Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Электрофизиологические методы измерения уровня фотопигмента в фоторецепторах дрозофилы

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63514
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

Summary

Представлен протокол электрофизиологической характеристики бистабильных фотопигментов: (i) использование смещений заряда внутри молекул фотопигмента после поглощения фотонов и их огромного количества в фоторецепторах и (ii) использование различий спектров поглощения состояний фотопигмента родопсина и метарходопсина. Эти протоколы полезны для скрининга мутаций, влияющих на бистабильные фотопигментные системы.

Abstract

Drosophila G-белок-связанный фотопигмент родопсин (R) состоит из белка (опсина) и хромофора. Процесс активации родопсина инициируется фотонной абсорбционно-индуцирующей изомеризацией хромофора, способствуя конформационным изменениям опсина и приводя ко второму темно-стабильному состоянию фотопигмента (метарходопсин, М). Исследование этого бистабильного фотопигмента с использованием случайного мутагенеза требует простых и надежных методов скрининга мутантных мух. Поэтому было разработано несколько методов измерения снижения функциональных уровней фотопигмента. Один из таких методов использует смещения заряда внутри фотопигмента после поглощения фотонов и огромного количества молекул фотопигмента, экспрессируемых в фоторецепторах. Этот электрический сигнал, называемый ранним рецепторным потенциалом (или ранним рецепторным током), измеряется различными электрофизиологическими методами (например, электроретинограммой и записями целых клеток) и линейно пропорционален функциональным уровням фотопигмента. Преимуществами этого метода являются высокое отношение сигнал/шум, прямое линейное измерение уровней фотопигмента и независимость механизмов фототрансдукции после активации родопсина или метарходопсина. Дополнительный электрофизиологический метод, называемый пролонгированным деполяризующим послепотенциальным (PDA), использует бистабильность фотопигмента Drosophila и абсорбционно-спектральные различия пигментных состояний мух R и M. КПК индуцируется интенсивным синим светом, превращая насыщенное количество родопсина в метародопсин, что приводит к сбою прекращения светового отклика в течение длительного времени в темноте, но оно может быть прекращено превращением метарходопсина в родопсин с использованием интенсивного оранжевого света. Поскольку КПК является надежным сигналом, который требует массивного преобразования фотопигмента, даже небольшие дефекты в биогенезе фотопигмента приводят к легко обнаруживаемому аномальному КПК. Действительно, дефектные мутанты PDA привели к идентификации новых сигнальных белков, важных для фототрансдукции.

Introduction

Светоактивированный родопсин (R), который является рецептором, связанным с G-белком (GPCR), состоит из 7 трансмембранных белков (опсин) и хромофора. У Drosophila melanogaster (плодовая муха) поглощение фотонов индуцирует изомеризацию хромофора 11-цис-3-ОН-ретинальной хромофора в all-trans-3-OH-retinal1, способствуя конформационному изменению родопсина на метародопсин (M, рисунок 1A). В отличие от позвоночного родопсина, преобладающая фракция хромофора беспозвоночных не диссоциирует от опсина, в результате чего возникает физиологически активное темно-стабильное пигментное состояние М. В свою очередь, дополнительное поглощение фотонов полностью транс-транс-3-ОН-хромофором сетчатки индуцирует изомеризацию хромофора 2,3, генерируя R-пигментное состояние с 11-цис-3-ОН-ретинальным хромофором. R-состояние представляет собой темный, стабильный и физиологически неактивный фотопигмент. В дополнение к чрезвычайно быстрому пути регенерации фотонов хромофора4, очень похожему на фотопигменты позвоночных, у беспозвоночных существует альтернативный ферментативный медленный путь регенерации хромофора, в котором некоторые из стадий выполняются в клетках сетчатки, окружающих клетки фоторецепторов 5,6.

Дрозофила влечет за собой большие преимущества в качестве модельного организма для изучения фоторецепторов беспозвоночных. В частности, доступность препарата и возможность применения молекулярной генетики сделали дрозофилу мощной модельной системой7. Таким образом, было установлено несколько экспериментальных методов in vivo и ex vivo для изучения фототрансдукции в целом и уровней фотопигмента в частности. Простейший метод in-vivo использует относительно большую внеклеточную зарегистрированную реакцию напряжения на свет глаза дрозофилы. Соответственно, световая стимуляция вызывает реакцию электрического напряжения во всем глазу, которая может быть измерена с помощью записи внеклеточной электроретинограммы (ERG), которая ~ 3 порядка больше, чем реакция ERG на свет глаз позвоночных 8,9. Ответ Drosophila ERG является надежным и легко получаемым, что делает его удобным методом выявления аномалий светового ответа из-за мутаций. Реакция ERG на свет возникает в основном из фоторецепторов, пигментных (глийных) клеток и вторичных нейронов пластинки (см. Рисунок 1B). Основными компонентами ERG являются (i) внеклеточный ответ напряжения фоторецепторов, (ii) переходные процессы «вкл» и «выкл» в начале и конце светового стимула, которые возникают из нейронов ламины (рисунок 2A, вставка, ON, OFF), (iii) медленный ответ клеток глии (рисунок 2A, вставка, стрелки) и (iv) краткий и переходный ответ, в результате смещения заряда при активации фотопигмента, которая предшествует переходному переходуON 10 (рисунок 2C [вставка], D, E). Этот краткий ответ состоит из двух фаз (M1 и M2, рисунок 2C [вставка]) и может быть вызван только чрезвычайно сильной световой стимуляцией, которая одновременно активирует миллионы молекул фотопигмента. Он не наблюдается ни при синей стимуляции (рисунок 2D, синий след), ни у мутантов с сильно сниженными уровнями фотопигмента (рисунок 2E, красный след), но его амплитуда слегка усиливается у мутанта, который отменяет активность ПЛК (рисунок 2E, оранжевый след). Фаза M1 является типичной ERP мухи, возникающей в результате активации M в фоторецепторах. Фаза M1, которая имеет положительную полярность (внутриклеточную), высвобождает нейротрансмиттер нормальным образом в синапсе, инвертирующем знак, и активирует нейроны lamina, которые реагируют на деполяризацию фоторецепторов, генерируя синаптически усиленную фазу M2. Таким образом, фазы М1 и М2 отражают активацию М10,11.

Деполяризация фоторецептора генерирует роговично-положительный переходный процесс «на», возникающий из знаково-инвертирующего синапса между аксоном фоторецептора и монополярными нейронами пластинки10,11 (рисунок 1В). Медленный подъем и распад ЭРГ возникают в результате деполяризации пигментных клеток (рисунок 2А, вставка, стрелки) в основном из-за выброса K+ из фоторецепторных клеток12 через транзиторный рецепторный потенциал (TRP) и TRP-подобные (TRPL) каналы13,14,15. Эти медленные кинетические компоненты в значительной степени маскируют и искажают форму сигнала реакции фоторецептора по сравнению с внутриклеточными или цельноклеточными записями реакции фоторецептора на свет 9,10. Кроме того, при очень сильном освещении может наблюдаться дополнительная переходная реакция, которая предшествует и частично сливается с переходным процессом «on» (рисунок 2C [вставка], D, E). Этот сигнал исходит непосредственно от массивной активации фотопигмента10.

Несколько протоколов светового режима с использованием нейтральной плотности (ND) и цветных фильтров, а также сильных осветительных вспышек были разработаны для исследования глаза в целом и каскада фототрансдукции в частности. Эти протоколы также использовались для исследования свойств фотопигмента.

Протокол интенсивности-отклика измеряет пиковую амплитуду реакции напряжения ERG всего глаза на увеличение интенсивности света (рисунок 2A, B). Этот протокол помогает обнаружить изменения чувствительности фоторецепторных клеток к свету9.

Протокол пролонгированной деполяризации послепотенциала (PDA) использует различия в спектрах поглощения родопсина и метародопсина, что позволяет в дрозофиле массивное фотопигментное преобразование R в его физиологически активное и темно-стабильное промежуточное M-состояние2. В ответе напряжения ERG подается относительно короткий импульс насыщенного света, и результирующая реакция напряжения регистрируется. При этом потолок (обратный потенциал) достигается сигналом деполяризации, поскольку активации доли процента от огромного количества молекул родопсина (~1 х 108) достаточно для достижения потолка. Наличие компонентов фототрансдукции в большом изобилии гарантирует, что этот потолок будет достигнут даже у мутантов со значительным снижением концентрации или тонким сбоем компонентов фототрансдукции. Такая ситуация исключает изоляцию этих мутантов. Pak et al. представили скрининг PDA7 в поисках надежного и показательного теста для изоляции визуальных мутантов. У дрозофилы реакция КПК вызвана генетическим удалением красного экранирующего пигмента, что позволяет превращать фотопигмент, и применением синего света, который преимущественно поглощается родопсином (рисунок 3A) и, таким образом, приводит к большому чистому преобразованию R в состояние фотопигмента M. Окончание фототрансдукции нарушается на уровне фотопигмента большим чистым преобразованием R в M, что, в свою очередь, приводит к устойчивому возбуждению в течение длительного времени после выключения света (рисунок 2C, рисунок 4A [вверху]). В течение периода ОАП фоторецепторы менее чувствительны к последующим тестовым огням и частично десенсибилизированы (инактивированы). PDA обнаруживает даже незначительные дефекты в биогенезе родопсина и проверяет максимальную способность фоторецепторной клетки поддерживать возбуждение в течение длительного периода. Поскольку он строго зависит от наличия высоких концентраций родопсина, он легко оценивается за недостаточное восполнение компонентов фототрансдукции. Примечательно, что экран КПК дал много новых и очень важных визуальных мутантов (рассмотренных в Pak et al.7). Таким образом, мутанты PDA, выделенные Pak et al.7 , по-прежнему чрезвычайно полезны для анализа зрительной системы Drosophila .

КПК индуцируется у дрозофилы путем насыщения синим светом, что приводит к непрерывной деполяризации в течение длительного времени после смещения света (рисунок 4A [вверху]). После насыщения КПК-индуцирующим синим светом периферические фоторецепторы (R1-6) остаются непрерывно активными в темноте на своей максимальной мощности, достигая насыщения. Дополнительные насыщенные синие огни во время КПК не вызывают никакого дополнительного ответа в клетках R1-6 в течение многих секунд, но вызывают ответ в клетках R7-8, который накладывается на КПК. Наложенные ответы объясняются различными спектрами поглощения фотопигментов, экспрессируемых в этих клетках (R7-8)16. КПК может быть подавлен фотоконверсией M обратно в R с насыщенным оранжевым светом (рисунок 4A [вверху]). Способность КПК доводить фоторецепторные клетки до их максимальной активной емкости, ситуация, которая не может быть достигнута интенсивным белым светом, объясняет, почему он был основным инструментом для скрининга визуальных мутантов дрозофилы. Это связано с тем, что он позволяет обнаруживать даже незначительные дефекты в белках, участвующих в биогенезе нормальных уровней фотопигмента17,18. Были выделены две группы дефектных мутантов PDA: ни инактивационные, ни послепотенциальные (нина) мутанты и инактивация, но не постпотенциальные (ina) мутанты. Фенотип первого представляет собой отсутствие ОАП и связанную с ним инактивацию, возникающую в результате значительного снижения уровней фотопигмента (рисунок 4А [средний]). Фенотип последнего показывает инактивацию, но не темную деполяризацию после синего света из-за все еще неизвестного механизма у мутанта с нормальным уровнем родопсина, но без белков, взаимодействующих с каналами TRP (рисунок 4A [внизу]).

КПК возникает из-за разницы в количестве фотопигмента относительно арестина (ARR2), который связывает и прекращаетактивность M 19,20,21 (рисунок 1A). В фоторецепторах дрозофилы количество фотопигмента примерно в пять раз больше, чем количество ARR219. Таким образом, уровни ARR2 недостаточны для инактивации всех молекул M, генерируемых большой чистой фотоконверсией R в M, оставляя избыток M постоянно активным в темноте 17,19,20,22,23. Этот механизм объясняет устранение ответа ОАП мутациями или каротиноидной депривацией24,25, вызывая снижение уровня фотопигмента, но не влияет на уровни арестина. Кроме того, это объяснение также учитывает фенотипы нулевого мутантного аллеля21 ARR2 (arr23), в котором КПК может быть достигнут при ~10-кратной диммере интенсивности синего света19,20,21 (рисунок 4B,C). КПК не является уникальной особенностью фоторецепторов мух, и она появляется у каждого тестируемого вида, который имеет темный стабильный M со спектром поглощения, отличным от спектра R-состояния, что позволяет достаточную фотоконверсию фотопигмента из состояния R в состояние M. Тщательно исследованным видом, у которого была обнаружена феноменология PDA, является фоторецептор ракушки (Balanus), у которого спектр поглощения R-состояния находится в большей длине волны, чем состояние M2 (рисунок 3B). Соответственно, в отличие от ситуации в мухе, в ракушке оранжево-красный свет индуцирует КПК, в то время как синий свет подавляет КПК2.

Протокол раннего рецепторного потенциала (ERP) использует смещение заряда, происходящее во время активации R или M. Зрительный пигмент является неотъемлемой частью поверхностной мембраны сигнального отсека как позвоночных, так и беспозвоночных мембран3. Соответственно, процесс активации, при котором молекулы фотопигмента изменяются из одного промежуточного состояния в другое, сопровождается смещением заряда 4,26. Поскольку молекулы фотопигмента электрически выровнены параллельно емкости мембраны4, быстрое синхронизированное конформационное изменение порождает быстрое поляризационное изменение поверхностной мембраны, которое у мух происходит в сигнальном отсеке, состоящем из стека из ~ 30 000-50 000 микроворсинок, называемых рабдомером. Эта поляризация затем пассивно разряжается через мембранную емкость клеточного тела до тех пор, пока клеточная мембрана не будет одинаково поляризована. ERP - это внеклеточная запись смещения заряда. Внутриклеточный зарегистрированный ERP проявляет внеклеточную ERP, интегрированную константой времени клеточной мембраны 4,27,28. Ток, активируемый визуальным смещением заряда пигмента, также может быть измерен в записях29,30 напряжения цельных ячеек (рисунок 5A-D), с основным преимуществом (в записях раннего рецепторного тока (ERC)) минимизации влияния емкости мембраны на кинетику сигнала.

В разделе протокола описывается, как выполнять измерения ERG из Drosophila eye9 и измерения ERC с помощью полноклеточных записей из изолированной ромматидии Drosophila 31,32. Мы также описываем конкретные протоколы, которые используются для исследования фототрансдукции в целом и фотопигментов в частности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Измерение зависимости интенсивности реакции, длительной деполяризующей афпотенциальной (PDA) и раннего рецепторного потенциала (ERP) с помощью электроретинограммы

  1. Подходящие условия выращивания для приготовления меланогастера D.
    1. Выращивайте D. melanogaster мух в бутылках, содержащих стандартную желтую кукурузу, содержащую пищу, в инкубаторе, поддерживаемом при температуре 24 ° C и в 12-часовом цикле темного / светлого
    2. Держите флаконы с мухами в темноте не менее чем за 24 часа до начала эксперимента.
  2. Общая настройка
    1. Подготовьте записывающие пипетки, вытянув 1 мм x 0,58 мм (O.D x I.D) заполненные волокном боросиликатные стеклянные капилляры (рисунок 6L, O). Сопротивление пипеток должно составлять 5-10 МОм; можно использовать любой подходящий съемник.
    2. Покройте два серебряных провода AgCl2, вставив серебряный провод 0,25 мм в раствор 3 M KCl, подключенный к специально изготовленному источнику питания 5 В.
    3. Вставьте каждую покрытую серебряную проволоку в держатели электродов (рисунок 6N).
    4. Заполните стеклянный капилляр отфильтрованным раствором Рингера (см. таблицу 1) с помощью шприца с удлиненным наконечником (рисунок 6M).
    5. Вставьте проволочный электрод в стеклянный капилляр. Убедитесь, что раствор внутри капилляра находится в контакте с серебряной проволокой.
    6. Вставьте держатели электродов (рисунок 7P, N) в два электродных микроманипулятора (рисунок 7G).
  3. Процедура подготовки мухи к электрическим записям
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сохранить муху в условиях, адаптированных к темноте, используйте только тусклое освещение красным светом во время следующих шагов.
    1. Обезболить мух в бутылке газом CO2 с помощью системы шпалы (рисунок 6A, B) и вылить их в контейнер для спального места.
    2. Выберите одну муху и осторожно держите ее за крыло с помощью острого пинцета. Накройте остальных мух чашкой Петри.
    3. Поместите муху на держатель мухи в правильной ориентации, лежа на боку, спиной к руке (рисунок 6P).
    4. Включите блок питания паяльника. Установите значение тока ~2,25 А. Этот ток должен нагревать платино-иридиевую нить 0,25 мм до ~55-56 °C (см. Дополнительный файл).
    5. Поместите каплю воска с низкой температурой плавления (~55-56 °C) на паяльник (рисунок 6F).
    6. Используя пинцет, поднимите муху с крыльев и закрепите ее крылья на держателе мухи (рисунок 6I) с помощью паяльника.
    7. С помощью паяльника соедините спинку мухи с поверхностью подставки воском (рисунок 6P).
    8. Опустите кончик паяльника на точку соединения ножек и расплавите воск, чтобы покрыть все ножки вместе (рисунок 6P).
    9. Поместите небольшую каплю воска между головой и спиной в область шеи (рисунок 6P).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте особенно осторожны, чтобы избежать перегрева головки мухи. Убедитесь, что муха правильно закреплена и не может двигаться во время эксперимента; незначительные движения могут создавать артефакты в записях. Убедитесь, что отверстия трахеи (дыхательные отверстия) в грудной клетке и брюшной полости не покрыты воском.
    10. Поместите держатель мухи (рисунок 7Q) в темную клетку Фарадея на магнитном блоке (рисунок 7I) и убедитесь, что муха находится примерно в 5 мм от конца световода (рисунок 7L).
    11. Поместите записывающий электрод (рисунок 7P) над глазом мухи и наземный электрод (рисунок 7N) над верхней частью спины мухи с помощью микроманипуляторов.
    12. Вставьте заземляющий электрод в заднюю часть мухи с помощью микроманипуляторов.
    13. Вставьте записывающий электрод во внешнюю периферию глаза мухи, предпочтительно, используя микроманипуляторы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После введения электрода в глаз будет наблюдаться небольшая ямочка; потяните электрод вверх, не удаляя его из глаза, пока ямочка не исчезнет. Электроды также могут быть погружены в небольшие капли электродного желе, нанесенного на туловище и глаз.
  4. Протокол "интенсивность-реакция"
    1. Поместите оранжевый фильтр (590 кромочный фильтр) перед ксеноновой лампой высокого давления. Используйте большой (шесть порядков) фильтр нейтральной плотности (ND).
    2. Подождите 60 с в темноте и дайте световой импульс 5 с.
    3. Замените ND-фильтр менее затухающим ND-фильтром с шагом в один порядок.
    4. Подождите 60 с в темноте и дайте второй световой импульс 5 с.
    5. Повторите шаги 1.4.1.-1.4.4, постепенно увеличивая интенсивность света с помощью менее затухающих ND-фильтров (последний импульс должен генерироваться без ND-фильтра вообще). Убедитесь, что серия ND-фильтров используется в правильном направлении, начиная с большого затухания и достигая низкого затухания.
  5. Протокол PDA (этот протокол может быть выполнен только на белоглазых мухах)
    1. Подайте световой импульс максимальной интенсивности 5 с с помощью оранжевого фильтра (590 краевой фильтр, чтобы преобразовать максимальный фотопигмент в состояние R).
    2. Замените оранжевый фильтр широкополосным синим (BP450/40 нм) фильтром и дайте три световых импульса 5 с максимальной интенсивностью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно давать длинный непрерывный импульс синего света максимальной интенсивности до тех пор, пока не будет достигнута устойчивая характеристика напряжения.
    3. Подождите 60 с в темноте, замените синий фильтр предыдущим оранжевым фильтром и дайте два световых импульса по 5 с с интервалом 60 с.
  6. ERP/M-потенциальный протокол для измерения фоторавновешенного спектра M (этот протокол может быть выполнен только на белоглазых мухах10,25)
    1. Дают непрерывный синий (полоса пропускания (BP) 450/40 нм) световой импульс до достижения стационарного отклика напряжения, который преобразует максимальное количество фотопигмента из состояния R в состояние M ячеек R1-6.
    2. Дают кратковременную (<3 мс) интенсивную вспышку света длиной волны между 350-700 нм (известный спектр поглощения фотопигмента R1-6 ячеек) с помощью узких (~20 нм) полосовых фильтров и измеряют пиковую амплитуду фазы M1 потенциального отклика M (которая отражает поглощение метарходопсина на этой конкретной длине волны при фоторавнового равновесии10,25).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для синхронной активации большого пула молекул фотопигмента требуется короткая, интенсивная вспышка света, чтобы содержание фотонов было упаковано в течение короткого периода времени. Потенциал M состоит из двух компонентов: M1 (отрицательная фаза роговицы), которая отражает смещение заряда метарходопсина в фоторецепторе, и M2 (положительная фаза роговицы11,33), которая отражает усиленный ответ M1 фоторецепторов в пластине 9,10,11 . Каждый из этих компонентов может быть идентифицирован и измерен. Однако предпочтительнее измерить потенциал М1, поскольку он является прямым линейным проявлением уровней М. Если используется М2, убедитесь, что его амплитуда находится в линейном диапазоне, используя легкую каротиноидную депривацию24,25.
    3. Снова дайте непрерывный синий (BP450/40 нм) световой импульс, за которым последует короткая (<1 мс) интенсивная световая вспышка другой длины волны.
    4. Повторяйте этот протокол до тех пор, пока не будет покрыт весь спектр поглощения М при фоторавновешении.

2. Протокол ERC для измерения спектра действия R и M состояний R1-6 ячеек с использованием записей напряжения-зажима цельной ячейки

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол использования записей зажима напряжения на целых ячейках см. в Katz et al.34. M-потенциал использует ERG для измерения активации M-состояния только потому, что вклад R-состояния подавляется емкостью мембраны. Напротив, ERC измеряет активацию состояний R (положительный ERC) и M (отрицательный ERC), поскольку записи напряжения-зажима устраняют эффект емкости мембраны (см. Введение).

  1. Преобразуйте фотопигмент в нужное состояние (R или M). Для преобразования R в M, во-первых, адаптируйте мух с помощью короткой (<1 мс) адаптивной синей (BP450/40 нм) вспышки. Для преобразования M в R дайте короткую адаптивную оранжевую (OG590 краевой фильтр) вспышку.
  2. Дайте короткую вспышку света (<1 мс) длины волны между 350-700 нм и измерьте максимальную отрицательную или положительную амплитуду отклика ERC, которая отражает поглощение M / R на этой конкретной длине волны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для синхронной активации большого пула молекул фотопигмента требуется короткая, интенсивная вспышка света для упаковки содержимого фотонов за короткий промежуток времени. Максимальное преобразование фотопигмента из R в M синей вспышкой может достигать ~80% от общего количества молекул фотопигмента из-за перекрытия в спектре поглощения R и M (рисунок 3A). Поэтому на длинах волн ниже ~ 550 нм ERC имеет два компонента: отрицательную фазу, которая отражает реакцию метарходопсина, и положительную фазу, которая отражает реакцию оставшегося родопсина. ERC линейно зависит от интенсивности света (рисунок 5D). Соответственно, чтобы получить спектральную чувствительность R и M состояний, каждая фаза ERC должна быть нормализована на различных длинах волн для равной энергии29.
  3. Повторите шаги 2.1.-2.2. использование вспышек различной длины волны.
  4. Построение нормализованного положительного и отрицательного ERC в зависимости от длины волны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сильная вспышка света индуцирует массивный ток через светочувствительные каналы, что приводит к метаболической нагрузке на фоторецептор, что, в свою очередь, вызывает открытие светонезависимого канала. ERC накладывается на этот конститутивный ток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 2 иллюстрирует надежность и простоту использования метода ERG. Он надежен, потому что он записывается в практически неповрежденной мухе с помощью простой техники внеклеточной записи напряжения, которая требует простой электрофизиологической установки. Надежность проявляется получением записей световых откликов с относительно большими амплитудами (в милливольтовом диапазоне) даже тогда, когда мутации сильно уменьшают или искажают световой отклик. Поэтому даже неопытный экспериментатор может использовать очень простую экспериментальную установку и научиться получать значимые результаты за несколько дней. Основная цель методики, предназначенной для измерения уровней фотопигмента, достигается чрезвычайно упрощенными методами КПК (рисунок 2C) и ERP (рисунок 2C-E). Альтернатива, а именно микроспектрофотометрия, требует дорогостоящего оптического оборудования и значительной подготовки и навыков (рисунок 3В). ERC (рисунок 5A-D), хотя и технически сложен, менее чувствителен к сохранению клеток; он характеризуется высоким отношением сигнал/шум и устранением емкости мембраны.

Figure 1
Рисунок 1: Фотохимический цикл: активация и дезактивация фотопигмента. (А) Насыщающее синее освещение (волнистая синяя стрелка) фотопреобразует родопсин (R) в метародопсин (М). Многократное фосфорилирование М родопсинкиназой и последующее связывание арестина 2 (ARR2) инактивирует M. Оранжевый свет (волнистая красная стрелка) фотоконвертирует нефосфорилированный M обратно в R. Нефосфорилированный M активирует гетеротримерный G-белок (Gqαβγ), вызывая диссоциацию Gqα от Gqβγ и обмен связанного ВВП с цитоплазматическим ГТФ. Затем Gqα-GTP активирует фосфолипазу C (PLC), которая гидролизует PIP2 в диацилглицерин (DAG) и инозитолтрисфосфат (IP3), тем самым активируя каналы TRP / TRPL до сих пор неясным образом. Ca2+ кальмодулин-зависимая киназа (CaMKII) фосфорилирует комплекс M pp-ARR2 и подвергается клатринозависимому эндоцитозу и деградации. Освещение оранжевым светом (волнистая красная стрелка) фотопреобразует комплекс M pp-ARR2 в фосфорилированный R (Rpp), высвобождая ARR2 в цитозоль. Фосфорилированный R (Rpp) подвергается дефосфорилированию родопсинфосфатазой (rdgC), образуя R, готовый к следующему циклу фотопигмента. (B) Профиль глубины ЭРГ белоглазой мухи до белого стимула 1 с (центральная колонна) или белой стробоскопической вспышки (правая колонка). Стимулы обозначены полосами или точками под следами. Следы расположены вертикально в порядке глубины, причем верхний след регистрируется ~ на 10 мкм ниже роговицы, причем каждая последующая запись на 25 мкм глубже, чем предыдущая. Слева камера lucida рисует соответствующий участок через другой глаз, указывающий на сетчатку, базальную мембрану (БМ), ламинарную кожуру, ламинарные картриджи (разрезанные наклонно) и медуллярную кожуру. Эта цифра была изменена с Stephenson and Pak11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Записи электроретинограммы (ERG) световых реакций белоглазого дикого типа (w1118) и мутантной дрозофилы, показывающие зависимость интенсивность-реакция, длительный деполяризующий послепотенциальный (PDA) и метародопсиновый потенциал (M-потенциал). (A) Соотношение силы и характеристики wt (w1118) мухи, полученной серией оранжевых огней (OG590 краевой фильтр, общая энергия, излучаемая краем световода с использованием оранжевого фильтра, составляла 4 мВт) с увеличением интенсивности света, указанной в шкале -log. Вставка показывает указанный ответ в более быстром масштабе времени. Вставка: Основными компонентами ЭРГ являются внеклеточный ответ напряжения фоторецептора (рецепторный потенциал), переходные процессы «вкл» и «выкл» (ответ ON, OFF) в начале и конце светового стимула, а также медленная реакция клеток глии (стрелки). (B) Средняя пиковая амплитуда откликов ERG строится в зависимости от относительной интенсивности света. (C) ERP мухи WT (w1118) был получен путем применения насыщенного синего (BP450/4 нм, общая энергия, излучаемая краем световода с помощью синего фильтра, составляла 1 мВт) света, который первоначально индуцировал КПК. ERP (вставка) была получена следующей интенсивной (~70 Дж, длительностью 2 мс) зеленой вспышкой (стрелка, широкополосный фильтр помех 550 нм), которая подавляла КПК. Вставка: различные компоненты ERP включают отрицательный потенциал M1 роговицы и положительный потенциал M2, как указано. Также указывается остаточный переходный (реакция "ON"). (Д-Е) Преобразование фотопигмента требуется для индукции М-потенциала: (D) М-потенциал был получен зеленой (широкополосный интерференционный фильтр 550 нм) вспышкой после синей адаптации, но не синей (BP450/4 нм) вспышкой после синей адаптации в WT (w1118) мухе. (E) Протокол D был повторен у WT (w1118, черный след) и двух мух-мутантов (PLC нулевой мутант, norpAP24, оранжевый след и гипоморфный мутант родопсина, ninaEP318, красный след). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Спектры поглощения фотопигментов мух и ракушек. (A) Спектры относительного поглощения родопсина мухи (R) и метародопсина (M), рассчитанные на основе фотометрических измерений разностного спектра и фоторавнового спектра. Эта цифра была изменена с Selinger и Minke35. (B) Две номограммы Дартнелла с пиковыми длинами волн при 492 нм и 532 нм, с отношением пикового поглощения 1,63:1, соответственно. Разница между этими кривыми дает наилучшее соответствие разностному спектру, измеренному от оцеллий ракушечника Balanus eborneus, полученному путем измерений пропускания в диапазоне 400-650 нм после насыщения монохроматической синей (442 нм) и оранжевой (596 нм) адаптации. Эта цифра была изменена с Minke и Kirschfeld36. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Фенотип PDA мутантов нины, ины и Arr2 . (А) Протокол индукции и подавления ОАП при дрозофиле. Протокол индукции КПК состоит из начального освещения с использованием импульса оранжевого света максимальной интенсивности (590 краевой фильтр, общая энергия, излучаемая краем световода с помощью оранжевого фильтра, составляла 4 мВт, оранжевая полоса) с последующим применением трех импульсов максимальной интенсивности синего света (2-й и3-й импульсы предназначены для проверки достижения максимального КПК, Фильтр BP450/40 нм, суммарная энергия, излучаемая от края световода с помощью синего фильтра, составляла 1 мВт, три синие полосы). Подавление КПК было получено путем применения оранжевого светового импульса с последующим применением дополнительного оранжевого света (две оранжевые полосы). Протокол индукции и подавления КПК повторяли у белоглазого мутанта структурного гена фотопигмента R1-6, ninaEP318 7 (средний). Протокол индукции и подавления PDA также повторялся в белоглазом нулевом мутанте глаз-специфической протеинкиназы C (PKC32) inaCP209 (внизу). (B) Сравнение количества синего света, необходимого для индукции КПК между белоглазым WT (W1118) и нулевым мутантом Arr2 (Arr23). Череда чередующихся оранжевых (насыщенных 590 краевых фильтров) и синих (BP450/40 нм) световых импульсов возрастающей интенсивности света (ND в относительно-логарифмической шкале). При синем свете интенсивности -log 1 индуцируется КПК (сверху). Парадигма верхнего следа была повторена в мутанте Arr23 , показав, что КПК был индуцирован при синем свете ~ 10-кратной интенсивности тусклого света (-log 2) (нижний). (C) Шлейф тусклых (-log 2) импульсов синего света постоянной интенсивности не смог вызвать КПК в W1118 fly (слева), в то время как тот же шлейф тусклых синих огней индуцировал КПК1-м световым импульсом в мутанте Arr23 (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Патч-зажимные общеклеточные записи световых реакций изолированных омматидий, записанные из белоглазого WT (w1118), показывающие генерацию раннего рецепторного тока (ERC) и его зависимость интенсивности-ответа. (A) Патч-зажимные общеклеточные записи из изолированного омматидия wt fly (w1118) двухфазного ответа ERC с задержкой в субмикросекунде. Световой стимул состоит из интенсивной (~220 Дж, длительность 0,8 мс) вспышки синего света (широкополосный фильтр с пиковым поглощением при 425 нм, стрелка), применяемой после сильной адаптации к желто-зеленой (широкополосный фильтр с пиковым поглощением при 546 нм света, черный след). При наступлении света наблюдается быстроотрицательный электрический артефакт. Отрицательная фаза возникает из активации M, а положительная фаза возникает из активации R. Активация светоиндуцированного тока (КСЖ) проявляется замедленной отрицательной фазой, возникающей при открытии светочувствительных каналов. Нулевой мутант ninaEI17 показал отсутствие реакции ERC на ту же вспышку света, примененную к изолированному омматидию (красный след). (B) Измерение ERC фотопигментов Rh1, записанных из той же ячейки, что и (A). Черный след показывает монофазную отрицательную реакцию (состояние М) на оранжевую вспышку стимуляции мухи WT (w1118) после сильной адаптации к синему свету. (C) Образец двухфазных следов ERC, измеренных из одной фоторецепторной клетки трансгенной дрозофилы (opn4;ninaEI17), эктопически экспрессирующей меланопсиновый фотопигмент (opn4) мышей в фоторецепторах мух R1-6 в ответ на увеличение интенсивности белых вспышек (в относительной шкале -log I); ND указывает на фильтры нейтральной плотности). Начало вспышки обозначается стрелкой. (D) Увеличение интенсивности света проявлялось линейным увеличением амплитуды ERC opn4;ninaEI17. График средней пиковой амплитуды отрицательной фазы откликов ERC (логарифмическая шкала) в зависимости от относительной интенсивности света (I/Imax, также в логарифмической шкале). Непрерывная прямая представляет собой кривую линейной регрессии, которая наилучшим образом соответствует экспериментальным точкам (R2 = 0,99, полосы погрешностей SEM, n = 5). Эта цифра была изменена по сравнению с Yasin et al.29. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Инструменты и устройства, необходимые для фиксации мухи и подготовки пипетки для записи. (A) Система шпалы мухи; (B) Педаль системы спального места; с) холодный источник света; D) стереоскопический микроскоп; E) восковой нагреватель нити; F) паяльник; (G) Педаль нагревателя восковой нити накаливания; H) грубый пинцет; I) магнитная подставка для мух; J) воск с низкой температурой плавления; (K) Деликатные салфетки; (L) Вертикальный съемник пипетки; (M) Шприц с удлиненным наконечником; (N) Держатели электродов; O) боросиликатные стеклянные капилляры; (P) Фиксированная муха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Обзор установки ERG. (A) Генератор импульсов; b) компьютер; (C) аналого-цифровой преобразователь; d) усилитель; E) стереоскопический микроскоп; F) микроманипулятор (механический тонкий); (G) Микроэлектродная предусилительная система с головной ступенью; H) антивибрационный стол; (I) Включение / выключение магнитного блока; J) микроманипулятор (механический грубый); (K) клетка Фарадея; L) световод от ксенонового источника света; (M) Световод от системы фонарей; (N) Держатель заземляющего электрода; (O) Детектор света; (P) Держатель регистрирующего электрода; (Q) Магнитная подставка для мух; (R) источник питания ксеноновой лампы; (S) Цветной и ND-фильтры; (T) Оптический стенд; (U) система ламп вспышки; (V) Драйвер затвора; (W) Блок питания лампы; (X) Ксеноновая система фонарей Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Решение Рингера
Реагент Концентрация (мМ)
НаКл 130
ККл 2
МгКл2 5
КаКл2 2
ХЕПЕС 10
титрование pH до 7,15 с использованием NaOH и HCl

Таблица 1: Состав раствора Рингера.

Дополнительный файл 1: Принципиальная схема регулятора расплава воска. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Основным преимуществом использования препарата фоторецептор Drosophila является его доступность, легкость и точность световой стимуляции, и, самое главное, способность применять силу молекулярной генетики7. Обширные генетические исследования установили дрозофилу как чрезвычайно полезную модельную систему для генетического вскрытия сложных биологических процессов7. Относительно простая структура генома дрозофилы (состоящая только из четырех хромосом, включая половые хромосомы X и Y, два более крупных аутосомных элемента, хромосомы 2 и 3 и четвертую хромосому с маленькой точкой), легкость роста и быстрое время генерации (~ 2 недели при 24 ° C) делают дрозофилу подходящей для скрининга огромного количества мутагенизированных отдельных мух. Более того, выделение и поддержание любой изолированной мутации становится возможным благодаря генерации балансирующих хромосом, содержащих доминантные маркеры и множественные инверсии, препятствующие рекомбинации с нативными хромосомами. Имеющиеся молекулярные инструменты позволили изучать in vitro модифицированные генные продукты в их родной клеточной среде37. Эта мощная методология произвела множество мутантных мух с дефектами в новых белках, которые в противном случае было бы трудно предсказать7.

Основным преимуществом использования ERG для измерения уровней фотопигмента и чувствительности к свету является его простота и удобство применения, а также большое отношение сигнал/шум. Недостатком использования ЭРГ является его гетерогенное клеточное происхождение, искажающее форму волнового отклика, возникающего от фоторецепторов9. Основным преимуществом записей всего ячейки с зажимом напряжения является возможность получения изменения проводимости путем измерения соотношения ток-напряжение (I-V). Открытие и закрытие каналов ГТО и ТРПЛ во время и после освещения отражаются этим измерением13. Кроме того, высокое отношение сигнал/шум получается благодаря низкому сопротивлению записывающей пипетки (~10 МОм) и измерению токов, что позволяет проводить надежные измерения квантовых ударов (однофотонных откликов), что полезно для калибровки эффективной интенсивности света38. Основным недостатком записей целых клеток с патч-зажимом является то, что, хотя записи ERG могут поддерживаться в течение нескольких часов даже при экстремальной интенсивности света, трудно выполнять надежные записи целых клеток в течение более 15-30 минут, и для длительных записей требуется стимуляция тусклого света. Для получения записей целых клеток требуется прямой контакт между записывающей пипеткой и фоторецепторной мембраной. Прямой контакт достигается путем удаления пигментных (глиальных) клеток, окружающих омматидию34 (рисунок 1B). Удаление пигментных клеток вызывает метаболический стресс, поскольку фоторецепторная клетка не может синтезировать метаболиты, необходимые для производства аденозинтрифосфата (АТФ), нарушая метаболическое снабжение39. Поскольку каналы ГТО и ТРПЛ уязвимы к аноксии и легко открываются самопроизвольно в темное время суток из-за истощения АТФ, применение изолированных омматидий накладывает большие трудности40,12. Вся процедура должна проводиться под тусклым красным светом, поскольку световая реакция вызывает большое потреблениеАТФ-34.

Большинство мутаций в каскаде фототрансдукции вызывают снижение чувствительности к свету. Это снижение чувствительности к свету может быть легко обнаружено экраном на основе измерения соотношения интенсивности и реакции. Парадигмы интенсивности-ответа достигаются повторными световыми стимуляциями с возрастающей интенсивностью на логарифмической шкале. Увеличение (а не уменьшение) интенсивности оранжевого света требуется для предотвращения адаптации к свету. ERG (M-потенциал) и PDA являются очень простыми методами измерения уровней фотопигмента. Альтернатива, а именно микроспектрофотометрия36, требует дорогостоящего оптического оборудования и значительной подготовки и навыков.

В заключение, ERG является простым в применении, но относительно неточным инструментом. Полностью клеточная запись31 точна для измерения уровней фотопигмента с использованием ERC и имеет важное значение для компенсации неточности и ограничений ERG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано грантами Израильского научного фонда (ISF) и Американо-израильского двустороннего научного фонда (BSF). Благодарим Анатолия Шапочникова за конструкцию воскового нагревателя нити.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe with elongated tip Figure 6M
1 rough tweezers Dumont #5, Standard 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter Molecular Device Digidata 1200 Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier Almost perfect electronics Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01 Figure 7H
Capillaries Harvard Apparatus Borosilicate glass capillaries 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex Molecular Device Software
CO2 tank
Cold light source Schott KL1500 LCD Figure 6C
Delicate wipers Kimtech Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage Home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter Figure 7S
Filter (Color) Schott BP450/40 nm Figure 7S
Filter (Color) Blazers 550 nm Figure 7S
Filter (Color) for cold light source Schott RG630 Figure 6C
Filter (Heat) Schott KG3 Figure 7S
Filters (Neutral density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 Figure 7S
Flash Lamp system Honeywell Figure 7U
Fly sleeper system with injector Inject + matic Figure 6A-B
Lamp power supply PTI LPS-220 Figure 7W
Light detector Home made Phototransistor (Figure 7O)
Light guide 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax Home made Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies Home made Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage Almost perfect electronics Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse) Tritech Research, Narishige M-2
Micromanipulator (mechanical fine) Leitz Microsystems Leitz Mechanical Micromanipulator Figure 7F
pCLAMP Molecular Device Software
Petri dish 60 mm
Pulse generator AMPI Master 8 Figure 7A
Redux cream for electrocardiography Parker Laboratories Redux Electrolyte Crème
Shutter driver Uniblitz, Vincent Associates VCM-D1 Single Channel Uni-stable Figure 7V
Shutter system Uniblitz, Vincent Associates LS2 2 mm Uni-stable Shutters Figure 7V
Silver Wire Warner Instruments 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament 0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope Nikon SMZ-2B Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope Wild Wild M5 With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller Sutter/ Narishige Model P-97/PP-830 Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater Home made See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElectronic JML-C2 Figure 7X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
  2. Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668 (1983).
  3. Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
  4. Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
  5. Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
  6. Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
  7. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  8. Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
  9. Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
  10. Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
  11. Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
  12. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  13. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  14. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  15. Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
  16. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
  17. Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
  18. Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
  19. Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
  20. Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
  21. Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
  22. Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
  23. Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
  24. Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
  25. Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
  26. Cone, R. A., Cobbs, W. H. Rhodopsin cycle in the living eye of the rat. Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).
  27. Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
  28. Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
  29. Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
  30. Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
  31. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
  32. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  33. Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
  34. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).
  35. Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
  36. Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
  37. Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
  38. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
  39. Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
  40. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).

Tags

Неврология выпуск 184
Электрофизиологические методы измерения уровня фотопигмента в <em>фоторецепторах дрозофилы</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B.… More

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (184), e63514, doi:10.3791/63514 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter