118) لاستجابة ERC ثنائية الطور مع زمن انتقال دون ميكروثانية. يتكون الحافز الضوئي من فلاش ضوء أزرق مكثف (~ 220 J ، مدة 0.8 مللي ثانية) (مرشح عريض النطاق مع ذروة امتصاص عند 425 نانومتر ، سهم) يتم تطبيقه بعد التكيف القوي مع الأصفر والأخضر (مرشح النطاق العريض مع ذروة الامتصاص عند 546 نانومتر من الضوء ، التتبع الأسود). في بداية الضوء ، لوحظت قطعة أثرية كهربائية سلبية سريعة. تنشأ المرحلة السلبية من تنشيط M ، وتنشأ المرحلة الإيجابية من تنشيط R. يتجلى تنشيط التيار الناجم عن الضوء (LIC) في المرحلة السلبية المتأخرة الناشئة عن فتح القنوات الحساسة للضوء. أظهر المتحور الفارغ ninaEI17 عدم استجابة ERC لنفس الوميض الضوئي المطبق على الأوماتيديوم المعزول (التتبع الأحمر). (ب) قياس ERC للصبغات الضوئية Rh1 المسجلة من نفس الخلية مثل (A). يظهر الأثر الأسود استجابة سلبية أحادية الطور (حالة M) لتحفيز الوميض البرتقالي لذبابة WT (w1118) بعد التكيف القوي مع الضوء الأزرق. (ج) عينة من آثار ERC ثنائية الطور تم قياسها من خلية مستقبلات ضوئية واحدة من ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا (opn4;ninaEI17) تعبر بشكل انتقائي عن الصباغ الضوئي للفئران الميلانوبسين (opn4) في المستقبلات الضوئية الذبابة R1-6 استجابة لزيادة كثافة أضواء الفلاش البيضاء (في مقياس -log I النسبي؛ يشير ND إلى مرشحات الكثافة المحايدة). يشار إلى بداية الفلاش بواسطة السهم. (د) تجلت الزيادة في شدة الضوء في زيادة خطية في سعة ERC ل opn4;ninaEI17. مخطط لمتوسط سعة الذروة للمرحلة السالبة من استجابات ERC (مقياس السجل) كدالة لشدة الضوء النسبية (I/Imax، أيضا في مقياس السجل). يمثل الخط المستقيم المستمر منحنى انحدار خطي يناسب النقاط التجريبية (R2 = 0.99 ، أشرطة الخطأ هي SEM ، n = 5). وقد عدل هذا الرقم من ياسين وآخرين(29). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الأدوات والأجهزة اللازمة لتثبيت الذباب وتسجيل إعداد ماصة . (أ) نظام النوم الذبابة. (ب) دواسة نظام النوم الطائر؛ (ج) مصدر الضوء البارد؛ (د) المجهر المجسم؛ (ه) سخان خيوط الشمع؛ (و) لحام الحديد؛ (ز) دواسة سخان خيوط الشمع؛ (ح) ملاقط خشنة؛ (I) حامل الذبابة المغناطيسية؛ (ي) الشمع منخفض درجة حرارة الانصهار؛ (ك) مناديل حساسة؛ (ل) مجتذب ماصة عمودية؛ (م) حقنة ذات طرف ممدود؛ (ن) حاملات الأقطاب الكهربائية؛ (س) الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات؛ (ع) ذبابة ثابتة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: نظرة عامة على إعداد ERG . (أ) مولد النبض. (ب) الحاسوب؛ (ج) محول A/D؛ (د) مكبر للصوت؛ (ه) المجهر المجسم؛ (و) مناور دقيق (غرامة ميكانيكية)؛ (ز) نظام مضخم الصوت الكهربائي الدقيق مع مرحلة الرأس؛ (ح) جدول مضاد للاهتزاز؛ (I) تشغيل / إيقاف كتلة المغناطيس ؛ (ي) جهاز المعالجة الدقيقة (الخشن الميكانيكي)؛ (ك) قفص فاراداي ؛ (ل) دليل الضوء من مصدر ضوء الزينون؛ (م) دليل الضوء من نظام ضوء فلاش؛ (ن) حامل القطب الأرضي؛ (س) كاشف الضوء؛ (ع) حامل قطب التسجيل؛ (س) حامل الذبابة المغناطيسية؛ (ص) مصباح زينون امدادات الطاقة؛ (S) حامل مرشحات الألوان و ND ؛ (T) مقعد بصري؛ (U) نظام مصباح فلاش؛ (V) برنامج تشغيل الغالق؛ (W) مصباح امدادات الطاقة؛ (X) نظام ضوء فلاش زينون يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حل رينجر | |
| الكاشف | التركيز (ملليمتر) |
| كلوريد الصوديوم | 130 |
| كيه سي ال | 2 |
| مج كل2 | 5 |
| كاكل2 | 2 |
| هيبس | 10 |
| معايرة الأس الهيدروجيني إلى 7.15 باستخدام NaOH و HCl | |
الجدول 1: تكوين حل رينجر.
الملف التكميلي 1: مخطط الدائرة لمنظم ذوبان الشمع. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الميزة الرئيسية لاستخدام إعداد مستقبلات ذبابة الفاكهة الضوئية هي إمكانية الوصول إليها ، وسهولة ودقة التحفيز الضوئي ، والأهم من ذلك ، القدرة على تطبيق قوة علم الوراثة الجزيئية7. وقد أثبتت الدراسات الجينية المكثفة ذبابة الفاكهة كنظام نموذجي مفيد للغاية للتشريح الجيني للعمليات البيولوجية المعقدة7. إن البنية البسيطة نسبيا لجينوم ذبابة الفاكهة (التي تتكون من أربعة كروموسومات فقط ، بما في ذلك الكروموسومات الجنسية X و Y ، وعنصرين جسديين أكبر ، الكروموسومات 2 و 3 ، والكروموسوم الرابع النقطي الصغير) ، وسهولة النمو ، ووقت التوليد السريع (~ 2 أسابيع عند 24 درجة مئوية) تجعل ذبابة الفاكهة مناسبة لفحص أعداد هائلة من الذباب الفردي المطفأ. علاوة على ذلك ، يصبح عزل وصيانة أي طفرة معزولة ممكنا بسبب توليد كروموسومات موازن ، تحتوي على علامات مهيمنة وانعكاسات متعددة ، والتي تمنع إعادة التركيب مع الكروموسومات الأصلية. سمحت الأدوات الجزيئية المتاحة بدراسة المنتجات الجينية المعدلة في المختبر في بيئتها الخلوية الأصلية37. أنتجت هذه المنهجية القوية عددا كبيرا من الذباب المتحور مع عيوب في البروتينات الجديدة التي كان من الصعب التنبؤ بها7.
الميزة الرئيسية لاستخدام ERG لقياس مستويات الصباغ الضوئي والحساسية للضوء هي بساطته وسهولة تطبيقه ونسبة الإشارة إلى الضوضاء الكبيرة. عيب استخدام ERG هو أصله الخلوي غير المتجانس ، مما يشوه الشكل الموجي للاستجابة الضوئية الناشئة عن المستقبلات الضوئية9. الميزة الرئيسية لتسجيلات الخلايا الكاملة للجهد المشبك هي القدرة على اشتقاق تغيير التوصيل عن طريق قياس العلاقة بين التيار والجهد (I-V). وينعكس فتح وإغلاق قناتي TRP وTRPL أثناء الإضاءة وبعدها بهذا القياس13. بالإضافة إلى ذلك ، يتم الحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية بسبب المقاومة المنخفضة لماصة التسجيل (~ 10 MΩ) وقياس التيارات ، مما يسمح بقياسات موثوقة للنتوءات الكمومية (استجابات الفوتون الواحد) ، وهو أمر مفيد لمعايرة شدة الضوء الفعالة38. العيب الرئيسي في تسجيلات الخلايا الكاملة المشبك بالتصحيح هو أنه في حين يمكن الاحتفاظ بتسجيلات ERG لساعات حتى في ظل شدة الضوء الشديدة ، فمن الصعب إجراء تسجيلات موثوقة للخلية الكاملة لأكثر من 15-30 دقيقة ، ويلزم تحفيز الضوء الخافت للتسجيلات الطويلة. للحصول على تسجيلات خلية كاملة ، يلزم الاتصال المباشر بين ماصة التسجيل وغشاء المستقبلات الضوئية. يتم تحقيق الاتصال المباشر عن طريق إزالة الخلايا الصبغية (الدبقية) المحيطة ب ommatidia34 (الشكل 1B). تسبب إزالة الخلايا الصبغية إجهادا استقلابيا لأن خلية المستقبلات الضوئية لا يمكنها توليف المستقلبات المطلوبة لإنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) ، مما يعطل إمدادات التمثيل الغذائي39. نظرا لأن قنوات TRP و TRPL عرضة لنقص الأكسجين وتفتح بسهولة تلقائيا في الظلام بسبب استنفاد ATP ، فإن استخدام ommatidia المعزول يفرض صعوبة كبيرة40,12. يجب أن يتم الإجراء بأكمله تحت الضوء الأحمر الخافت لأن استجابة الضوء تحفز استهلاكا كبيرا من ATP34.
معظم الطفرات في شلال النقل الضوئي تحفز انخفاض في الحساسية للضوء. يمكن اكتشاف هذا الانخفاض في الحساسية للضوء بسهولة بواسطة شاشة تعتمد على قياس العلاقة بين الشدة والاستجابة. يتم تحقيق نماذج الاستجابة للشدة عن طريق المحفزات الضوئية المتكررة مع زيادة الكثافة على مقياس لوغاريتمي. مطلوب زيادة (وليس نقصان) كثافة الضوء البرتقالي لمنع التكيف مع الضوء. ERG (M-potential) و PDA هي طرق بسيطة للغاية لقياس مستويات التصبغ الضوئي. ويتطلب البديل، أي قياس الطيف الضوئي المجهري36، معدات بصرية باهظة الثمن وتدريبا ومهارة كبيرين.
في الختام ، فإن ERG هي أداة سهلة التطبيق ولكنها غير دقيقة نسبيا. تسجيل الخلايا الكاملة31 دقيق لقياس مستويات الصباغ الضوئي باستخدام ERC ، وهو ضروري للتعويض عن عدم دقة وقيود ERG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من خلال منح من مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF) ، ومؤسسة العلوم ثنائية القومية الأمريكية الإسرائيلية (BSF). ونشكر السيد أناتولي شابوتشنيكوف على بناء سخان خيوط الشمع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe with elongated tip | Figure 6M | ||
| 1 rough tweezers | Dumont #5, Standard | 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H) | |
| 2 condenser lenses | |||
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1200 | Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C |
| Amplifier | Almost perfect electronics | Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | Figure 7H |
| Capillaries | Harvard Apparatus | Borosilicate glass capillaries | 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O) |
| Clampex | Molecular Device | Software | |
| CO2 tank | |||
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | Figure 6C |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes (Figure 6K) | |
| Electrode holder | Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P) | ||
| Faraday cage | Home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K) | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | Figure 7S |
| Filter (Color) | Schott | BP450/40 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) | Blazers | 550 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG630 | Figure 6C |
| Filter (Heat) | Schott | KG3 | Figure 7S |
| Filters (Neutral density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | Figure 7S |
| Flash Lamp system | Honeywell | Figure 7U | |
| Fly sleeper system with injector | Inject + matic | Figure 6A-B | |
| Lamp power supply | PTI | LPS-220 | Figure 7W |
| Light detector | Home made | Phototransistor (Figure 7O) | |
| Light guide | 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M) | ||
| Light source | High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R) | ||
| Low temperature melting wax | Home made | Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J) | |
| Magnetic stand for flies | Home made | Figure 6I and Figure 7Q | |
| Microelectrode preamplifier system with head-stage | Almost perfect electronics | Impedance tester (Figure 7G) | |
| Micromanipulator (mechanical coarse) | Tritech Research, Narishige | M-2 | |
| Micromanipulator (mechanical fine) | Leitz Microsystems | Leitz Mechanical Micromanipulator | Figure 7F |
| pCLAMP | Molecular Device | Software | |
| Petri dish | 60 mm | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | Figure 7A |
| Redux cream for electrocardiography | Parker Laboratories | Redux Electrolyte Crème | |
| Shutter driver | Uniblitz, Vincent Associates | VCM-D1 Single Channel Uni-stable | Figure 7V |
| Shutter system | Uniblitz, Vincent Associates | LS2 2 mm Uni-stable Shutters | Figure 7V |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Soldering iron composed of a platinum-iridium filament | 0.25 mm diameter (Figure 6F) | ||
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | Figure 6D |
| Stereoscopic zoom Microscope | Wild | Wild M5 | With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E) |
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Vertical pipette puller | Sutter/ Narishige | Model P-97/PP-830 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L) |
| Wax filament heater | Home made | See figure S1 (Figure 6E-G) | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElectronic | JML-C2 | Figure 7X |
References
- Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
- Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668 (1983).
- Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
- Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
- Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
- Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
- Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
- Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
- Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
- Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
- Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
- Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
- Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
- Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
- Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
- Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
- Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
- Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
- Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
- Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
- Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
- Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
- Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
- Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
- Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
- Cone, R. A., Cobbs, W. H.
- Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
- Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
- Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
- Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
- Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
- Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
- Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
- Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).
- Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
- Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
- Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
- Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
- Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
- Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
